JPH0423982A - 新規β―グルクロニダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高甘味度甘味料として有用なグリチルレチン
酸モノグルクロナイドの製造等に使用可能な新規β−グ
ルクロニダーゼに関するものである。

〔従来の技術〕

β−グルクロニダーゼは種々の動植物、微生物等の中か
ら見いだされ、牛肝臓、カタツムリ、大腸菌等から分離
されたものが市販されている。この酵素は、たとえば配
糖体・グリチルリチン（こ作用させるとその糖部分すな
わち２−０−β−グルクロノシルグルクロン酸部分を加
水分解し、グリチルリチンからグルクロン酸１分子が除
かれたグリチルレチン酸モノグルクロナイドを生じさせ
る。

グリチルレチン酸モノグルクロナイドは砂糖の約１００
０倍の甘味を有するので、β−グルクロニダーゼによる
グリチルリチンの加水分解は高甘味度甘味料の製造法と
して関心を持たれている。しかしながら、従来知られて
いるβ−グルクロニダーゼはいずれも糖部分の単糖間グ
リコシド結合を切断するだけでなく糖部分とアグリコン
との間のグリコシド結合も切断するので、グリチルレチ
ン酸モノグルクロナイドだけを生成させるわけではなく
、必ず、グルクロンａ２分子が除かれたグリチルレチン
酸も生成させてしまう。副生ずるグリチルレチン酸はま
ったく甘味を示さないから、反応後これを分離しない限
り真に高甘味度の甘味料を得ることはできないが、分離
精製は容易ではなく、それが、経済的にグリチルレチン
酸モノグルクロナイド系甘味料を製造することを困難に
する。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明の目的は、グリチルリチンにおける糖部分
の末端グルクロン酸のようにグルクロン酸の２位にβ−
Ｄ−グリコジル結合したグルクロン酸のみを加水分解に
より遊離させる作用を有するβ−グルクロニダーゼを提
供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

種々検討の結果、本発明者らはクリプトコツカス属に属
する酵母の中に本発明の目的達成を可能にするものがあ
ることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明はクリプトコツカス属に属する酵母を
用いて本発明者らにより初めて製造された新規β−グル
クロニダーゼを提供するものであって、該β−グルクロ
ニダーゼは次のような理化学的性質を有することが確認
されている。

■　基質特異性および作用 ２−０−β−グルクロノシルグルクロン酸残基における
グルクロン酸間グリコシド結合を加水分解するが、フェ
ノールフタレン−β−Ｄ−グルクロナイドにおけるグリ
コシド結合には作用しない。

したがって、グリチルリチンに作用させると２−０β−
グルクロノシルグルクロン酸残基からなる糖部分を加水
分解して分子末端のグルクロン酸を遊離させるが上記糖
部分とアグリコン部分との間のグリコシド結合は加水分
解しないので、グリチルレチン酸を生じさせることなし
にグリチルレチン酸モノグルクロナイドを生じさせる。

■　至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ：約５．７ 安定ｐｌ（範囲＝４．０〜７．５ ■　至適温度および安定温度範囲 至適温度：５０℃ 安定温度範囲＝６０℃以下 上述のような、特異な性質を有する本発明のβ−グルク
ロニダーゼは、クリプトコツカス・マグナスＭＧ−２７
（微工研菌寄第１１０９２号）等を用いて製造すること
ができる。すなわち、誘導物質としてグルクロン酸残基
含有天然物を約０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜
２％含有する培地で上記クリプトコツカス・マグナスそ
の他β−グルクロニダーゼ生産能を有する微生物を培養
する。使用可能なグルクロン酸残基含有天然物としては
、グリチルリチン、２−０−β−グルクロノンルグルク
ロン酸（グルクロノビオース）、大豆サポニン、アルギ
ン酸ナトリウム、アラビアガム、およびこれらを含有す
る植物または微生物培養物等がある。他の培地成分とし
ては、酵母エキス、ポリペプトン、トリプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカ、グルコース、フラクトース
、シュクロース、マルトース等、酵母培養に通常使用さ
れる窒素源、炭素源、無機塩類等の中から任意のものを
用いることができる。

培養は、回分式、連続式のいずれによっても行うことが
できる。

２０〜３５℃で１〜７日間、好気的に培養を行うと、本
発明のβ−グルクロニダーゼが生産されて培養液中に蓄
積されるので、これを分離して精製すれば、本発明の酵
素を得ることができる。なお、β−グルクロニダーゼは
一部が菌体外に溶出しているが一部は菌体に保持されて
いる。

菌体外に溶出しているβ−グルクロニダーゼを採取し精
製する場合は、まず培養液から菌体を遠心分離、濾過な
どの方法で除く。β−グルクロニダーゼを含む培養上清
はそのままでも粗酵素液として酵素反応に使用すること
ができるが、精製する場合は、たとえば硫酸アンモニウ
ム塩析、アセトン、エタノール、インプロパツール等に
よる溶媒沈澱法、ゲル濾過法、イオン交換測脂法等、酵
素精製の常法により精製する。

菌体に保持されているβ−グルクロニダーゼを採取する
場合は、菌体を培養液から分取し、溶菌酵素を作用させ
るか超音波破砕処理を施すかして、菌体から酵素を遊離
させ、遠心分離して粗酵素液を採取、これを上記と同様
にして精製する。

培養菌体に保持されているβ−グルクロニダーゼをその
まま酵素反応に使用することもできる。その場合は、β
−グルクロニダーゼが蓄積された菌体を培養液から採取
し、洗浄してそのまま酵素反応に使用する。

上記クリプトコツカス属酵母は本発明者らが広島県尾道
市の土壌から分離した菌株であって、その菌学的性質は
次のとおりである。

細胞の形態および大きさ：楕円体状または卵形状（３，
０〜　５．３　μｍ）　　　Ｘ　　　（４，０〜　５．
３　μ鳳）成育（ＹＭ寒天培地）：クリーム色、平滑仮
性菌糸：形成せず 子のう胞子：形成せず 炭水化物の利用性 グルコース、ガラクトース、マルトース、シュクロース
、ラクトース、セロビオース、イノシトール、キシロー
ス、ラフィノース、マンニトール、可溶性デンプン、ア
ラビノース、イヌリン、グリセロールを利用する。

メリビオース、エリスリトール、ラムノース、リビトー
ルを利用しない。

硝酸塩：還元しない。

デンプン様物質の生成：する ウレアーゼ：陽性 ゼラチンの液化性：なし 高浸透圧性培地（５０％グルコース−ＹＭ培地）におけ
る生育：生育せず ３７℃における生育：生育せず 以上の諸性質をザ・イースト・ア・タキツノミック・ス
タデイ・第３版の記載と照合することにより、本菌株は
クリプトコツカス・マグナスであると同定された。

本発明のβ−グルクロニダーゼは、前述のように、グリ
チルリチンに作用させるとグリチルリチンの糖部分の２
−〇−β−グルクロノシルグルクロン酸における糖量グ
リコシド結合を加水分解し、１モルのグルクロン酸を遊
離させ、グリチルレチン酸モノグルクロナイドを生成さ
せる。この作用を利用してグリチルリチンからグリチル
レチン酸モノグルクロナイドを製造する場合は、本酵素
をｐＨ５〜７、温度３５〜６０℃で、最高収率が達成さ
れるまでグリチルリチンに作用させればよい。グリチル
レチン酸が生成しないので、グリチルレチン酸モノグル
クロナイドは反応混合物から簡単に単離することができ
、容易に高甘味度甘味料とすることができる。

〔実施例〕

以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、各側に
おいて示しｔ；β−グルクロニダーゼの活性は次のよう
にして測定されたものである。

酵素活性測定法＝２％グリチルリチン溶液（ｐＨ５，５
のＩＭ−酢酸緩衝液に溶解）１ｍｌと酵素液１ｍｌを混
合し、４０℃で１時間反応させる。生成したグリチルレ
チン酸モノグルクロナイドの量を高速液体クロマトグラ
フィーで定量し、１分間にｌμＭのグリチルレチン酸モ
ノグルクロナイドを生成させる酵素量を１％位とする。

高速液体クロマトグラフィーの条件は次のとおりである
。

カラム：東ソー製ＴＳＫｇｅｌ　　ＯＤＳ８０ＴＭキャ
リヤー：アセトニトリル／水／酢酸（４９：５１：１） 流速＋１．Ｏｓｌ／鳳１１ 横１１ＵＶ、２５４立醜 実施例１ グリチルリチン１％、グルクロノビオース１％、ポリペ
プトン０，５％、酵母エキス０．３％を含むｐＨ６。

０の培地１，１１にクリプトコツカス・マグナスＭＧ＝
２７株を植菌し、２８°Ｃで３日間、好気的に培養した
。

培養終了後、１０，０００−で２０分間遠心分離して培
養液から菌体を除き、１党の上澄液を得た。この上澄液
を、等量の冷アセトン中に投入し、生じた沈殿を濾別し
、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解させ、−夜
４℃で同緩衝液に対して透析した。その後、生じた沈殿
を遠心分離して除き、上澄液を、ｐＨ４，０の５０１Ｍ
酢酸緩衝液で平衡化したｓｐ−ｈコバール６５０Ｍに吸
着させ、０．１〜０．５ＭＬｙ′）Ｎ通ＣＩを含む同上
緩衝液を用いる濃度勾配法によって酵素を溶出させた。

上記により溶出した活性画分（精製酵素１）を集め、ｐ
Ｈ５，５の１０ｍＭ酢酸緩衝液に対して一夜４℃で透析
したのち、ｐＨ５，５の５０＋ｅＭ酢酸緩衝液で平衡化
したＣＭ−トヨバール６５０Ｍに吸着後、０〜０．４Ｍ
のＮ＊Ｃｌを含む同上緩衝液を用いる濃度勾配法によっ
て酵素を溶出させた。

上記により溶出しｔ：活性画分（精製酵素■）を集め、
ｐＨ５，５の１０ｍＭ酢酸緩衝液に対して一夜４°Ｃで
透析した後、同上緩衝液で平衡化したトヨバールＨＷ−
５５Ｆのゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、０
．１Ｍ−ＮａＣ１を含む同上緩衝液で酵素を溶出させ、
活性画分（精製酵素■）を集めた。これにより、収率１
２％で、比活性が４５８倍に精製された酵素を得た。

以上の精製経過を表１に示す。

表１ 実施例２ グリチルリチン１％、グルコース１％、ポリペプトン１
％、酵母エキス０．３％を含むｐＨ６，０の培地１゜１
１に、クリプトコツカス・マグナスＭＧ−２７株を植菌
し、２８°Ｃで４日間培養した。培養終了後、遠心分離
して、菌体８５ｇを得た。この菌体のβ−グルクロニダ
ーゼ活性は、５１．１単位／ｇであった。

次いでこの菌体８０ｇをｐＨ６，５の１０鳳Ｍリン酸緩
衝液２００■ｌに懸濁し、溶菌酵素・ザイモリエイス２
０Ｔ（生化学工業株式会社）を０．８ｇ添加して４０℃
で１８時間反応させた。反応後、遠心分離して固形物を
除き、粗酵素液１２０１を得た。この粗酵素液のβ−グ
ルクロニダーゼ活性は、４．５４単位／１であった。

〔発明の効果〕

本発明による新規β−グルクロニダーゼは上述のような
特性のものであるから、特にグリチルリチンを加水分解
してグリチルレチン酸モノグルクロナイドヲ製造するた
めの酵素として使用するとグリチルレチン酸を副生ずる
ことなしにグリチルレチン酸モノグルクロナイドを高収
率で与える。したがって、この酵素により高品質のグリ
チルレチン酸モノグルクロナイド系甘味料を安価に製造
することが可能になる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ２−Ｏ−β−グルクロノシルグルクロン酸残基における
   グルクロン酸間グリコシド結合を加水分解するがフェノ
   ールフタレン−β−Ｄ−グルクロナイドにおけるグリコ
   シド結合には作用しない基質特異性を有する新規β−グ
   ルクロニダーゼ。