JPH04248998A - 媒質の細胞外位置にあるｄｎａの投与方法 - Google Patents
媒質の細胞外位置にあるｄｎａの投与方法Info
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- JPH04248998A JPH04248998A JP3234103A JP23410391A JPH04248998A JP H04248998 A JPH04248998 A JP H04248998A JP 3234103 A JP3234103 A JP 3234103A JP 23410391 A JP23410391 A JP 23410391A JP H04248998 A JPH04248998 A JP H04248998A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、液体媒質の細胞外位置
に見出されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の微少量を投
与する方法に関する。
に見出されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の微少量を投
与する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】このような投与は、多数の環境の大きい
関連（Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ） である。即ち、（１）
生理学的見地から、生存する有機体の細胞外位置のＤＮ
Ａの存在は、２種類の現象に関係する可能性がある。一
方では、細胞死は、通常及び永続する現象であり、この
現象が細胞外媒質ヘクロマチン崩壊（従ってＤＮＡ）の
生成物の釈放をもたらし又この現象の役目が有機体の発
生及び各種の機能系（部分的に免疫系）の成熟に関する
現象で目下確立されている。他方では、若干の著者は、
細胞外空間へのＤＮＡの釈放が活性細胞の排出過程に関
係するかも知れず、従って細胞間連通の機構となり得る
と理論を立てた。
関連（Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ） である。即ち、（１）
生理学的見地から、生存する有機体の細胞外位置のＤＮ
Ａの存在は、２種類の現象に関係する可能性がある。一
方では、細胞死は、通常及び永続する現象であり、この
現象が細胞外媒質ヘクロマチン崩壊（従ってＤＮＡ）の
生成物の釈放をもたらし又この現象の役目が有機体の発
生及び各種の機能系（部分的に免疫系）の成熟に関する
現象で目下確立されている。他方では、若干の著者は、
細胞外空間へのＤＮＡの釈放が活性細胞の排出過程に関
係するかも知れず、従って細胞間連通の機構となり得る
と理論を立てた。
【０００３】（２） 病理学的見地から、ＤＮＡを含む
生存構造の破壊に関する現象によって伴われるすべての
過程は、それが多細胞有機体或いは感染性粒子（細菌性
、ウィルス性、寄生虫性）の細胞にしろ、隣接細胞外媒
質へＤＮＡ（及び／又はＲＮＡ）の釈放をもたらす。こ
の現象の重要性、その研究及びそれを探査するため使用
される系統的分類法の今日性は、単一義ではない（フー
ルニエ．ユーロリュ−マトロジー（Ｆｏｕｒｎｉｅ Ｅ
ｕｒｏｒｈｕｍａｔｏｌｏｇｙ）、ターガス．アンド．
サン．プレス（Ｔａｇａｓａｎｄ Ｓｏｎ Ｐｒｅｓｓ
）、アゼン（Ａｔｈｅｎｓ）、１９８７年第９〜１３頁
）。 （Ａ） 或る病気、特に感染性或いは遺伝性病気の推移
している間、病原性動因或いは病原性過程に対し特異な
ＤＮＡは、その細胞外液体に存在するかも知れない。こ
のＤＮＡの検出及び識別は、従って、病因論的関心事で
ある。これらの情況では、ハイブリダイゼーション（新
種細胞形成）技術をしばしば使用する。これらの技術は
、試験される試料（予め精製され且つ熱によって変性さ
れ且つ固形支持体で固定される）で、部分的に存在する
ＤＮＡ及び放射性物質或いは冷間マーカー、例えば、ビ
チオンで予め標識づけされる追加のＤＮＡ検出試料を一
緒に融合することができる。固形支持体でＤＮＡを固定
するのは、メンブラン（例えばナイロン或いはニトロセ
ルロース）でしばしば行われる。この方法は、比較的久
しく且つ準定量的だけであるが、しかしＤＮＡの“冷間
”標識づけを使用する場合でもピコグラムの水準で特異
ＤＮＡを検出させる（バロード．ハジダン外（Ｂａｒｒ
ａｕｄ−Ｈａｄｉｄａｎｅ ｅｔ ａｌ．）、毒物学記
録誌（Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｅｄ．）１９８７年、付録１
１、第２００〜２０５頁）。固形支持体として微小滴定
板及び、ビオチン標識づけＤＮＡ検出試料を使用する定
量的技術は、長田外によっても説明されている（ＦＥＢ
Ｓ．１９８５年、１８３、第３７９〜３８２頁）。 （Ｂ） 他方では、多くの環境において、ＤＮＡの特異
性、即ちＤＮＡ一次構造の分子特性に無関係にＤＮＡを
検出及び投与することが重要となり得る。即ち、（Ｉ）
人間病理学では、ＤＮＡの投与は、環境に従って診断
及び／又は生理病理学関連となるかも知れない。即ち、
（ａ） 細胞外空間へのＤＮＡの釈放は、細胞死の過程
を反映し又、その証拠であり又全有機体を通じて生体内
でのこの細胞死を検出且つ定量化させることができる。 従ってＤＮＡの検出及び投与は、実験的或いは人間病理
学の多くの場合で診断学及び予後の有義である。これは
、例えば、血栓塞栓症病（バーゴ外（Ｖａｒｇｏｅｔ
ａｌ．） 、胸（Ｃｈｅｓｔ）、１９９０年、９７、第
６３〜６８頁）及び血管炎（スタインマン（Ｓｔｅｉｎ
ｍａｎ） 、リューマチ様関節炎（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ
Ｒｈｅｕｍ） １９８２年、２５ 第１４２５〜１
４３０頁）に対する場合である。
生存構造の破壊に関する現象によって伴われるすべての
過程は、それが多細胞有機体或いは感染性粒子（細菌性
、ウィルス性、寄生虫性）の細胞にしろ、隣接細胞外媒
質へＤＮＡ（及び／又はＲＮＡ）の釈放をもたらす。こ
の現象の重要性、その研究及びそれを探査するため使用
される系統的分類法の今日性は、単一義ではない（フー
ルニエ．ユーロリュ−マトロジー（Ｆｏｕｒｎｉｅ Ｅ
ｕｒｏｒｈｕｍａｔｏｌｏｇｙ）、ターガス．アンド．
サン．プレス（Ｔａｇａｓａｎｄ Ｓｏｎ Ｐｒｅｓｓ
）、アゼン（Ａｔｈｅｎｓ）、１９８７年第９〜１３頁
）。 （Ａ） 或る病気、特に感染性或いは遺伝性病気の推移
している間、病原性動因或いは病原性過程に対し特異な
ＤＮＡは、その細胞外液体に存在するかも知れない。こ
のＤＮＡの検出及び識別は、従って、病因論的関心事で
ある。これらの情況では、ハイブリダイゼーション（新
種細胞形成）技術をしばしば使用する。これらの技術は
、試験される試料（予め精製され且つ熱によって変性さ
れ且つ固形支持体で固定される）で、部分的に存在する
ＤＮＡ及び放射性物質或いは冷間マーカー、例えば、ビ
チオンで予め標識づけされる追加のＤＮＡ検出試料を一
緒に融合することができる。固形支持体でＤＮＡを固定
するのは、メンブラン（例えばナイロン或いはニトロセ
ルロース）でしばしば行われる。この方法は、比較的久
しく且つ準定量的だけであるが、しかしＤＮＡの“冷間
”標識づけを使用する場合でもピコグラムの水準で特異
ＤＮＡを検出させる（バロード．ハジダン外（Ｂａｒｒ
ａｕｄ−Ｈａｄｉｄａｎｅ ｅｔ ａｌ．）、毒物学記
録誌（Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｅｄ．）１９８７年、付録１
１、第２００〜２０５頁）。固形支持体として微小滴定
板及び、ビオチン標識づけＤＮＡ検出試料を使用する定
量的技術は、長田外によっても説明されている（ＦＥＢ
Ｓ．１９８５年、１８３、第３７９〜３８２頁）。 （Ｂ） 他方では、多くの環境において、ＤＮＡの特異
性、即ちＤＮＡ一次構造の分子特性に無関係にＤＮＡを
検出及び投与することが重要となり得る。即ち、（Ｉ）
人間病理学では、ＤＮＡの投与は、環境に従って診断
及び／又は生理病理学関連となるかも知れない。即ち、
（ａ） 細胞外空間へのＤＮＡの釈放は、細胞死の過程
を反映し又、その証拠であり又全有機体を通じて生体内
でのこの細胞死を検出且つ定量化させることができる。 従ってＤＮＡの検出及び投与は、実験的或いは人間病理
学の多くの場合で診断学及び予後の有義である。これは
、例えば、血栓塞栓症病（バーゴ外（Ｖａｒｇｏｅｔ
ａｌ．） 、胸（Ｃｈｅｓｔ）、１９９０年、９７、第
６３〜６８頁）及び血管炎（スタインマン（Ｓｔｅｉｎ
ｍａｎ） 、リューマチ様関節炎（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ
Ｒｈｅｕｍ） １９８２年、２５ 第１４２５〜１
４３０頁）に対する場合である。
【０００４】（ｂ） 循環ＤＮＡが病理学的役割を演ず
るかもしれない。各種の機構を含むことができる。即ち
、（ｉ） その物理化学特性、特にその粘度及び電荷の
ために、循環ＤＮＡは、循環の通常の働きを乱すことが
でき且つ／又は若干の組織或いは器官で沈澱され；（ｉ
ｉ）細胞外ＤＮＡは、補体及び凝固系のような各種の生
物学系を活性化でき；（ｉｉｉ） それは宿主ゲノーム
へ一体化されることによってその遺伝子の性質及び特性
のために病原性役割を果すことができ；（ｉｖ）終局的
に抗体の存在下高分子複合体の生成のベースで転移（播
種）狼瘡紅斑に罹病した患者の糸球体の病変の発生に関
係する機構となり得る（フールニエ（Ｆｏｕｒｎｉｅ）
、腎臓インターン（ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．） １９８
８年、３３ 第４８７〜４９７頁）。 （ＩＩ）薬理毒物学で、循環ＤＮＡの投与は、生体での
医薬或いは毒性物質の細胞毒性の検出を助けることがで
きる（ブレット外（Ｂｒｅｔ ｅｔ ａｌ．） 、毒物
学、１９９０年、６１ 第２８３〜２９２頁）。従っ
て、それは同じ薬理学クラス内で最良効能／毒性比率を
もつ物質の選択で薬剤開発段階の間有用であるかも知れ
ない。更に、それは、実験的薬理毒物学データから予測
できない薬剤毒性の早期検出に対して人間の臨床実験段
階Ｉの過程の間使用することができる。結局各種生物学
液体、特に、尿の細胞外位置は見出されるＤＮＡの投与
は、各種の生体異物及び薬剤の毒性作用の慣例のふるい
分け（ｒｏｕｔｉｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ） に有用
となるだろう。 （ＩＩＩ） 生物学的適合性研究の領域で、医学診療所
で使用される各種の体外循環系特に血液透析に関して、
ＤＮＡの投与は、この系の可能性のある生物不親和性へ
関連する細胞死現象の強度の生体内分析を可能にする（
フールニエ外（Ｆｏｕｒｎｉｅｅｔ ａｌ．） 、米国
腎臓学誌、１９８９年、９ 第３８４〜３９１頁）。 （ＩＶ）バイオ工学の領域で、例えば、遺伝工学によっ
て得られる活性生物学物質を含む残留ＤＮＡ汚染媒質の
投与は、無害の検査で重要である（生物学標準化に関す
る世界保健機構専門委員会、１９８２年）。
るかもしれない。各種の機構を含むことができる。即ち
、（ｉ） その物理化学特性、特にその粘度及び電荷の
ために、循環ＤＮＡは、循環の通常の働きを乱すことが
でき且つ／又は若干の組織或いは器官で沈澱され；（ｉ
ｉ）細胞外ＤＮＡは、補体及び凝固系のような各種の生
物学系を活性化でき；（ｉｉｉ） それは宿主ゲノーム
へ一体化されることによってその遺伝子の性質及び特性
のために病原性役割を果すことができ；（ｉｖ）終局的
に抗体の存在下高分子複合体の生成のベースで転移（播
種）狼瘡紅斑に罹病した患者の糸球体の病変の発生に関
係する機構となり得る（フールニエ（Ｆｏｕｒｎｉｅ）
、腎臓インターン（ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．） １９８
８年、３３ 第４８７〜４９７頁）。 （ＩＩ）薬理毒物学で、循環ＤＮＡの投与は、生体での
医薬或いは毒性物質の細胞毒性の検出を助けることがで
きる（ブレット外（Ｂｒｅｔ ｅｔ ａｌ．） 、毒物
学、１９９０年、６１ 第２８３〜２９２頁）。従っ
て、それは同じ薬理学クラス内で最良効能／毒性比率を
もつ物質の選択で薬剤開発段階の間有用であるかも知れ
ない。更に、それは、実験的薬理毒物学データから予測
できない薬剤毒性の早期検出に対して人間の臨床実験段
階Ｉの過程の間使用することができる。結局各種生物学
液体、特に、尿の細胞外位置は見出されるＤＮＡの投与
は、各種の生体異物及び薬剤の毒性作用の慣例のふるい
分け（ｒｏｕｔｉｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ） に有用
となるだろう。 （ＩＩＩ） 生物学的適合性研究の領域で、医学診療所
で使用される各種の体外循環系特に血液透析に関して、
ＤＮＡの投与は、この系の可能性のある生物不親和性へ
関連する細胞死現象の強度の生体内分析を可能にする（
フールニエ外（Ｆｏｕｒｎｉｅｅｔ ａｌ．） 、米国
腎臓学誌、１９８９年、９ 第３８４〜３９１頁）。 （ＩＶ）バイオ工学の領域で、例えば、遺伝工学によっ
て得られる活性生物学物質を含む残留ＤＮＡ汚染媒質の
投与は、無害の検査で重要である（生物学標準化に関す
る世界保健機構専門委員会、１９８２年）。
【０００５】循環ＤＮＡ及び各種生物学液体の細胞外位
置に見出されるＤＮＡを投与する重要性が示され各種の
比色計、螢光測定法、免病学及び生物学工学が開発され
た。これらは、一方では、投与の特異性、感度及び定量
的性質に、又他方では、この投与を行うべき試料の予備
処理を行う必要性に関する。即ち、 （Ｉ） 特異性（若干の技術の）は、投与される試料で
存在するＤＮＡと異なる各種の物質と、その投与方法に
使用される試薬との間の相互作用のために保証されない
。これは、免疫工学及びＤＮＡ固定物質を使用する方法
にとってもちろん螢光測定及び熱量測定技術にとっても
真実である。投与の特異性の検査は、デオキシリボヌク
レアーゼＩのような特異酵素を使用して投与ＤＮＡを溶
解した後行われる追加の投与を系統的に必要とする（ス
タインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）、臨床研究誌（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、１９７５年、５６ 第５
１２〜５１５頁）。 （ＩＩ）それらの技術の感度の制約及び定量的性質の欠
如は各種の要因に関連する。即ち（ｉ） 若干の技術（
例えば抗免疫電気泳動法）の実際原理は場合にはよって
は定量投与を可能にしない；（ｉｉ）投与されるＤＮＡ
分子の可変サイズ、即ち異なるサイズをもつＤＮＡ分子
数が同じ量に対してすら可変であるのに、検出される信
号が反応性ＤＮＡ分子（又ヌクレオチド或いはベース対
の数によって表示されるようなＤＮＡの絶体量のでない
）の数の関数である；（ｉｉｉ） 精製されるＤＮＡ量
が少ない場合、低い収率に対し連鎖されるＤＮＡ損失。 （ＩＩＩ） 投与前試料の処理、若干の技術によって要
求されるようにＤＮＡを精製し且つ濃縮するため、しば
しば厄介であり且つ場合によっては無作為であり、超遠
心分離のような実際に調整するため困難である方法を用
いなければ初期試料に存在するＤＮＡの定量回収で、前
述のような制約をもたらす（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ
） 分析生化学、１９８１年、１１０、第２２９〜２３
１頁）。
置に見出されるＤＮＡを投与する重要性が示され各種の
比色計、螢光測定法、免病学及び生物学工学が開発され
た。これらは、一方では、投与の特異性、感度及び定量
的性質に、又他方では、この投与を行うべき試料の予備
処理を行う必要性に関する。即ち、 （Ｉ） 特異性（若干の技術の）は、投与される試料で
存在するＤＮＡと異なる各種の物質と、その投与方法に
使用される試薬との間の相互作用のために保証されない
。これは、免疫工学及びＤＮＡ固定物質を使用する方法
にとってもちろん螢光測定及び熱量測定技術にとっても
真実である。投与の特異性の検査は、デオキシリボヌク
レアーゼＩのような特異酵素を使用して投与ＤＮＡを溶
解した後行われる追加の投与を系統的に必要とする（ス
タインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）、臨床研究誌（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、１９７５年、５６ 第５
１２〜５１５頁）。 （ＩＩ）それらの技術の感度の制約及び定量的性質の欠
如は各種の要因に関連する。即ち（ｉ） 若干の技術（
例えば抗免疫電気泳動法）の実際原理は場合にはよって
は定量投与を可能にしない；（ｉｉ）投与されるＤＮＡ
分子の可変サイズ、即ち異なるサイズをもつＤＮＡ分子
数が同じ量に対してすら可変であるのに、検出される信
号が反応性ＤＮＡ分子（又ヌクレオチド或いはベース対
の数によって表示されるようなＤＮＡの絶体量のでない
）の数の関数である；（ｉｉｉ） 精製されるＤＮＡ量
が少ない場合、低い収率に対し連鎖されるＤＮＡ損失。 （ＩＩＩ） 投与前試料の処理、若干の技術によって要
求されるようにＤＮＡを精製し且つ濃縮するため、しば
しば厄介であり且つ場合によっては無作為であり、超遠
心分離のような実際に調整するため困難である方法を用
いなければ初期試料に存在するＤＮＡの定量回収で、前
述のような制約をもたらす（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ
） 分析生化学、１９８１年、１１０、第２２９〜２３
１頁）。
【０００６】これらの制約及び困難を克服するため、Ｄ
ＮＡの回収及び精製に対する方法、ならびに分子生物学
で使用される方法及び材料の使用は、ＤＮＡの定量的投
与に対して示唆された。 （Ｉ） ラプチス及びメナード（Ｒａｐｔｉｓ ａｎｄ
Ｍｅｎａｒｄ）（臨床研究誌、１９８０年 ６６第
１３９１〜１３９９頁）は、予めリグビー外（Ｒｉｇｂ
ｙ ｅｔ ａｌ． ） によって説明される（分子生物
学誌 １９７７年、１１３、第２３７〜２５１頁）、
ハプロトミック切断移動技術（Ｃｈａｐｌｏｔｏｍｉｃ
ｃｕｔ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅ）「ニックトランスレーション」）を使用する放射
性アイソトープでの生体内で循環ＤＮＡを精製且つ、標
識づけした後転移狼瘡紅斑をもつ患者の循環ＤＮＡを検
出する最初であった。投与される材料の調製に対する技
術の困難さ（試料の稀釈、酵素性溶解、有機抽出、透析
、カラム精製、エタノールでの沈澱）は、ＤＮＡの慣例
の検出及び投与に対するこの方法の適用を禁止する。 （ＩＩ）フールニエ外（Ｆｏｕｒｎｉｅ ｅｔ ａｌ．
） （分析生化学、１９８６年、１５８ 第２５０〜
２５６頁）は、無細胞生物学液体でＤＮＡの微少量の回
収及び投与に対する新しい方法を説明した。フェノール
での処理によるＤＮＡの抽出、共沈剤としてゼラチンを
使用するエタノールでの沈澱によるその回収及びハプロ
トミック切断移動技術を使用する定量投与に基づいてい
るこの方法は、若干の慣例適用でのこの方法の使用と両
立できる数個の試料の同時処理の問題を解決した。この
方法の制約は、下記である、即ち（ｉ） 異なる温度で
の若干の遠心分離工程を必要とする試料を投与する前に
それを抽出する必要、真空段階での凍結乾燥或いは蒸発
及び試料の再分解に対する工程；（ｉｉ）ＤＮＡの放射
性標識づけの必要；（ｉｉｉ） トリチウム標識づけ遊
離ヌクレオチドで放射標識づけされるＤＮＡの調製に対
する試料が沈澱されたフィルタを洗浄することに関する
諸工程（フィルタ上で吸着される溶離ＤＮＡの困難のた
めビオチン或いは任意他の「冷間」マーカーでＤＮＡを
標識づけする場合で容易に使用できない諸工程）。 （ＩＩＩ） ブリグス外（Ｂｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．
）（ＩＢＬ １９８９年６月、第１８〜２５頁）は、
ピコグラム水準（２〜２００ｐｇ）でＤＮＡの酵素性投
与を可能にする“全ＤＮＡ効力検査系”を説明した。こ
の方法によると、精製及び熱変性されるＤＮＡは、単独
よりＤＮＡを固定する蛋白質の中間体を介してメンブラ
ンで固定され且つモレキュラー．デバイセス社（アメリ
カ合衆国カリフォニア州メンロ．パーク）によって開発
された電位差計バイオセンサを使用して、酵素（ウレア
ーゼ）に対し結合される抗単独よりＤＮＡ単クローン抗
体を使用して定量化される。この方法は、特に多数の制
約をもつ。即ち（ｉ） 投与を行うため特殊且つ高価な
装置（＞２０００００ＦＦ）の使用；（ｉｉ）「収量」
がＤＮＡ分子のサイズの関数であるから、投与の非定量
的性質；（ｉｉｉ） 試料の各型式へ「適合される」予
備処理（熱でのＤＮＡの変性、ニトロセルロースでの予
備濾過及びプロティナーゼＫでの溶解、場合によっては
ＤＮＡのサイズに従って次いで分離される）の必要。
ＮＡの回収及び精製に対する方法、ならびに分子生物学
で使用される方法及び材料の使用は、ＤＮＡの定量的投
与に対して示唆された。 （Ｉ） ラプチス及びメナード（Ｒａｐｔｉｓ ａｎｄ
Ｍｅｎａｒｄ）（臨床研究誌、１９８０年 ６６第
１３９１〜１３９９頁）は、予めリグビー外（Ｒｉｇｂ
ｙ ｅｔ ａｌ． ） によって説明される（分子生物
学誌 １９７７年、１１３、第２３７〜２５１頁）、
ハプロトミック切断移動技術（Ｃｈａｐｌｏｔｏｍｉｃ
ｃｕｔ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅ）「ニックトランスレーション」）を使用する放射
性アイソトープでの生体内で循環ＤＮＡを精製且つ、標
識づけした後転移狼瘡紅斑をもつ患者の循環ＤＮＡを検
出する最初であった。投与される材料の調製に対する技
術の困難さ（試料の稀釈、酵素性溶解、有機抽出、透析
、カラム精製、エタノールでの沈澱）は、ＤＮＡの慣例
の検出及び投与に対するこの方法の適用を禁止する。 （ＩＩ）フールニエ外（Ｆｏｕｒｎｉｅ ｅｔ ａｌ．
） （分析生化学、１９８６年、１５８ 第２５０〜
２５６頁）は、無細胞生物学液体でＤＮＡの微少量の回
収及び投与に対する新しい方法を説明した。フェノール
での処理によるＤＮＡの抽出、共沈剤としてゼラチンを
使用するエタノールでの沈澱によるその回収及びハプロ
トミック切断移動技術を使用する定量投与に基づいてい
るこの方法は、若干の慣例適用でのこの方法の使用と両
立できる数個の試料の同時処理の問題を解決した。この
方法の制約は、下記である、即ち（ｉ） 異なる温度で
の若干の遠心分離工程を必要とする試料を投与する前に
それを抽出する必要、真空段階での凍結乾燥或いは蒸発
及び試料の再分解に対する工程；（ｉｉ）ＤＮＡの放射
性標識づけの必要；（ｉｉｉ） トリチウム標識づけ遊
離ヌクレオチドで放射標識づけされるＤＮＡの調製に対
する試料が沈澱されたフィルタを洗浄することに関する
諸工程（フィルタ上で吸着される溶離ＤＮＡの困難のた
めビオチン或いは任意他の「冷間」マーカーでＤＮＡを
標識づけする場合で容易に使用できない諸工程）。 （ＩＩＩ） ブリグス外（Ｂｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．
）（ＩＢＬ １９８９年６月、第１８〜２５頁）は、
ピコグラム水準（２〜２００ｐｇ）でＤＮＡの酵素性投
与を可能にする“全ＤＮＡ効力検査系”を説明した。こ
の方法によると、精製及び熱変性されるＤＮＡは、単独
よりＤＮＡを固定する蛋白質の中間体を介してメンブラ
ンで固定され且つモレキュラー．デバイセス社（アメリ
カ合衆国カリフォニア州メンロ．パーク）によって開発
された電位差計バイオセンサを使用して、酵素（ウレア
ーゼ）に対し結合される抗単独よりＤＮＡ単クローン抗
体を使用して定量化される。この方法は、特に多数の制
約をもつ。即ち（ｉ） 投与を行うため特殊且つ高価な
装置（＞２０００００ＦＦ）の使用；（ｉｉ）「収量」
がＤＮＡ分子のサイズの関数であるから、投与の非定量
的性質；（ｉｉｉ） 試料の各型式へ「適合される」予
備処理（熱でのＤＮＡの変性、ニトロセルロースでの予
備濾過及びプロティナーゼＫでの溶解、場合によっては
ＤＮＡのサイズに従って次いで分離される）の必要。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】後者の両技術は、小さ
い容積に対して使用でき又ピコグラム水準で細胞外ＤＮ
Ａをその性質に関係なく投与させることができるが、し
かしそれらは、本発明の目的の状況内で使用できない。 なぜなら本発明では、錯生物学液体数ピコグラムに対す
る程度のＤＮＡの量の投与が、（ｉ） 投与前のＤＮＡ
の予備抽出を必要とせず、（ｉｉ）放射性アイソトープ
の使用を要せず、（ｉｉｉ） 固形支持体、特に微小滴
定板で行うことができ、（ＩＶ）２時間以内に結果を得
させるからである。
い容積に対して使用でき又ピコグラム水準で細胞外ＤＮ
Ａをその性質に関係なく投与させることができるが、し
かしそれらは、本発明の目的の状況内で使用できない。 なぜなら本発明では、錯生物学液体数ピコグラムに対す
る程度のＤＮＡの量の投与が、（ｉ） 投与前のＤＮＡ
の予備抽出を必要とせず、（ｉｉ）放射性アイソトープ
の使用を要せず、（ｉｉｉ） 固形支持体、特に微小滴
定板で行うことができ、（ＩＶ）２時間以内に結果を得
させるからである。
【０００８】本発明の目的は、先行技術の方法より、慣
例要求に良好に適合される生物学液体、特に血漿の細胞
外位置にあるＤＮＡの微量投与方法を提供するにある。
例要求に良好に適合される生物学液体、特に血漿の細胞
外位置にあるＤＮＡの微量投与方法を提供するにある。
【０００９】
【問題を解決するための手段】本発明は、固形支持体へ
投与されるＤＮＡの吸着、ＤＮＡに対し特異な酵素或い
は酵素類を含む１つ或いはそれ以上の標識づけされるデ
オキシリボヌクレオチドトリホスフェートの合体によっ
てこのＤＮＡの標識づけ、一定ＤＮＡへ合体されるマー
カーを検出する適当な方法によってＤＮＡの投与の諸工
程からなり、その際これらの工程は複数の洗浄工程によ
ってお互いから分離できる。
投与されるＤＮＡの吸着、ＤＮＡに対し特異な酵素或い
は酵素類を含む１つ或いはそれ以上の標識づけされるデ
オキシリボヌクレオチドトリホスフェートの合体によっ
てこのＤＮＡの標識づけ、一定ＤＮＡへ合体されるマー
カーを検出する適当な方法によってＤＮＡの投与の諸工
程からなり、その際これらの工程は複数の洗浄工程によ
ってお互いから分離できる。
【００１０】
【作用】本発明による新しい方法は、投与に対して要求
される各種の反応を行う従来の“微小滴定板”型式固形
支持体で行うことができ、試料が血漿試料である場合実
際投与段階前にＤＮＡの抽出を必要とせず、放射性物質
の使用を必要とせず、信号を従来の分光光度計、分光螢
光計或いはバイオセンサで読出しできるような特異な装
置を必要とせず、２、３マイクロリッタ（Ｍｉｃｒｏｌ
ｉｔｒｅｓ） の試料しか必要とせず、ＤＮＡに対し特
異であり、著しく敏感であり、数百試料より多くで同時
に使用でき、又２時間以内で投与の結果を得させる。
される各種の反応を行う従来の“微小滴定板”型式固形
支持体で行うことができ、試料が血漿試料である場合実
際投与段階前にＤＮＡの抽出を必要とせず、放射性物質
の使用を必要とせず、信号を従来の分光光度計、分光螢
光計或いはバイオセンサで読出しできるような特異な装
置を必要とせず、２、３マイクロリッタ（Ｍｉｃｒｏｌ
ｉｔｒｅｓ） の試料しか必要とせず、ＤＮＡに対し特
異であり、著しく敏感であり、数百試料より多くで同時
に使用でき、又２時間以内で投与の結果を得させる。
【００１１】本発明に適合せる方法の好ましい実施態様
によると、固形支持体上でのＤＮＡ吸着は、ＤＮＡの強
い親和性をもつゼラチン或いはカチオン高分子錯体から
なる物質の中間体を介して行われる。
によると、固形支持体上でのＤＮＡ吸着は、ＤＮＡの強
い親和性をもつゼラチン或いはカチオン高分子錯体から
なる物質の中間体を介して行われる。
【００１２】この実施態様の有利な様相によると、ＤＮ
Ａを吸着する物質は、ヒストン（ｈｉｓｔｏｎｉｃ）蛋
白質或いはヒストリン（ｈｉｓｔｏｒｉｃ）蛋白質から
なる。
Ａを吸着する物質は、ヒストン（ｈｉｓｔｏｎｉｃ）蛋
白質或いはヒストリン（ｈｉｓｔｏｒｉｃ）蛋白質から
なる。
【００１３】この実施態様の構成によると、その固形支
持体は、０．０５〜０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤にヒストリン
蛋白質の混合物の培養（定温）によって感作される。
持体は、０．０５〜０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤にヒストリン
蛋白質の混合物の培養（定温）によって感作される。
【００１４】本発明と一致せる方法の好ましい実施例に
よると、試料に存在するＤＮＡの吸着は、培養温度がど
んなものでも、２、３分から数時間までの範囲となる培
養過程の間行われる。
よると、試料に存在するＤＮＡの吸着は、培養温度がど
んなものでも、２、３分から数時間までの範囲となる培
養過程の間行われる。
【００１５】本発明と一致せる方法の実施例の好ましい
態様によると、その固形支持体は、ＤＮＡの吸着後１回
或いはそれ以上洗浄される。
態様によると、その固形支持体は、ＤＮＡの吸着後１回
或いはそれ以上洗浄される。
【００１６】この実施態様の有利な様相によると、その
固形支持体の洗浄或いは複数の洗浄は、２．５ｍＭｐＨ
８トリスヒドロオキアミノメタン、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝
剤で行われる。
固形支持体の洗浄或いは複数の洗浄は、２．５ｍＭｐＨ
８トリスヒドロオキアミノメタン、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝
剤で行われる。
【００１７】この実施態様の別の有利な様相によると、
その固形支持体の洗浄或いは複数の洗浄は、硼酸塩緩衝
剤（イオン強度約０．１）、０．１％トウィーン（Ｔｗ
ｅｅｎ） ２０、ｐＨ８〜８．５で行われる。
その固形支持体の洗浄或いは複数の洗浄は、硼酸塩緩衝
剤（イオン強度約０．１）、０．１％トウィーン（Ｔｗ
ｅｅｎ） ２０、ｐＨ８〜８．５で行われる。
【００１８】本発明と一致する好ましい実施態様による
と、吸着ＤＮＡの標識づけは、ＤＮＡに対し特異な１つ
或いはそれ以上の酵素を含む分子生物学反応を使用して
行われ、例えば酵素反応を使用する後の工程で検出でき
る物質で化学的に標識づけされる少くとも１つのデオキ
シドリボヌクレオチドトリホスフェートの合体をさせる
。
と、吸着ＤＮＡの標識づけは、ＤＮＡに対し特異な１つ
或いはそれ以上の酵素を含む分子生物学反応を使用して
行われ、例えば酵素反応を使用する後の工程で検出でき
る物質で化学的に標識づけされる少くとも１つのデオキ
シドリボヌクレオチドトリホスフェートの合体をさせる
。
【００１９】この実施態様の有利な構成によると、ＤＮ
Ａの標識づけは、例えば、酵素反応を使用する後の工程
で検出できる少くとも１の物質の合体によってハプロト
ミック切断移動反応（「ニックトランスレーション」）
を使用して行われる。
Ａの標識づけは、例えば、酵素反応を使用する後の工程
で検出できる少くとも１の物質の合体によってハプロト
ミック切断移動反応（「ニックトランスレーション」）
を使用して行われる。
【００２０】この実施態様の有利な様相によると、第２
段階の経過している間の標識づけは約１５〜４０°Ｃ（
例えば３０°Ｃ）の範囲となる温度で、２、３分から数
時間特に１５〜２４０分間（例えば６０分間）の範囲と
なる培養期間の間行われる。
段階の経過している間の標識づけは約１５〜４０°Ｃ（
例えば３０°Ｃ）の範囲となる温度で、２、３分から数
時間特に１５〜２４０分間（例えば６０分間）の範囲と
なる培養期間の間行われる。
【００２１】この実施態様の有利な様相によると、一定
ＤＮＡへ合体されるヌクレオチド或いは複数のヌクレオ
チドは、アビジン或いはストレプタビジンへ関連される
それ或いはそれらの検出に対して使用されるビオチン及
び酵素で標識づけされる。本発明と一致する方法のこの
実施態様の有利な構成によると、ハプロトミック切断移
動による標識づけはトリスヒドロキシアミノメタン（０
．５〜５ｍＭ）、塩化マグネシウム（２〜５ｍＭ）及び
場合によってはβメルカプトエタノール（７〜１５ｍＭ
）及び牛属血清アルブミン（２０〜６０マイクログラム
／ミリリッタ）の存在下、１つ或いはそれ以上の標識づ
けデオキリボヌクレオチドトリホスフェート１０〜１０
０ピコモル、場合によっては標識づけされないデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェート１０〜１００ピコモ
ル、ＤＮＡポリメラーゼ約０．０４ユニット及びデオキ
シリボヌクレアーゼＩ約４ピコグラムをもつ固形支持体
上で吸着されるＤＮＡの培養によって行われる。
ＤＮＡへ合体されるヌクレオチド或いは複数のヌクレオ
チドは、アビジン或いはストレプタビジンへ関連される
それ或いはそれらの検出に対して使用されるビオチン及
び酵素で標識づけされる。本発明と一致する方法のこの
実施態様の有利な構成によると、ハプロトミック切断移
動による標識づけはトリスヒドロキシアミノメタン（０
．５〜５ｍＭ）、塩化マグネシウム（２〜５ｍＭ）及び
場合によってはβメルカプトエタノール（７〜１５ｍＭ
）及び牛属血清アルブミン（２０〜６０マイクログラム
／ミリリッタ）の存在下、１つ或いはそれ以上の標識づ
けデオキリボヌクレオチドトリホスフェート１０〜１０
０ピコモル、場合によっては標識づけされないデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェート１０〜１００ピコモ
ル、ＤＮＡポリメラーゼ約０．０４ユニット及びデオキ
シリボヌクレアーゼＩ約４ピコグラムをもつ固形支持体
上で吸着されるＤＮＡの培養によって行われる。
【００２２】本発明と一致する方法の好ましい実施態様
によると、その固形支持体は、ＤＮＡの中へ定量的に合
体されるマーカーの検出の前に１回或いはそれ以上の洗
浄される。
によると、その固形支持体は、ＤＮＡの中へ定量的に合
体されるマーカーの検出の前に１回或いはそれ以上の洗
浄される。
【００２３】この実施態様の好ましい様相によると、任
意或いは複数の洗浄は、０．２Ｍリン酸塩、０．１Ｍク
エン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤で
行われる。
意或いは複数の洗浄は、０．２Ｍリン酸塩、０．１Ｍク
エン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤で
行われる。
【００２４】この実施態様の別の有利な様相によると、
固形支持体の任意或いは複数の洗浄は、硼酸塩緩衝剤（
イオン強度約０．１）０．１％トウィーン２０ｐＨ８〜
８．５で行われる。
固形支持体の任意或いは複数の洗浄は、硼酸塩緩衝剤（
イオン強度約０．１）０．１％トウィーン２０ｐＨ８〜
８．５で行われる。
【００２５】本発明と一致する方法の好ましい実施態様
によると、ＤＮＡへ合体されるマーカー検出は、適当な
装置を用いて定量化できる信号を適当な酵素の存在下そ
の反応が放射する基質を使用する酵素反応を用いて行わ
れる。
によると、ＤＮＡへ合体されるマーカー検出は、適当な
装置を用いて定量化できる信号を適当な酵素の存在下そ
の反応が放射する基質を使用する酵素反応を用いて行わ
れる。
【００２６】この実施態様の好ましい様相によると、Ｄ
ＮＡへ合体されるマーカーがビオチンにされるので、Ｄ
ＮＡへ合体されるこのマーカーの検出は、第３段階の経
過している間、アビジン／酵素或いはストレプタビジン
／酵素の添加によって行われる。
ＮＡへ合体されるマーカーがビオチンにされるので、Ｄ
ＮＡへ合体されるこのマーカーの検出は、第３段階の経
過している間、アビジン／酵素或いはストレプタビジン
／酵素の添加によって行われる。
【００２７】この実施態様の有利な様相によると、アビ
ジン或いはストレプタビシンへ結合される酵素はペルオ
キシダーゼである。
ジン或いはストレプタビシンへ結合される酵素はペルオ
キシダーゼである。
【００２８】この実施態様の有利な様相によると、０．
２Ｍリン酸塩、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、４％ポ
リエチレングリコール（６０００）緩衝剤で適当な濃度
に対し予め稀釈されるストレプタビジン／ペルオキシダ
ーゼ錯体は、温度約４〜３７°Ｃで５〜３０分間培養さ
れる。
２Ｍリン酸塩、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、４％ポ
リエチレングリコール（６０００）緩衝剤で適当な濃度
に対し予め稀釈されるストレプタビジン／ペルオキシダ
ーゼ錯体は、温度約４〜３７°Ｃで５〜３０分間培養さ
れる。
【００２９】本発明の方法と一致する好ましい実施例に
よると、ペルオキシドの酵素性活性度は、固形支持体を
洗浄後、その酵素の作用下測定可能信号をその改質が与
える基質の添加によって決定される。
よると、ペルオキシドの酵素性活性度は、固形支持体を
洗浄後、その酵素の作用下測定可能信号をその改質が与
える基質の添加によって決定される。
【００３０】この実施態様の有利な様相によると、任意
或いは複数の洗浄は、０．２Ｍリン酸塩、０．１Ｍクエ
ン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤で行
われる。
或いは複数の洗浄は、０．２Ｍリン酸塩、０．１Ｍクエ
ン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤で行
われる。
【００３１】この実施態様の別の有利な様相によると、
固形支持体の任意或いは複数の洗浄は、硼酸塩緩衝剤（
イオン強度約０．１）、０．１％トウィーン２０、ｐＨ
８〜８．５で行われる。
固形支持体の任意或いは複数の洗浄は、硼酸塩緩衝剤（
イオン強度約０．１）、０．１％トウィーン２０、ｐＨ
８〜８．５で行われる。
【００３２】この実施態様の有利な様相によると、ペル
オキシドの酵素性活性度は、０．２Ｍリン酸塩、０．１
Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝
剤で固形支持体を洗浄後３３´５５´テトラメチルベン
ジジンの添加によって決定される。青色反応の読出しは
、４５０ｎｍの際分光光度計で、２〜４Ｎ硫酸の添加に
よって反応を停止後、２、３分後れて行われる。
オキシドの酵素性活性度は、０．２Ｍリン酸塩、０．１
Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝
剤で固形支持体を洗浄後３３´５５´テトラメチルベン
ジジンの添加によって決定される。青色反応の読出しは
、４５０ｎｍの際分光光度計で、２〜４Ｎ硫酸の添加に
よって反応を停止後、２、３分後れて行われる。
【００３３】先行する構成に加えて、更に本発明は、以
下の説明から明らかとなるだろう別の構成を含んでいる
。
下の説明から明らかとなるだろう別の構成を含んでいる
。
【００３４】本発明は、具体的には先行する構成と一致
して、（ｉ） 細胞外位置で生物学液体にあるＤＮＡを
投与する新しい方法、（ｉｉ）この方法を使用する生物
学的分析、（ｉｉｉ） 生理学及び病理学状況の解明及
び（ｉｖ）本発明と一致する方法を用いて確立される診
断を目的とする。
して、（ｉ） 細胞外位置で生物学液体にあるＤＮＡを
投与する新しい方法、（ｉｉ）この方法を使用する生物
学的分析、（ｉｉｉ） 生理学及び病理学状況の解明及
び（ｉｖ）本発明と一致する方法を用いて確立される診
断を目的とする。
【００３５】
【実施例】本発明の要旨である方法の実施例及び応用を
説明する下記の例から本発明をより良く理解できる。こ
れらの例が例示の目的にしか示されず又どのようにでも
本発明を限定するものではない。 実施例１：血漿で循環するＤＮＡの検出−微小滴定板の
感作、即ち、０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤ｐＨ９．６の１０μ
ｇ／ｍｌでヒストン蛋白質５０ｍｌの添加。４°Ｃで２
４時間培養、続いて硼酸塩緩衝剤（イオン強度０．１）
０．１％トウィーン２０で３回洗浄。 −固形支持体でＤＮＡの吸着、即ち３０°Ｃで１５分間
血漿５０μｌの培養。 −ＤＮＡの標識づけ：即ち２．５ｍＭトリスヒドロキシ
アミノメタン緩衝剤ｐＨ８．１ｍＭＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）で３回洗浄後、０．５ｍＭトリスヒド
ロキシアミノメタン０．１ＭｐＨ８、３ｍＭＭｇＣｌ２
、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、９ｍＭβ２メルカプトエタノ
ール及びビオチン１４ｄＡＴＰ４０ピコモル、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＲ及びｄＣＴＰ２０ピコモル、ＤＮＡポリメラ
ーゼ０．０４ユニット及び膵臓デオキシリボヌクレアー
ゼＩ４ピコグラムを含む反応媒質５０μｌの添加及び３
０°Ｃで１時間培養。 −標識づけの検出：即ち、０．２Ｍリン酸塩／０．１Ｍ
クエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤
で３回洗浄後、リン酸塩／クエン酸塩４％、ポリエチレ
ングリコール緩衝剤で１／１０００に対し稀釈されるス
トレプタビジン／ペルオキシド抱合体（アメルサム）４
０μｌの添加。３０°Ｃで培養１５分間及び０．２Ｍリ
ン酸塩／０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウ
ィーン２０緩衝剤で４回洗浄後、基質（３３´５５´テ
トラメチルベンジジン）５０μｌの添加。２、３分後、
４ＮＨ２ＳＯ４５０μｌの添加によってその着色反応を
停止し且つ読出しが４５０ｎｍで「マルチスカン流」分
光光度計で行われる。 実施例２：固形支持体としてヒストン蛋白質によって感
作される微小滴定板を使用する細菌性エンドトキシン（
或いはリポポリサッカリド：ＬＰＳ）で注射されるマウ
スの血漿で又無処理マウスの血漿で循環するＤＮＡの検
出（表１）。 −微小滴定板の感作。即ち、０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤ｐＨ
９．６の１０μｇ／ｍｌでヒストン蛋白質５０μｌの添
加。４°Ｃで２４時間培養、続いて硼酸塩緩衝剤（イオ
ン強度０．１）０．１％トウィーン２０ｐＨ８．３で３
回洗浄。 −固形支持体上で吸着。即ち３０°Ｃで１２０分間異な
る稀釈でマウス血漿３５μｌの培養。 −ＤＮＡの標識づけ：即ち２．５ｍＭトリスヒドロキシ
アミノメタン緩衝剤ｐＨ８．１ｍＭＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）で３回洗浄後、０．５ｍＭトリスヒド
ロキシアミノメタン０．１ＭｐＨ８、３ｍＭＭｇＣｌ２
、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、９ｍＭβ２メルカプトエタノ
ール及びビオチン１４−ｄＡＴＰ４０ピコモル、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ２０ピコモル、ＤＮＡポリメ
ラーゼ０．０４ユニットを含む反応媒質３５μｌの添加
及び３０°Ｃで２時間培養。 −標識づけの検出：即ち、０．２Ｍリン酸塩／０．１Ｍ
クエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤
で３回洗浄後、リン酸塩／クエン酸塩４％ポリエチレン
グリコールで１／１０００に対し稀釈されるストレプタ
ビジン／ペルオキシダーゼ抱合体（ＢＲＬ）４０μｌの
添加。３０°Ｃで培養３０分及び０．２Ｍリン酸塩／０
．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０
緩衝剤で４回洗浄後、基質（３５´５５´テトラメチル
ベンジジン）５０μｌの添加。２、３分後、４ＮＨ２Ｓ
Ｏ４５０μｌの添加により着色反応を停止し且つ４５０
ｎｍのとき「マルチスカン流」分光光度計で読出しを行
う。
説明する下記の例から本発明をより良く理解できる。こ
れらの例が例示の目的にしか示されず又どのようにでも
本発明を限定するものではない。 実施例１：血漿で循環するＤＮＡの検出−微小滴定板の
感作、即ち、０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤ｐＨ９．６の１０μ
ｇ／ｍｌでヒストン蛋白質５０ｍｌの添加。４°Ｃで２
４時間培養、続いて硼酸塩緩衝剤（イオン強度０．１）
０．１％トウィーン２０で３回洗浄。 −固形支持体でＤＮＡの吸着、即ち３０°Ｃで１５分間
血漿５０μｌの培養。 −ＤＮＡの標識づけ：即ち２．５ｍＭトリスヒドロキシ
アミノメタン緩衝剤ｐＨ８．１ｍＭＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）で３回洗浄後、０．５ｍＭトリスヒド
ロキシアミノメタン０．１ＭｐＨ８、３ｍＭＭｇＣｌ２
、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、９ｍＭβ２メルカプトエタノ
ール及びビオチン１４ｄＡＴＰ４０ピコモル、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＲ及びｄＣＴＰ２０ピコモル、ＤＮＡポリメラ
ーゼ０．０４ユニット及び膵臓デオキシリボヌクレアー
ゼＩ４ピコグラムを含む反応媒質５０μｌの添加及び３
０°Ｃで１時間培養。 −標識づけの検出：即ち、０．２Ｍリン酸塩／０．１Ｍ
クエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤
で３回洗浄後、リン酸塩／クエン酸塩４％、ポリエチレ
ングリコール緩衝剤で１／１０００に対し稀釈されるス
トレプタビジン／ペルオキシド抱合体（アメルサム）４
０μｌの添加。３０°Ｃで培養１５分間及び０．２Ｍリ
ン酸塩／０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウ
ィーン２０緩衝剤で４回洗浄後、基質（３３´５５´テ
トラメチルベンジジン）５０μｌの添加。２、３分後、
４ＮＨ２ＳＯ４５０μｌの添加によってその着色反応を
停止し且つ読出しが４５０ｎｍで「マルチスカン流」分
光光度計で行われる。 実施例２：固形支持体としてヒストン蛋白質によって感
作される微小滴定板を使用する細菌性エンドトキシン（
或いはリポポリサッカリド：ＬＰＳ）で注射されるマウ
スの血漿で又無処理マウスの血漿で循環するＤＮＡの検
出（表１）。 −微小滴定板の感作。即ち、０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤ｐＨ
９．６の１０μｇ／ｍｌでヒストン蛋白質５０μｌの添
加。４°Ｃで２４時間培養、続いて硼酸塩緩衝剤（イオ
ン強度０．１）０．１％トウィーン２０ｐＨ８．３で３
回洗浄。 −固形支持体上で吸着。即ち３０°Ｃで１２０分間異な
る稀釈でマウス血漿３５μｌの培養。 −ＤＮＡの標識づけ：即ち２．５ｍＭトリスヒドロキシ
アミノメタン緩衝剤ｐＨ８．１ｍＭＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）で３回洗浄後、０．５ｍＭトリスヒド
ロキシアミノメタン０．１ＭｐＨ８、３ｍＭＭｇＣｌ２
、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、９ｍＭβ２メルカプトエタノ
ール及びビオチン１４−ｄＡＴＰ４０ピコモル、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ２０ピコモル、ＤＮＡポリメ
ラーゼ０．０４ユニットを含む反応媒質３５μｌの添加
及び３０°Ｃで２時間培養。 −標識づけの検出：即ち、０．２Ｍリン酸塩／０．１Ｍ
クエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０緩衝剤
で３回洗浄後、リン酸塩／クエン酸塩４％ポリエチレン
グリコールで１／１０００に対し稀釈されるストレプタ
ビジン／ペルオキシダーゼ抱合体（ＢＲＬ）４０μｌの
添加。３０°Ｃで培養３０分及び０．２Ｍリン酸塩／０
．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２０
緩衝剤で４回洗浄後、基質（３５´５５´テトラメチル
ベンジジン）５０μｌの添加。２、３分後、４ＮＨ２Ｓ
Ｏ４５０μｌの添加により着色反応を停止し且つ４５０
ｎｍのとき「マルチスカン流」分光光度計で読出しを行
う。
【００３６】
【表１】
―――――――――――――――――――――――――
――――――――――― ＬＰＳで注射され
るマウスの血漿で及び処理しないマウスの血漿で
循環するＤＮＡの検出 ―――――――――――――――――――――――――
―――――――――――
ＯＤ１ユニット（ＯＤ×１０００）
――――――――――――――――
ヒストンにより
十分感作 稀
釈 十分感作される
されない―――――――――――――――
――――――――――――――――――――― 「Ｌ
ＰＳ」 １／３
１４６２ １２８
血漿２ １／１５
９７２
９０ 未処理
１／３ １１６
１２２ 血漿３ １／１５ １０１
１０３――――――――――
―――――――――――――――――――――――――
―： １：ＯＤ＝光学密度 ２：０．１５ＭＮａＣｌ（０．２ｍｌ）で稀釈されるミ
ネソタＲｅ５９５菌からＬＰＳ１００マイクログラムで
腹腔内ルートによる出血前８時間注射され８週間成熟さ
れる雌マウスＯＦＩ。
――――――――――― ＬＰＳで注射され
るマウスの血漿で及び処理しないマウスの血漿で
循環するＤＮＡの検出 ―――――――――――――――――――――――――
―――――――――――
ＯＤ１ユニット（ＯＤ×１０００）
――――――――――――――――
ヒストンにより
十分感作 稀
釈 十分感作される
されない―――――――――――――――
――――――――――――――――――――― 「Ｌ
ＰＳ」 １／３
１４６２ １２８
血漿２ １／１５
９７２
９０ 未処理
１／３ １１６
１２２ 血漿３ １／１５ １０１
１０３――――――――――
―――――――――――――――――――――――――
―： １：ＯＤ＝光学密度 ２：０．１５ＭＮａＣｌ（０．２ｍｌ）で稀釈されるミ
ネソタＲｅ５９５菌からＬＰＳ１００マイクログラムで
腹腔内ルートによる出血前８時間注射され８週間成熟さ
れる雌マウスＯＦＩ。
【００３７】３：１５ＭＮａＣｌで出血前８時間注射さ
れ、８週間成熟される雌マウスＯＦＩ。 実施例３：固形支持体としてヒストン蛋白質により感作
される微量滴定板を使用する無処理マウスの血漿に異な
る稀釈度で投与される細菌性エンドトキシンで注射され
るマウスの血漿の循環するＤＮＡの検出（表２）。
れ、８週間成熟される雌マウスＯＦＩ。 実施例３：固形支持体としてヒストン蛋白質により感作
される微量滴定板を使用する無処理マウスの血漿に異な
る稀釈度で投与される細菌性エンドトキシンで注射され
るマウスの血漿の循環するＤＮＡの検出（表２）。
【００３８】その方法論は、実施例２で説明されるもの
と同じである。得られた結果は、無処理マウスの血漿か
ら得られたＯＤ値に対して修正された。
と同じである。得られた結果は、無処理マウスの血漿か
ら得られたＯＤ値に対して修正された。
【００３９】
【表２】
―――――――――
―――――――――――
稀釈度の効果
――――――――――――
――――――――
稀釈度１ ＯＤ２
――――――――――
――――――――――
１／５，６ １４１
２ １／
２２ １０６３
１／９０
５２３
１／３６０
１９２
１／１４００ ７６
１／５７００
２６
――――――――――――――――――――１：
無処理マウスの血漿（ＮＭＰ）の細菌性エンドトキシン
（ＬＰＳ）で注射されるマウスの血漿の稀釈度。
―――――――――――
稀釈度の効果
――――――――――――
――――――――
稀釈度１ ＯＤ２
――――――――――
――――――――――
１／５，６ １４１
２ １／
２２ １０６３
１／９０
５２３
１／３６０
１９２
１／１４００ ７６
１／５７００
２６
――――――――――――――――――――１：
無処理マウスの血漿（ＮＭＰ）の細菌性エンドトキシン
（ＬＰＳ）で注射されるマウスの血漿の稀釈度。
【００４０】２：光学密度。その結果は、ＮＭＰで稀釈
されるＬＰＳで注射されるマウスの血漿によって与えら
れる値とＮＭＰにより与えられる値との間でＯＤユニッ
ト（ＯＤ×１０００）の差によって表示される。 実施例４：異なる起源のＤＮＡの投与（表３）。
されるＬＰＳで注射されるマウスの血漿によって与えら
れる値とＮＭＰにより与えられる値との間でＯＤユニッ
ト（ＯＤ×１０００）の差によって表示される。 実施例４：異なる起源のＤＮＡの投与（表３）。
【００４１】異なる起源のＤＮＡの同じ量を投与するた
め使用される方法論は、実施例２及び３で使用されるも
のと同じである。
め使用される方法論は、実施例２及び３で使用されるも
のと同じである。
【００４２】投与は、４つの異なる起源の７３１ｎｇ／
ｍｌでＤＮＡ３５μｌで行われた。
ｍｌでＤＮＡ３５μｌで行われた。
【００４３】
【表３】
―――――――――
―――――――――――
異なる起源のＤＮＡの投与
――――――――――――
――――――――
ＤＮＡ１ ＯＤユニット
―――――――――
―――――――――――
Ａ
１１２７
Ｂ １００
７
Ｃ ９９１
Ｄ
１１９５
／２
１８２
――――――――――――――――――――１：
投与ＤＮＡの起源、即ち Ａ：バクテリオファージ（ＭＰ２、マンハイム．ベーリ
ンガー） Ｂ：プラズミド（ＰＢＲ３３２、マンハイム．ベーリン
ガー） Ｃ：カーフ．サイマス（ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ） （
Ｖシグマ型式）Ｄ：ハムスター細胞（ＣＨＯから抽出さ
れるモノニクレオソーム） ２：１＝陰性対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
）（０．１５ＭＮａＣｌ） 実施例５：無処理マウス血漿（ＮＭＰ）の１／４へ稀釈
されるＬＰＳで注射されるマウスの血漿のＤＮＡの投与
。吸着及び標識づけ段階の長さの効果。投与の特異性の
対照（表４）。
―――――――――――
異なる起源のＤＮＡの投与
――――――――――――
――――――――
ＤＮＡ１ ＯＤユニット
―――――――――
―――――――――――
Ａ
１１２７
Ｂ １００
７
Ｃ ９９１
Ｄ
１１９５
／２
１８２
――――――――――――――――――――１：
投与ＤＮＡの起源、即ち Ａ：バクテリオファージ（ＭＰ２、マンハイム．ベーリ
ンガー） Ｂ：プラズミド（ＰＢＲ３３２、マンハイム．ベーリン
ガー） Ｃ：カーフ．サイマス（ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ） （
Ｖシグマ型式）Ｄ：ハムスター細胞（ＣＨＯから抽出さ
れるモノニクレオソーム） ２：１＝陰性対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
）（０．１５ＭＮａＣｌ） 実施例５：無処理マウス血漿（ＮＭＰ）の１／４へ稀釈
されるＬＰＳで注射されるマウスの血漿のＤＮＡの投与
。吸着及び標識づけ段階の長さの効果。投与の特異性の
対照（表４）。
【００４４】使用される方法論は、実施例１で説明され
る。２つの吸着時間（１５及び６０分）及び４つの標識
づけ時間（１５、３０、６０、１２０分）を試験した。 投与の特異性は、標識づけＤＮＡに対する反応媒質のＤ
ＮＡに対する特異酵素をオミットすることによって対照
された。
る。２つの吸着時間（１５及び６０分）及び４つの標識
づけ時間（１５、３０、６０、１２０分）を試験した。 投与の特異性は、標識づけＤＮＡに対する反応媒質のＤ
ＮＡに対する特異酵素をオミットすることによって対照
された。
【００４５】
【表４】
―――――――――――――――――――――――――
―――――――――――
吸着及び標識づけ段階の長さの効果
及び投与の特異性
の対照――――――――――――――――――――――
――――――――――――――
ＯＤユニ
ット（ＯＤ×１０００）――――――――――――――
――――――――――――――――――――――
段階の持続期間 ＬＰＳで注
射される ＮＭＰ
マウスの血漿―
―――――――――――――――――――――――――
―――――――――― 吸 着 標識づ
け ＋１ −２
＋ − １５ １５
９３８ １８８
２３２ １９９ １５ ３０
１１４１ ２１２ ２
４２ ２１４ １５ ６０
１４５３ ２１９ ２４
６ ２０３ １５ １２０
１４７８ ２２４ ２６２
２１２ ６０ １５
９６１ １１４ １６０
１２２ ６０ ３０
１０６４ １１６ １４９
１１１ ６０ ６０
１３８７ １０７ １６２
９９ ６０ １２０
１４４４ １９０ ２７６
１８０――――――――――――――――――――――
――――――――――――――１：＋：存在ＤＮＡに対
し特異酵素。
―――――――――――
吸着及び標識づけ段階の長さの効果
及び投与の特異性
の対照――――――――――――――――――――――
――――――――――――――
ＯＤユニ
ット（ＯＤ×１０００）――――――――――――――
――――――――――――――――――――――
段階の持続期間 ＬＰＳで注
射される ＮＭＰ
マウスの血漿―
―――――――――――――――――――――――――
―――――――――― 吸 着 標識づ
け ＋１ −２
＋ − １５ １５
９３８ １８８
２３２ １９９ １５ ３０
１１４１ ２１２ ２
４２ ２１４ １５ ６０
１４５３ ２１９ ２４
６ ２０３ １５ １２０
１４７８ ２２４ ２６２
２１２ ６０ １５
９６１ １１４ １６０
１２２ ６０ ３０
１０６４ １１６ １４９
１１１ ６０ ６０
１３８７ １０７ １６２
９９ ６０ １２０
１４４４ １９０ ２７６
１８０――――――――――――――――――――――
――――――――――――――１：＋：存在ＤＮＡに対
し特異酵素。
【００４６】２：（−）：不在ＤＮＡに対し特異酵素。
【００４７】
【発明の効果】以上説明したように本発明の方法は、血
漿で又、一般に、ＤＮＡより１０００倍多い蛋白質の程
度に含有する生物学媒質で定量的にＤＮＡを投与させ且
つ可視スペクトルで光学密度を読出す装置しか必要とせ
ずに容易に調整できる方法を構成し、ｎｇ／ｍｌ程度の
濃度の２、３マイクロリッターだけの試料でＤＮＡを検
出するため再現可能且つ十分敏感である。更に、本発明
の方法は、先行技術の方法よりも容易且つ少くとも１０
倍多い試料の同時投与を可能にし、実験状況下でもちろ
ん、人の血漿ＤＮＡ水準増加の生理学及び生理病理学的
異議を十分に理解させ且つＤＮＡによる生物学試料の細
胞死現象を定量化或いは汚染を検出させることが重要で
あるすべての状態を研究するため著しく貴重な道具を構
成する。
漿で又、一般に、ＤＮＡより１０００倍多い蛋白質の程
度に含有する生物学媒質で定量的にＤＮＡを投与させ且
つ可視スペクトルで光学密度を読出す装置しか必要とせ
ずに容易に調整できる方法を構成し、ｎｇ／ｍｌ程度の
濃度の２、３マイクロリッターだけの試料でＤＮＡを検
出するため再現可能且つ十分敏感である。更に、本発明
の方法は、先行技術の方法よりも容易且つ少くとも１０
倍多い試料の同時投与を可能にし、実験状況下でもちろ
ん、人の血漿ＤＮＡ水準増加の生理学及び生理病理学的
異議を十分に理解させ且つＤＮＡによる生物学試料の細
胞死現象を定量化或いは汚染を検出させることが重要で
あるすべての状態を研究するため著しく貴重な道具を構
成する。
Claims (27)
- 【請求項１】 媒質の細胞外位置にあるＤＮＡの投与
方法において、支持体上へ媒質にあるＤＮＡを固定する
工程と、少なくとも１つの標識づけされるデオキシリボ
ヌクレオチドを固定ＤＮＡへ合体する工程と、合体マー
カーを直接或いは間接に検出する工程と、を含む方法。 - 【請求項２】 支持体上へのＤＮＡの固定が吸着によ
って行われる請求項１の方法。 - 【請求項３】 ＤＮＡの固定が微小滴定板或いはメン
ブランのような固形支持体上へ吸着によって行われる請
求項２の方法。 - 【請求項４】 ＤＮＡの固定が支持体上へ直接固定或
いは間接固定でも、ＤＮＡに対し特定親和性をもつ物質
を使用する吸着によって行われる請求項２の方法。 - 【請求項５】 支持体上でのＤＮＡ固定がそれによっ
て行われるＤＮＡに対する特異親和性をもつ物質がゼラ
チン或いはカチオン物質に含まれる物質群から選択され
る請求項４の方法。 - 【請求項６】 支持体上へのＤＮＡ固定がそれによっ
て行われるＤＮＡに対する特異親和性をもつ物質がそれ
らの起源が何であっても１つ或いはそれ以上のヒストン
蛋白質によって代表される請求項５の方法。 - 【請求項７】 支持体上へのＤＮＡの固定は定温培養
温度がどんなものでも数時間０．０５〜０．１Ｍ炭酸塩
緩衝剤ｐＨ約９．６にヒストン蛋白質の混合物の定温培
養によって固形支持体感作の後行われる請求項６の方法
。 - 【請求項８】 試料に存在するＤＮＡの吸着が定温培
養温度がどんなものでも、１５〜１２０分間定温培養の
経過している間行われる請求項２〜７の１の方法。 - 【請求項９】 固形支持体は、吸着ＤＮＡの標識づけ
の行われる前に１回或いはそれ以上洗浄される請求項３
〜８のいずれか１項の方法。 - 【請求項１０】 固形支持体は吸着ＤＮＡの標識づけ
が行われる前に２．５ｍＭトリスｐＨ８、１ｍＭＥＤＴ
Ａの１回或いはそれ以上の洗浄される請求項９の方法。 - 【請求項１１】 吸着ＤＮＡの標識づけがＤＮＡに対
し特異な酵素を用いて行われる請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡの標識づけが少なくとも１つ
の標識デオキシリボヌクレオチドの、範囲１５〜４０°
Ｃの温度で、１５〜２４０分間の培養を経過する間、ハ
プロトミック切断移動反応（「ニックトランスレーショ
ン」）或いは全体による「プライマー標識づけ」或いは
「ターミナル標識づけ」のような任意他のＤＮＡ標識づ
け技術を使用して行われる請求項１１の方法。 - 【請求項１３】 ＤＮＡへ合体されるヌクレオチド或
いは複数のヌクレオチドがビオチンで標識づけされ且つ
それ或いはそれらの検出に対し使用される酵素がアビジ
ン或いはストレプタビジンである請求項１２の方法。 - 【請求項１４】 ハプロトミック切断移動による標識
づけがトリヒドロキシアミノメタン（０．５〜５ｍＭ）
、塩化マグネシウム（２〜５ｍＭ）及び場合によっては
βメルカプトエタノール（７〜１５ｍＭ）、及び牛属血
清アルブミン（２０〜６０マイクログラム／ミリｌ）の
ような緩衝剤の存在下１つ或いはより以上の、標識デオ
キシリボヌクレオチドトリホスフェート約１０〜１００
ピコモル、場合によっては１つ或いはより以上の不標識
デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート約１０〜１
００ピコモル、ＤＮＡポリメラーゼ約０．０４ユニット
及びデオキシリボヌクレアーゼＩ約４ピコグラムをもつ
固形支持体上へ吸着されるＤＮＡの培養によって行われ
る請求項１２或いは１３の方法。 - 【請求項１５】 ＤＮＡを標識づけした後、固形支持
体は、ＤＮＡへ定量的に合体されるマーカーの検出を行
う前に１回或いはより以上洗浄される請求項３〜１４の
いずれか１項の方法。 - 【請求項１６】 ＤＮＡを標識づけした後、０．２Ｍ
リン酸塩、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％ト
ウィーン２０緩衝剤で任意の洗浄或いは複数の洗浄を行
う請求項１５の方法。 - 【請求項１７】 ＤＮＡへ合体されるマーカーの検出
が酵素反応によって行われる請求項１〜１６のいずれか
１項の方法。 - 【請求項１８】 合体されるマーカーがビチオンであ
り且つＤＮＡへ合体されるこのマーカーの検出が抱合体
として公知のアビジン／酵素或いはストレプタビジン／
酵素化合物の添加によって行われる請求項１７の方法。 - 【請求項１９】 アビジン或いはストレプタビジンに
対し結合される酵素がペルオキシダーゼである請求項１
８の方法。 - 【請求項２０】 アビジン或いはストレプタビジンに
対して結合されるペルオキシダーゼが０．２Ｍリン酸塩
、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、４％ポリエチレング
リコール（６０００）緩衝剤で適当な濃度に対し予め稀
釈される請求項１９の方法。 - 【請求項２１】 アビジン或いはストレプタビジンに
対し結合されるペルオキシドがビチオンで標識づけされ
るＤＮＡの存在下温度約４〜３７°Ｃで５〜３０分間培
養される請求項２０の方法。 - 【請求項２２】 抱合体の培養後、固形支持体が１回
或いはより以上洗浄される請求項１８〜２１のいずれか
１項の方法。 - 【請求項２３】 抱合体の培養後０．２Ｍリン酸塩、
０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．４、０．１％トウィーン２
０緩衝剤で固形支持体の洗浄或いは複数の洗浄を行う請
求項２２の方法。 - 【請求項２４】 抱合体の存在が任意の基質を使用し
て検出され、この基質の反応が抱合体の存在下分光光度
計、分光螢光計或いは特にバイオセンサのような適当な
装置で定量化可能信号をもたらす請求項１７〜２３のい
ずれか１項の方法。 - 【請求項２５】 ペルオキシドの酵素性活性度がペル
オキシダーゼの作用下着色反応を生成する３３´５５´
テトラメチシルブベンジジンの添加によって決定される
請求項１９〜２４のいずれか１項の方法。 - 【請求項２６】 前記着色反応が４５０ｎｍの際分光
光度計で２〜４Ｎ硫酸添加によってその反応を停止後２
、３分示される請求項２５の方法。 - 【請求項２７】 硼酸塩（イオン強度約０．１）０．
１％トウィーン２０、ｐＨ８．３、緩衝剤で該洗浄或い
は該複数の洗浄を行う請求項９、１５又は２２の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9010700 | 1990-08-21 | ||
| FR9010700A FR2666096B1 (fr) | 1990-08-21 | 1990-08-21 | Nouveau procede de dosage d'acide desoxyribonucleique present en position extracellulaire dans un milieu. |
| US07/744,348 US6033846A (en) | 1990-08-21 | 1991-08-13 | Process for dosing of deoxyribonucleic acid found in an extracellular position in a medium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04248998A true JPH04248998A (ja) | 1992-09-04 |
Family
ID=26228213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3234103A Pending JPH04248998A (ja) | 1990-08-21 | 1991-08-21 | 媒質の細胞外位置にあるｄｎａの投与方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6033846A (ja) |
| EP (1) | EP0472482B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04248998A (ja) |
| AT (1) | ATE145009T1 (ja) |
| CA (1) | CA2049166A1 (ja) |
| DE (1) | DE69123010T2 (ja) |
| FR (1) | FR2666096B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US8388951B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-03-05 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic DNA mutation disease |
| RU2269358C2 (ru) * | 2003-07-14 | 2006-02-10 | Дмитрий Дмитриевич Генкин | Способ лечения генерализованных инфекций, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток |
| US8710012B2 (en) | 2003-07-14 | 2014-04-29 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating oncological diseases |
| US8916151B2 (en) * | 2005-04-25 | 2014-12-23 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating a reduction of fertility |
| WO2008066403A1 (fr) * | 2006-11-28 | 2008-06-05 | Dmitry Dmitrievich Genkin | Procédé de traitement de maladies humaines accompagnées d'une teneur plus élevée d'adn dans des espaces intercellulaires et préparation médicamenteuse destinée à sa mise en oeuvre |
| US20090147264A1 (en) * | 2007-04-30 | 2009-06-11 | The University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Label-free, real-time detection system for molecular interaction analysis |
| US10617743B2 (en) | 2014-06-19 | 2020-04-14 | Cls Therapeutics Limited | Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy |
| WO2016190780A1 (en) | 2015-05-22 | 2016-12-01 | Dmitry Dmitrievich Genkin | Extracellular dna as a therapeutic target in neurodegeneration |
| KR20200122320A (ko) | 2018-01-16 | 2020-10-27 | 씨엘에스 테라퓨틱스 리미티드 | 데옥시리보뉴클레아제 (dnase) 활성을 갖는 효소의 간 발현에 의한 질환의 치료 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4468346A (en) * | 1983-10-27 | 1984-08-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins |
| WO1985002627A1 (en) * | 1983-12-16 | 1985-06-20 | Genetics International, Inc. | Assay for nucleic acids |
| US4617261A (en) * | 1984-03-21 | 1986-10-14 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids and hybridization probes |
| US4767699A (en) * | 1985-05-02 | 1988-08-30 | Allied Corporation | Diagnostic reagent, kit and method employing polynucleotide displacement, separation, enzymatic cleavage and adenosine phosphate detection |
| FR2588383B1 (fr) * | 1985-10-04 | 1988-01-08 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau procede de recuperation et de dosage de microquantites d'acide desoxyribonucleique dans un liquide biologique acellulaire |
| DE3850273T2 (de) * | 1987-03-02 | 1994-09-29 | Gen Probe Inc | Polykationische Träger zur Reinigung, Trennung und Hybridisierung von Nukleinsäure. |
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1990
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