JPH04244015A - ハイブリッド型人工膵臓の製造方法 - Google Patents
ハイブリッド型人工膵臓の製造方法Info
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- JPH04244015A JPH04244015A JP3032877A JP3287791A JPH04244015A JP H04244015 A JPH04244015 A JP H04244015A JP 3032877 A JP3032877 A JP 3032877A JP 3287791 A JP3287791 A JP 3287791A JP H04244015 A JPH04244015 A JP H04244015A
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- agarose
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、膵臓の機能が冒された
り、低下している糖尿病患者に対し、膵臓の機能を代行
するための人工膵臓の製造方法に関し、特に、ハイブリ
ッド型の人工膵臓の製造方法に関する。
り、低下している糖尿病患者に対し、膵臓の機能を代行
するための人工膵臓の製造方法に関し、特に、ハイブリ
ッド型の人工膵臓の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、糖尿病の治療には、インスリン製
剤が用いられている。すなわち、前もって測定された患
者の血中グルコース濃度に応じて必要量のインスリン製
剤を投与する方法が用いられている。しかしながら、患
者の血中グルコース濃度の連続的な変化に応じてインス
リンを投与することはできないため、患者のグルコース
代謝を生理的にコントロールすることができない。従っ
て、血管障害や腎臓障害等の糖尿病の併発症を防止する
ことは難しい。
剤が用いられている。すなわち、前もって測定された患
者の血中グルコース濃度に応じて必要量のインスリン製
剤を投与する方法が用いられている。しかしながら、患
者の血中グルコース濃度の連続的な変化に応じてインス
リンを投与することはできないため、患者のグルコース
代謝を生理的にコントロールすることができない。従っ
て、血管障害や腎臓障害等の糖尿病の併発症を防止する
ことは難しい。
【０００３】そこで、新たな治療法として、ハイブリッ
ド型人工膵臓が注目を集めている。ハイブリッド型人工
膵臓とは、インスリンを分泌する組織、すなわち膵ラン
ゲルハンス島（以下、膵ラ島と略す。）を、半透膜内に
包括固定化し、患者の生体防御系（免疫系等）から隔離
したあと移植して用いられるものである。ハイブリッド
型人工膵臓において膵ラ島を封入する材料として、種々
の材料が検討されている。例えば、Ｓｕｎらは、アルギ
ン酸−ポリリジン−アルギン酸のポリイオンコンプレッ
クスの三層構造からなる材料で膵ラ島を包括固定化して
いる（Ｇ．Ｍ．Ｏ’ＳＨＥＡ ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓ
ｕｎ，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，３５，９４３（１９８６））
。
ド型人工膵臓が注目を集めている。ハイブリッド型人工
膵臓とは、インスリンを分泌する組織、すなわち膵ラン
ゲルハンス島（以下、膵ラ島と略す。）を、半透膜内に
包括固定化し、患者の生体防御系（免疫系等）から隔離
したあと移植して用いられるものである。ハイブリッド
型人工膵臓において膵ラ島を封入する材料として、種々
の材料が検討されている。例えば、Ｓｕｎらは、アルギ
ン酸−ポリリジン−アルギン酸のポリイオンコンプレッ
クスの三層構造からなる材料で膵ラ島を包括固定化して
いる（Ｇ．Ｍ．Ｏ’ＳＨＥＡ ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓ
ｕｎ，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，３５，９４３（１９８６））
。
【０００４】他方、岩田らは、アガロースおよびアガロ
ース分解物により膵ラ島を包括固定化している〔岩田博
夫，雨宮 浩，松田武久，林 良輔，高野久輝，阿
久津哲造，人工臓器，１６，１２６３（１９８７）およ
び特開昭６２−２１５５３０〕。
ース分解物により膵ラ島を包括固定化している〔岩田博
夫，雨宮 浩，松田武久，林 良輔，高野久輝，阿
久津哲造，人工臓器，１６，１２６３（１９８７）およ
び特開昭６２−２１５５３０〕。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のようなハイブリ
ッド型人工膵臓を用いて同種移植を行ったところ、長期
間の生着が認められたが、異種移植を行った場合にはい
ずれのハイブリッド型人工膵臓を用いたとしても、再現
性に優れかつ長期間にわたり人工膵臓としての機能を果
たすものは得られず、低血糖で患者が死亡したり、免疫
反応等により拒絶される場合があった。
ッド型人工膵臓を用いて同種移植を行ったところ、長期
間の生着が認められたが、異種移植を行った場合にはい
ずれのハイブリッド型人工膵臓を用いたとしても、再現
性に優れかつ長期間にわたり人工膵臓としての機能を果
たすものは得られず、低血糖で患者が死亡したり、免疫
反応等により拒絶される場合があった。
【０００６】本発明の目的は、上述した従来のハイブリ
ッド型人工膵臓の問題を解消するものであり、異種移植
を行った場合でも、長期間に渡って血糖値を正常化させ
ることができ、また低血糖による死亡等を防止すること
が可能なハイブリッド型人工膵臓の製造方法を提供する
ことにある。
ッド型人工膵臓の問題を解消するものであり、異種移植
を行った場合でも、長期間に渡って血糖値を正常化させ
ることができ、また低血糖による死亡等を防止すること
が可能なハイブリッド型人工膵臓の製造方法を提供する
ことにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、膵ラ島を天然
及び／または合成高分子からなる固定化材料により包括
固定化し、次に５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養す
ることを特徴とするハイブリッド型人工膵臓の製造方法
である。本発明において、膵ラ島は、天然及び／または
合成高分子からなる固定化材料に包括固定化される。本
発明において用いられる天然及び／または合成高分子か
らなる固定化材料は、グルコース等の栄養素や膵ラ島か
ら分泌されたインスリンを透過させる必要があるため、
並びに移植する際に膵ラ島が免疫担当細胞等と接触する
ことを防ぐための充分な機械的強度を必要とする。
及び／または合成高分子からなる固定化材料により包括
固定化し、次に５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養す
ることを特徴とするハイブリッド型人工膵臓の製造方法
である。本発明において、膵ラ島は、天然及び／または
合成高分子からなる固定化材料に包括固定化される。本
発明において用いられる天然及び／または合成高分子か
らなる固定化材料は、グルコース等の栄養素や膵ラ島か
ら分泌されたインスリンを透過させる必要があるため、
並びに移植する際に膵ラ島が免疫担当細胞等と接触する
ことを防ぐための充分な機械的強度を必要とする。
【０００８】このような天然高分子からなる固定化材料
としては、例えば、アガロース、アガロース分解物、κ
−カラギーナン、コラーゲン、ゼラチン、ジェランガム
、アラビアゴム、キサンタンゴム、アルギン酸塩、ペク
チン、寒天、マンナン、フィブリン、キトサン等があり
、合成高分子からなる固定化材料としては、例えば、光
架橋性ポリビニルアルコール、イソプロピルアクリルア
ミド共重合体、ポリアクリルアミド等がある。更に天然
及び合成高分子からなる固定化材料としては、例えば、
アルギン酸−ポリリジン、カルボキシメチルセルロース
−ポリリジンのようなポリイオンコンプレックス等があ
る。このように天然及び／または合成高分子からなる固
定化材料としては、膵ラ島を生きた状態で固定化するこ
とが可能な材料ならばどのようなものでもよい。また、
これらの固定化材料の２種以上を併用して使用すること
も可能である。これらの固定化材料について、更に説明
すると、例えばアガロースは、通常、寒天中に含まれる
ものであり、また、該アガロースを酸などにより分解す
ることによりアガロース分解物を得ることができる。ま
た、光架橋性ポリビニルアルコールは、ポリビニルアル
コールに、感光性官能基であるスチリルピリジニウム基
またはスチリルキノリウム基を結合させたものであり、
既に市販されており、例えば東洋合成工業から入手する
ことができる。
としては、例えば、アガロース、アガロース分解物、κ
−カラギーナン、コラーゲン、ゼラチン、ジェランガム
、アラビアゴム、キサンタンゴム、アルギン酸塩、ペク
チン、寒天、マンナン、フィブリン、キトサン等があり
、合成高分子からなる固定化材料としては、例えば、光
架橋性ポリビニルアルコール、イソプロピルアクリルア
ミド共重合体、ポリアクリルアミド等がある。更に天然
及び合成高分子からなる固定化材料としては、例えば、
アルギン酸−ポリリジン、カルボキシメチルセルロース
−ポリリジンのようなポリイオンコンプレックス等があ
る。このように天然及び／または合成高分子からなる固
定化材料としては、膵ラ島を生きた状態で固定化するこ
とが可能な材料ならばどのようなものでもよい。また、
これらの固定化材料の２種以上を併用して使用すること
も可能である。これらの固定化材料について、更に説明
すると、例えばアガロースは、通常、寒天中に含まれる
ものであり、また、該アガロースを酸などにより分解す
ることによりアガロース分解物を得ることができる。ま
た、光架橋性ポリビニルアルコールは、ポリビニルアル
コールに、感光性官能基であるスチリルピリジニウム基
またはスチリルキノリウム基を結合させたものであり、
既に市販されており、例えば東洋合成工業から入手する
ことができる。
【０００９】本発明において、膵ラ島としては、人、牛
、豚、ハムスターまたはマウスなどから単離したものを
適宜使用することができる。単離方法は、摘出した膵臓
を、コラゲナーゼにより一定時間消化し、しかる後、比
重遠心法により分別して膵ラ島を回収する。本発明では
、回収した膵ラ島を天然及び／または合成高分子からな
る固定化材料により包括固定化する。
、豚、ハムスターまたはマウスなどから単離したものを
適宜使用することができる。単離方法は、摘出した膵臓
を、コラゲナーゼにより一定時間消化し、しかる後、比
重遠心法により分別して膵ラ島を回収する。本発明では
、回収した膵ラ島を天然及び／または合成高分子からな
る固定化材料により包括固定化する。
【００１０】包括固定化法としては、例えばアガロース
、アガロース分解物、κ−カラギーナンやイソプロピル
アクリルアミド共重合体等では、膵ラ島を固定化材料溶
液に分散し、温度変化によりゲル化させて包括固定化す
る。以下、具体的に例を挙げてこの包括固定化法を説明
する。アガロースまたはアガロース分解物で膵ラ島を包
括固定化する場合は、アガロースまたはアガロース分解
物を、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地のような適当な培地成
分を含有する水溶液中に、好ましくは１〜３０重量％、
さらに好ましくは２〜２０重量％の範囲となるように分
散させる。この分散液を、加熱溶融後、温度４０℃近辺
まで冷却し、これに回収した膵ラ島を分散させる。 得られた分散液に、流動パラフィン等の水と混合しない
疎水性の液体を加えて充分に攪拌し、アガロースまたは
アガロース分解物溶液を懸濁させる。次に、懸濁液を冷
却することにより、アガロースまたはアガロース分解物
溶液をゲル化させる。この場合、懸濁液の凝集を防止す
るために、攪拌しつつ冷却する。次に、ハンクス液のよ
うなｐＨが中性付近の緩衝液を加えた後、遠心分離し、
下層に沈んだアガロースまたはアガロース分解物のマイ
クロカプセルを回収する。このようにして、膵ラ島が包
括固定化された、数１０μｍ〜数ｍｍ程度の粒径のマイ
クロカプセル形状のハイブリッド型人工膵臓を得ること
ができる。
、アガロース分解物、κ−カラギーナンやイソプロピル
アクリルアミド共重合体等では、膵ラ島を固定化材料溶
液に分散し、温度変化によりゲル化させて包括固定化す
る。以下、具体的に例を挙げてこの包括固定化法を説明
する。アガロースまたはアガロース分解物で膵ラ島を包
括固定化する場合は、アガロースまたはアガロース分解
物を、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地のような適当な培地成
分を含有する水溶液中に、好ましくは１〜３０重量％、
さらに好ましくは２〜２０重量％の範囲となるように分
散させる。この分散液を、加熱溶融後、温度４０℃近辺
まで冷却し、これに回収した膵ラ島を分散させる。 得られた分散液に、流動パラフィン等の水と混合しない
疎水性の液体を加えて充分に攪拌し、アガロースまたは
アガロース分解物溶液を懸濁させる。次に、懸濁液を冷
却することにより、アガロースまたはアガロース分解物
溶液をゲル化させる。この場合、懸濁液の凝集を防止す
るために、攪拌しつつ冷却する。次に、ハンクス液のよ
うなｐＨが中性付近の緩衝液を加えた後、遠心分離し、
下層に沈んだアガロースまたはアガロース分解物のマイ
クロカプセルを回収する。このようにして、膵ラ島が包
括固定化された、数１０μｍ〜数ｍｍ程度の粒径のマイ
クロカプセル形状のハイブリッド型人工膵臓を得ること
ができる。
【００１１】また、アルギン酸塩やキトサン等では、膵
ラ島を固定化材料溶液に分散し、イオン架橋によりゲル
化させて包括固定化する。また、光架橋性ポリビニルア
ルコールの場合には、この光架橋性ポリビニルアルコー
ルは、重合度が１００〜５０００以下のものが好ましく
、このものの水溶液に膵ラ島を分散させる。次に、膵ラ
島を分散させた光架橋性ポリビニルアルコール水溶液を
光架橋させて、ゲル化させることにより膵ラ島を包括固
定化する。以下、具体的にこの包括固定化法を説明する
。光架橋性ポリビニルアルコールを、このポリマー濃度
が好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは２〜３
０重量％となるように、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地
等の適当な培地成分が含有された水溶液中に溶解させる
。この際、室温で溶解しない場合には、加熱して溶解さ
せる。この水溶液に、回収した膵ラ島を分散させる。 得られた分散液に、流動パラフィン等の水と混合しない
疎水性の液体を加えて充分に攪拌し、光架橋性ポリビニ
ルアルコール溶液を懸濁させる。次に、光を照射するこ
とにより、光架橋性ポリビニルアルコール溶液をゲル化
させる。この場合、懸濁液の凝集を防止するために、攪
拌しつつ光照射する。次に、ハンクス液のようなｐＨが
中性付近の緩衝液を加え、遠心分離し、下層に沈んだ光
架橋性ポリビニルアルコールのマイクロカプセルを回収
する。このようにして、膵ラ島が包括固定化された、数
１０μｍ〜数ｍｍ程度のマイクロカプセル形状のハイブ
リッド型人工膵臓を得ることができる。
ラ島を固定化材料溶液に分散し、イオン架橋によりゲル
化させて包括固定化する。また、光架橋性ポリビニルア
ルコールの場合には、この光架橋性ポリビニルアルコー
ルは、重合度が１００〜５０００以下のものが好ましく
、このものの水溶液に膵ラ島を分散させる。次に、膵ラ
島を分散させた光架橋性ポリビニルアルコール水溶液を
光架橋させて、ゲル化させることにより膵ラ島を包括固
定化する。以下、具体的にこの包括固定化法を説明する
。光架橋性ポリビニルアルコールを、このポリマー濃度
が好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは２〜３
０重量％となるように、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地
等の適当な培地成分が含有された水溶液中に溶解させる
。この際、室温で溶解しない場合には、加熱して溶解さ
せる。この水溶液に、回収した膵ラ島を分散させる。 得られた分散液に、流動パラフィン等の水と混合しない
疎水性の液体を加えて充分に攪拌し、光架橋性ポリビニ
ルアルコール溶液を懸濁させる。次に、光を照射するこ
とにより、光架橋性ポリビニルアルコール溶液をゲル化
させる。この場合、懸濁液の凝集を防止するために、攪
拌しつつ光照射する。次に、ハンクス液のようなｐＨが
中性付近の緩衝液を加え、遠心分離し、下層に沈んだ光
架橋性ポリビニルアルコールのマイクロカプセルを回収
する。このようにして、膵ラ島が包括固定化された、数
１０μｍ〜数ｍｍ程度のマイクロカプセル形状のハイブ
リッド型人工膵臓を得ることができる。
【００１２】アルギン酸−ポリリジン等のイオンコンプ
レックスの場合には、膵ラ島をゲル化することのできる
負電荷の水溶性物質（この場合アルギン酸塩）に包括固
定化し、さらにこの周囲に耐久性のある正電荷の膜（こ
の場合ポリリジン）を形成させ、包括固定化する。以下
、具体的に例を挙げて、この包括固定化法を説明する。 アルギン酸ナトリウム溶液に、回収した膵ラ島を分散さ
せる。これを塩化カルシウム溶液に滴下して、ゲル化し
たアルギン酸カルシウム粒子を回収する。さらにこのゲ
ル化した粒子を分子量約１５０００〜約２５０００のポ
リリジンを含む生理食塩水に浸漬してゲル粒子の表面に
ポリリジン膜を形成させる。更に、アルギン酸ナトリウ
ム溶液にこの粒子を浸漬し、ポリリジン膜の表面にアル
ギン酸塩膜を形成させる。次にこの粒子をクエン酸ナト
リウム緩衝液で処理して、内部のアルギン酸カルシウム
を溶解させて、膵ラ島が包括固定化された、数１０μｍ
〜数ｍｍ程度の粒径のマイクロカプセル形状のハイブリ
ッド型人工膵臓を得ることができる。
レックスの場合には、膵ラ島をゲル化することのできる
負電荷の水溶性物質（この場合アルギン酸塩）に包括固
定化し、さらにこの周囲に耐久性のある正電荷の膜（こ
の場合ポリリジン）を形成させ、包括固定化する。以下
、具体的に例を挙げて、この包括固定化法を説明する。 アルギン酸ナトリウム溶液に、回収した膵ラ島を分散さ
せる。これを塩化カルシウム溶液に滴下して、ゲル化し
たアルギン酸カルシウム粒子を回収する。さらにこのゲ
ル化した粒子を分子量約１５０００〜約２５０００のポ
リリジンを含む生理食塩水に浸漬してゲル粒子の表面に
ポリリジン膜を形成させる。更に、アルギン酸ナトリウ
ム溶液にこの粒子を浸漬し、ポリリジン膜の表面にアル
ギン酸塩膜を形成させる。次にこの粒子をクエン酸ナト
リウム緩衝液で処理して、内部のアルギン酸カルシウム
を溶解させて、膵ラ島が包括固定化された、数１０μｍ
〜数ｍｍ程度の粒径のマイクロカプセル形状のハイブリ
ッド型人工膵臓を得ることができる。
【００１３】包括固定化する形状としては、１個あるい
は数個の膵ラ島を包括固定化した数１０μｍから数ｍｍ
程度の粒径のマイクロカプセルタイプ、膵ラ島を数十か
ら数千個まとめて固定化したタブレットタイプあるいは
糸状に成形したもの等、いずれの形状でもよい。本発明
では、上記のようにして得られたハイブリッド型人工膵
臓を、５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養する。例
えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ−５〜１０％牛胎児血
清またはＲＰＭＩ−１６４０−５〜１０％牛胎児血清等
にハイブリッド型人工膵臓を入れ、０〜４１℃で５％Ｃ
Ｏ２下で５日間以上、好ましくは、２０〜４０℃で５％
ＣＯ２ 下で２０日以上にわたり培養する。最後に、良
い状態の膵ラ島を含むハイブリッド型人工膵臓のみを回
収し、移植に適したハイブリッド型人工膵臓を得ること
ができる。
は数個の膵ラ島を包括固定化した数１０μｍから数ｍｍ
程度の粒径のマイクロカプセルタイプ、膵ラ島を数十か
ら数千個まとめて固定化したタブレットタイプあるいは
糸状に成形したもの等、いずれの形状でもよい。本発明
では、上記のようにして得られたハイブリッド型人工膵
臓を、５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養する。例
えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ−５〜１０％牛胎児血
清またはＲＰＭＩ−１６４０−５〜１０％牛胎児血清等
にハイブリッド型人工膵臓を入れ、０〜４１℃で５％Ｃ
Ｏ２下で５日間以上、好ましくは、２０〜４０℃で５％
ＣＯ２ 下で２０日以上にわたり培養する。最後に、良
い状態の膵ラ島を含むハイブリッド型人工膵臓のみを回
収し、移植に適したハイブリッド型人工膵臓を得ること
ができる。
【００１４】
【作用】膵ラ島を単離し、かつ包括固定化した後に、す
ぐに移植を行った場合、これらの操作によりダメージを
受けた膵ラ島も移植されることになる。その結果、ダメ
ージを受けた膵ラ島から多量のインスリンおよび免疫原
性の物質が放出され、移植された動物が低血糖状態とな
り死亡したり、膵ラ島が免疫拒絶されることがある。こ
れに対して、本発明では、封入操作後５日間以上ｉｎ
ｖｉｔｒｏにて培養するため、この培養操作により、
ダメージを受けた膵ラ島が修復され、あるいは脱落する
。 従って、５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養するこ
とにより、正常に機能している膵ラ島のみを含有するハ
イブリッド型人工膵臓を回収することができるため、該
ハイブリッド型人工膵臓を移植することにより、ダメー
ジを受けた膵ラ島に基づく問題点を解消することができ
る。
ぐに移植を行った場合、これらの操作によりダメージを
受けた膵ラ島も移植されることになる。その結果、ダメ
ージを受けた膵ラ島から多量のインスリンおよび免疫原
性の物質が放出され、移植された動物が低血糖状態とな
り死亡したり、膵ラ島が免疫拒絶されることがある。こ
れに対して、本発明では、封入操作後５日間以上ｉｎ
ｖｉｔｒｏにて培養するため、この培養操作により、
ダメージを受けた膵ラ島が修復され、あるいは脱落する
。 従って、５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養するこ
とにより、正常に機能している膵ラ島のみを含有するハ
イブリッド型人工膵臓を回収することができるため、該
ハイブリッド型人工膵臓を移植することにより、ダメー
ジを受けた膵ラ島に基づく問題点を解消することができ
る。
【００１５】
【発明の効果】よって、本発明によれば、膵ラ島を天然
及び／または合成高分子からなる固定化材料により包括
固定化し、５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するも
のであるため、ダメージを受けた膵ラ島に起因する問題
点を解消することができ、移植を受けた動物が低血糖状
態に陥ることを防止し、かつレシピエントの免疫誘導を
防止することが可能となる。従って、長期間の生着が可
能なハイブリッド型人工膵臓を提供することが可能とな
る。
及び／または合成高分子からなる固定化材料により包括
固定化し、５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するも
のであるため、ダメージを受けた膵ラ島に起因する問題
点を解消することができ、移植を受けた動物が低血糖状
態に陥ることを防止し、かつレシピエントの免疫誘導を
防止することが可能となる。従って、長期間の生着が可
能なハイブリッド型人工膵臓を提供することが可能とな
る。
【００１６】
【実施例の説明】以下のようにして実施例１〜５及び比
較例１〜５の人工膵臓を作成し、移植試験および補体依
存性細胞障害試験により評価した。 実施例１ アガロース０．１５ｇをＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液
３．０ｍｌに加えてポリマー濃度を５重量％にし、オー
トクレーブにて１２１℃で２０分間、加熱滅菌と同時に
アガロースを溶解させ、次に、４０℃の温度に保った。 このアガロース溶液に、ハムスターの膵臓からコラゲナ
ーゼ処理法により単離した膵ラ島約１０００個をＥａｇ
ｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液０．１ｍｌに分散したものを加
えて攪拌し、さらに４０℃に加温した流動パラフィン約
２０ｍｌを加えて攪拌し、アガロースを分散させた。次
に、この分散液を攪拌下で氷冷し、アガロースをゲル化
させ、ハンクス液約３０ｍｌを加え２０００ｒｐｍ×１
０分間の条件で遠心して沈澱したマイクロカプセルを回
収した。このマイクロカプセルは、粒径が約５０〜８０
０μｍで、カプセル１ケあたり、１〜数個の膵ラ島が包
括固定化されていた。次に、該マイクロカプセルをＥａ
ｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ−５％牛胎児血清中、３７℃、５
％ＣＯ２ 下で３０日間培養し、良い状態の膵ラ島を含
むマイクロカプセルを回収し、実施例１のハイブリッド
型人工膵臓を製造した。
較例１〜５の人工膵臓を作成し、移植試験および補体依
存性細胞障害試験により評価した。 実施例１ アガロース０．１５ｇをＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液
３．０ｍｌに加えてポリマー濃度を５重量％にし、オー
トクレーブにて１２１℃で２０分間、加熱滅菌と同時に
アガロースを溶解させ、次に、４０℃の温度に保った。 このアガロース溶液に、ハムスターの膵臓からコラゲナ
ーゼ処理法により単離した膵ラ島約１０００個をＥａｇ
ｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液０．１ｍｌに分散したものを加
えて攪拌し、さらに４０℃に加温した流動パラフィン約
２０ｍｌを加えて攪拌し、アガロースを分散させた。次
に、この分散液を攪拌下で氷冷し、アガロースをゲル化
させ、ハンクス液約３０ｍｌを加え２０００ｒｐｍ×１
０分間の条件で遠心して沈澱したマイクロカプセルを回
収した。このマイクロカプセルは、粒径が約５０〜８０
０μｍで、カプセル１ケあたり、１〜数個の膵ラ島が包
括固定化されていた。次に、該マイクロカプセルをＥａ
ｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ−５％牛胎児血清中、３７℃、５
％ＣＯ２ 下で３０日間培養し、良い状態の膵ラ島を含
むマイクロカプセルを回収し、実施例１のハイブリッド
型人工膵臓を製造した。
【００１７】実施例２
アガロースの代わりに、アガロース５ｇを水５０ｍｌに
溶解し、酢酸１．５ｍｌを加えて１００℃で１０分間加
水分解して得られたアガロース分解物を用い、そのポリ
マー濃度を１５重量％にし、かつ培養日数を６日間にし
たこと以外は、実施例１と同様にして、実施例２のハイ
ブリッド型人工膵臓を製造した。
溶解し、酢酸１．５ｍｌを加えて１００℃で１０分間加
水分解して得られたアガロース分解物を用い、そのポリ
マー濃度を１５重量％にし、かつ培養日数を６日間にし
たこと以外は、実施例１と同様にして、実施例２のハイ
ブリッド型人工膵臓を製造した。
【００１８】実施例３
培養条件を２０℃、５％ＣＯ２ 下で２０日間としたこ
と以外は、実施例１と同様にして実施例３のハイブリッ
ド型人工膵臓を製造した。 実施例４ 光架橋性ポリビニルアルコール（重合度：１７００、ケ
ン化度％：８８、スチリルピリジニウム置換基の割合：
１．３モル％）０．３ｇをポリマー濃度が１０重量％に
なるようにＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培養液３．０ｍｌ
に加え、オートクレーブにて１２１℃、２０分間加熱滅
菌と同時に光架橋性ポリビニルアルコールを溶解させた
。 ３７℃まで冷却し、この溶液に、ハムスターの膵臓から
コラゲナーゼ処理法により単離した膵ラ島約１０００個
をＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液０．１ｍｌに分散した
ものを加えて攪拌し、さらに流動パラフィン約２０ｍｌ
を加えて攪拌し、光架橋性ポリビニルアルコールを分散
させた。
と以外は、実施例１と同様にして実施例３のハイブリッ
ド型人工膵臓を製造した。 実施例４ 光架橋性ポリビニルアルコール（重合度：１７００、ケ
ン化度％：８８、スチリルピリジニウム置換基の割合：
１．３モル％）０．３ｇをポリマー濃度が１０重量％に
なるようにＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培養液３．０ｍｌ
に加え、オートクレーブにて１２１℃、２０分間加熱滅
菌と同時に光架橋性ポリビニルアルコールを溶解させた
。 ３７℃まで冷却し、この溶液に、ハムスターの膵臓から
コラゲナーゼ処理法により単離した膵ラ島約１０００個
をＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液０．１ｍｌに分散した
ものを加えて攪拌し、さらに流動パラフィン約２０ｍｌ
を加えて攪拌し、光架橋性ポリビニルアルコールを分散
させた。
【００１９】次に、この分散液を攪拌下、３００Ｗのハ
ロゲンランプを装着したスライドプロジェクターを用い
て約１５分間光を照射することで、光架橋性ポリビニル
アルコールをゲル化させ、ハンクス液約３０ｍｌを加え
、２０００ｒｐｍ×１０分間の条件で遠心し、沈澱した
マイクロカプセルを回収した。このマイクロカプセルは
、粒径が約５０〜８００μｍで、カプセル１ケあたり、
１〜数個の膵ラ島が包括固定化されていた。
ロゲンランプを装着したスライドプロジェクターを用い
て約１５分間光を照射することで、光架橋性ポリビニル
アルコールをゲル化させ、ハンクス液約３０ｍｌを加え
、２０００ｒｐｍ×１０分間の条件で遠心し、沈澱した
マイクロカプセルを回収した。このマイクロカプセルは
、粒径が約５０〜８００μｍで、カプセル１ケあたり、
１〜数個の膵ラ島が包括固定化されていた。
【００２０】さらに、該マイクロカプセルをＥａｇｌｅ
’ｓ ＭＥＭ−５％牛胎児血清中、３７℃、５％ＣＯ
２ 下で２０日間培養し、状態のよい膵ラ島を含むマイ
クロカプセルを回収し、実施例４のハイブリッド型人工
膵臓を製造した。 実施例５ アルギン酸ナトリウム０．０４５ｇをポリマー濃度が１
．５重量％になるように生理食塩水３ｍｌに加え、この
溶液にハムスターの膵臓からコラゲナーゼ処理法により
単離した膵ラ島約１０００個を生理食塩水約０．１ｍｌ
に分散したものを加えて攪拌し、膵ラ島を分散させた。 １．５重量％の塩化カルシウム溶液１００ｍｌの入った
ビーカーに、この分散液を２２Ｇの大きさのエアージェ
ットノズルから滴下し、ゲル化したアルギン酸カルシウ
ム粒子を回収した。この粒子を、塩化ナトリウムが０．
６重量％、２−シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸
が２重量％の濃度で溶解された緩衝溶液（ｐＨ８．２）
の１重量部と、１重量％の塩化カルシウム溶液の２０重
量部とを混合した溶液（以下、ＣＨＥＳ溶液と略す）及
び１．１重量％の塩化カルシウム溶液で順次洗浄した。 さらにゲル化したアルギン酸カルシウム粒子を、分子量
１８０００のポリリジンを０．５％含む生理食塩水５０
ｍｌに６分間浸漬してポリリジン膜を形成させた後、マ
イクロカプセルを取り出しＣＨＥＳ溶液、１．１重量％
の塩化カルシウム溶液及び生理食塩水で順次洗浄した。
’ｓ ＭＥＭ−５％牛胎児血清中、３７℃、５％ＣＯ
２ 下で２０日間培養し、状態のよい膵ラ島を含むマイ
クロカプセルを回収し、実施例４のハイブリッド型人工
膵臓を製造した。 実施例５ アルギン酸ナトリウム０．０４５ｇをポリマー濃度が１
．５重量％になるように生理食塩水３ｍｌに加え、この
溶液にハムスターの膵臓からコラゲナーゼ処理法により
単離した膵ラ島約１０００個を生理食塩水約０．１ｍｌ
に分散したものを加えて攪拌し、膵ラ島を分散させた。 １．５重量％の塩化カルシウム溶液１００ｍｌの入った
ビーカーに、この分散液を２２Ｇの大きさのエアージェ
ットノズルから滴下し、ゲル化したアルギン酸カルシウ
ム粒子を回収した。この粒子を、塩化ナトリウムが０．
６重量％、２−シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸
が２重量％の濃度で溶解された緩衝溶液（ｐＨ８．２）
の１重量部と、１重量％の塩化カルシウム溶液の２０重
量部とを混合した溶液（以下、ＣＨＥＳ溶液と略す）及
び１．１重量％の塩化カルシウム溶液で順次洗浄した。 さらにゲル化したアルギン酸カルシウム粒子を、分子量
１８０００のポリリジンを０．５％含む生理食塩水５０
ｍｌに６分間浸漬してポリリジン膜を形成させた後、マ
イクロカプセルを取り出しＣＨＥＳ溶液、１．１重量％
の塩化カルシウム溶液及び生理食塩水で順次洗浄した。
【００２１】さらに、このマイクロカプセルを０．１５
％のアルギン酸ナトリウム溶液２０ｍｌに４分間浸漬し
、ポリリジン膜の表面にアルギン酸塩膜を形成させた。 得られたマイクロカプセルを生理食塩水で洗浄し、さら
に、０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液で６分間処
理して、内部のアルギン酸カルシウムを溶解させた後、
再び生理食塩水で洗浄してマイクロカプセルを回収した
。このマイクロカプセルは、粒径が約５０〜８００μｍ
で、カプセル１ケあたり、１〜数個の膵ラ島が包括固定
化されていた。
％のアルギン酸ナトリウム溶液２０ｍｌに４分間浸漬し
、ポリリジン膜の表面にアルギン酸塩膜を形成させた。 得られたマイクロカプセルを生理食塩水で洗浄し、さら
に、０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液で６分間処
理して、内部のアルギン酸カルシウムを溶解させた後、
再び生理食塩水で洗浄してマイクロカプセルを回収した
。このマイクロカプセルは、粒径が約５０〜８００μｍ
で、カプセル１ケあたり、１〜数個の膵ラ島が包括固定
化されていた。
【００２２】次に、該マイクロカプセルをＥａｇｌｅ’
ｓ ＭＥＭ−５％牛胎児血清中、３７℃、５％ＣＯ２
下で３０日間培養し、状態のよい膵ラ島を含むマイク
ロカプセルを回収し、実施例５のハイブリッド型人工膵
臓を製造した。 比較例１ 培養日数を４日間にしたこと以外は実施例１と同様にし
て、比較例１のハイブリッド型人工膵臓を製造した。
ｓ ＭＥＭ−５％牛胎児血清中、３７℃、５％ＣＯ２
下で３０日間培養し、状態のよい膵ラ島を含むマイク
ロカプセルを回収し、実施例５のハイブリッド型人工膵
臓を製造した。 比較例１ 培養日数を４日間にしたこと以外は実施例１と同様にし
て、比較例１のハイブリッド型人工膵臓を製造した。
【００２３】比較例２
培養日数を１日間にしたこと以外は実施例２と同様にし
て、比較例２のハイブリッド型人工膵臓を製造した。 比較例３ 培養日数を３日間にしたこと以外は実施例４と同様にし
て、比較例３のハイブリッド型人工膵臓を製造した。
て、比較例２のハイブリッド型人工膵臓を製造した。 比較例３ 培養日数を３日間にしたこと以外は実施例４と同様にし
て、比較例３のハイブリッド型人工膵臓を製造した。
【００２４】比較例４
培養日数を１日間にした以外は、実施例５と同様にして
、比較例４のハイブリッド型人工膵臓を製造した。 比較例５ ハイブリッド型人工膵臓の代わりに、ハムスターの膵ラ
島そのものを比較例５として用意した。 （移植試験）６週令の雄性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内
に２００ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを投与して糖
尿病にした。この糖尿病マウスの腹腔内にハイブリッド
型人工膵臓約１０００個を移植した。移植前後の血糖値
を表１に示した。
、比較例４のハイブリッド型人工膵臓を製造した。 比較例５ ハイブリッド型人工膵臓の代わりに、ハムスターの膵ラ
島そのものを比較例５として用意した。 （移植試験）６週令の雄性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内
に２００ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを投与して糖
尿病にした。この糖尿病マウスの腹腔内にハイブリッド
型人工膵臓約１０００個を移植した。移植前後の血糖値
を表１に示した。
【００２５】
【表１】
【００２６】表１に示すように移植前の血糖値は５００
ｍｇ／ｄｌ以上あり典型的な糖尿病であるが、実施例１
〜５においては、１０９日を越えた現在でも血糖値はマ
ウスの正常血糖値である２００ｍｇ／ｄｌ以下を維持し
ており、ハイブリッド型人工膵臓として機能している。 これに対して比較例１〜５では、いずれも糖尿病状態に
戻り、マウスは死亡に至っていることがわかる。 （補体依存性細胞障害試験）移植前後の血清をＰＢＳ（
−）で５倍希釈し、その０．１ｍｌをとり、さらに抗原
としてハムスター・ラ氏島をディスパーゼ処理法により
単個細胞に分散したもの（５×１０５ 個／ｍｌ）０．
１ｍｌ、および補体としてモルモット正常血清をＰＢＳ
（−）で１０倍希釈したものを０．２ｍｌを加えて、３
７℃で１時間インキュベートした。その後０．５％トリ
パンブルーＰＢＳ（−）溶液０．４ｍｌを加えて生細胞
と死細胞の数をカウントし、細胞障害率を求めた。結果
を表２に示した。
ｍｇ／ｄｌ以上あり典型的な糖尿病であるが、実施例１
〜５においては、１０９日を越えた現在でも血糖値はマ
ウスの正常血糖値である２００ｍｇ／ｄｌ以下を維持し
ており、ハイブリッド型人工膵臓として機能している。 これに対して比較例１〜５では、いずれも糖尿病状態に
戻り、マウスは死亡に至っていることがわかる。 （補体依存性細胞障害試験）移植前後の血清をＰＢＳ（
−）で５倍希釈し、その０．１ｍｌをとり、さらに抗原
としてハムスター・ラ氏島をディスパーゼ処理法により
単個細胞に分散したもの（５×１０５ 個／ｍｌ）０．
１ｍｌ、および補体としてモルモット正常血清をＰＢＳ
（−）で１０倍希釈したものを０．２ｍｌを加えて、３
７℃で１時間インキュベートした。その後０．５％トリ
パンブルーＰＢＳ（−）溶液０．４ｍｌを加えて生細胞
と死細胞の数をカウントし、細胞障害率を求めた。結果
を表２に示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】表２に示すように実施例１〜５では細胞障
害率の変化は見られなかったが、比較例１〜５において
は血糖値の上昇に伴って細胞障害率も上昇した。すなわ
ち比較例１〜５では、レシピエントのマウスにハムスタ
ー・膵ラ島の抗体が誘導されたものと考えられる。
害率の変化は見られなかったが、比較例１〜５において
は血糖値の上昇に伴って細胞障害率も上昇した。すなわ
ち比較例１〜５では、レシピエントのマウスにハムスタ
ー・膵ラ島の抗体が誘導されたものと考えられる。
Claims (1)
- 【請求項１】 膵ランゲルハンス島を天然及び／また
は合成高分子からなる固定化材料により包括固定化し、
次に５日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することを特
徴とするハイブリッド型人工膵臓の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03287791A JP3204675B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-02-27 | ハイブリッド型人工膵臓の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-405007 | 1990-12-21 | ||
| JP40500790 | 1990-12-21 | ||
| JP03287791A JP3204675B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-02-27 | ハイブリッド型人工膵臓の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04244015A true JPH04244015A (ja) | 1992-09-01 |
| JP3204675B2 JP3204675B2 (ja) | 2001-09-04 |
Family
ID=26371466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03287791A Expired - Fee Related JP3204675B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-02-27 | ハイブリッド型人工膵臓の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3204675B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027367A1 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | Metabolex, Inc. | Novel encapsulation compositions and methods |
| JP2020520990A (ja) * | 2017-05-17 | 2020-07-16 | アドバンスド エステティック テクノロジーズ インコーポレイテッドＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． | アガロイド構造及び関連する使用方法と製造方法 |
-
1991
- 1991-02-27 JP JP03287791A patent/JP3204675B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027367A1 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | Metabolex, Inc. | Novel encapsulation compositions and methods |
| US5916790A (en) * | 1995-03-03 | 1999-06-29 | Metabolex, Inc. | Encapsulation compositions, and methods |
| US6020200A (en) * | 1995-03-03 | 2000-02-01 | Metabolex, Inc. | Encapsulation compositions and methods |
| JP2020520990A (ja) * | 2017-05-17 | 2020-07-16 | アドバンスド エステティック テクノロジーズ インコーポレイテッドＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． | アガロイド構造及び関連する使用方法と製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3204675B2 (ja) | 2001-09-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |