JPH04243899A - 第ｖｉｉｉ因子の精製およびこの方法で得られた第ｖｉｉｉ因子 - Google Patents
第ｖｉｉｉ因子の精製およびこの方法で得られた第ｖｉｉｉ因子Info
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- JPH04243899A JPH04243899A JP3166197A JP16619791A JPH04243899A JP H04243899 A JPH04243899 A JP H04243899A JP 3166197 A JP3166197 A JP 3166197A JP 16619791 A JP16619791 A JP 16619791A JP H04243899 A JPH04243899 A JP H04243899A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ヒトの血漿から第Ｖ
ＩＩＩ因子を精製する方法に関するもので、この方法は
、第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液を、イオン交換クロマ
トグラフィカラムで処理して、吸着された第ＶＩＩＩ因
子の高イオン性強生理食塩溶液のための平衡バッファお
よび溶出液として酸性ｐＨで作用させ、ついで安定剤お
よび必要に応じて抗蛋白分解酵素の存在下でこの溶出液
を集めることからなる。
ＩＩＩ因子を精製する方法に関するもので、この方法は
、第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液を、イオン交換クロマ
トグラフィカラムで処理して、吸着された第ＶＩＩＩ因
子の高イオン性強生理食塩溶液のための平衡バッファお
よび溶出液として酸性ｐＨで作用させ、ついで安定剤お
よび必要に応じて抗蛋白分解酵素の存在下でこの溶出液
を集めることからなる。
【０００２】
【従来の技術】Ａ型血友病の臓器代用療法において第Ｖ
ＩＩＩ因子によって達成される重要性の増加は、この物
質を多量に、そしてさらに高度に純粋に得ることを可能
にする方法の開発を強く要望するに至っている。基本的
には遠心分離、沈降、クロマトグラフィおよびろ過技術
にもとづいている従来の取得方法［Ｎ． Ｈｅｉｍｂｕ
ｒｇｅｒ， Ｈ．Ｓｃｈｗｉｎｎ， Ｐ． Ｇｒａｔｚ
， Ｇ． Ｌｕｂｅｎ， Ｇ． Ｋｕｍｐｅ および
Ｂ． Ｈｅｒｃｈｅｎｈａｍ： ”Ｆａｃｔｏｒ ＶＩ
ＩＩ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ， ｈｉｇｈｌｙ ｐｕ
ｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｈｅａｔ−ｔｒｅａｔｅｄ ｉ
ｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓ
ｃｈ．／Ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１ （１），
４， ６１９−６２２ （１９８１）； Ｓ，Ｗ．
Ｈｅｒｒｉｎｇ， Ｋ．Ｔ． Ｓｈｉｔａｎｉｓｈｉ，
Ｋ．Ｅ． Ｍｏｏｄｙ および Ｒ．Ｋ． Ｅｎｎｓ：
”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔ
ｏｒ ＶＩＩＩ：Ｃ ｂｙ ｐｒｅｐａｔａｔｉｖｅ
ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｉｚｅ−ｅｘｃ
ｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”Ｊ．
ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３２６： ２１
７−２２４ （１９８５）； Ｈ． Ｓｍｉｔｈ およ
び Ｄ． Ｗｏｌｔｅｒ： ”Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ−ｉｎ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｅｓ” Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃ
ｈ．／Ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９（ＩＩ） １
０ （１９８９）参照］によれば、蛋白質１ｍｇ当り通
常２から１００ Ｕ．Ｉ．第ＶＩＩＩ因子：Ｃの固有活
性を示す物質を得ることが可能であるが、いかなる場合
にも完全に満足すべきものではない。一方、免疫親和性
クロマトグラフィを使ったクローニングおよび（または
）精製法［Ｄ．Ｂ． Ｂｒｅｔｔｌｅｒ， Ａ．Ｄ．
Ｆｏｒｓｅｒｂｅｒｇ， Ｐ．Ｈ． Ｌｅｖｉｎｅ，
Ｊ． Ｆｅｔｉｌｌｏ， Ｋ． Ｌａｍｏｎ および
Ｊ． Ｓｕｌｌｉｖａｎ： ”Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ
：Ｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆ
ｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄ
ｉｅｓ” Ｂｌｏｏｄ， ７３， １８５９−１８６３
（１９８９）； Ｌ．Ｏ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ
． Ｆｏｒｓｍａｎ， Ｋ． Ｈｕａｎｇ， Ｋ． Ｌ
ａｒｓｅｎ， Ａ： Ｌｕｎｄｉｎ， Ｂ． Ｐａｖｌ
ｕ， Ｈ． Ｓａｎｄｂｅｒｇ， Ｋ． Ｓｅｗｅｒｉ
ｎ および Ｊ． Ｓｍａｒｔ： ”Ｉｓｏｌａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ
ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｅ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ ｉｎ
ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ， ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａ
ｔｅ ａｎｄｐｌａｓｍａ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３， ２９７９
−２９８３ （１９８６）； Ｍ． Ｍｏｒｆｉｎｉ，
Ｄ．Ｒａｆａｎｅｌｌｉ， Ｅ． Ｆｉｌｉｍｂｅｒ
ｔｉ， Ｓ． Ｃｉｏｎｏｔｔｉ， Ｅ． Ｐｉａｚｚ
ａ， Ｇ． Ｌｏｎｇｏ および Ｐ． Ｒｏｓｓｉ
Ｆｅｒｒｉｎｉ： ”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ
ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ， ｔｒｅａｔｅｄ ａｎｄ
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ” Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ， ５６， １６９−１７８ （１９８
９）参照］によれば、確かに注目すべき固有活性を有す
る生成物が得られるが、しかしこの方法は、ウィルス、
異型蛋白質および宿主細胞からのＤＮＡ残留物による汚
染という重大な欠点を示す。 すなわちこのような方法によって得られた物質は、完全
に精製し、そして投与前に汚染物質が存在しないことを
テストすることが必要である。したがって、高い固有活
性の物質を精製することが可能で、しかも上記のような
欠点のない方法を開発することの必要性が認識されてい
る。
ＩＩＩ因子によって達成される重要性の増加は、この物
質を多量に、そしてさらに高度に純粋に得ることを可能
にする方法の開発を強く要望するに至っている。基本的
には遠心分離、沈降、クロマトグラフィおよびろ過技術
にもとづいている従来の取得方法［Ｎ． Ｈｅｉｍｂｕ
ｒｇｅｒ， Ｈ．Ｓｃｈｗｉｎｎ， Ｐ． Ｇｒａｔｚ
， Ｇ． Ｌｕｂｅｎ， Ｇ． Ｋｕｍｐｅ および
Ｂ． Ｈｅｒｃｈｅｎｈａｍ： ”Ｆａｃｔｏｒ ＶＩ
ＩＩ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ， ｈｉｇｈｌｙ ｐｕ
ｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｈｅａｔ−ｔｒｅａｔｅｄ ｉ
ｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓ
ｃｈ．／Ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１ （１），
４， ６１９−６２２ （１９８１）； Ｓ，Ｗ．
Ｈｅｒｒｉｎｇ， Ｋ．Ｔ． Ｓｈｉｔａｎｉｓｈｉ，
Ｋ．Ｅ． Ｍｏｏｄｙ および Ｒ．Ｋ． Ｅｎｎｓ：
”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔ
ｏｒ ＶＩＩＩ：Ｃ ｂｙ ｐｒｅｐａｔａｔｉｖｅ
ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｉｚｅ−ｅｘｃ
ｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”Ｊ．
ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３２６： ２１
７−２２４ （１９８５）； Ｈ． Ｓｍｉｔｈ およ
び Ｄ． Ｗｏｌｔｅｒ： ”Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ−ｉｎ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｅｓ” Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃ
ｈ．／Ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９（ＩＩ） １
０ （１９８９）参照］によれば、蛋白質１ｍｇ当り通
常２から１００ Ｕ．Ｉ．第ＶＩＩＩ因子：Ｃの固有活
性を示す物質を得ることが可能であるが、いかなる場合
にも完全に満足すべきものではない。一方、免疫親和性
クロマトグラフィを使ったクローニングおよび（または
）精製法［Ｄ．Ｂ． Ｂｒｅｔｔｌｅｒ， Ａ．Ｄ．
Ｆｏｒｓｅｒｂｅｒｇ， Ｐ．Ｈ． Ｌｅｖｉｎｅ，
Ｊ． Ｆｅｔｉｌｌｏ， Ｋ． Ｌａｍｏｎ および
Ｊ． Ｓｕｌｌｉｖａｎ： ”Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ
：Ｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆ
ｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄ
ｉｅｓ” Ｂｌｏｏｄ， ７３， １８５９−１８６３
（１９８９）； Ｌ．Ｏ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ
． Ｆｏｒｓｍａｎ， Ｋ． Ｈｕａｎｇ， Ｋ． Ｌ
ａｒｓｅｎ， Ａ： Ｌｕｎｄｉｎ， Ｂ． Ｐａｖｌ
ｕ， Ｈ． Ｓａｎｄｂｅｒｇ， Ｋ． Ｓｅｗｅｒｉ
ｎ および Ｊ． Ｓｍａｒｔ： ”Ｉｓｏｌａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ
ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｅ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ ｉｎ
ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ， ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａ
ｔｅ ａｎｄｐｌａｓｍａ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３， ２９７９
−２９８３ （１９８６）； Ｍ． Ｍｏｒｆｉｎｉ，
Ｄ．Ｒａｆａｎｅｌｌｉ， Ｅ． Ｆｉｌｉｍｂｅｒ
ｔｉ， Ｓ． Ｃｉｏｎｏｔｔｉ， Ｅ． Ｐｉａｚｚ
ａ， Ｇ． Ｌｏｎｇｏ および Ｐ． Ｒｏｓｓｉ
Ｆｅｒｒｉｎｉ： ”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ
ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ， ｔｒｅａｔｅｄ ａｎｄ
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ” Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ， ５６， １６９−１７８ （１９８
９）参照］によれば、確かに注目すべき固有活性を有す
る生成物が得られるが、しかしこの方法は、ウィルス、
異型蛋白質および宿主細胞からのＤＮＡ残留物による汚
染という重大な欠点を示す。 すなわちこのような方法によって得られた物質は、完全
に精製し、そして投与前に汚染物質が存在しないことを
テストすることが必要である。したがって、高い固有活
性の物質を精製することが可能で、しかも上記のような
欠点のない方法を開発することの必要性が認識されてい
る。
【０００３】
【課題を解決するための手段】この発明方法によれば、
イオン交換クロマトグラフィ法を使用して、酸性ｐＨで
高イオン性強生理食塩溶液を適用し、これにより生物学
的活性を不安定にすることなしに不要な蛋白質の除去を
可能とすることによって、きわめて高い純度（３００
Ｕ．Ｉ．／ｍｇ蛋白質以上の固有活性）を有し、そして
前述のような欠点のない第ＶＩＩＩ因子を得ることが可
能である。 このような処理によれば、溶液の浸透性および濃度条件
が回復され、そしてこの溶液は公知の技術にしたがって
安定化およびパスツール殺菌される。この発明のクロマ
トグラフィ精製の方法は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆ
ａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような陰イ
オン交換樹脂、および１０−３０ ｍＭのトリス（Ｔｒ
ｉｓ）、１５０−３００ ｍＭのＮａＣｌ、５−１５
ｍＭのＣａＣｌ２からなるｐＨ６．４−６．８の平衡バ
ッファ（ＴＣ）を含むクロマトグラフィカラムを使用し
て行なわれる。クロマトグラフィは、２０−３０ ｃｍ
／ｈ（１／ ３／４のカラム比の直径／高さ比による）
の流量で、樹脂１ｍｌ当り１０−２０ｍｇの蛋白質をロ
ードさせて行なわれる。１．６−２ Ｕ．Ｉ．の固有活
性の第ＶＩＩＩ因子を含む溶液がカラムに供給され、未
結合の蛋白質およびフォン・ウィルブランド（ｖｏｎ
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子が、樹脂を前述のＴＣバッ
ファで洗浄することによって除去され、樹脂に吸着され
た第ＶＩＩＩ因子は、１０−３０ ｍＭのトリス（Ｔｒ
ｉｓ）、４５０−６００ｍＭのＮａＣｌ、５−１５ ｍ
ＭのＣａＣｌ２からなるｐＨ６．４−６．８の溶出バッ
ファ（ＴＥ）で溶出される。カラムから溶出された第Ｖ
ＩＩＩ因子が集められ、アルブミン５％
０．２−１．２５ ｍｇ／ｍｌ 溶出物ヘパリン
０．０２−０．１２５ Ｕ．Ｉ．／ｍｌ
溶出物ＰＥＧ４０００ ０．００６ ｍｇ／ｍ
ｌ 溶出物で、また必要に応じて抗蛋白分解酵素として
のリジンまたはヒスチジンの１０ ｍＭ溶液で安定化さ
れる。上記の方法によれば、出発物質について計算して
８０％以上の回収率で、溶液の純度を少なくとも１５０
倍にすることができる。安定化された溶出液は、濃縮さ
れ、透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）され、最終容
積が最初の容積の１／４になるまでさらに濃縮される。 ついでこの溶液は、０．７ ｇ／ｌ の最終濃度までＰ
ＥＧ４０００で安定化され、最後にそのままで冷凍され
、またはこの技術で公知の方法にしたがってパスツール
殺菌、脱塩、濃縮、小瓶への分配、および凍結乾燥（ｌ
ｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）を受ける。この発明方法
の他の利点および特徴は、下記の実施例を参照すること
によりさらによく理解されよう。
イオン交換クロマトグラフィ法を使用して、酸性ｐＨで
高イオン性強生理食塩溶液を適用し、これにより生物学
的活性を不安定にすることなしに不要な蛋白質の除去を
可能とすることによって、きわめて高い純度（３００
Ｕ．Ｉ．／ｍｇ蛋白質以上の固有活性）を有し、そして
前述のような欠点のない第ＶＩＩＩ因子を得ることが可
能である。 このような処理によれば、溶液の浸透性および濃度条件
が回復され、そしてこの溶液は公知の技術にしたがって
安定化およびパスツール殺菌される。この発明のクロマ
トグラフィ精製の方法は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆ
ａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような陰イ
オン交換樹脂、および１０−３０ ｍＭのトリス（Ｔｒ
ｉｓ）、１５０−３００ ｍＭのＮａＣｌ、５−１５
ｍＭのＣａＣｌ２からなるｐＨ６．４−６．８の平衡バ
ッファ（ＴＣ）を含むクロマトグラフィカラムを使用し
て行なわれる。クロマトグラフィは、２０−３０ ｃｍ
／ｈ（１／ ３／４のカラム比の直径／高さ比による）
の流量で、樹脂１ｍｌ当り１０−２０ｍｇの蛋白質をロ
ードさせて行なわれる。１．６−２ Ｕ．Ｉ．の固有活
性の第ＶＩＩＩ因子を含む溶液がカラムに供給され、未
結合の蛋白質およびフォン・ウィルブランド（ｖｏｎ
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子が、樹脂を前述のＴＣバッ
ファで洗浄することによって除去され、樹脂に吸着され
た第ＶＩＩＩ因子は、１０−３０ ｍＭのトリス（Ｔｒ
ｉｓ）、４５０−６００ｍＭのＮａＣｌ、５−１５ ｍ
ＭのＣａＣｌ２からなるｐＨ６．４−６．８の溶出バッ
ファ（ＴＥ）で溶出される。カラムから溶出された第Ｖ
ＩＩＩ因子が集められ、アルブミン５％
０．２−１．２５ ｍｇ／ｍｌ 溶出物ヘパリン
０．０２−０．１２５ Ｕ．Ｉ．／ｍｌ
溶出物ＰＥＧ４０００ ０．００６ ｍｇ／ｍ
ｌ 溶出物で、また必要に応じて抗蛋白分解酵素として
のリジンまたはヒスチジンの１０ ｍＭ溶液で安定化さ
れる。上記の方法によれば、出発物質について計算して
８０％以上の回収率で、溶液の純度を少なくとも１５０
倍にすることができる。安定化された溶出液は、濃縮さ
れ、透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）され、最終容
積が最初の容積の１／４になるまでさらに濃縮される。 ついでこの溶液は、０．７ ｇ／ｌ の最終濃度までＰ
ＥＧ４０００で安定化され、最後にそのままで冷凍され
、またはこの技術で公知の方法にしたがってパスツール
殺菌、脱塩、濃縮、小瓶への分配、および凍結乾燥（ｌ
ｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）を受ける。この発明方法
の他の利点および特徴は、下記の実施例を参照すること
によりさらによく理解されよう。
【０００４】
【実施例】第１ステージ：約２０００ ｌ の新鮮なヒ
ト血漿が、２０−３０℃の水冷ジャケットを装備した２
５００ ｌ の容器内で０−５℃にすることにより連続
的な攪拌下で解凍される。ロータの直径に応じて毎分１
４から２０ ｌ の間で変化する速度の隔膜ポンプで液
体が供給されたＷｅｓｔｆａｌｉａ型の低速遠心分離機
（６０００−８０００ ｒｐｍ）、またはＳｈａｒｐｌ
ｅｓ型の低速遠心分離機（１２０００−１７０００ ｒ
ｐｍ）での低温沈降によって、冷沈降物（ＣＰ）が集め
られる。得られた冷沈降物（収率８−１０ ｇｒ／ｌ）
は、直ちに次の精製処理を受けてもよく、あるいは約１
Ｋｇ に分割して厚さ２ ｃｍ のスラブに凍結（−
８０℃で）されてもよい。
ト血漿が、２０−３０℃の水冷ジャケットを装備した２
５００ ｌ の容器内で０−５℃にすることにより連続
的な攪拌下で解凍される。ロータの直径に応じて毎分１
４から２０ ｌ の間で変化する速度の隔膜ポンプで液
体が供給されたＷｅｓｔｆａｌｉａ型の低速遠心分離機
（６０００−８０００ ｒｐｍ）、またはＳｈａｒｐｌ
ｅｓ型の低速遠心分離機（１２０００−１７０００ ｒ
ｐｍ）での低温沈降によって、冷沈降物（ＣＰ）が集め
られる。得られた冷沈降物（収率８−１０ ｇｒ／ｌ）
は、直ちに次の精製処理を受けてもよく、あるいは約１
Ｋｇ に分割して厚さ２ ｃｍ のスラブに凍結（−
８０℃で）されてもよい。
【０００５】第２ステージ：冷沈降物が１キログラムず
つ、ゆっくり攪拌しながら約１時間にわたって２５−３
０℃で３−４倍の蒸留水に溶解され、最終溶液１ｍｌ当
り３−６０ Ｕ．Ｉ．ヘパリンからなる溶液とされる。 同じ温度に維持された水酸化アルミニウムの２％水懸濁
液が常時攪拌しながら溶液（１６０ ｍｌ／Ｋｇ冷沈降
物）に添加される。
つ、ゆっくり攪拌しながら約１時間にわたって２５−３
０℃で３−４倍の蒸留水に溶解され、最終溶液１ｍｌ当
り３−６０ Ｕ．Ｉ．ヘパリンからなる溶液とされる。 同じ温度に維持された水酸化アルミニウムの２％水懸濁
液が常時攪拌しながら溶液（１６０ ｍｌ／Ｋｇ冷沈降
物）に添加される。
【０００６】ついでポリエチレングリコール４０００（
ＰＥＧ）が２．５−４％の濃度で添加され、両者の接触
状態が、ゆるやかな攪拌下で約２０−３０分にわたって
維持される。この溶液のｐＨが１Ｎ酢酸で６．４−６．
６に調節され、ついでこの溶液は９−１０℃に冷却され
る。低速遠心分離機により、水酸化アルミニウムに吸着
された蛋白質、およびＰＥＧにより沈降された冷不溶蛋
白質が除去される。沈降物は廃棄物（これはフィブリノ
ーゲンおよびフィブリングルーのような他の蛋白質の精
製のための出発物質として使用することができる）であ
るが、上澄液、すなわち第ＶＩＩＩ因子溶液は次のステ
ージでさらに精製される。
ＰＥＧ）が２．５−４％の濃度で添加され、両者の接触
状態が、ゆるやかな攪拌下で約２０−３０分にわたって
維持される。この溶液のｐＨが１Ｎ酢酸で６．４−６．
６に調節され、ついでこの溶液は９−１０℃に冷却され
る。低速遠心分離機により、水酸化アルミニウムに吸着
された蛋白質、およびＰＥＧにより沈降された冷不溶蛋
白質が除去される。沈降物は廃棄物（これはフィブリノ
ーゲンおよびフィブリングルーのような他の蛋白質の精
製のための出発物質として使用することができる）であ
るが、上澄液、すなわち第ＶＩＩＩ因子溶液は次のステ
ージでさらに精製される。
【０００７】第３ステージ：通常の技術にしたがって得
られ、そして１−２ Ｕ．Ｉ．／ｍｇ 蛋白質の固有活
性を有する、前のステージで述べた溶液は、下記の特性
を有する陰イオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィ
カラムに供給された：ａ） カラムの直径／高さ比：
１／ ３／４；ｂ） 適用された樹脂：Ｑ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）；ｃ） 平衡バッファ（ＴＣ）：トリス ２０ｍＭ
，ＮａＣｌ ２５０ｍＭ，ＣａＣｌ２ １０ｍＭ，ｐＨ
６．６；ｄ） 流速２４．５ ｃｍ／ｈ（異なるク
ロマトグラフィ相について一定）；ｅ） １０−２０
蛋白質／ｍｌ 樹脂に対応する食養法１８−２０ Ｕ．
Ｉ．第ＶＩＩＩ因子／ｍｌ 樹脂。
られ、そして１−２ Ｕ．Ｉ．／ｍｇ 蛋白質の固有活
性を有する、前のステージで述べた溶液は、下記の特性
を有する陰イオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィ
カラムに供給された：ａ） カラムの直径／高さ比：
１／ ３／４；ｂ） 適用された樹脂：Ｑ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）；ｃ） 平衡バッファ（ＴＣ）：トリス ２０ｍＭ
，ＮａＣｌ ２５０ｍＭ，ＣａＣｌ２ １０ｍＭ，ｐＨ
６．６；ｄ） 流速２４．５ ｃｍ／ｈ（異なるク
ロマトグラフィ相について一定）；ｅ） １０−２０
蛋白質／ｍｌ 樹脂に対応する食養法１８−２０ Ｕ．
Ｉ．第ＶＩＩＩ因子／ｍｌ 樹脂。
【０００８】樹脂を３−５カラム容量のＴＣバッファで
洗浄することにより不結合蛋白質が除去される。樹脂上
に吸着された第ＶＩＩＩ因子は、４カラム容量の溶出液
バッファ、トリス ２０ｍＭ，ＮａＣｌ ２５０ｍＭ，
ＣａＣｌ２ １０ｍＭ，ｐＨ ６．６、で溶出される。 カラムから溶出された第ＶＩＩＩ因子溶液は、容器に集
められ、これに下記の安定剤が添加される。
洗浄することにより不結合蛋白質が除去される。樹脂上
に吸着された第ＶＩＩＩ因子は、４カラム容量の溶出液
バッファ、トリス ２０ｍＭ，ＮａＣｌ ２５０ｍＭ，
ＣａＣｌ２ １０ｍＭ，ｐＨ ６．６、で溶出される。 カラムから溶出された第ＶＩＩＩ因子溶液は、容器に集
められ、これに下記の安定剤が添加される。
【０００９】アルブミン５％ ０．
２−１．２５ ｍｇ／ｍｌ 溶出物ヘパリン
０．０２−０．１２５ Ｕ．Ｉ
．／ｍｌ 溶出物ＰＥＧ４０００
０．００６ ｍｇ／ｍｌ 溶出物ついでこの安
定化された溶出液は、１／２容に濃縮され、０．１Ｍグ
リセリン、０．１３Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ Ｎａ
３クエン酸塩バッファ、ｐＨ７の２容に対して透析ろ過
され、さらに超ろ過システムの膜が溶出液バッファＴＥ
と平衡するように注意しながら、１／２容（最終容量＝
出発容量の１／４）に濃縮された。超ろ過システムとし
て、カットオフ３０ Ｋｄおよび出発冷沈降物１ Ｋｇ
当り０．１−０．２ ｍ２以上の表面積を有する中空繊
維カートリッジが使用される。ＰＥＧ４０００で安定化
され、０．７ ｇｒ／ｌ の最終濃度とされた溶液は、
−８０℃で冷凍され、または通常の操作技術である以下
に記載するステージのように処理される。
２−１．２５ ｍｇ／ｍｌ 溶出物ヘパリン
０．０２−０．１２５ Ｕ．Ｉ
．／ｍｌ 溶出物ＰＥＧ４０００
０．００６ ｍｇ／ｍｌ 溶出物ついでこの安
定化された溶出液は、１／２容に濃縮され、０．１Ｍグ
リセリン、０．１３Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ Ｎａ
３クエン酸塩バッファ、ｐＨ７の２容に対して透析ろ過
され、さらに超ろ過システムの膜が溶出液バッファＴＥ
と平衡するように注意しながら、１／２容（最終容量＝
出発容量の１／４）に濃縮された。超ろ過システムとし
て、カットオフ３０ Ｋｄおよび出発冷沈降物１ Ｋｇ
当り０．１−０．２ ｍ２以上の表面積を有する中空繊
維カートリッジが使用される。ＰＥＧ４０００で安定化
され、０．７ ｇｒ／ｌ の最終濃度とされた溶液は、
−８０℃で冷凍され、または通常の操作技術である以下
に記載するステージのように処理される。
【００１０】第４ステージ：純粋な第ＶＩＩＩ因子の溶
液が、下記の溶液で安定化された。
液が、下記の溶液で安定化された。
【００１１】グリシン
６０ ｇｒ／ｋｇ 溶液、リシン
１４５．９ｇｒ／ｋｇ 溶液
、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２９４ ｇｒ／
ｋｇ 溶液、サッカロース
１．２ ｇｒ／ｋｇ 溶液。
６０ ｇｒ／ｋｇ 溶液、リシン
１４５．９ｇｒ／ｋｇ 溶液
、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２９４ ｇｒ／
ｋｇ 溶液、サッカロース
１．２ ｇｒ／ｋｇ 溶液。
【００１２】安定剤（上に挙げた）の添加の間、溶液の
ｐＨが調節され、ＮａＯＨ １Ｎで７．４５−７．５
５に維持された。もしこの段階で冷凍第ＶＩＩＩ因子が
使用されたならば、これはまず解凍し、２５℃にもたら
し、ついで安定化される前に約１時間にわたってこの温
度で攪拌する必要がある。この安定化された溶液は、サ
ッカロースの完全な溶解（完全に透明な溶液）を達成す
るために攪拌下で３５℃に約１時間維持され、その後６
０℃±１℃で１０時間にわたって殺菌される。殺菌後に
この溶液はゆっくり（５０℃まで少なくとも１５分）と
冷却され、ついで０．１３Ｍ ＮａＣｌ、０．１ Ｍ
グリシンバッファ、ｐＨ ７．１ ｑ１（ＴＦ）で１：
１（ｖ／ｖ）に希釈される。
ｐＨが調節され、ＮａＯＨ １Ｎで７．４５−７．５
５に維持された。もしこの段階で冷凍第ＶＩＩＩ因子が
使用されたならば、これはまず解凍し、２５℃にもたら
し、ついで安定化される前に約１時間にわたってこの温
度で攪拌する必要がある。この安定化された溶液は、サ
ッカロースの完全な溶解（完全に透明な溶液）を達成す
るために攪拌下で３５℃に約１時間維持され、その後６
０℃±１℃で１０時間にわたって殺菌される。殺菌後に
この溶液はゆっくり（５０℃まで少なくとも１５分）と
冷却され、ついで０．１３Ｍ ＮａＣｌ、０．１ Ｍ
グリシンバッファ、ｐＨ ７．１ ｑ１（ＴＦ）で１：
１（ｖ／ｖ）に希釈される。
【００１３】第５ステージ：この希釈された溶液は、最
初の容積（安定化の前）まで、カットオフ３０ Ｋｄお
よび出発冷沈降物１ Ｋｇ当り０．１−０．２ ｍ２以
上の表面積を有する中空繊維超ろ過システムによって濃
縮される。ついで安定剤が除去され、この溶液の生理学
的状態が、２．５容のバッファＴＦに対する透析ろ過に
よって再確立される。この最終溶液は、所望のＵ．Ｉ．
／ｍｌ値まで濃縮され、清澄化フィルタでろ過され、つ
いで孔径０．２μの滅菌フィルタで滅菌される。その後
、この滅菌された溶液は、無菌的に小瓶に分けられ、−
４０℃で冷凍される。 ついで小瓶は、低圧で、−４０℃から＋３０℃までのゆ
っくりとした温度上昇により解凍（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚ
ｅ）される。この発明方法によって得られた第ＶＩＩＩ
因子の特性が表Ｉに示される。表 ＩＩＵ．Ｉ．
第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／ｍｌ
１００ − １２０ Ｕ．Ｉ．／ｍｌ全蛋白
質
４．９ − ５．３ ｍｇ／ｍｌ安定剤として添加さ
れたアルブミン ４．８ − ５．０ ｍｇ／ｍｌ残留
蛋白質 ０．１ − ０．３
ｍｇ／ｍｌ安定化前の固有活性、Ｕ．Ｉ． ＶＩＩＩ：
Ｃ／蛋白質
３００ − １２００アルブミン安定化後の固有活性
１８ − ２４Ｕ．Ｉ． ｖｏｎ
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ抗原（ｖＷ：ＲＡｇ） ＜ ２
５ Ｕ．Ｉ．／ｍｌｖＷ：ＲＡｇ／ＶＩＩＩ：Ｃ比
＜ ０．４フィブリノーゲン含有量
＜０．０６ ｍｇ／ｍｌフィブロ
ネクチン含有量 ＜ ０．０
０１ ｍｇ／ｍｌＩｇＧ含有量
＜ ０．００４ ｍｇ／ｍｌＩｇＡ含有量
＜ ０．００５ ｍｇ／ｍｌＩｇＭ
含有量 ＜ ０．００２ ｍ
ｇ／ｍｌ
初の容積（安定化の前）まで、カットオフ３０ Ｋｄお
よび出発冷沈降物１ Ｋｇ当り０．１−０．２ ｍ２以
上の表面積を有する中空繊維超ろ過システムによって濃
縮される。ついで安定剤が除去され、この溶液の生理学
的状態が、２．５容のバッファＴＦに対する透析ろ過に
よって再確立される。この最終溶液は、所望のＵ．Ｉ．
／ｍｌ値まで濃縮され、清澄化フィルタでろ過され、つ
いで孔径０．２μの滅菌フィルタで滅菌される。その後
、この滅菌された溶液は、無菌的に小瓶に分けられ、−
４０℃で冷凍される。 ついで小瓶は、低圧で、−４０℃から＋３０℃までのゆ
っくりとした温度上昇により解凍（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚ
ｅ）される。この発明方法によって得られた第ＶＩＩＩ
因子の特性が表Ｉに示される。表 ＩＩＵ．Ｉ．
第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／ｍｌ
１００ − １２０ Ｕ．Ｉ．／ｍｌ全蛋白
質
４．９ − ５．３ ｍｇ／ｍｌ安定剤として添加さ
れたアルブミン ４．８ − ５．０ ｍｇ／ｍｌ残留
蛋白質 ０．１ − ０．３
ｍｇ／ｍｌ安定化前の固有活性、Ｕ．Ｉ． ＶＩＩＩ：
Ｃ／蛋白質
３００ − １２００アルブミン安定化後の固有活性
１８ − ２４Ｕ．Ｉ． ｖｏｎ
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ抗原（ｖＷ：ＲＡｇ） ＜ ２
５ Ｕ．Ｉ．／ｍｌｖＷ：ＲＡｇ／ＶＩＩＩ：Ｃ比
＜ ０．４フィブリノーゲン含有量
＜０．０６ ｍｇ／ｍｌフィブロ
ネクチン含有量 ＜ ０．０
０１ ｍｇ／ｍｌＩｇＧ含有量
＜ ０．００４ ｍｇ／ｍｌＩｇＡ含有量
＜ ０．００５ ｍｇ／ｍｌＩｇＭ
含有量 ＜ ０．００２ ｍ
ｇ／ｍｌ
Claims (16)
- 【請求項１】 ヒトの血漿から第ＶＩＩＩ因子を精製
する方法であって、第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液を、
吸着された第ＶＩＩＩ因子のための平衡バッファとして
、および溶出液として、高イオン強度生理食塩水を適用
したイオン交換クロマトグラフィカラムで処理すること
、および安定剤および必要に応じて抗蛋白分解酵素の存
在下で前記溶出液を捕集すること、を特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記イオン交換クロマトグラフィカラ
ムが陰イオン交換樹脂からなっている請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 前記イオン交換樹脂が第４級アミン基
を有している請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記平衡バッファが、１０−３０ ｍ
Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０−３００ ｍＭのＮａ
Ｃｌ、５−１５ ｍＭのＣａＣｌ２からなり、ｐＨが６
．４−６．８である請求項１〜３のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項５】 前記平衡バッファが、２０ ｍＭのト
リス（Ｔｒｉｓ）、２５０ ｍＭのＮａＣｌ、１０ ｍ
ＭのＣａＣｌ２からなり、ｐＨが６．６である請求項４
記載の方法。 - 【請求項６】 前記第ＶＩＩＩ因子のための溶出液が
、１０−３０ ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、４５０−６
５０ ｍＭのＮａＣｌ、５−１５ ｍＭのＣａＣｌ２か
らなり、ｐＨが６．４−６．８である請求項１〜５のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記第ＶＩＩＩ因子のための溶出液が
、２０ ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、５５０ ｍＭのＮ
ａＣｌ、１０ ｍＭのＣａＣｌ２からなり、ｐＨが６．
６である請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 溶出された第ＶＩＩＩ因子が、アルブ
ミン５％ ０．２−１．２５ ｍｇ
／ｍｌ 溶出物ヘパリン ０．０２−０
．１２５ Ｕ．Ｉ．／ｍｌ 溶出物ＰＥＧ４０００
０．００６ ｍｇ／ｍｌ 溶
出物および必要に応じて抗蛋白分解酵素で安定化されて
いる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 前記抗蛋白分解酵素としてリシンまた
はヒスチジンが使用される請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 前記抗蛋白分解酵素が１０ ｍＭの
濃度で使用される請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか１項に記
載の方法であって、Ａ） 新鮮な冷凍ヒト血漿が、攪
拌下で解凍され、遠心分離により冷沈降物を集めること
、Ｂ） 前記冷沈降物が、蒸留され、ヘパリン化され
た水に溶解され、この溶液が水酸化アルミニウム懸濁液
で、ついでＰＥＧ４０００で処理され、そのｐＨが１Ｎ
酢酸で６．４−６．６の値に調節され、その後この溶液
が９−１１℃に冷却され、ついで水酸化アルミニウムに
吸着された蛋白質および沈降物が遠心分離により除去さ
れること、Ｃ） 上記工程で得られた上澄液が、陰イ
オン交換樹脂を含むクロマトグラフィカラムで、２０
ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、２５０ ｍＭのＮａＣｌ、
１０ ｍＭのＣａＣｌ２からなり、ｐＨが６．６の平衡
バッファを使って処理され、ついで不要の蛋白質をなく
すために前記樹脂が上記バッファで洗浄され、つぎにｖ
ｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子および第ＶＩＩＩ因子
が、２０ ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、５５０ ｍＭの
ＮａＣｌ、１０ ｍＭのＣａＣｌ２からなり、ｐＨが６
．６による溶出により回収され、得られた第ＶＩＩＩ因
子が、アルブミン５％ ０．２−１
．２５ ｍｇ／ｍｌ 溶出物ヘパリン
０．０２−０．１２５ Ｕ．Ｉ．／ｍ
ｌ 溶出物ＰＥＧ４０００
０．００６ ｍｇ／ｍｌ 溶出物で安定化され、得ら
れた溶出物が濃縮され、透析ろ過され、さらに濃縮（最
終容積＝出発容積の１／４）されること、Ｄ） この
第ＶＩＩＩ因子溶液が殺菌および濃縮され、小瓶に分け
られ、冷凍されること、からなる方法。 - 【請求項１２】 前記平衡バッファが、２０ ｍＭの
トリス（Ｔｒｉｓ）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ ｍ
ＭのＣａＣｌ２からなり、ｐＨが６．６である請求項１
１記載の方法。 - 【請求項１３】 第ＶＩＩＩ因子のための溶出バッフ
ァが、２０ ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、５５０ ｍＭ
のＮａＣｌ、１０ ｍＭのＣａＣｌ２からなり、ｐＨが
６．６である請求項１１記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか１項に記
載の方法にしたがって得られた第ＶＩＩＩ因子。 - 【請求項１５】 ３００ Ｕ．Ｉ．／ｍｇ蛋白質以上
の固有活性を有する請求項１４記載の第ＶＩＩＩ因子。 - 【請求項１６】 Ａ型血友病の臓器代用療法に有用な
医薬組成物のための請求項１４または１５に記載の第Ｖ
ＩＩＩ因子の使用。
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