JPH0426700A - 代用血清：細胞成長活性剤（ｃ．ｇ．ａ）調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト及び動物血液（並びに他の生体液）中に
存在する細胞成長促進物質に関する。本明細書には、こ
のような物質の組成物及び製造方法、並びに細胞成長、
細胞増殖、細胞成長の増強、細胞成長制御のための、細
胞培養に際して血清の代用をするための、細胞、組織、
器官及び他の生体物質の維持のための、並びに偏好性微
生物の培養に際して使用するためのこれらの物質の用途
が記載される。

さらに、本発明は、細胞培養における細胞由来生成物の
増大のための手段に関する。

好ましい一実施例においては、本発明の成長促進物質は
、例えばウシ胎児血清の代用物として細胞を成育させる
ための培地として用いる。創傷治癒のためのｉｎ　ｖｉ
ｖｏ使用のような他の用途も考えられている。

光泄Ｉと１月 血液又は血清は、合成媒質のみでは少しだけしか又は全
く成育しないと考えられる広範囲の偏好性微生物及び細
胞を成育させるための培地への添加物として広く用いら
れる。

一般に、血液又は血清は、これらのｒ成長因子Ｊを提供
するために使用する。しかしながら、血液又は血清は多
くの物質を含む非常に複雑な物質である。さらに、血清
中のｒ成長因子」の濃度は非常に低く、このためその精
製は非常に難しい。Ｓ、に、　Ｄｉｎｋａ参昭：　　Ｅ
、　Ｋｕｒｓｔａｋｌｉ　［ｔ’　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ、ＣＩ、Ｓ
ｅｔｔｉｎｇ　Ｕｐ　ａｎｄ　Ｍａｉｎ−ｔｅｎａｎｃ
ｅ　ｏｆ　Ｔｉ−５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅｓ、ｌの中のＧｒｏｗｔｈ　　Ｒｅｇｕｌａ−
ｔｉｏｎ　　Ｆａｃｔｏｒ　　ｉｎ　　Ｓｅｒｕｍ　　
Ｕｓｅｄ　　ＦｏｒＩｎ　Ｖｉｔｕｏ　　Ｃｕｂ　　ｔ
ｕｅ　ｏｆ　　Ｃｅ１ｌｓ：Ｐｌｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　
　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｊｑｕｅｓ、１〜３３（１９８５
）。

科学者は、成長に関与する物質を単離、精製する方法を
探究してきた。いくつかの物質が化学的に確認されたが
、これらはポリペプチド又は蛋白質である。しかしなが
ら、このような成長因子は、通常、血中に非常に低濃度
で存在するために、精製は非常に難しい。これらの複雑
な系からの成長因子の分別のために目下用いることので
きる方法は、大量の血清を処理するには一般的に適当で
ない（Ｄ、Ｇｒｏｐｏｄａｒｏｗｉｃｈ　ａｎｄ　Ｊ、
Ｓ、Ｍｏｒａｎ、４５Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈａｍ
、　　５３１〜１９７６）血清から得られる蛋白質性成
長因子の分別に用いることができる方法は、私の初期の
特許、例えば米国特許第４．１８９．５３５号及び第４
．３４６．８４６号で検討された。前者特許は、血清蛋
白質の陰イオン交換樹脂への吸着とその後の溶液の勾配
塩を用いた成長送信物質の特異的溶出を示している。後
者特許は、沈殿物を生成するための血清又は血漿への過
塩素酸の添加とその後の溶液ｐ日増大による成長因子の
抽出を示す。

血中成長因子の一群は、成長ホルモンによって調節され
ると思われる肝起源のものと推測される循環ペプチドの
一群であるソマトメジンである。

ソマトメジンは酸性環境において大型担体蛋白質から分
離され、さらにそれは、分子量１０．０００ダルトン未
満の活性ソマトメジン分子が可溶性形態で、酢酸を用い
た酸性化（ｐ）１２．３）後のヒト血漿の限外濾過中に
存在することが明らかにされている（　　Ｂ、Ｈ，Ｇｉ
ｎｂｅｒｇ等、　４８（２）Ｊ、Ｃｅ１ｎ、Ｅｎｄｏｅ
ｒｊｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｍｅｔｏｂｏ１ｉｓｍ４３〜
４９．１９７９）。ソマトメジンは、Ｃ，ｏｈｎ分別中
に生成される血漿蛋白質沈殿物中に存在し、酸性化によ
り担体蛋白質から分離される。

ソマトメジンの酸分離は、Ｃｏｈｎ沈殿血漿蛋白質から
のこれらの成長促進剤の収集のためのいくつかの方法で
用いられてきた（Ｈ，Ｂｕｒｇｉ、１２１　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、３４９〜３５９，１９６６
；Ｋｎｕｔ　Ｌｌｔｈｎｅ、＋７５Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｍｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌ）１〜３５１９７３；
Ｅ、Ｒｉｎｄｅｎ−ｋｎｏｃｈｔ　＆　Ｒ，Ｅ、　）Ｉ
ｏｍｂｌｅ、　７３　（７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、＾、　２３６５〜２３６９．１９７６）血液凝
固過程中に、成長因子は血小板から放出される。何人か
の研究者は、血清成長促進剤の主要部分は実際には血小
板起源のものであるかもしれないと主張している（例え
ばＲ，ＲｏｓｓとＡ、　Ｖｏｇｅｌ。

Ｃｅ１ｌ　１４：２０３〜２１０．１９７８を参照）。

成長因子はすべての血清蛋白質の小さなパーセンテージ
しか占めないという事実の結果として、研究書違は血小
板成長因子を、イオン交換クロマトグラフィ法を用いて
溶解洗浄血小板調製物から単離した。Ｃ，Ｈ。

Ｈｅ１ｄｉｎ等（ＥＸＰ、Ｃｅ１ｌ　ｆｌｅｓ、１０９
，４２９〜４３７．１９７７）は、それぞれ分子量４０
．０００ダルトン及び１０．０００ダルトン未満の２つ
の陰イオン画分、並びに２５．０００〜ａｏ、　ｏｏｏ
ダルトンの大きさのプロセッシング活性を有する異質陽
イオン画分を記載した。

Ｒｏｓｓ等（ｔｌｏｒｗｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｂｏｏｋ　Ａ、Ｇ、１（。

５ａｔｏ及びＲ，ａｓｓ共編中、ｐｐ、　３〜１６　（
Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＭａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、１９７９）は、分子量１ｏ、ｏｏｏ〜３０、０
００の陽イオン画分を単離した。さらに処理すことによ
り、＋６．　Ｉ）ＤＯ〜３８．０００ダルトンの分子量
までミトゲン活性が受理された。

これらの血小板由来成長因子は、細胞成長を促進するた
めに用いられていた。しかしながら、これらの成長因子
は、有効であるためには、さらに貧血小板血漿を混合し
なければならない。

硫酸アンモニウム沈殿は、ＪａｃｑｕｅｓとＢａｒｒｙ
（Ｊ、　Ｇｅｍ、　Ｐｈｙｓｊｏｌ、　３４ニア６５〜
７７６、１９５１）Ｘが用いた。

Ｅａｇｌｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２：４３〜４６，１
９５５）、Ｆｉｓｈｅｒ等（Ｐｒｏｃ：Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｉＪ、　Ｓ、　Ａ、　４４：４〜
１０．　ｌ９５Ｂ）　。

Ｌｉｂｅｒｍａｎと　Ｏｖａ　（Ｊ、　Ｂ　ｉｏ　Ｉ、
　ｃｈｅｎ、　２３３　：　６３７〜６４２、Ｍｉｃｈ
ｌ、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、　２３：３２４
〜３３４．１９６１）　、　Ｈｅａｌｙ＆　Ｐａｒｋｅ
ｒ（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、３０：５３９〜５５３．
１９６６）Ｔｏｄａｒｏ等（Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎ５ｔ、
Ｓｙｍｐ、Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　７：８７〜９８、１９
６７）　、　Ｐａｕｌ等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓ　ｉｃ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

６８：６４５〜６４８．１９７１）　、　Ｌｆｐｔｏｎ
等（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ　７４：４６６〜４７０
．１９７２）、ｔ（ｏｆｆｍａｎｎ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ
　Ｒｅｓ、８５：２７５〜２８０．１９７３）　、　Ｌ
ｅｆｆｅｒｔ　（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６２ニ
ア６７〜７７９、１９７４）　、　５ｌｏｔｔａ等（Ｈ
ｏｐｐａ−８ｅｙｌｅｒ”ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　３５６　：３６７〜３７６、１９７５）　
、　Ｍｃｋｅｅｈａｎ等（Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙ　’ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｒｍｍｎ、　８
０　：　１０１３〜＋０２１．　＋　９７８）は、血清
成長因子の分離のために硫酸アンモニウム塩を用いた。

はとんどの細胞成長促進活性が、４０〜５０％の硫酸ア
ンモニウム濃度で含有されていた。

相当の活性が他の濃度で沈殿された画分中にも存在した
。Ｊｏｈｎ　Ｂｏｚｉｃｅｖｉｃｈ　（米国特許箱３．
４２９８６７号、　１９６９年　月２５日）は、実質的
にガンマグロブリンを含まない血清を調製するために硫
酸アンモニウムを用いた。

動物供給源からの全血清の使用による欠点は多い。最も
重大な不利益は、自発性血液凝固が時間を要するという
事実による。さらに血液凝固の自発性のために、凝固の
時間及び完全性は、供血源、並びにこのような血液の収
集、処理及び保存の環境によって相当に変化する。

これらの因子が各血清バッチの特異的成長促進活性の質
に決定的影響を及ぼすことが判明している。

全血清の単離に際して講じられた予防手段にもかかわら
ず、成長支持効能はしばしば、終日又は、それ以上を要
する待機期間により、並びにやや難しい血餅除去によっ
て、危機にさらされることが判明している。

個々の動物及び特定の環境によって、血清の清澄化に関
与する工程は、血清容積当たりの細胞成長促進因子又は
Ｍｉ織培養支持因子の特異的活性に有害であるかもしれ
ない蛋白質分解のようなある種の非制御生物学的工程を
生じる。

したがって、この天然物質の変異性は、しばしばこれら
の組織培養におけるその有用性をゆがめ、且つ縮小して
きた。

天然又は自発性全血清の使用に際してのもう１つの重要
な欠点は、所望の組織及び細胞培養支持因子以外の多数
の余分な及びおそらくは望ましくない血清成分を用いる
必要性にある。

細胞を成育させるために最も一般的に用いられる天然物
質の１つは、ウシ胎児血清　（ＦＢＳ）である。この国
における屠殺率及び牛肉消費の変動に依存するために、
　ＦＢＳはしばしば不足する。したがって、価格構造は
全く不安定で高値傾向にある。

ＦＢＳ又は他の任意の血清の使用に際して考えられる危
険に対する別の考察は、しばしば検出不可能な、例えば
微生物又は毒性化学物質のような汚れの存在に関する。

微生物性汚染としては、細菌、ウィルス、プラズマ及び
他の病原体が挙げられる。毒性物質としては、ホルモン
、殺虫剤、除草剤、重金属のような摂取された物質が挙
げられるが、これに限定されない。

哨乳類の血清中に存在する成長因子の重要性に顧みて、
並びに血清採取の慣用手順はゆっくりしたもので、組織
培地への成長促進添加物としては血清の特異的活性を非
常に危くする可能性があるという事実を認識して、安全
で、非変質性で且つ迅速な方法で、血液から成長促進画
分を単離する確実な方法に対する必要性が、組織培養の
分野には非常に重要になってきている。

ル豆少里刀 したがって、本発明の目的は、従来通り１ｎＶｉｔｒｏ
細胞成長を支持することができる血液又は無血小板血清
を得るために、天然又は自発性の非常に変動し易い血液
凝固工程に頼らずに、血液の成長活性画分を単離する方
法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、活性の有意の損失を伴うこ
となく成長支持物質の画分を提供することである。

さらに本発明の目的は、硫酸アンモニウムを用いた血漿
又は脱繊維素化血漿の塩沈殿により成長活性の画分な提
供することである。

本発明の別の目的は、遠心分離により血球を最初に除去
した血漿の塩沈殿によって成長促進画分を提供すること
である。

本発明のいま１つの目的は、自発的凝固血液から得られ
た全血清に比して一貫した、優れた品質を有する成長促
進血液画分を提供することである。

さらに本発明の目的は、血液、血清、血漿及びその他の
体液から得られるヒト成長促進基画分の精製である。

本発明のさらなる目的は、成育のための適切な支持を提
供するために、合成組織培地への明確でない、未知の且
つ過剰量の血清蛋白質の添加を避けること、あるいは少
なくとも添加を縮小することである。

本発明の別の目的は、上記と同様のＦＢＳの使用に関連
した問題を克服することである。

本発明のさらなる目的は、細胞内に蓄積しているあるい
は周囲成育培地中に分泌される蛋白質の大量産出を増強
する体液からの成長促進画分を提供することである。

血漿又は血漿由来血清画分から得られる本発明の成長因
子は、経済的で、安全な、且つ限定された付加的栄養培
地に大いに役立つ。

さらに本発明の目的は、例えば結合組織を含むコラーゲ
ン層のｉｎ　Ｖｉｔｒｏ培養におけるような組織又は器
官培養の増強のためのＣＧＡ製剤を使用することである
。このようにして培養される擬似器官は、水分損失を防
止するのに役立ったり、微生物感染に対する防護を提供
するための代用皮膚層又は−時的防護スクリーンとして
有用であることが判明しており、これは火傷罹災者にと
って決定的に重要なものである。

日の言しし）８日 代用血清としての細胞成長促進剤は、血漿、脱繊維素化
血漿、血漿由来血清、及び血清（血餅除去後の血液から
得られる）から単離する。

水溶性蛋白質性成長活性剤の精製は、成長促進画分の選
択沈殿によって行うのが便利である。当業界で十分公知
のように、硫酸アンモニウム塩を用いて、それらの大き
さ及び全体的電荷により、種々の蛋白質を沈殿させるこ
とができる。この方法は、血中アルブミン、免疫グロブ
リン及びその他のこのような成分の単離に非常によく用
いられる。

血清又は血漿中の硫酸アンモニウム濃度が段々増大する
のに伴って、蛋白質の別個の集団が沈殿する。各工程後
、沈殿物質は、遠心分離又は濾過といった慣用重力法に
より溶液から分離することができる。

単離工程を、２つの好ましい方法で述べる。

第−の方法は、上記の異なる種類の血漿又は血清のよう
な明澄化無血球残留血液に固体又は液体形態で添加され
る硫酸アンモニウムを用いたワンステップ沈殿である。

はぼ室温での硫酸アンモニウムの最終濃度は３０％飽和
まで引き上げられる。

本発明の第二の実施例においては、以下の一般プロトコ
ルに従って多段階沈殿法を用いる。

精製血液体成分、例えば既述の血漿を、固体又は液体形
態で硫酸アンモニウムと混合する。漸増的に得られる硫
酸アンモニウム濃度は、室温、又は指定温度、例えば４
℃で、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％及び
７０％　（Ｗ／Ｖ）飽和液である。

硫酸アンモニウム塩濃度の各増加段階で、例えば遠心分
離のような慣用手段により、沈殿物を分離又は収集する
。沈殿物質又はペレット化物質を、約０．８５％の塩化
ナトリウムを含む１０分の１反応量の又は任意の所望量
の生理食塩水中に再懸濁および溶解する。

各再溶解画分を、約７．２〜７．６に調整したｐＨ範囲
で、同一生理食塩水に対して透析する。

成長因子の種々の増分画分の抽出物を透析によりこのよ
うにして完全に再可溶化した後、各画分の重量オスモル
濃度を測定し、必要ならば、減菌０．２２ミクロン孔径
膜フイルタによる濾過の前に食塩水で適当に調節する。

その後、画分を、好ましくは約−２０℃又はそれ以下で
冷凍保存する。

沈殿および分離工程の血中血漿又は血清上澄画分を、塩
濃度を次の適当な又は好適な増分に増大するために、十
分量の硫酸アンモニウム（液体又は固体形態で）と混合
する。これらの沈殿及び分離工程を各増加濃度で反復し
、硫酸アンモニウムに関して約７０％　（Ｗ／Ｖ）飽和
で沈殿を生じる最終工程で終了する。遠心分離し、分離
した後、既述の通り、生理的食塩水に対して上澄を透析
する。任意に、７０％　（Ｗ／Ｖ）沈殿工程を省略して
、５０％飽和硫酸アンモニウム沈殿蛋白質除去後の上澄
を用いる方を選んでもよい。

５０％、６０％、又は７０％　（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニ
ウム沈殿伝物質は、上記と同様、約２０〜３５％、又は
好ましくは２５〜３０％　（Ｗ／Ｖ）飽和硫酸アンモニ
ウム範囲で溶液中に再溶解するか、もしくは直接、開始
容量の１０分の１又は所望容量の食塩水に再溶解し、次
いで透析する。

それに代わる方法としては、血漿又は血清蛋白質の次の
増分沈殿を得るために、透析期間を置かずに直接十分量
の硫酸アンモニウム溶液を用いて各工程で上澄を混合す
る、より迅速な方法がある。しかしながら、５０％飽和
硫酸アンモニウム上澄血清又は血漿中に残存する成長刺
激活性は、いくつかの培地を富にするに際して有効であ
ることが判明している（実施例参照）。

段階的沈殿蛋白質は、一般に、その生物学的及び物理化
学的特性に従って変化する。各画分を、その成長増強特
性に関して分析する。３０〜５０％飽和硫酸アンモニウ
ムから得られた蛋白質断片は、未処理血漿又は血清のほ
とんどの成長支持活性を有する組成物を含有することが
見出されている。

同時に、この手法は、しばしば蛋白質分解の活性化を引
き起こすある程度不完全な血液凝固が関与する変量を回
避する。

もう一つの利点は、自発性凝固によって生じる情況に比
して、血球が遠心分離中無傷のままであるという事実に
よって生じる。さらに、全ての血球が凝固により除去さ
れるわけではなく、凝固はしばしば不完全である。溶血
、並びにそれに付随する血球成分の血漿又は血清中への
放出は、成長増強能力の可変性においである役割を演じ
る可能性がある。

以下の実施例は、本発明の単離法に従って実施した場合
の血液画分の有効性を説明する。

凝血による血球の労力を要し且つ不経済な除去を避ける
ということは別にして、組成物の成長増強特性はしばし
ば、常用血清生成物と同じ位、又はそれ以上に有効であ
ることが判明している。

もちろん、塩沈殿は硫酸アンモニウムに限定されるもの
ではなく、その他の好適な、生理学的に受容可能な塩も
含まれる。これらの塩としては、硫酸カリウム、硫酸ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、及び塩化
ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。

血漿又は血清から得られる種々の画分は、細胞産出量、
細胞倍化時間、［３ＨＥ−ＴｄＲ取込み、蛋白質増大、
及び特異的酵素検定又は生物学的検定についての公知の
判定基準により、組織又は細胞支持活性に関して試験す
ることができる。さらに、画分の組成物は、ヘモグロビ
ン及びその他の血漿又は血清成分、並びに血球溶解物質
のような蛋白質及び汚れの存在に関して検定することが
できる。

慣例的に、画分を、孔径的０．２ミクロン、もしくは約
０．４５ミクロンの減菌フィルタ膜を用いて濾過する。

特定目的の用途に関しては、常用全血清又は血漿の場合
に用いるのと同様の公知の適切な方法により、ウィルス
又はマイクプラズマの存在に関して画分な調べることが
できる。

組織培地中の添加物として用いるためには、精製画分の
保存液量は、濃縮しない場合には、血漿または血清の開
始容量とほぼ同じものを保持するのが便利である。した
がって、成長促進物質を豊富に含んだ血漿又は、血清画
分は、常用血清と同じパーセント（％）濃度の培地への
適量の成長因子の添加のために考えられた濃度の因子と
同容量で培地中に用いることができる。その結果、組織
培地の組成物は、通常１％〜６％の範囲で変化する適当
な容量濃度での成長促進溶液を含み得る（実施例参照）
。

血漿又は血清から単離された精製画分を、常用未処理物
質と比較して、細胞増殖試験におけるその細胞成長刺激
活性に関して調べた。

本発明の他の利点は、３０％〜５０％範囲の画分に比し
て、特別に且つ選択的に十分、硫酸アンモニウム１０％
〜３０％塩沈殿画分にいくつかの細胞株が反応するとい
う事実において判明し得る。

血漿又は血清の成長支持画分又は成長促進画分の単離方
法は、もちろん、はぼすべての適当な動物源から採取さ
れる血液又は他の体液に適用することができる。したが
って、ウシに加えて、その他の適当な供給源としては、
ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、アヒル、シチメン
チョウ、ニワトリ等が挙げられる。

さらに、血漿又は血清画分の成長促進活性は、長期保存
のために、あるいは運搬を容易にするために親液化し得
る。

細胞成長活性剤　（ＣＧＡ’ｓ）は天然蛋白質であって
、血液中に存在して細胞の成長及び分裂を発生させ且つ
制御し、さらに、本明細書に記載したと同様の新規な特
許方法によって生成される。これらの因子は、蛋白質発
現、分泌又は貯蓄物質産生、並びにこれらの細胞によっ
て産生される製薬又はウィルスの量にも影響を及ぼすこ
とを私は見出した。しかしながら、これらの天然循環蛋
白質の性質又は生物学的作用機序は、未だ不明である。

このような蛋白質が蛋白質発現または分泌される蛋白質
の産出量にいかに影響を及ぼすかに関しては、直接的証
拠がない。蛋白質発現を生じるＣＧＡは、細胞が細胞周
期を進行中は細胞成長及び分裂と並行すると一般に仮定
されている。この仮定はもはや真実でないかもしれない
。

個々のＣＧＡ　’、は特徴づけられていないために、そ
れらの個々の血中濃度を測定することはできない。した
がって、それらの明白は活性は、確定済みのパラメータ
を用いて細胞成長を測定することによってのみ（非脱繊
組素化血漿は細胞培地中で凝固すると考えられる）、血
清画分で試験した。

しかしながら、この方法では、個々の成分又はその相対
的特性についてのいかなる情報も明らかにするこはでき
なかった。さらに、思わぬ困難な問題が、活性は必ずし
も加法的又は相乗的なものではないという事実から出て
くる。様々な程度に、それらは、濃度に依り相互に増強
又は阻害し得る一定の最適範囲を超える濃度は、濃度依
存阻害を引き起こすことさえできる（第７図参照）。し
かしながら、それ自体活性を有していない単一因子又は
複数因子の存在は、活性蛋白質性化合物を併用した場合
、細胞成長促進活性を徹底的に増太し得る。

本発明の好ましい具体例は以下の実施例により実証され
るが、いかなる点においてもそれに限定されるものでは
ない。

これらの実施例においては、本発明の組成物は、そのＩ
ｒＣＧＡＪ１番号又はｆｆＢ（Ｊ番号によって表わされ
る。ここでＣＧＡ−１はＢＣｌｏｏＯであって、３０％
沈殿から得られたものである。ＣＧＡ−２はＢＣ２００
０として公知であって、５０％沈殿から得られる。

ＣＧＡ−３はＢＣ３０００であり、これは５０％沈殿工
程上澄から得られる。

これらの実施例並びに図面はまた、細胞成長エンハンサ
Ｅにも言及している。エンハンサＥは溶解赤血球から得
られる。それは、それ自体はとんど又は、全く細胞成長
促進活性を有していないが、水と混合したＣＧＡ製剤の
場合、それは細胞成長を有意に増強する。好ましい具体
例（実施例）に示す通り、エンハンサＥは、通常、１％
　（Ｗ／Ｖ）濃度で添加する。

エンハンサＥは、同時係属中の米国特許出願節１３１、
１８８号（１９８７年１２月ＩＯ日提出）に開示され、
特許請求されている。その記載内容は参照により本明細
書中に含めるものとする。

塞ｍ例」エ　　ＣＧＡ調整 ＣＧＡ　’　ｓ製造に関しては、全血の代わりに血漿又
は血清を用いるのが好ましい。クエン酸ナトリウム抗凝
固薬の存在下で産生される血漿を、ＣＧＡ’ｓ産生に用
いるために、さらに血球及び血小板を除去処理する。血
清は、血球及び血小板を含有する全血を凝固させて生成
する。凝固中は、非常に複雑な蛋白質分解カスケード反
応が進行する。この工程を通して、蛋白質は活性化蛋白
質分解酵素の作用を受け、血球及び血小板はさらに別の
細胞成長促進蛋白質及びその他の物質を放出する。この
活性は、年齢、性別、季節、食物、環境及びストレス関
連条件、並びにその他の条件に左右される。血清は、こ
のように、病理学的液体と考えられる。逆に、血漿は、
生体が有する正常細胞成長促進活性剤の全てを密接に反
映する。

割嵐旦孟 本製品、即ちＣＧＡ製剤は、特定の細胞に対して、ウシ
胎児血清に比して良好な細胞成長を提供することを目的
とした。

２つの異なる組換え細胞株（一方はハイブリドーマ、他
方は丁細胞株）に置けるＣＧＡ画分の効力は、予期に反
して、細胞成長促進のＣＧＡ率は、蛋白質発現活性化の
ＣＧＡ率とは異なるという結果であった（第２．３．４
．５．６．７．８図）。

続いて、他の細胞を用いて、ＣＧＡ画分が、細胞成長速
度、蛋白質発現、及び細胞生成物、収量に異なる効力を
発揮することを私は見出した。意外な結果は、細胞の種
類によって変わるだけでなく、同じ単一親細胞から直接
得られたクローン培養の中でも変化した。これはハイブ
リドーマ又は組換え細胞株を用いた場合と同様であると
考えられる（第９．１０．１１図）。

夫巖■ユ 細胞成長が事実上認められない場合でも、ＣＧＡ画分に
よる蛋白質発現及び分泌率は、ウシ胎児血清存在下と同
じ位、又はそれ以上に高いということが判明した。した
がって、細胞成長速度は、私が以前仮定したように蛋白
質発現率と同様、生成物収量の確実な指標と考えること
はできない。さらに、基本培地の特定の組成物が、　Ｃ
ＧＡ画分と結合して明らかに重大な効力を有することも
見出した（第１２．１３図）。

事実、最適細胞成長のための基本培地とＣＧＡとの好ま
しい組み合わせは、意外にも、最適生成物収量又は蛋白
質発現に有効な組み合わせとは異なるものであってもよ
い（第１３．１４図）。

好ましい本実施例としては、細胞の種類により効力が変
わるだけでなく、ハイブリドーマ及び組み換え細胞と同
様、同一親細胞から得られた細胞に関してさえ異なる組
み合わせが挙げられる。

組のデータは、ＣＧＡ処理による生成物収量はウシ胎児
血清を用いた場合の１０倍まで高いことを示している（
第１５図）。

Ｋ胤１ われわれの実験データは、ＣＧＡがウィルスワクチン製
造のために使用される細胞のウィルス複製に同様の効力
を及ぼすことを示す（第１６．１７．１８．１９．２０
．２１図）。ウィルス産出量は、高細胞成長時のウシ胎
児血清の場合より低細胞成長の場合に高いことがわかる
。われわれの最近のデータは、ＣＧＡを用いて連続的に
二次培養した細胞は、ウシ胎児血清で成育させた細胞よ
りも数倍高い生成物収量、蛋白質発現を生じ得ることを
示している（第２２図）。

実施例５（第１図） １０％　（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ　、又は１％、２％及び３％
（Ｖ／Ｖ）　ＣＧＡ画分くそれぞれＣＧＡ−１、−２及
び−３（Ｂｉｏｔｉｓ　（ＣＧＡ　”　）　）の存在下
で細胞成長を査定した。特定的に、ＣＨＯ−Ｋｌ細胞（
モルモット卵巣）。Ｃ１１２７細胞（マウス乳癌）　、
Ｈ３ＢＰ細胞（ヒト包皮繊維芽細胞）、及び及びＭＤＣ
Ｋ細胞（イヌ腎臓）をＢＭＥ培養中で成育させた。ＣＧ
Ａ画分はすべて、添加物ＣＧＡ−１よりも　ＣＧＡ−２
及びＣＧＡ−３によって優れた成長促進効力を示した。

他方、ＣＧＡ−１は、　ＣＧＡ−２、−３又はＦＢＳよ
りも大きな成長率を生じた。

尺嵐孤ｌ（第２図及び第３図） １０％ＦＢＳ、又は３％ＣＧＡ＋Ｅ（Ｅは米国特許第１
３１、１８８号（近年係属中）に記載と同様の瀉血生成
物である）の存在下で、ＣＨＯ細胞を培養した。

添加物Ｅは、常に総濃度的１％　（Ｖ／Ｖ）で使用する
。第２図及び第３図に示した結果は、細胞成長率（取り
込まれるｃｐｍ）は、ｌＯ％ＦＢＳを用いたＣＨＯ培養
と比較した場合、　ＣＧＡ−３（＋　Ｅ　）含有培地に
おいてはっきりと低減する。しかしながら、生成物産出
量は、培地中に分泌される細胞蛋白質に取り込まれた数
で測定した場合、　ＦＢＳによって生じた産生量とほぼ
等しい。

夫巖■ユ（第４図） ＨＢＰＳ繊維芽細胞の培養は、成長及び生産力に関して
、　ＣＨＯ細胞培養と同じ効力を示した。

したがって、３日間の期間中にＣＧＡ−３によって生じ
る生成物産生は、分泌増加を示した。逆に成長率は相対
的に遅かった。培養を含む１０％ＦＢＳは、第１日芽に
先駆物質のはっきりした取り込みを示すが、これはその
後急速に減少した。３日後の繊維芽細胞の生成物産生に
及ぼすＦＢＳ効力に関するデータはない。

夫ｍ（第６図及び第７図） Ｂハイブリドーマ細胞成長を３日間に互って、１０％　
（Ｖ／Ｖ）　ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ＋Ｅ（Ｅは上記と同
じ）を用いて比較した。ハイブリドーマの細胞成長は３
日月に劇的にスローダウンしたが、その生成物分泌は増
加し続けた。

Ｋ嵐■慮（第８図） この実験は、Ｔ細胞バイプリドーマ培養成長率が、　Ｆ
ＢＳまたはＣＧＡを添加したにもかかわらず、培地■よ
りも培地ＴＩにおいてより活発に維持されたことを実証
する。

Ｋ敷匠刊（第９図） ＣＨＯ−ＦＣＲ細胞の成長に及ぼすＭＣＤＢ３０２　、
ＡＬＰＩ（ＡＭＥＮ、及びｌ５ＣＯＶＥの変法ＤＭＥＭ
培地の効力を比較するに際して、その培地を１０％ＦＢ
Ｓ、１．５％ＢＤ２０００．３％ＢＣ２０００、１，５
％ＢＣ３０００、又は３％ＢＣ３０００±Ｅと組み合わ
せた。明らかに、ＡＬＰＨＡ変法ＭＥＮ＋　３％ＢＣ３
０００は、　ＦＢＳのように高くないとはいえ、最高の
成長促進活性を示した。

尖考ｌ（μ（第１０図） ＣＨＯ−植物組み換え細胞の成育は、　１．５％及び３
％ＢＣ３０００の存在下で成育させた場合、ＭＣＤＢ３
０２、Ａｌｐｈａ変法ＭＥＮ、及びｌ５ＣＯＶＥの変法
ＤＭＥＮの好ましい培地中でかなり増強された。Ｅを添
加した場合も、　１．５％ＢＣ２０００と組み合わせた
ＭＣＢＤ３０２において促進効力が示された。

Ｋ１丘Ｕ（第１１図） ＣＨＯ−Ｋｌ細胞は、成長因子とはかかわりなく、ＭＣ
ＤＢ３０２においてより活発に成育するように見えたが
、一方３％ＢＣ３０００を豊富に含んだｌ５ＣＯＶＥの
変法ＭＥＮは最大の成長促進効力を示した。

来遊ＬｆＬ口（第１２図） 種々の培地中のＣ）１０−Ｋｌ細胞に置ける平均成育力
に関する試験から、ＤＭＥＭ　　Ｆ　−１２＋　　１．
５％ＢＣ２０００＋　ＢＥｌｏｏＯ（１％Ｅ）、及びＡ
ｌｐｈａ変法ＭＥＮ十ＢＥ１０００　（１％Ｅ）が最も
有効であることが明らかになった。

実１１引Ｕ（第１３図） 生成物産生は、急速成長率を支持しない培地中で本発明
の成長因子により特に増強されると思われた。

ＣＨＯ−ＲＣＲ細胞からの生成物収量（ＳＦＣＥ　ｍｇ
／ｍｌ）と細胞数を比較した場合、特に良好な比率は、
ＭＣＤＢ３０２培地＋（ＣＧＡ＋Ｅ）中で成育された細
胞に見出される。

火遊ｌ引ｉ（第１４図） 懸濁液培養におけるＣＨＯ−Ｋｌ細胞長期成育力は、１
．５％　ＣＧＡ＋　１％Ｅ十旧（ＷｉｌｌｊａｎのＥ）
、又は１％ＣＧＡ−２＋　１％Ｅ−Ｍ２　（Ａｌｐｈａ
培地）の場合に顕著であることが示されたが、ここでＥ
は上記と同様で、Ｗｉｌｌｊａｎ培地に加えられる。全
体的に、スピナーフラスコ中のＣＨＯ−Ｋｌは育成細胞
の成育力は、２％力月長期培養においては９７％又はそ
れ以上であった。

実１１引四（第１５図） 試験により、　ＣＧＡ−３％ＢＣ２０００＋　１％ＢＥ
１００Ｏの存在下で育成したＣＨＯ−旧細胞は、５％Ｆ
ＢＳ又は３％ＢＣ３０００＋　１％ＢＥ１００Ｏで育成
した細胞より５〜１０倍生産力が高いことが示された。

Ｋ監匠旦（第１６図） 第１６図のデータは、培地とＣＧＡの最上の組み合わせ
を調査中の比較上の一連のニワトリ胚細胞培養を示す。

１％ＢＣ３０００，２％ＢＣ３０００、又は３％ＢＣ３
０００を添加した培地　１９９　Ｆ１２が、１０％　Ｆ
ＢＳを伴う同一培地よりも成長刺激性が有意に高いこと
は明白である。ＷｉｌｌｉａｎのＥ培地＋１％ＢＣ３０
００が特に成長に有効であった。

実１１引Ｉ（第１７図） ローラー試験管中のニワトリ胚細胞成長に及ぼすＣＧＡ
の濃度効力は、１％又は２％ＣＧＡを用いた場合、５％
ＦＢＳに対する場合の率の２倍以上であることが実証さ
れる。

火監五月（第１８図及び第１９図） ＳＢ−１ウイルス又は　ＨＴＶウィルスに感染したヒヨ
コ胚細胞を育成させるのみ好ましい２％ＣＧＡ（ＢＣ２
０００）に冨んだ培地を用いた場合、細胞成長及びウィ
ルス生成物は５％ＦＢＳ含有培地とほぼ等しいことが観
察された。

割敷鯉腫（第２０図及び第２１図） ３％ＢＣ３０００及び３％ＢＣ６５００の　ＣＧＡ画分
は、ＭＤＢＫ細胞培養において成長及び　ＢＶＤ−ウィ
ルス産生を有意に増強するが、これに比して１０％ＦＢ
Ｓ培地中では培養は好都合に成育されると思われる。（
第２０図参照）。同様に、ＭＤＢＫ細胞における　ｒＢ
Ｒウィルス滴定（第２１図）は、ｌＯ％ＦＢＳに比して
冨ＣＧＡ培地中で優れているが、一方感染ＭＤ８に細胞
の細胞成長は、２％ＢＦ２０００＋　１％ＢＣ１００Ｏ
１３％ＢＣ３０００，３％ＢＣ６５００、又は３％ＢＣ
６５００＋　１％ＢＥ１００Ｏの存在下で特に良好であ
る。

ウィルス感染細胞を含むＣＧＡ培地育成細胞を有する培
養における個々の明らかな変異性にもかかわらず、−貫
した成長及び産生増強のためのＣＧＡ製剤の使用は、冨
ＦＢＳ培地を改良することが判明している。平均生成物
収量増強は実施例１８に示される。

夾１１引Ｕ（第２２図） 多数のＧＡ１１Ｉロットを、　ＣＨＯ−ＦＣＲ細胞に及
ぼす生成物増強効力に関して試験した。　１．５％ＣＧ
Ａ１１Ｉ　＋１％Ｅ通過培養中を通過した細胞の生産性
反応は、　１．５％又は３０％濃度でのＣＧＡｍ　＋　
Ｅを用いて刺激した場合のＦＢＳ（１０％）通過培養と
実際上等しいか又は上回っていた。

本発明のＣＧＡ画分を含有する組成物は、培地中の細胞
及び組織の成長及び生産性を増強する。同様に、ＣＧＡ
画分の組成物は、それらの潜在的創傷治癒効力に対して
創傷の治療に有効用途を見出している。

本発明はまた、　ＣＧＡ画分及び製薬上受容可能な局所
使用のための担体から成る製薬組成物を提供する。

特に皮膚の創傷の治療に用いるＣＧＡ画分の用量は、　
ＣＧＡ物質の相対的効能に伴って変わる。しかしながら
、一般指針としては、好適な濃度は約１％〜３％　（Ｖ
／Ｖ）であってよい。このような量を１日１回以上、例
えば１日数回投与し、このような治療が必要な期間、数
日間又は数週間連続してもよい。

上に示された好ましい範囲内では、　ＣＧＡ製剤が毒性
作用を有することは予測されない。創傷の局部治療の好
ましい具体例は、ヒト皮膚の治療のためにヒト血清又は
血漿から得られる　ＣＧＡ画分を用いる予定である。同
様に、他の温血動物の場合には、本発明の活性剤（ＣＧ
Ａ）は、考えられる拒否又はその他の免疫毒物学的作用
を避けるために、治療を受けるものと同じ種から単離す
る。

局所的及び経皮投与のために、製剤は軟膏、クリーム、
ローション、ゲル、スプレー、エアロゾル、つけ薬、皮
膚塗布剤、または膏薬として提供され得る。

局所又は経皮使用のための有効量のＣＧＡ画分の組成物
は、酸化防止剤、ビタミン、アミノ酸、炭水化物、脂質
、微量金属、生理学的に受容可能な塩溶液又は緩衝液、
鉱質、抗生物質、組織プラスミノゲン活性剤のような組
織活性修正剤、又は他の因子を含有してもよい。

本発明を、その好ましい実施例に関して上記したが、請
求の範囲に定義されているように、本発明の精神を逸脱
することなく種々の修正及び変更を本方法に組み入れ得
ることは、当業者には明らかである。

【図面の簡単な説明】

第】図は、ウシ胎児血清とＢｉｏｔｉｃｓ　　ＣＧＡＴ
Ｍの細胞成長の比較を示す。 第２図は、１０％ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ−３＋　Ｅを伴
う培地Ｉ　（Ａｌｐｈａ変法ＤＭ変法１仁ＥＮるＣＨＯ
細胞成長（第２ａ図）及び生成物収量（第２ｂ図）を示
す。 第３図は、１０％　ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ−３＋　Ｅを
伴う培地１１　（Ｗｉｌｌｉａｎ培地Ｅ）におけるＣＩ
（０細胞成長（第３ａ図）及び生成物収量（第３ｂ図）
を示す。 第４図は、１０％ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ−３＋　Ｅを伴
う培地■における繊維芽細胞成長（第４ａ図）及び生成
物収量（第４ｂ図）を示す。 第５図は、１０％ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ−３＋　Ｅを伴
う培地Ｈにおける繊維芽細胞成長（第５ａ図）及び生成
物収量（第５ｂ図）を示す。 第６図は、ｌＯ％ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ−３＋　Ｅを伴
う培地ＩにおけるＴハイブリドーマ細胞成長（第６ａ図
）及び生成物収量（第６ｂ図）を示す。 第７図は、１０％ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ−３＋　Ｅを伴
う培地１１におけるＢハイブリドーマ細胞成長（第７ａ
図）及び生成物収量（第７ｂ図）を示す。 第８図は、１０％ＦＢＳ又は３％ＣＧＡ−３＋　Ｅを伴
う培地１１におけるＴハイブリドーマ細胞成長（第８８
及びａｂ）を示す。 第９図は、ＣＨＯ−ＦＣＲ細胞に及ぼすＭＣＤＢ３０２
、Ａｌｐｈａ　ＭＥＮ、及びｌ５ｃｏｖｅの変法ＤＭＦ
Ｍ培地の効力を示す。 第１Ｏ図は、　ＣＨＯ植物細胞の成長に及ぼすＭＣＤＢ
３０２、Ａｌｐｈａ　ＭＥＮ、及びｌ５ｃｏｖｅの変法
ＤＭＦＭ培地の効力を示す。 第１１図は、ＣＨＯ−Ｋｌの成長に及ぼすＭＣＤＢ３０
２、Ａｌｐｈａ　ＭＥＮ及びｒ　５ｃｏｖｅの変法ＤＭ
ＦＭ培地の効力を示す。 第１２図は、ＣＨＯ−Ｋｌ細胞に対する最良の培地及び
ＣＧＡを示す。 第１３図は、Ｃ）１０−ＦＣＲ細胞の成長に及ぼすＭＣ
ＤＢ３０２、Ａｌｐｈａ　ＭＥＮ及びＩ　５ｃｏｖｅの
変法ＤＭＦＭ培地の効力を示す。 第１４図は、１１濁液培ｉ　中（７）　ＣＧＡＢＣ２０
００ニヨルＣ１（０−に１細胞成長を示す。 第１５図は、ＣＨＯ−ｌ細胞の生成物収量に及ぼす細胞
成長活性剤（ＣＧＡ’Ｓ）及びウシ胎児血清の効力を示
す。 第１６図は、ニワトリ胚細胞に対する最上培地及びＣＧ
Ａを示す。 第１７図は、５％ＦＢＳ又はＣＧＡ−３を含入するロー
ラー試験管中のニワトリ胚細胞成長を示す。 第１８図は、ニワトリ胚細胞成長及び５Ｂ−１ウイルス
収量に及ぼすびＣＧＡ’ｓの効力を示す。 第１９図は、ニワトリ胚細胞成長及びＨＶＴウィルス収
量に及ぼすＣＧＡ　’　ｓの効力を示す。 第２０図は、ＭＯＢＫ細胞成長及びＢＶＯウィルス収量
に及ぼすＣＧＡ’ｓの効力を示す。 第２１図は、　ＣＧＡ−２およびＣＧＡ−３中で成育し
たＭＤＢＫ細胞における　ＩＢＲウィルス滴定の効力を
示す。 第２２図は、１０％ＦＢＳ又は１．５％ＣＧＡ−３＋　
Ｅ中を通過したＣＨＯ−ＲＣＲ細胞を含むＣＧＡ−３の
１３のロットに関する平均生成物収量増強を示す。 （ＯＯＯＴ） へｄ○：Ｉ準暉叫 （ＯＯＯＴ） Ｗｄ○：±冷準圭 Ｗ　ｄ　○：　＊＊？１ｉｌｌ［ｌｌ１１／ｌｉｄ○：
由油寵下 ｇ　ｇ　９　　Ｚ　’ｉ４　　Ｓ’　８　ｇＷ　Ｆ！　
　！ｉ！　９　９　ｇ　２　Ｅ　。 （ＯＯＯＴ） 暦ｄ○：晋準剛叫 （ＯＯＯＴ） Ｎｄ○：鮨蘭準圭 へｄ○：晋萌刺叫 ：　’：４　’！＊　ＨＨ４号９＠ｇｇｇ′ｊｇ　。 （ＯＯＯＴ） ］へ／○ｎ二±油錐玉 （ＯＯＯＴ） λｄ○二晋軍画叫 （０００Ｉ） 囚ｄ○：歯汁準玉 （ＯＯＯＴ） 因ｄ○、晋軍薗叫 ８　°！ｇ　　ｇ　　ｇ　　ｇ　　Ｓ　　ｇ　　９　８
８！０（ＯＯＯＴ） ＩＡＩｄ○：晋軍薗昧 ：４５　ｇ　　！！！！：！！！９　　幻　１　寸　〜
　０仄ｄ○：否軍割町 （ＯＯＯＴ） ］広／９ｎ：山冷錐玉

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）血液および無血小板血漿からの細胞及び組織成長
   促進剤の単離方法であって、次の：（ａ）遠心分離によ
   り血液試料から血球及び血小板を除去し； （ｂ）塩沈殿により成長活性剤含有画分を増量的に分離
   し； （ｃ）沈殿成長促進剤画分を可溶化して、その後、生理
   的重量オスモル濃度の食塩水中で透析して： （ｄ）組織及び細胞培養必需品中に付加的に用いるため
   に成長支持血漿をプールする；各工程から成る方法。
2. （２）血漿由来無血球血清の血液画分から得られる細胞
   及び組織成長促進物質の製造方法であって、次の： （ａ）血球及び血小板を除去するために血液試料を遠心
   分離して、上澄液又は血漿を保持し；（ｂ）上澄血漿に
   血餅形形成活性剤を加えて凝固を誘発し； （Ｃ）遠心分離又はデカンテーションにより上澄液から
   血餅を除去し； （ｄ）請求項１に記載したと同様に塩沈殿工程により上
   澄液から成長促進画分を精製し；並びに（ｅ）組織及び
   細胞培地中に付加的に用いるために精製成長促進画分を
   プールし、パッケージングする； 各工程から成る方法。
3. （３）細胞及び組織成長促進血漿画分を提供する方法で
   あって、次の： （ａ）遠心分離により血球及び血小板を除去すうことに
   よって血液試料から血漿を単離し；（ｂ）約３０％、５
   ０％、６０％、及び７０％の飽和硫酸アンモニウムを用
   いて、塩沈殿により血漿から蛋白質として成長促進画分
   を分離し； （ｃ）生理的濃度で塩沈殿血清蛋白質を可溶化し；並び
   に （ｄ）組織及び細胞培地中に付加的に用いるために可溶
   化画分をプールし、パッケージングする； 各工程から成る方法。
4. （４）細胞及び組織成長促進特性を含有する血清又は血
   漿の画分であって、次の： （ａ）塩を用いた沈殿により無血球及び無血小板血液か
   ら単離し、その後生理的食塩水中で可溶化及び透析する
   生理的食塩水中の血清又は血漿蛋白質； （ｂ）その中の組織及び細胞の成長を促進させるために
   組織及び細胞培地中での付加的使用に有用である上記画
   分；並びに （ｃ）生物学的生成物産出を増強する上記付加的使用物
   ； から成る画分。
5. （５）約５０％の飽和硫酸アンモニウム塩濃度により沈
   殿させた画分中に細胞成長促進活性を単離する請求項４
   記載の細胞及び組織成長促進画分。
6. （６）１０％〜３０％飽和硫酸アンモニウム塩によって
   沈殿させた画分中に細胞成長促進画分活性を単離する請
   求項４記載の細胞及び組織促進画分。
7. （７）細胞成長促進画分活性を約５０％飽和硫酸アンモ
   ニウムで沈殿後に残留する上澄画分中に単離する請求項
   ４記載の細胞及び組織成長促進画分。
8. （８）細胞成長促進画分活性を３０％〜５０％飽和硫酸
   アンモニウム塩によって沈殿された画分中に単離する請
   求項４記載の細胞及び組織成長促進画分。
9. （９）透析画分を減菌濾過装置を通す濾過によって減菌
   する請求項４記載の細胞及び組織成長促進画分。
10. （１０）約−２０℃又はそれ以下で凍結及び保存可能な
    請求項４記載の細胞及び組織成長促進画分。
11. （１１）親液化乾燥物質として保存し、有効使用のため
    に液体形態で再構成可能な請求項４記載の細胞及び組織
    成長促進画分。
12. （１２）血液を反芻動物から採取した請求項４記載の細
    胞及び組織成長促進画分。
13. （１３）血液を鳥類から採取した請求項４記載の細胞及
    び組織成長促進画分。
14. （１４）血液をヒトから採取した請求項４記載の細胞及
    び組織成長促進画分。
15. （１５）成長促進特性又は生成物産出増強特性を有する
    血液から得られる塩沈殿組成物であって、以下の： （ａ）血球及び血小板分を除去するために血液試料を遠
    心分離することにより上澄血漿の供給：（ｂ）上澄血漿
    と、３０％飽和濃縮を生じるに十分な硫酸アンモニウム
    を混合することによる上記上澄血漿の画分沈殿； （ｃ）沈殿血漿画分の除去及び遠心分離による上澄の保
    全； （ｄ）生理食塩水中の沈殿血漿画分の希釈及び透析；並
    びに （ｃ）工程（ｃ）及び（ｄ）を用いて５０％又は６０％
    飽和硫酸アンモニウム中で引き続き沈殿されるさらなる
    血漿画分の単離； から成る各工程により単離される組成物。
16. （１６）ビタミン、必須及び非必須アミノ酸、ミネラル
    、炭水化物、脂質、微量元素、緩衝液、ナトリウム及び
    カリウム塩を含む群から選択される量の可溶性混合物を
    含有する培地中の請求項１３記載の成長促進画分の混合
    液部分標本中に構成される組織及び細胞培養促進栄養培
    地の組生物。
17. （１７）組織及び細胞培養栄養培地の組成物における、
    組織及び細胞成長促進有効量の、並びに細胞生成物産出
    増強量の請求項４記載の細胞及び組織成長促進画分の添
    加から成る改良法。
18. （１８）改良組織又は細胞培養栄養培地における、ウシ
    胎児血清のような天然物質成長増強剤を、細胞成長又は
    生成物産出を促進するに十分な量で、塩を用いた沈殿に
    より無血球、無血小板血液から単離される血清又は血漿
    から成る成長促進血清又は血漿画分と置換することを包
    含する改良方法。
19. （１９）そこにさらに成長促進量又は生成物産出有効量
    のエンハンサＥを加えることを包含する請求項１８記載
    の改良組織又は細胞培養栄養培地であって、上記エンハ
    ンサＥが、増強上澄を細胞破壊屑と分離することにより
    破裂赤血球から生成される培地。
20. （２０）請求項１３記載の成長促進画分、及び製薬的に
    受容可能な担体を包含する製薬組成物。
21. （２１）ヒトを含む温血動物の局所性又は、経皮治療法
    であって、羅患者に有効量の請求項４記載の成長促進画
    及び薬学的に受容可能な担体を投与することを包含する
    方法。