JPH04252955A - 蛋白質の測定方法、試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は蛋白質の測定方法、試薬
及びキットに関するものである。更に詳しくは、アルツ
ハイマー病アミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ７７０を特異的
に認識する抗体を、少なくともその組み合わせの一方に
用いることを特徴とするサンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
る、アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ７７
０又はその断片の免疫学的測定方法、試薬及びキットに
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、人口構成の高齢化に伴い、老人性
痴呆症をはじめとする、脳神経系の疾病が社会問題化し
つつある。これらの疾病の中には発症の原因や簡便な診
断法、治療法の確立されていない疾病も多く、その研究
開発が強く望まれている。このような病気には、アルツ
ハイマー型老人性痴呆症及びアルツハイマー病（以下こ
の２つを併せて、ＡＤと略す）が含まれる。ＡＤ患者の
脳には、老人斑アミロイドβ蛋白（以下老人斑アミロイ
ドと略す）を主要構成成分とする老人斑と呼ばれる構造
体が、正常人に比し、多く沈着することから老人斑アミ
ロイドとＡＤ発症の関係が注目されてきた。Ｋａｎｇら
により、老人斑アミロイドには前駆体（以下ＡＰＰと略
す）が存在すること（以下Ｋａｎｇらにより発見された
ＡＰＰをＡＰＰ６９５と略す）が報告され（Ｋａｎｇら
、Ｎａｔｕｒｅ　　３２５　　　７３３−７３６　　１
９８７、特開昭６３―２２２６９３号公報参照）、さら
に本発明者らの研究等により、ＡＰＰには少なくとも３
種類（ＡＰＰ６９５に加えてＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７
７０）存在することが明らかになった（Ｐｏｎｔｅら、
Ｎａｔｕｒｅ　　３３１　　５２５―５２７　　１９８
８、Ｔａｎｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ　　３３１　　５２８
―５３０　　１９８８、Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　　３３１　　５３０―５３２　　１９８８、欧
州特許公開番号０３０４０１３号公報、特許出願公表　
　平２―５０１７９６号公報、国際公開番号ＷＯ８９／
０７６５７）。更に、７１４アミノ酸からなるアルツハ
イマー病アミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ７１４（Ｇｏｌｄ
ｅら、Ｎｅｕｒｏｎ　　４　　２５３ー２６７　　１９
９０）、及び老人斑アミロイド部分はもたない、５６３
アミノ酸からなるＡＰＰ５６３（ｄｅＳａｕｖａｇｅら
　　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２４５　　６５１−６５３　　
１９８９）もマイナー成分ながらその存在が知られてい
る（図１）。ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０にはＫｕｎ
ｉｔｚ型プロテアーゼインヒビターと高い相同性を有す
る領域が存在すること、及び実際にプロテアーゼインヒ
ビター活性が存在することが明らかになった（図１）。 ＡＤ患者における老人斑アミロイドの脳内沈着を、プロ
テアーゼインヒビターによる脳内の代謝阻害、ＡＰＰの
不完全分解の結果と考えるならば、プロテアーゼインヒ
ビター活性を有するＡＰＰの過剰発現が、ＡＤの発症に
何らかの役割をはたしている可能性が考えられる。この
見地から、本発明者らは、３種類のＡＰＰメッセンジャ
ーＲＮＡの発現量をＡＤ患者と正常人の脳について検討
したところ、ＡＤ患者においてＡＰＰ７７０メッセンジ
ャーＲＮＡの発現量が２倍程高いという結果を得た。ま
たＡＰＰ７５１メッセンジャーＲＮＡ量もＡＤ患者で対
照に比べ１．１倍から１．３倍高いという結果を得てい
る（Ｔａｎａｋａら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１５７　　４７
２―４７９　　１９８８　　及びＢ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６
５　　１４０６―１４１４　　１９９０）。ＡＰＰ７７
０メッセンジャーＲＮＡの方がＡＤ患者と対照との差が
明確であり、ＡＰＰ７７０蛋白の特異的な検出がＡＤの
診断に重要な情報を提供することを示唆している。

【０００３】また、ヒト髄液を被検体として、プロテア
ーゼインヒビター（ＫＰＩ；ここでＫＰＩとはＡＰＰ７
７０及びＡＰＰ７５１のＮ末端側から数えて２８９番目
のＧｌｕから３４４番目のＡｌａまでの５６残基を指し
、種々のプロテアーゼに対して阻害活性を有する。）領
域を含むＡＰＰまたはその断片量をトリプシンＥＬＩＳ
Ａ法（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６６
　　１４５３―１４５９１９９０　　及び　　特願平１
―２１４１１８、特願平２−２２０８８９）により測定
した結果、ＡＤ群は脳血管性痴呆群に比し、有意に高値
を示すという結果が得られている（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ
ら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６６　　１４５３―１４５９　
　１９９０、及び、第３１回日本神経学会総会　　抄録
集２４１ページＩＩーＪー０５　　１９９０年）。この
結果は、ＡＰＰ７７０及びＡＰＰ７５１中に共通に存在
するプロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）領域を認識す
るウサギ抗血清と、トリプシン（このプロテアーゼイン
ヒビター領域と強く結合する）とを用いたトリプシンＥ
ＬＩＳＡ法により得られたものである。（但し、ＥＬＩ
ＳＡとは、Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｌｉｎｋｅｄ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　Ａｓｓａｙの略である）。しか
しながら、例えば、血清や血漿を被検体とし、且つトリ
プシンを固相に結合して第１抗体の代わりに用いる場合
には、血液中のトリプシンインヒビターとトリプシンが
結合してしまうため、アッセイプレート固相への被検体
タンパク（即ちＡＰＰ）の結合量が充分でない場合があ
る。そこで、トリプシンＥＬＩＳＡ法に代わるＡＰＰ７
５１及びＡＰＰ７７０の高感度検出方法が望まれている
。更に先述した様にＡＤ患者と対照とのメッセンジャー
ＲＮＡの発現量の違いがＡＰＰ７７０について特に顕著
であったことを考えると特にＡＰＰ７７０蛋白を特異的
に且つ、高感度に検出する方法が強く望まれている。し
かしながら、現在のところＡＰＰ７７０蛋白を特異的に
検出する方法については報告がない。

【０００４】ＫＰＩ配列、即ちＡＰＰ７７０及びＡＰＰ
７５１を認識する抗体に関しては、合成ペプチドを抗原
として作製したものが報告されているが（Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎら、ＥＭＢＯ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　８　　３６２
７−３６３２、１９８９、Ｐａｌｍｅｒｔら、Ｎｅｕｒ
ｏｌｏｇｙ　　４０　　１０２８−１０３４１９９０）
、これらはいずれもウェスタンブロッティングにしか使
用されておらずＥＬＩＳＡには使用されていない。ウェ
スタンブロッティング法に於いては、被検体を濃縮、脱
塩、さらに界面活性剤や還元剤による変性処理等の操作
を行った後、電気泳動によりタンパク質の分離を行い、
これに対して抗原抗体反応を行わなければならない。そ
のため操作が煩雑で、多数の検体について測定が困難で
あること、被検試料に含まれるＡＰＰ以外の夾雑タンパ
クの量によって検出感度が著しく左右されること等の点
で問題がある。更にこれらのウェスタンブロッティング
で使用されている抗体は、ＡＰＰ７７０とＡＰＰ７５１
を区別することができない。また、ＡＰＰのＣ末端側（
ＡＰＰ６９５、７５１、７７０に共通な配列。ＡＰＰ６
９５でいえば第６６７―６７６残基）に対する抗体で、
ラジオイムノアッセイ法（以下ＲＩＡと略す）によって
、血清中のＡＰＰ濃度を検討したところ、ＡＤ／対照に
有意差はなかったとする報告もある（Ｒｕｍｂｌｅら、
Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｊ．Ｍｅｄ．３２０、１
４４６―１４５２、１９８９）。ただし髄液や血液等体
液中に存在するＡＰＰの殆どは、膜貫通領域よりＣ末端
側の配列を有していない（例えばＰａｌｍｅｒｔら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８６
、６３３８―６３４２、１９８９、Ｐａｌｍｅｒｔら、
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　　４０、１０２８―１０３４、１
９９０、ｖａｎ　　Ｎｏｓｔｒａｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　　２４８、７４５―７４８、１９９０、Ｃｏｌｅら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
．　　１７０、２８８―２９５、１９９０など）。これ
らの現状に於いて、臨床現場でのＡＰＰ７７０の特異的
、且つ迅速な定量方法の確立が求められていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、測
定操作及び試料の調製が簡便であるとともに、高感度に
ＡＰＰ７７０及びその断片を測定することのできる、測
定方法、試薬及びキットを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的達成のため、本
発明者が鋭意研究を行った結果、ＡＰＰ７７０及びその
断片の定量方法として、ＡＰＰ７７０を特異的に認識す
る抗体を少なくとも１種類用いた２抗体サンドイッチＥ
ＬＩＳＡ法によって可能となることを見いだし、さらに
当該方法により、測定操作及び試料の調製が簡便である
とともに、高感度にこれらを定量できる試薬及びキット
を作成し、本発明を完成するに至った。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。サ
ンドイッチＥＬＩＳＡ法による免疫学的測定方法とは、
抗原上の２つの異なった抗体認識部位（これを抗原決定
基という）にそれぞれ結合する２種類の抗体を用いて抗
原の有無又はその量を測定する方法である。本発明にお
いて用いられる、ＡＰＰ７７０の検出のための抗体とし
ては、一方がＡＰＰ７７０を特異的に認識する抗体であ
ることが要件であり、他方に用いられる抗体としてはＡ
ＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、又はＡＰＰ７７０等各種Ａ
ＰＰを認識できる抗体や、ＡＰＰ７７０に固有の配列を
認識する抗体で第１抗体とは異なる抗原決定基を認識す
る抗体との組み合わせであっても良い。

【０００８】ＡＰＰ７７０を特異的に認識する抗体とし
て、例えば本発明実施例１に記載した７Ｅ１１モノクロ
ーナル抗体（微工研菌寄第１１６３３号（ＦＥＲＭ　　
Ｐ−１１６３３）のハイブリドーマが産生する）が挙げ
られる。他方に用いられる抗体としては、ＡＰＰ６９５
、ＡＰＰ７５１、又はＡＰＰ７７０等各種ＡＰＰを認識
できる抗体や、ＡＰＰ７７０に固有の配列を認識する抗
体で第１抗体とは異なる抗原決定基を認識する抗体でも
良い。また、髄液や血清中のＡＰＰの殆どは膜貫通領域
からＣ末端までの配列を含んでいないことから、ＡＰＰ
６９５やＡＰＰ７５１又はＡＰＰ７７０の膜貫通領域か
ら　カルボキシル末端までを除去したＡＰＰ誘導体を認
識するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体等も有
用である。例えば、本発明者らによって作成された、Ａ
ＰＰ６９５のＣ末端部分１０３アミノ酸（膜貫通領域及
び細胞内部分）が欠失したＡＰＰ６９５誘導体であるＡ
ＰＰ５９２（実施例参照）を免疫して得られた、ウサギ
抗ＡＰＰ５９２ポリクローナル抗体等及びマウス抗ＡＰ
Ｐ５９２モノクローナル抗体等が挙げられる。モノクロ
ーナル抗体の例としては、微工研菌寄第１１９４２号（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９４２、モノクローナル抗体１Ｂ
２を産生する）、同１１９４３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１
１９４３、モノクローナル抗体３Ｂ２を産生する）、及
び同１１９４４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９４４、モノ
クローナル抗体６Ａ３を産生する）のハイブリドーマが
産生する抗体等が挙げられる。或いは、ＡＰＰ７７０及
びＡＰＰ７５１上に存在するＫＰＩを認識する抗体との
組み合わせであっても良い。このような例としては本発
明実施例１に記載した抗ＺｔＰＩポリクローナル抗体が
挙げられる。

【０００９】これらの抗体は完全な形の抗体のままで用
い得ることは勿論のこと、その本質的結合能が維持され
る抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）
２　　等として用いることもできる。本発明における被
検試料としては特に限定はないが、具体的には、髄液、
血液（血漿及び血清）、尿等が挙げられる。また、脳等
の組織や細胞の抽出物を用いることもできる。

【００１０】本発明において用いられる不溶性担体とし
ては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリエステル、フッ素樹脂、ガラス、金属及びこ
れらの組み合わせ等を例示することができる。また不溶
性担体の形状としては、例えばトレー状、球状、繊維状
、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状で
本発明を実施することができる。多数の被検試料を同時
に測定できる点では、９６穴マイクロプレート等が好ま
しい。

【００１１】本発明に於いては第２抗体として用いられ
る抗体を直接、酵素や放射性同位元素或いはＦＩＴＣ等
の蛍光物質で標識してもよい。或いは、かかる第２抗体
に対する抗体を標識したものを第３抗体として用いても
よい。或いは第２抗体を、ビオチン等のマーカー化合物
で標識し、このマーカー化合物に特異的に結合する物質
（ビオチンの場合、ストレプトアビジンやアビジン）を
、酵素や蛍光色素、放射性同位元素等で標識したものを
結合させるという方法も用いられる。

【００１２】本発明に於いては最終的な検出手段は特に
限定せず、ＡＰＰ７７０の特異的な検出に用いられる１
組の２種類の抗体の一方として、ＡＰＰ７７０を特異的
に認識する抗体を用いることが要件であり、かかる組み
合わせにより認識固定された後の検出手段は如何なるも
のでも構わない。しかしながら、本発明に用いることが
できる代表的検出法を例示すると、第２抗体を酵素、放
射性同位元素、蛍光物質或いは他の結合物質で標識した
ものを用いる検出方法となる。

【００１３】酵素を用いる検出方法では、酵素としては
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラ
ディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ）等があり、それぞれの酵素に対応
する比色基質、或いは蛍光基質を加え、比色計、または
蛍光光度計を用いて生成物を定量する。上記酵素に対す
る代表的基質としては、β―Ｇａｌの基質として、ｏ―
ニトロフェニル―β―Ｄ―ガラクトシド（比色基質）、
４―メチルウンベリフェリル―β―Ｄ―ガラクトシド（
蛍光基質）等、ＨＲＰの基質として、ｏ―フェニレンジ
アミン（比色基質）等、ＡＰの基質として、ｐ―ニトロ
フェニルリン酸（比色基質）等を挙げることができる。 放射性同位元素を用いる検出方法としては、１２５−Ｉ
等で標識された第２抗体を用い、γ−ウェルカウンター
等を用いて放射活性を測定する。また、第２抗体をビオ
チン標識し、更にアビジンで標識した酵素と反応させ、
以下酵素を用いる検出の場合と同様の反応を行って、検
出することも可能である。また蛍光物質を用いる方法で
は、蛍光物質として、フルオレッセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）等を例示することができる。これらは
例示したものに限らず、免疫学的測定方法に使用されて
いるものであれば、他のものでも使用できる。

【００１４】本発明で用いる抗体を使用して、ＲＩＡを
組むことも可能である。ＲＩＡの１つの方法としてＡＰ
Ｐ７７０又はその断片を、放射性同位元素で標識して標
識抗原とし、これと試料中の抗原（非標識抗原）とが、
本発明で用いる抗体を不溶性担体に結合したものに、競
争的に結合させ、標識抗原の結合の度合いで、試料中の
抗原量を測定する方法が挙げられる。即ち、試料中の抗
原量が多ければ、不溶性担体に結合した標識抗原は少な
くなり、遊離の標識抗原が多くなる。試料中の抗原量が
少なければ、その逆となる。また、ＲＩＡの他の方法と
して、先述した様に、本発明で用いる第２抗体を放射性
同位元素で標識し、試料中の抗原と結合した標識抗体量
を測定する方法も挙げられる。

【００１５】次に本発明による、アルツハイマー病アミ
ロイド前駆体蛋白ＡＰＰ７７０の測定方法について具体
的に説明する。ＡＰＰ７７０を特異的を認識する抗体（
第１抗体）を適当な不溶性担体、例えば９６穴ポリスチ
レン製マイクロプレートに固定化する（以下これを”固
定化抗体”という）。固定用バッファーとしては、炭酸
ナトリウム―炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．
６）、或いはリン酸緩衝塩類溶液（以下ＰＢＳ（−）と
略す）等が用いられる。固定は、４℃で一晩放置するの
が一般的であるが、例えば、室温で２時間程度静置する
ことも可能である。このようにして第１抗体を固定した
マイクロプレートをＰＢＳ（−）等によって洗浄する。 次いで不溶性担体と、測定しようとする試薬又は被検試
料との非特異的結合を避けるために、適当な物質、例え
ば１〜３％ウシ血清アルブミンやスキムミルク／ＰＢＳ
（−）溶液で、不溶性担体の表面を被覆する。 被覆は、３７℃や室温で２時間程度、静置又はプレート
ミキサー等で攪拌しながら行うのが一般的である。被覆
後、再びマイクロプレートをＰＢＳ（−）等で洗浄する
。このようにして得られた、第１抗体が固定化された不
溶性担体を被検試料と一定時間及び一定温度で接触させ
反応させる。反応は４℃で一晩プレートミキサー等で攪
拌しながら行うのが一般的であるが、室温や３７℃で１
〜２時間程度行うことも可能である。この間に固定化抗
体（第１抗体）と被検試料中のＡＰＰ７７０又はその断
片が結合する。次いでＰＢＳ（−）等で洗った後、適当
な標識物質、例えば、β―ガラクトシダーゼ、ホースラ
ディッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ等の酵素や、１２５−Ｉ等の放射性同位元素で標識化
した、前述したようなＡＰＰ７７０を認識できる抗体（
第２抗体）の溶液を、不溶性担体上の固定化抗体に結合
したＡＰＰ７７０又はその断片と一定時間及び一定温度
例えば、４℃で一晩、或いは室温で１〜２時間接触させ
第２抗体と反応させる。これを再び、ＰＢＳ（−）等で
洗い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標識さ
れた標識物質の量を測定する。酵素を用いる検出方法で
は、酵素としては、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇ
ａｌ）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ
）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）等があり、それ
ぞれの酵素に対応する比色基質、或いは蛍光基質を加え
、比色計、または蛍光光度計を用いて生成物を定量する
。上記酵素に対する代表的基質としては、β―Ｇａｌの
基質として、ｏ―ニトロフェニル―β―Ｄ―ガラクトシ
ド（比色基質）、４―メチルウンベリフェリル―β―Ｄ
―ガラクトシド（蛍光基質）等、ＨＲＰの基質として、
ｏ―フェニレンジアミン（比色基質）等、ＡＰの基質と
して、ｐ―ニトロフェニルリン酸（比色基質）等を挙げ
ることができる。放射性同位元素を用いる検出方法とし
ては、１２５−Ｉ等で標識された第２抗体を用い、γ−
ウェルカウンター等を用いて放射活性を測定する。また
アビジンのビオチンに対する高親和性を利用して、第２
抗体をビオチン標識し、更にアビジンやストレプトアビ
ジンで標識した酵素をと反応させ、以下酵素を用いる検
出の場合と同様の反応を行って、検出することも可能で
ある。　　一方、被検試料の代わりに種々の濃度の標準
品、例えば組換えＤＮＡ法により産生した、精製アルツ
ハイマー病アミロイド前駆体蛋白又はその断片、或いは
標準となる髄液や血液、尿などを用いて標準検量線を作
製し、これと、被検試料の測定値を対比させ、被検試料
中のアルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白の量を算出
し、定量することができる。第１抗体としてＡＰＰ７７
０を特異的に認識する抗体、第２抗体としてＡＰＰを認
識する抗体について述べたが、第１抗体と第２抗体の組
み合わせは逆であっても構わない。また、第１抗体、第
２抗体がＡＰＰ７７０に固有な配列上の異なる抗原決定
基を認識する抗体の組み合わせであってもよい。

【００１６】本発明に於ける測定試薬は、一方を不溶性
担体に結合した第１抗体と他方の第２抗体とにより構成
される。また、この試薬を能率よく、且つ簡便に利用す
るために、これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキッ
トを形成することができる。係る補助剤としては、例え
ば、検量線作製用標準品、試薬を溶解させるための溶解
剤、不溶化担体を洗浄するために使用される洗浄剤、抗
体の標識物質として酵素を使用した場合、酵素活性を測
定するための基質、その反応停止剤等の免疫学的測定試
薬のキットとして通常使用されるものが挙げられる。

【００１７】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳述するが、本
発明は該実施例によって限定されるものではない。 実施例１　　抗原、アッセイ用タンパク及び抗体の作成
［工程１］ＡＰＰ７７０に特異的なモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ７Ｅ１１の作成 （ｉ）マウスの感作 ＡＰＰ７７０に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ
作成のための抗原ＡＰＰＩ−８８（特願平２−２４２４
６９号に於いてはＩＪの名前で記載してある。）は、以
下のようにして調製した。ＡＰＰＩ−８８はＡＰＰ７７
０の２８９番目のＧｌｕ残基から３６９番目のＡｌａ残
基までのアミノ酸配列を含む。北口ら（北口ら、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０３８　　１
０５−１１３　　１９９０、及び特願平２−２４２４６
９号）に記載の方法によりＡＰＰＩ−８８を動物細胞に
発現させ、精製ＡＰＰＩ−８８　　５００μｇを得た。 この精製ＡＰＰＩ−８８をＰＢＳ（−）に溶かし、Ｌａ
ｅｍｍｌｉのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ　　Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　６
８０−６８５　　（１９７０））中で１００℃、３分間
煮沸後、４倍容のアセトンを加え、−２０℃で１時間冷
却を行い、９０００回転２０分間の遠心操作を行った。 過剰量のＳＤＳを除去し、沈査よりＳＤＳ変性ＡＰＰＩ
−８８を回収し、これをハイブリドーマ作成のための抗
原として用いた。免疫は５０μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰＩ
−８８を５００μｌのＰＢＳ（−）に溶かしたものをそ
れぞれ３匹の６週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスの腹腔にフ
ロイントの完全アジュバントと共に注射し、以後２週間
の間隔でフロイントの不完全アジュバントと共に合計４
回の免疫を行った。免疫の過程で抗原に対する血清の抗
体価の上昇を単クローン抗体実験マニュアル（講談社サ
イエンティフィク　　富山朔二著）に従って、固相ＥＬ
ＩＳＡ法により確認した。

【００１８】（ｉｉ）細胞融合 単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフ
ィク　　富山朔二著）に従って細胞融合を行った。血清
の抗体価の最も高かったマウスに２００μｌのＰＢＳ（
−）に溶かした５０μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰＩ−８８を
尾静脈より注射し、その３日後に、脾細胞を無菌的に取
り出し、ステンレスメッシュで単細胞にほぐし、脾細胞
の１／５量の８−アザグアニン耐性骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ
６３−Ａｇ８−６５３細胞（株式会社　　免疫生物研究
所より入手）と、ＭｅｄｉａＩＴＭ培地（株式会社　　
免疫生物研究所）を混合し、遠沈後、細胞のペレットに
５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）を加え、融
合操作を行った。その後、融合細胞を遠心して上清を吸
引除去した後、３０％ＦＣＳ入りＨＡＴ培地を加え、９
６穴マイクロプレート１１枚にまいた。融合後、約２週
間で６００ウェルからコロニーが生育し、これらの培養
上清についてＳＤＳ変性ＡＰＰＩ−８８をスクリーニン
グ用抗原とした固相ＥＬＩＳＡを行い、ＳＤＳ変性ＡＰ
ＰＩ−８８と強く反応するクローンを得、限界希釈法に
よるクローニングを３回繰り返した。３回のクローニン
グにより安定した抗体産生を示す１クローンを７Ｅ１１
と命名し、これを平成２年７月２７日付けで微生物工業
技術研究所に寄託した（微工研菌寄第１１６３３号）。

【００１９】このハイブリドーマが産生するモノクロー
ナル抗体７Ｅ１１の反応性を以下に述べる本実施例工程
２（ｉ）及び（ｉｉ）で作成した、ＡＰＰ６６７、ＡＰ
Ｐ６４８、ＡＰＰ５９２に対して検討したところ、後述
するように、ＳＤＳ変性、非変性何れの条件でもＡＰＰ
６６７とのみ強く反応した。即ち、モノクローナル抗体
７Ｅ１１は、ＡＰＰ７７０を特異的に認識することがわ
かった。

【００２０】［工程２］ＡＰＰの調製 （ｉ）ＡＰＰ５９２の調製 ＡＰＰ６９５のＣ末端側１０３アミノ酸を欠失させた蛋
白である５９２アミノ酸（シグナルペプチドを含む）か
ら成るＡＰＰ５９２（図２）は、欧州特許公開番号０３
０４１３号実施例１に記載の方法で得たヒト老人斑アミ
ロイド前駆体ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡから出発して、上述
欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例５に記載の方
法でサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞で産生させ培養上清
中へ分泌させ、精製した。以下詳述する。

【００２１】欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例
５工程２記載のプラスミドｐＳＶＭＴ５９２をＣＯＳ−
１細胞に導入した。即ち、ｐＳＶＭＴ５９２　　２０μ
ｇを、１×１０６個のＣＯＳ−１細胞に対し、ショ糖含
有ＰＢＳ（２７２ｍＭショ糖、７ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．４）１ｍＭＭｇＣｌ２）中で、バイオラッド
社のジーンパルサーＴＭを用い、電圧４００Ｖ、キャパ
シター３μＦ、１．０〜１．３ｍ秒で、３０秒の間隔を
おいて２回電気パルスを与えることにより導入を行った
。 導入後の細胞を、１０％ウシ胎児血清（以下ＦＣＳと略
す）を含むダルベッコの変法最小基本培地中で３７℃、
５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養後、ダルベッコのリ
ン酸緩衝塩類溶液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含）（以下Ｐ
ＢＳ（−）と略す）で洗浄し、ＦＣＳを除いた後、ＦＣ
Ｓを含まない培地に交換し、以後４８時間毎に培地を交
換し、計３回培養上清を回収した。更に導入を３０回行
い、計９００ｍｌの培養上清を得た。

【００２２】ついで、プラスミド導入ＣＯＳ−１細胞の
培養上清に対し終濃度２ｍＭになるよう（ｐ―アミジノ
フェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（和光純
薬工業株式会社）を添加し、ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＴＭ
３０（アミコン社）を用いて濃縮を行い、さらに同装置
中で２０ｍＭＴｒｉｓ―塩酸（ｐＨ８．０）にバッファ
ー交換を行った。次に、ＤＥＡＥ―Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラム（ファルマシア社）を用い、上記試料をアプライ
し、２０ｍＭＴｒｉｓ―塩酸（ｐＨ８．０）、ＮａＣｌ
勾配０―１Ｍの条件でカラムクロマトグラフィーを行っ
た。クロマトグラフィーの各画分について、後述するよ
うに本発明参考例２に於いて大腸菌で発現させたＡＰＰ
１９―３７９（ＺＫＸ）に対して作成したウサギ抗ＡＰ
Ｐ１９―３７９（ＺＫＸ）抗血清を用いた固相ＥＬＩＳ
Ａを行い、ＡＰＰ溶出位置を同定した。（ＺＫＸは、Ａ
ＰＰ７７０中のＮ末端から１９番目のアミノ酸残基から
３７９番目のアミノ酸残基までを含むポリペプチドとβ
―ガラクトシダーゼとの融合タンパクであり、大腸菌中
に発現させ、６Ｍ尿素による可溶化を行い精製した。精
製方法については参考例２で詳述した。ＺＫＸは、ＡＰ
Ｐ７７０、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５に共通な配列の
ほかに、プロテアーゼインヒビター部分及びＡＰＰＰ７
７０に特異的な配列を含むが、ＡＰＰの膜貫通領域から
Ｃ末端までの配列は含まない）。ＡＰＰ５９２は、０．
３―０．４ＭＮａＣｌで溶出された。ＥＬＩＳＡ陽性画
分をセントリコンＴＭ３０（アミコン社）を用いて濃縮
し、さらに同装置中で５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
７．２）にバッファー交換した。

【００２３】次に、ヘパリンカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行った。即ち、ＤＥＡＥ―Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社）による部分
精製画分をヘパリン―５ＰＷカラム（東ソー株式会社）
にアプライし、ＮａＣｌ勾配０―２Ｍの条件でクロマト
グラフィーを行った。クロマトグラフィーの各画分につ
いて同様にウサギ抗ＡＰＰ１９―３７９（ＺＫＸ）抗血
清を用いた固相ＥＬＩＳＡを行い、ＡＰＰ５９２溶出位
置を同定した。ＡＰＰ５９２は１．０―１．２ＭＮａＣ
ｌで溶出した。ＥＬＩＳＡ陽性画分をセントリコンＴＭ
３０（アミコン社）を用いて濃縮後、２０ｍＭＴｒｉｓ
―塩酸（ｐＨ８．０）にバッファー交換した。これらを
７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
染色を行い、純度及び分子量の確認を行った。ｐＳＶＭ
Ｔ５９２を導入したＣＯＳー１細胞培養上清から、上記
操作を行うことにより得られたタンパクは、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上でややブロードな単一バンドであり、見かけの
分子量は９４．５ｋＤａと決定された。更に、この蛋白
のＮ末端のアミノ酸配列を、アプライド社気相シーケン
サーで解析したところ、ＡＰＰ６９５のうちシグナルペ
プチド（Ｎ末端から１７アミノ酸）が除去された、ＡＰ
Ｐ６９５のＮ末端から１８番目のＬｅｕから３３番目の
Ｇｌｎまでのアミノ酸配列（ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７
０にも共通）が確認された。こうして、精製ＡＰＰ５９
２が得られた。

【００２４】（ｉｉ）ＡＰＰ６４８及びＡＰＰ６６７の
調製 ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０各々のＣ末端側１０３アミ
ノ酸を欠失させた蛋白である、６４８アミノ酸（シグナ
ルペプチドを含む）から成るＡＰＰ６４８（図２）、及
び、６６７アミノ酸（シグナルペプチドを含む）から成
るＡＰＰ６６７（図２）は、欧州特許公開番号０３０４
１３号実施例５工程２記載のプラスミドｐＳＶＭＴ６６
７、およびｐＳＶＭＴ６４８を、本実施例工程２（ｉ）
と同様にして、ＣＯＳ−１細胞への導入、培養上清の回
収、精製を行った。精製に際しては、クロマトグラフィ
ーの各フラクションの確認に、ウサギ抗ＡＰＰ１９―３
７９（ＺＫＸ）抗血清の他に、ＡＰＰ６６７については
、特開平２−１３８９９５号公報の実施例９で得たモノ
クローナル抗体ＡＤＪ５―３―７（微工研受託番号ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ―１０３８８号）も用いた。さらに、ＡＰＰ
６６７及びＡＰＰ６４８については、そのトリプシン阻
害活性も確認手段の１つとし、この両者とも強い阻害活
性が確認された（阻害活性測定は、欧州特許公開番号０
３０４０１３号実施例に記載のｓＰＩのトリプシン阻害
活性測定方法に準じて行った）。精製したＡＰＰ６４８
、ＡＰＰ６６７の分子量は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで、それぞれ１００．５ｋＤａ、１０５．５ｋＤａ
であった。

【００２５】［工程３］　　抗ＡＰＰ抗体の作製［工程
３−１］抗ＡＰＰモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ３Ｂ２及び６Ａ３の作製 （ｉ）マウスの感作 ハイブリドーマ作成のための抗原は、以下のようにして
調製した。本実施例工程２（ｉ）で得た精製ＡＰＰ５９
２をＰＢＳ（−）に溶かし、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ−
ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ　　Ｕ．
Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ２２７　　６８０−６８５　　（１９
７０））中で１００℃、３分間煮沸後、４倍容のアセト
ンを加え、−２０℃で１時間冷却を行い、９０００回転
２０分間の遠心操作を行った。こうして過剰量のＳＤＳ
を除去し、沈査よりＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を回収し、
これをハイブリドーマ作成のための抗原として用いた。 免疫は２０μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を５００μｌ
のＰＢＳ（−）に溶かしたものをそれぞれ３匹の６週齢
のＢａｌｂ／ｃ雌マウスの皮下にフロイントの完全アジ
ュバントと共に注射し、以後２週間の間隔で合計３回の
免疫を行った。さらに、１週間の間隔で２回皮下注射を
行った。

【００２６】免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価の
上昇を単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエン
ティフィク　　富山朔二著）に従って、固相ＥＬＩＳＡ
法により確認した。 （ｉｉ）細胞融合 単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフ
ィク　　富山朔二著）に従って細胞融合を行った。即ち
、血清の抗体価の最も高かったマウスに２００μｌのＰ
ＢＳ（−）に溶かした２５μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９
２を尾静脈より注射し、ブーストとした。その３日後に
、脾細胞を無菌的に取り出し、ステンレスメッシュで単
細胞にほぐし、脾細胞の１／５量の８−アザグアニン耐
性骨髄細胞腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３細胞（株式
会社　　免疫生物研究所より入手）と、ＭｅｄｉａＩ培
地（株式会社　　免疫生物研究所）を混合し、遠沈後、
細胞のペレットに５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー
社製）を加え、融合操作を行った。その後、融合細胞を
遠心して上清を吸引除去した後、３０％ＦＣＳ入りＨＡ
Ｔ培地を加え、９６穴マイクロプレート１１枚にまいた
。 融合後、約２週間で約９５０ウェルからコロニーが生育
し、これらの培養上清についてＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２
をスクリーニング用抗原とした固相ＥＬＩＳＡを行い、
抗原と強く反応するクローンを得、限界希釈法によるク
ローニングを３回繰り返した。３回のクローニングによ
り安定した抗体産生を示す２つのクローンを３Ｂ２及び
６Ａ３と各々命名し、これを平成３年１月１０日付けで
微生物工業技術研究所に寄託した。（３Ｂ２の受託番号
は、微工研菌寄第１１９４３号、および、６Ａ３のそれ
は同１１９４４号）。これらのハイブリドーマが産生す
るモノクローナル抗体３Ｂ２及び６Ａ３の反応性を本実
施例工程２（ｉ）及び（ｉｉ）で作成した、ＡＰＰ６６
７、ＡＰＰ６４８、ＡＰＰ５９２に対して検討したとこ
ろ、後述するように、ＳＤＳ変性、非変性何れの条件で
もこれら３種のＡＰＰ誘導体と強く反応した。即ち、こ
れらのモノクローナル抗体は、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７
５１、ＡＰＰ６９５の何れをも認識できることがわかっ
た。

【００２７】［工程３−２］　　抗ＡＰＰモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ１Ｂ２の作製 （ｉ）マウスの感作 後述するように参考例２工程１−３で得たＺＫＸを、上
述の実施例１工程３−１（ｉ）記載と同様の方法で変性
させた。このＳＤＳ変性ＺＫＸ　　２０μｇを５００μ
ｌのＰＢＳ（−）に溶かしたものをそれぞれ４匹の６週
齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスの皮下にフロイントの完全ア
ジュバントと共に注射し、２週間後に同様の免疫を行っ
た。さらに、２週間の間隔で、ＳＤＳ変性ＺＫＸの免疫
を、フロイントの不完全アジュバントを用いて６回行っ
た。その２週間ののちＳＤＳ変性ＺＫＸ　　２０μｇを
静注した。約１カ月後、今度は２０μｇのＳＤＳ変性Ａ
ＰＰ５９２をフロイントの完全アジュバントと共に皮下
に注射し、さらに、１週間後同様にしてＡＰＰ５９２に
よる免疫を行った。

【００２８】免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価の
上昇を本実施例工程３−１と同様にして、固相ＥＬＩＳ
Ａ法により確認した。 （ｉｉ）細胞融合 血清の抗体価の最も高かったマウスに２００μｌのＰＢ
Ｓ（−）に溶かした２５μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２
を尾静脈より注射し、ブーストとした。これ以降の操作
は、本実施例工程３−１（ｉｉ）と同様に行い、ＡＰＰ
５９２と強く反応するクローンを得、限界希釈法による
クローニングを３回繰り返した。３回のクローニングに
より安定した抗体産生を示すクローンを１Ｂ２と命名し
、これを平成３年１月１０日付けで微生物工業技術研究
所に寄託した（微工研菌寄第１１９４２号）。このハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体１Ｂ２の反応
性を本実施例工程２（ｉ）及び（ｉｉ）で作成した、Ａ
ＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８、ＡＰＰ５９２に対して検討
したところ、後述するように、ＳＤＳ変性、非変性何れ
の条件でもこれら３種のＡＰＰ誘導体と強く反応した。 　　即ち、モノクローナル抗体１Ｂ２は、ＡＰＰ７７０
、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５の何れをも認識できるこ
とがわかった。 ［工程４］モノクローナル抗体の特徴づけ（ｉ）免疫グ
ロブリンのクラス及びサブクラスの決定モノクローナル
抗体７Ｅ１１、１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３の免疫グロブリ
ンのクラス及びサブクラスをアイソタイピングキット（
アマーシャム社）を使用して決定した。 その結果、７Ｅ１１についてはＩｇＧ１、Ｌ鎖はκ、１
Ｂ２についてはＩｇＧ２ｂ、Ｌ鎖はκ、３Ｂ２について
はＩｇＧ２ｂ、Ｌ鎖はκ、６Ａ３についてはＩｇＧ２ａ
、Ｌ鎖はκと決定された。

【００２９】（ｉｉ）特異性の決定 上記モノクローナル抗体の特異性を以下に示す試験によ
り決定した。各種ＡＰＰ（ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８
、ＡＰＰ５９２）を用い、非変性及びＳＤＳ−変性処理
を行い、通常の固相ＥＬＩＳＡ法を用いて判定を行った
。一次抗体として上記モノクローナル抗体を、２μｇ／
ｍｌのＩｇＧ濃度で加え、二次抗体はβ―ガラクトシダ
ーゼ標識ヒツジＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇ（アマーシ
ャム社）を用い、基質は４―メチルウンベリフェリル−
β―Ｄ―ガラクトピラノシドを用い、３０分間酵素反応
を行った後、蛍光リーダーＦＣＡ（ＰＡＮＤＥＸ社）を
用いて蛍光強度を測定した。その結果を表１に示す。

【００３０】モノクローナル抗体７Ｅ１１はＡＰＰ６６
７とのみ反応した。１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３は、いずれ
も、３種のＡＰＰ（ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８及びＡ
ＰＰ５９２）のすべてを、強く認識した。ネガティブコ
ントロールとして、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との
反応性も検討したが、これら４つのモノクローナル抗体
はＢＳＡとは全く反応しなかった。

【００３１】［工程５］腹水化モノクローナル抗体から
のＩｇＧの精製 大量のモノクローナル抗体を得るため本実施例工程１で
得た７Ｅ１１、工程３で得た１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３の
各ハイブリドーマ１×１０７個を、ＭｅｄｉａＩ培地（
株式会社　　免疫生物研究所）０．５ｍｌに浮遊させ、
予め１週間前に腹腔内に０．５ｍｌのプリスタン（アル
ドリッチ社）投与しておいたＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔
に注射した。約２週間で腹部の肥大が認められ、腹腔切
開により腹水を採取した。各ハイブリドーマにつき７匹
のマウスを処理し、各々約１０ｍｌずつの腹水を得た。 得られた各ハイブリドーマ由来腹水５ｍｌずつを、アフ
ィプレップＴＭプロテインＡカートリッジ（バイオラッ
ド社）を用いて精製を行った。精製はバイオラッド社発
行の添付プロトコールに従った。７Ｅ１１クローンから
５．７ｍｇ、１Ｂ２クローンから７．９ｍｇ、３Ｂ２ク
ローンから４．３ｍｇ、６Ａ３クローンから３．３ｍｇ
の精製ＩｇＧが得られた。

【００３２】［工程６］抗ＺｔＰＩ（抗ＫＰＩ）ポリク
ローナル抗体の作成及び精製 ［工程６−１］β−ガラクトシダーゼ・ＫＰＩ融合蛋白
の大腸菌による発現 （ｉ）融合タンパク発現プラスミドの構築大腸菌β−ガ
ラクトシダーゼのＮ末端にｓＰＩ（ＡＰＰ７７０の２８
８番目のＡｒｇ残基から３５９番目のＡｒｇ残基までを
含む。ｓＰＩの産生については欧州特許出願８８１１３
２８３．１号実施例７に記載してある。また、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　　１０３８　　１
０５−１１３、１９９０　　にＡＰＰＩ−７２の名前で
記載してある）を結合した融合タンパク（ＺＰＩ）を発
現しうるプラスミドを構築した。具体的には、発現用ベ
クターｐＥＸ１（ベーリンガー・マンハイム山之内社）
を　制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、直鎖状
ベクターＤＮＡ断片を得た。一方、欧州特許出願８８１
１３２８３．１号（公開番号０３０４０１３号、対応の
日本出願は特願昭６３−２０１９９８号）の実施例４に
記載のプラスミドｐＰＩｔｒｐ　７５−１をＢａｍＨＩ
及びＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後０．
３ｋｂｐの断片を、フナコシ社製ジーン・クリーン・キ
ットを用いて単離した。得られた２つの断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結せしめた。

【００３３】該反応物を、マニアティスらの実験書（Ｔ
．Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））に記載されている方
法に従って調製した大腸菌ＰＯＰ２１３６株（ベーリン
ガー・マンハイム山之内社）コンピテントセルに加え、
形質転換せしめた。アンピシリン耐性形質転換コロニー
６個を選び、各プラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩ及びＰ
ｓｔＩで切断し解析したところ、すべて目的とするプラ
スミドを有していた。得られたプラスミドをｐＥＸ−Ｚ
ＰＩと命名した。本プラスミドは、ラムダ・ファージ由
来のＰＲ　プロモーターの制御により、β−ガラクトシ
ダーゼ・ＫＰＩの融合タンパクを発現しうる。

【００３４】（ｉｉ）融合タンパクの生産本実施例工程
６−１の（ｉ）で得たプラスミドｐＥＸ−ＺＰＩを保持
する大腸菌ＰＯＰ２１３６／ｐＥＸ−ＺＰＩを、５０μ
ｇ／ｍｌ　のアンピシリン含有Ｌ培地で、３０℃一晩培
養せしめた。本培養液１ｍｌ　を、５０μｇ／ｍｌ　ア
ンピシリン含有Ｌ培地５０ｍｌ　に添加し、３０℃にて
３時間培養した後、４２℃の恒温培養槽に移し、さらに
３時間培養した。４２℃において、ラムダ・ファージＰ
Ｒ　プロモーターのリプレッサーは不活化され、ＰＲプ
ロモーターが作動することによって、目的とする融合タ
ンパクが生産される。

【００３５】該培養液を遠心分離し菌体を集め、菌体の
一部を、レムリーの方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．、
Ｎａｔｕｒｅ、２２７．６８０−６８５（１９７０）〕
に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で煮
沸後、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲ
ルをクマシー染色した結果、分子量約１２０Ｋｄの目的
とする融合タンパクが存在することが確認された。以下
、このβガラクトシダーゼ・ＫＰＩ融合タンパクをＺＰ
Ｉと略す。

【００３６】（ｉｉｉ）ＺＰＩの可溶化本実施例工程６
−１の（ｉｉ）で得た培養菌体の一部を、尿素を終濃度
０Ｍ、２Ｍ、４Ｍ、６Ｍ、８Ｍをそれぞれ含む２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）に懸濁し、オータケ・ソニケ
ーター（大岳製作所）を用いて菌体を超音波破壊し、遠
心分離により不溶物を集めた。得られた不溶物を本実施
例工程６−１の（ｉｉ）と同様に処理して、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。

【００３７】クマシー染色の結果、目的物ＺＰＩのバン
ドは、尿素０Ｍ、２Ｍおよび４Ｍ含有バッファーで抽出
した不溶画分では検出されたが、尿素６Ｍおよび８Ｍ含
有バッファー抽出後の不溶画分では認められなかった。 以上の結果から、目的融合タンパクは産生後大腸菌体内
で不溶物としてタンパク封入体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　
　ｂｏｄｙ）を形成し、この不溶物は６Ｍ以上の尿素で
可溶化されることが判明した。

【００３８】（ｉｖ）ＺＰＩの部分精製本実施例工程６
−１の（ｉｉ）と同様にして、大腸菌ＰＯＰ２１３６／
ｐＥＸ−ＺＰＩを培養し、２００ｍｌ　の培養液から菌
体を回収した。該培養菌体を、４０ｍｌの４Ｍ尿素を含
む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに懸濁
し、菌体を超音波破壊した。菌体破壊物を遠心分離（１
００００×ｇ、１０分間）し、沈澱物を回収した。次い
でこの沈澱物を２０ｍｌの８Ｍ尿素を含む２０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに再懸濁し、超音波処
理により沈澱を分散せしめた。遠心分離（１００００×
ｇ、１０分間）後上清を回収した。以上の操作により、
４Ｍ尿素で可溶な大腸菌タンパク、および８Ｍ尿素に不
溶な大腸菌タンパクが除去され、ＺＰＩの部分精製液が
得られた。この部分精製液の一部をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で解析したところ、全タンパク
質のうち５０％以上が目的融合タンパクＺＰＩであった
。

【００３９】（ｖ）プロテアーゼインヒビター領域の抽
出 本実施例工程６−１の（ｉｖ）で得たＺＰＩ部分精製液
２０ｍｌを、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）２Ｌ　
に対して２回透析し、尿素を除去せしめると同時にタン
パクの立体構造を回復せしめた。得られた透析液を３７
℃にて保温した後、ＴＰＣＫ処理済みトリプシン固定化
アガロースビーズ（シグマ社）１００単位を加え、３７
℃で１時間振とうすることにより、ＺＰＩ中のβガラク
トシダーゼ領域を切断すると同時にプロテアーゼインヒ
ビター領域を吸着させた。かかる懸濁液を、５’プライ
ム→３’プライム社のセレクトＳＴＭ空カラムに充填し
、アガロースビーズを回収した。アガロースビーズとバ
ッファーとの分離は、１，０００ｒｐｍ、１分間の遠心
操作により行った（以下の記述中のアガロースビーズの
回収も同様にして行なった）。回収したビーズを、０．
３Ｍ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　、１０ｍ
Ｍ　　ＨＣｌ（ｐＨ２）からなる溶出液６ｍｌで溶出し
た。溶出は計３回行い、各溶出液を５ＮＮａＯＨを用い
て中和した後、トリプシン阻害活性を測定した。阻害活
性の測定は、欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例
４に記載のｓＰＩのトリプシン阻害活性測定と同様の方
法によった。

【００４０】各溶出液に含まれるトリプシン・インヒビ
ター活性濃度は、溶出分画の順に、ＢＰＴＩに換算して
１６．４μｇ／ｍｌ　、１．５μｇ／ｍｌ　、０．２７
μｇ／ｍｌ　であった。これらの溶出分画を、ＺｔＰＩ
画分とする。 （ｖｉ）プロテアーゼ・インヒビターの解析本実施例工
程６−１の（ｖ）で得た溶出液に、あらかじめ−２０℃
に冷却したアセトンを４倍容量加え、−２０℃にて１時
間冷却した。さらに、冷却遠心分離（１０，０００×ｇ
１５分間）し、沈澱を回収した。得られた沈澱を１ｍｌ
　の２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）に再溶解し、本
実施例工程６−１の（ｖ）と同様にしてトリプシン阻害
活性量を測定した。その結果、　欧州特許公開番号０３
０４０１３号実施例４に記載のｓＰＩに換算して６２μ
ｇ相当のトリプシン・インヒビターが含まれていること
が判明した。

【００４１】得られたインヒビター溶液の一部を、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した
ところ、分子量約６Ｋｄのメジャーな蛋白質が検出され
た。 ［工程６−２］抗ＺｔＰＩ抗血清の作成本実施例工程６
−１の（ｉｖ）で得られたＺＰＩ３００μｇを、前述し
たレムリーの方法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で用いるサンプルバッファー（２％ＳＤＳ、
５％β−ＭＥを含む、ただし色素は加えなかった）中で
、１００℃で５分間処理したのち、４倍容のアセトンを
加え、−２０℃で１時間冷却を行い、９０００回転２０
分間の遠心操作を行い、沈澱を回収した。その沈澱をＰ
ＢＳ（−）に懸濁し、これとフロイント完全アジュバン
ト（ＦＣＡ）とをよく混合してウサギに皮下注射した。 ３１日後にＦＣＡのかわりにフロイント不完全アジュバ
ントを用いた以外は同じ処理（免疫）を行った。さらに
１４日後、３００μｇの本実施例工程６−１の（ｖ）で
得られたＺｔＰＩを同様の処理を行い免疫した。さらに
１６日後、ＺｔＰＩを用いて同じ処理を行った。さらに
１５日後、欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例４
に記載の方法で得たｓＰＩ　　１５０μｇを同じ処理を
して免疫した。このウサギから５０ｍｌ採血し、抗血清
を得た。以後この抗血清を抗ＺｔＰＩ抗血清と呼ぶ。血
清中の抗体価は、非変性及びＳＤＳ変性のｓＰＩ（２５
ｎｇ／ウェル）を抗原とする固相ＥＬＩＳＡによって行
った。最終的に得られた抗血清の力価は、対照（抗原な
しのウェル）の３倍以上の発色を示す抗血清の希釈度で
示すと、非変性ｓＰＩに対して６４０００倍、ＳＤＳ変
性ｓＰＩに対して１２８０００倍であった。また尿中ト
リプシンインヒビター（日本ケミカルリサーチ社）とは
全く反応しなかった。即ち、本抗ＺｔＰＩ抗血清はＫＰ
Ｉ配列に対する高い特異性と抗体価を有することがわか
った。 ［工程６−３］抗ＺｔＰＩ　　ＩｇＧの精製本実施例工
程６−２で得た抗ＺｔＰＩ血清２０ｍｌを５６℃にて３
０分インキュベートして非働化させた後、等量のＰＢＳ
（−）を加えて希釈し、４℃で１００％飽和硫安溶液（
予め０．１Ｎアンモニア溶液にてｐＨ６．５に調整した
もの）を最終濃度３３％飽和になる様攪拌しながら徐々
に加えた。加え終わってから更に１２時間攪拌を続けた
後、３０００×ｇで３０分間冷却遠心した。 得られた沈澱を５０％飽和硫安溶液に懸濁し、再び冷却
遠心して沈澱を得た。沈澱を１０ｍｌの１０ｍＭリン酸
ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、透析チ
ューブにつめて５Ｌの同バッファーに対して３回透析を
行った。得られた透析試料を、予め１０ｍＭリン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化させたＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラム（ＤＥ５２、ワットマン社）にア
プライし、同バッファーで溶出させた。素通り画分を集
め、セントリプレップＴＭ３０（アミコン社）で濃縮し
、１５．７ｍｇの部分精製抗ＺｔＰＩ抗体を得た。部分
精製抗体をアフィプレップＴＭプロテインＡカートリッ
ジ（バイオラッド社）を用い、バイオラッド社発行添付
プロトコールに従って、更に精製を行い、精製抗ＺｔＰ
Ｉ　　ＩｇＧ１２．７ｍｇを得た。

【００４２】［工程７］抗体のビオチン化本実施例工程
５で得た７Ｅ１１、１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３精製モノク
ローナル抗体及び工程６−３で得た精製抗ＺｔＰＩ抗体
各２ｍｇを用い、免疫実験操作法（第９巻、３５３９−
３５４９　　１９８２　　日本免疫学会編）に従って抗
体のビオチン化を行った。予め０．１ＭＮａＨＣＯ３溶
液に対して透析、バッファー交換を行い、濃度を１ｍｇ
／ｍｌに調整しておいた精製７Ｅ１１、１Ｂ２、３Ｂ２
、６Ａ３、及び抗ＺｔＰＩ抗体に、１ｍｇ／ｍｌの濃度
に調整したＮＨＳ−ビオチン（Ｎ−ヒドロキシサクシニ
ミド−ビオチン、ピアス社）のジメチルスルホキシド溶
液２８０μｌを加え、室温で４時間静かに攪拌した。次
に、４℃で３ＬのＰＢＳ（−）に対して４回の透析を行
い、ビオチン標識７Ｅ１１、１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３及
び抗ＺｔＰＩ抗体を得た。

【００４３】実施例２　　抗ＺｔＰＩ抗体と７Ｅ１１モ
ノクローナル抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッ
チＥＬＩＳＡ 実施例１工程６−３で得た精製抗ＺｔＰＩ抗体を５μｇ
／ｍｌの濃度で０．１Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナト
リウムバッファー（ｐＨ９．６）に溶解し、９６穴マイ
クロプレートに１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温
で２時間静置した。プレートをＰＢＳ（−）で３回洗浄
の後、１％ウシ血清アルブミン（シグマ社）を含むＰＢ
Ｓ（−）を加え、３７℃で２時間被覆した。次に、０．
１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）中で希釈し
た精製ＡＰＰ６６７標準液（２〜２０００ｎｇ／ｍｌ）
を加え、攪拌しながら室温で１時間処理を行った。次に
、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）で
プレートを３回洗浄した後、実施例１の工程７で得たビ
オチン標識した精製７Ｅ１１　　ＩｇＧを１μｇ／ｍｌ
の濃度で５０μｌずつ各ウェルに加え、攪拌しながら室
温で１時間反応を行った。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２
０を含むＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、β−ガラクト
シダーゼ標識アビジンＤ（ベクター社）を加え、更に攪
拌しながら室温で１時間反応させた。０．０５％のＴｗ
ｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）で５回洗浄の後、２ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（−）中に溶かした４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分反応させた後、
ＦＣＡ（ＰＡＮＤＥＸ社）で蛍光強度を測定した。結果
は図３に示す様に検出限界が約０．５ｎｇ／ウェルであ
った。

【００４４】実施例３　　１Ｂ２モノクローナル抗体と
７Ｅ１１モノクローナル抗体の組み合わせによる２抗体
サンドイッチＥＬＩＳＡ 実施例２と同様の方法を用いて１Ｂ２モノクローナル抗
体と７Ｅ１１モノクローナル抗体の組み合わせによる２
抗体サンドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図
４に示す様に検出限界が約３０ｎｇ／ウェルであった。

【００４５】実施例４　　３Ｂ２モノクローナル抗体と
７Ｅ１１モノクローナル抗体の組み合わせによる２抗体
サンドイッチＥＬＩＳＡ 実施例２と同様の方法を用いて３Ｂ２モノクローナル抗
体と７Ｅ１１モノクローナル抗体の組み合わせによる２
抗体サンドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図
５に示す様に検出限界が約２０ｎｇ／ウェルであった。

【００４６】実施例５　　６Ａ３モノクローナル抗体と
７Ｅ１１モノクローナル抗体の組み合わせによる２抗体
サンドイッチＥＬＩＳＡ 実施例２と同様の方法を用いて６Ａ３モノクローナル抗
体と７Ｅ１１モノクローナル抗体の組み合わせによる２
抗体サンドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図
６に示す様に検出限界が約２０ｎｇ／ウェルであった。

【００４７】参考例１　　７Ｅ１１モノクローナル抗体
を用いたＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）法によるＡＰ
Ｐ６６７の検出 （ｉ）　　バッファー １５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（バイオラ
ッド社）及び０．０２％ＮａＮ３を含む５０ｍＭリン酸
ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を調製し、バッフ
ァーＡとした。

【００４８】（ｉｉ）　　１２５Ｉ−ＡＰＰ６６７の調
製実施例１工程２（ｉｉ）で得た精製ＡＰＰ６６７をボ
ルトン−ハンター法（Ｂｏｌｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｊ．１３３　、５２９−５３９、１９７３）によって
１２５Ｉ標識し、１２５Ｉ−ＡＰＰ６６７を得た。 （ｉｉｉ）　　ＡＰＰ６６７標準液の調製実施例１工程
２（ｉｉ）で得た精製ＡＰＰ６６７を２０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、バッファーＡで
希釈し、種々の濃度のＡＰＰ６６７標準液を作成した。

【００４９】（ｉｖ）　　ＡＰＰ６６７のＲＩＡＡＰＰ
６６７標準液１００μｌを、バッファーＡで１μｇ／ｍ
ｌの濃度に調製した精製７Ｅ１１　　ＩｇＧ（実施例１
工程５で精製）溶液２００μｌ、１２５Ｉ−標識ＡＰＰ
６６７のバッファーＡ溶液１００μｌ（１００００ｃｐ
ｍ）、及びバッファーＡ２００μｌを加えて混和後、４
℃、１８時間インキュベートした。デキストラン−炭素
液（デキストランＴ−７０（フナコシ薬品株式会社）、
０．００２５％溶液と活性炭Ｎｏｒｉｔ　　Ａ（シグマ
社）０．２５％液で等量混合した液）２００μｌを添加
して、４℃で１８時間静置後、２．５００×ｇで２０分
間遠心分離し、上清の放射能をガンマウェルカウンター
にて測定した。測定限界は約２０ｎｇ／アッセイであっ
た。

【００５０】実施例６　　ＡＰＰ７７０検出用キットの
作製 第１抗体として抗ＺｔＰＩ抗体、第２抗体としてビオチ
ン標識−７Ｅ１１モノクローナル抗体、標準ＡＰＰとし
て精製ＡＰＰ６６７、標識検出試薬としてβ−ガラクト
シダーゼ標識−ストレプトアビジン、４−メチルウンベ
リフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、基質溶解剤
としてジメチルスルホキシド、バッファーとしてＰＢＳ
（−）、洗浄剤としてＴｗｅｅｎ−２０、酵素反応用バ
ッファーとして１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ（−）
、被覆剤としてウシ血清アルブミンを用い、ＡＰＰ７７
０検出キットを作製した（表２）。このキットを用いて
、ＡＰＰ７７０の検出を行った。

【００５１】粉末ＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社製）
９．６ｇを精製水に溶解し、１ｌのＰＢＳ（−）溶液と
した。洗浄剤としてＴｗｅｅｎ−２０を用いて０．０５
％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（−）溶液を調製
した。被覆剤としてウシ血清アルブミン１ｇを１００ｍ
ｌのＰＢＳ（−）に溶解し、１％ウシ血清アルブミン溶
液とした。第１抗体は抗ＺｔＰＩ抗体１ｍｇを１ｍｌの
ＰＢＳ（−）に溶解したものを２００倍濃縮液として調
製した。第２抗体はビオチン標識−７Ｅ１１モノクロー
ナル抗体１ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ（−）に溶解したもの
を１０００倍濃縮液として調製した。β−ガラクトシダ
ーゼ標識−ストレプトアビジン１ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ
（−）に溶解したものを１０００倍濃縮液として調製し
た。β−ガラクトシダーゼの基質として４−メチルウン
ベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド１０ｍｇを
１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解したものを５
００倍濃縮液として用時調製した。標準ＡＰＰ（精製Ａ
ＰＰ６６７　　１０μｇ及び１０ｍｇのウシ血清アルブ
ミンを含むＰＢＳ（−）溶液１ｍｌの凍結乾燥品）は１
ｍｌの精製水に溶解した。

【００５２】各調製した試薬で、実施例２に準じてＡＰ
Ｐ７７０の検出を実施し、同様の結果を得た。 実施例７　　本キットを用いたヒト髄液中のＡＰＰ７７
０の定量 ２名のアルツハイマー病患者から得られた髄液を検体と
して、本発明実施例６記載のキットを用いて、髄液中の
ＡＰＰ７７０を定量した。方法は実施例２に準じた。結
果は、２８．２ｎｇ／ｍｌ及び３４．８ｎｇ／ｍｌであ
った。

【００５３】参考例２　　免疫用抗原ＺＫＸタンパク及
び抗ＺＫＸ抗体の作成 ［工程１］　　免疫用抗原ＺＫＸの調製まず、βーガラ
クトシダーゼの一部分と、ＡＰＰ７７０のＮ末端から数
えて１９番目残基から３７９番目残基までの断片との融
合蛋白であるＺＫＸの産生について述べる。

【００５４】［工程１−１］発現プラスミド　　ｐＥＸ
−ＺＫＸの構築 発現用ベクターｐＥＸ２（ベーリンガー・マンハイム山
之内社）を　制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉ（ＭｓｔＩＩ）及び
ＳａｌＩで切断し、直鎖状ベクターＤＮＡ断片を得た。 一方、欧州特許出願８８１１３２８３．１号（公開番号
０３０４０１３号、対応の日本出願は特願昭６３−２０
１９９８号）の実施例１に記載のプラスミドｐＧＢＰ２
（ＡＴＣＣ−６７５０２）をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動によりＡＰＰ７７０のＮ
末端側約３６０残基をコードするＤＮＡ断片を、フナコ
シ社製ジーン・クリーン・キットを用いて単離した。さ
らに配列番号１〜６の６つの合成リンカー、１，２，３
，４，５，６（これらのリンカーをアニールさせると図
７に示したようにＭｓｔＩＩ切断末端とＫｐｎＩ切断末
端を有し、ｐＥＸ２のＭｓｔＩＩサイトに結合してもフ
レームはずれずに連続するアミノ酸をコードする）をア
プライドバイオシステムズ社ＤＮＡ合成機３８０Ａを用
いて合成し、さきに得られた２つのＤＮＡ断片とともに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結せしめた。図７にこの
概要を示す。

【００５５】該反応物を、マニアティスらの実験書に記
載されている方法に従って調製した大腸菌ＰＯＰ２１３
６株（ベーリンガー・マンハイム山之内社）コンピテン
トセルに加え、形質転換せしめた。アンピシリン耐性形
質転換コロニー６個を選び、各プラスミドを抽出し、Ｂ
ａｍＨＩで切断し解析したところ、すべて目的とするプ
ラスミドを有していた。得られたプラスミドをｐＥＸ−
ＺＫＸと命名した。本プラスミドは、ラムダ・ファージ
由来のＰＲ　プロモーターの制御により、βガラクトシ
ダーゼのＮ末端約１５０アミノ酸とＡＰＰ７７０のＮ末
端から数えて１９番目残基から３７９番目残基までの配
列を含む融合タンパクＺＫＸを発現しうる。ＺＫＸは、
ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５に共通な配
列の一部のほかに、プロテアーゼインヒビター部分及び
ＡＰＰＰ７７０特異的な配列を含むが、ＡＰＰの膜貫通
領域からＣ末端までの配列は含まない。

【００５６】［工程１−２］　　融合タンパクの生産参
考例２工程１−１で得たプラスミドｐＥＸ−ＺＫＸを保
持する大腸菌ＰＯＰ２１３６／ｐＥＸ−ＺＫＸを、５０
μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ培地で、３０℃一晩培
養せしめた。本培養液１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有Ｌ培地５０ｍｌに添加し、３０℃にて３時間
培養した後、４２℃の恒温培養槽に移し、さらに３時間
培養した。４２℃において、ラムダ・ファージＰＲ　プ
ロモーターのリプレッサーは不活化され、ＰＲ　プロモ
ーターが作動することによって、目的とする融合タンパ
クが生産される。

【００５７】該培養液を遠心分離し菌体を集め、菌体の
一部を、レムリーの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ　　Ｕ．Ｋ．
、Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　　６８０−６８５　　（１
９７０）］に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッフ
ァー中で煮沸後、１０％ポリアクリルアミドゲルを用い
てＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。 泳動後、ゲルをクマシー染色した結果、分子量約５８ｋ
Ｄａの目的とする融合タンパクが存在することが確認さ
れた。以下、この部分βガラクトシダーゼ・部分ＡＰＰ
７７０融合タンパクをＺＫＸと略す。 ［工程１−３］ＺＫＸの部分精製 参考例２工程１−２と同様にして、大腸菌ＰＯＰ２１３
６／ｐＥＸ−ＺＫＸを培養し、２００ｍｌの培養液から
菌体を回収した。該培養菌体を、４０ｍｌの４Ｍ尿素を
含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに懸
濁し、菌体を超音波破壊した。菌体破壊物を遠心分離（
１００００×ｇ、１０分間）し、沈澱物を回収した。 次いでこの沈澱物を２０ｍｌの８Ｍ尿素を含む２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに再懸濁し、超音
波処理により沈澱を分散せしめた。遠心分離（１０００
０×ｇ、１０分間）後上清を回収した。以上の操作によ
り、４Ｍ尿素で可溶な大腸菌タンパク、および８Ｍ尿素
に不溶な大腸菌タンパクが除去され、ＺＫＸの部分精製
液が得られた。この部分精製液の一部をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で解析したところ、全タン
パク質のうち５０％以上が目的融合タンパクＺＫＸであ
った。ＺＫＸのトリプシン阻害活性を、欧州特許公開番
号０３０４０１３号実施例に記載のｓＰＩのトリプシン
阻害活性測定方法に準じて測定したところ強い阻害活性
を示した。また、本発明実施例１工程６記載の抗ＺｔＰ
Ｉ抗血清を用いたウエスタンブロットでも、このＺＫＸ
は強く反応した。

【００５８】［工程１−４］抗ＺＫＸ抗血清の作成参考
例２工程１−３で得られたＺＫＸを兎に免疫して抗血清
を得た。即ち、実施例１工程３記載のＳＤＳ変性ＡＰＰ
５９２作成と同様の方法でＳＤＳ変性ＺＫＸを作成し、
２００μｇのＳＤＳ変性ＺＫＸを１ｍｌのＰＢＳ（−）
に溶かしたものを、それぞれ２匹の家兎の背中の皮下に
フロイントの完全アジュバントと共に注射し、以後２週
間の間隔でフロイントの不完全アジュバントと共に合計
６回の免疫を行った。血清中の抗体価は、非変性及びＳ
ＤＳ変性のＺＫＸ（２５ｎｇ／ウェル）を抗原とする固
相ＥＬＩＳＡによって行った。最終的に得られた抗血清
の力価は、対照（抗原無しのウェル）の２倍以上の発色
を示す抗血清の希釈度で示すと、非変性ＺＫＸに対して
１６０００倍、ＳＤＳ変性ＺＫＸに対して３２０００倍
であり、実施例１工程２記載のＡＰＰ６６７、ＡＰＰ５
９２、さらに本実施例１工程６−１（ｖｉ）記載のＺｔ
ＰＩに対しても強く反応した。

【００５９】

【表１】

【００６０】

【表２】

【００６１】

【発明の効果】本発明の測定方法、試薬及びキットを用
いることにより、アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋
白ＡＰＰ７７０及びその断片が簡便に且つ、高感度に検
出、定量することが可能となり、アルツハイマー病の診
断方法、試薬及び診断キットとして有用である。また、
アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白を用いる研究の
場に於ける研究試薬としても有用である。

【００６２】

【配列表】

【００６３】 配列番号：１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー１ 配列 ＴＧＡＧＧＣＣＧＡＴ　ＡＣＴＧＣＴＧＴＣＧ　ＴＣＣ
ＣＣＴＣＡＡＡ　ＣＴＧＧＣＡＧＡＴ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３９

【００６４
】 配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー２ 配列 ＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣ　ＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡ　ＴＧＴ
ＡＣＡＣＣＡＡ　ＣＧＴＡＡＣＣＴＡＴ　ＣＣ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００６５
】 配列番号：３ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー３ 配列 ＣＡＴＴＡＣＧＧＴＣ　ＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴ　ＴＴＧ
ＴＴＣＣＣＡＣ　ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧ　ＡＧＣＴＣＧ
ＧＴＡＣ　　　　　　　　　　　　　　５０

【００６６
】 配列番号：４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー４ 配列 ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧ　ＧＡＴＣＣＣＧＴＧＧ　ＧＡＡ
ＣＡＡＡＣＧＧ　ＣＧＧＡＴＴＧＡＣＣ　ＧＴ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００６７
】 配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー５ 配列 ＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ　ＧＴＴＡＣＧＴＴＧＧ　ＴＧＴ
ＡＣＡＴＧＧＧ　ＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡ　ＣＣ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００６８
】 配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー６ 配列 ＧＴＧＣＡＴＣＴＧＣ　ＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧ　ＧＧＡ
ＣＧＡＣＧＡＣ　ＡＧＴＡＴＣＧＧＣＣ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０

【図面の簡単な説明】

【図１】アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ
６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７１４、
ＡＰＰ５６３の模式図である。ｂからｆの黒く塗りつぶ
した部分はプロテアーゼインヒビター活性を有する５６
アミノ酸から成る領域、点々部分はＡＰＰ７７０に固有
の１９アミノ酸から成る領域、斜線部は脳に沈着する老
人斑アミロイド部分を示す。ａはＡＰＰのうち脳に沈着
するアミロイドβ蛋白部分（影をつけた部分）と膜貫通
領域を示す。ＡＰＰ５６３はβ蛋白部分をもたない。

【図２】分泌型ＡＰＰ（ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８、
ＡＰＰ５９２）の構造を示す模式図である。図中の数字
は各ＡＰＰのＮ末端から数えたアミノ酸残基の番号を示
す。

【図３】抗ＺｔＰＩ抗体と７Ｅ１１モノクローナル抗体
の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図
４】１Ｂ２モノクローナル抗体と７Ｅ１１モノクローナ
ル抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳ
Ａ

【図５】３Ｂ２モノクローナル抗体と７Ｅ１１モノクロ
ーナル抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬ
ＩＳＡ

【図６】　　６Ａ３モノクローナル抗体と７Ｅ１１モノ
クローナル抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチ
ＥＬＩＳＡ

【図７】β−ガラクトシダーゼの一部分とＡＰＰ７７０
の部分タンパクとの融合タンパクであるＺＫＸの発現プ
ラスミド作成の模式図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋
   白ＡＰＰ７７０を特異的に認識する抗体を、少なくとも
   その組み合わせの一方に用いることを特徴とする２抗体
   サンドイッチＥＬＩＳＡ法による、アルツハイマー病ア
   ミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ７７０又はその断片の免疫学
   的測定方法。
2. 【請求項２】　　請求項１記載の２種類の抗体のうち一
   方を不溶性担体に結合した第１次試薬と、もう一方の抗
   体である第２次試薬とからなる、アルツハイマー病アミ
   ロイド前駆体蛋白ＡＰＰ７７０又はその断片の測定試薬
   。
3. 【請求項３】　　請求項２記載の測定試薬を構成要素の
   一部とする、アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白Ａ
   ＰＰ７７０又はその断片の測定キット。