JPH0426833B2 - - Google Patents
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- JPH0426833B2 JPH0426833B2 JP57193278A JP19327882A JPH0426833B2 JP H0426833 B2 JPH0426833 B2 JP H0426833B2 JP 57193278 A JP57193278 A JP 57193278A JP 19327882 A JP19327882 A JP 19327882A JP H0426833 B2 JPH0426833 B2 JP H0426833B2
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- JP
- Japan
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- culture
- polysaccharide
- mendocina
- strains
- pseudomonas
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明はアゾトバクター・ヴイネランデイ
（Azotobacter vinelandii）以外の微生物でアル
ギン酸型のポリサツカライドを生産できる細菌に
関する。 アルギン酸、親水性コロイド状炭水化物酸は、
Ｄ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸単位よりな
る可変性ブロツク共重合体である。アルギン酸の
アルカリ塩は水に可溶であり、その様なアルギン
酸塩の溶液の際立つた特徴はそれらの低濃度にお
ける高粘度である。カルシウム又はマグネシウム
イオンのような二価イオンを溶液に添加すると、
ゲル化を起こす。アルギン酸塩の独特な物性は、
乳化剤、安定剤及び増粘剤として広範囲の工業的
用途を与えている。それらは特に食品工業、医薬
品、紙及び繊維加工及び農業において特に有用で
ある。 アルギン酸塩及びアルギン酸は或る種の海草の
抽出により工業的に得られてきた。代替源は微生
物的アルギン酸産生者のアゾトバクター・ヴイネ
ランデイ（Azotobacter vinelandii）である。ア
ルギン酸塩型のポリサツカライドを産生すること
が注目されているもう一つの微生物はシユードモ
ナス・アエルギノザ（Pseudomonas
aeruginosa）である。A.ヴイネランデイ及びP.
アエルギノザにより産生されるポリサツカライド
は、分子が部分的にアセチル化されていることを
除いては海草から得られているものと同様であ
る。 しかしながら、アゾトバクター・ヴイネランデ
イ（Azotobacter vinelandii）からのアルギン酸
塩の製造においては、或る種の問題が生ずる。粘
稠な重合体を高収率において適当な濃度で製造す
るためには、発酵の厳格なコントロールが必要で
ある。他方、嚢胞性繊維症患者における第二次感
染として伴われるので、源泉として望ましくな
い。シユードモナスその他の種例えばP.プチダ
（P.putida）及びP.メンドシナ（P.mendocina）
は安全な源泉ではあるものの、通常相当な量のエ
キソポリサツカライドを産生しないので通常は使
用することができない。 英国特許出願第2026515A号はその様なポリサ
ツカライドの製造方法において、シユードモナス
（Pseudomonas）の通常は非−ムコイド種をβ−
ラククタム又はアミノ−グリコシド抗生物質に耐
性を有し、ポリサツカライド生産者である菌株を
選択するためにその様な抗生物質で処理すること
を特徴とする方法を開示している。この方法は滅
多にポリサツカライド生産者とはならない非病菌
性シユードモナス（Pseudomonas）の菌株を利
用可能とする。しかしながら、残る問題は菌株の
安定性の欠陥である。これまでのところ、この方
法では、通常は非ムコライド性であるシユードモ
ナス属菌の、安定な菌株、すなわち、工業的方法
を実行するのに十分な時間、連続的発酵装置内に
おいてポリサツカライド産生能力を有する菌株を
選択することは不可能であることが判明してい
る。 我々は、目的ポリサツカライドを良好な収量で
産生し、連続発酵においても安定であるシユード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas
mendocina）の三種の新たな菌株を得た。 本発明においては、NCIB 11687，11688及び
11689よりなる群から選ばれるシユードモナス・
メンドシナ（Pseudomonas mendocina）菌株の
生物学的に純粋な培養菌及びNICB 11687，
11688及び11689よりなる群から選ばれるシユード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas
mendocina）菌株を含有する培養液において、該
培養液がＤ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸残
基の部分的にアセチル化された可変性ブロツク共
重合体より構成されるポリサツカライドを資化性
炭素源の浸水好気性発酵により産生する能力を有
することを特徴とする培養液も又提供される。上
記新菌株は次のようにして得られた。P.メンドシ
ナ（P.mendocina）NCIB 10541を最少阻止濃度
（MIC）よりも高い水準においてカルベニシリン
に曝露し、耐性ポリサツカライド−産生菌株を選
択した。この方法は英国特許出願2026515Aに開
示されたものである即ち、対数増殖期にあるP.メ
ンドシナ（P.mendocina）NCIB 10541の培養液
を普通ブロス内において系列稀釈し、カルベニシ
リン（Beechams Pharmaceuticals，Worthing）
を含有する普通平板寒天上に最初100mg-1の倍
量の０〜1000mg-1の範囲で塗り延ばした。これ
はMICの近似的表示を与えるものであつたが、
それは更に２mg-1の倍量のより狭い範囲におけ
る第二回目の測定により決定された。P.メンドシ
ナ（P.mendocina）NCIB 10541の対数増殖培養
液の普通ブロス内の系列稀釈を1.5倍のMICのカ
ルベニシリンを含有する普通平板寒天上に塗り延
ばした。これらの平板は30℃における36時間のイ
ンキユベーシヨン後、調べられ耐性粘液性クロー
ンをそれらの隆起した光輝性外観に基づいて選択
し、２％のグルコースを添加した最小寒天培地
（Ｃ源を含有しない塩類培地：Jayasuria GCN
1955 J.Gen.Microbiol.12 419〜28）上で生育す
ることにより精製した。 これらの選択菌株を次いで突然変異剤と次のよ
うに接触させた。対数増殖期の選択菌株の培養液
を遠心分離により採取し、PH6.0において0.5Mト
リス−マレイン酸緩衝液中で洗浄し、この緩衝液
の９ml中に0.5×109箇（ml-1）の密度で再懸濁し
た。同一緩衝液に溶解したＮ−メチル−Ｎ−ニト
ロ−ニトロソグアニジン（Sigma Chemicals）
を20mg-1の最終濃度まで添加した。この混合物
を30℃において30分間インキユベートし、菌体を
次いで遠心分離により採取し、最少塩類培地内で
洗浄し、１％のグルコースを含有する塩類培地
100ml中に再懸濁した。カルベニシリン増菌から
最も有望な菌株を突然変異剤に曝露した。この突
然変異は多数の極めて大きな粘液性クローンを産
生し、それを精製し、振盪フラスコ培養における
ポリサツカライド生産性の分析を行つた。最も有
望なものが選択され、1981年10月22日に国立工業
細菌寄託機関（National Collection of
Industrial Bacteria）（NICB）に11687号、
11688号及及び11689号の番号で寄託した。最も安
定な、従つて最も好ましい菌株はNCIB 11687で
ある。 本発明に従つて使用される菌株はシユードモナ
ス・メンドシナ（Pseudomonas・mendocina）
のエキソポリサツカライド産生菌株であり、下記
の特性を有する。 単菌及び双菌として存在する0.7〜0.8×1.4〜
2.8μmの桿状菌。主として単毛極性鞭毛による運
動性有り。莢或いは補欠体を産生せず。グラム陰
性。 細胞内カロテノイド色素の生産の結果としての
黄色コロニー、ややべとつき有り。拡散性色素非
生産。 卵黄反応陰性、カタラーゼ陽性。 有機生育因子不要求。各種有機化合物を生育用
単一炭素源として利用可能。例えばアルギニン、
ゲラニオール、グリコレート、エチレングリコー
ル、プロピレングリコール及びザルコシンなど。
但し、グリコース及びフラクトース二糖類及びマ
ンニトール以外のペントース類ヘキソース類は利
用せず。 硝酸塩を用いた培地以外は偏性好気性。41℃に
おいて生育、しかし、４℃において不生育。生育
最適温度約35℃。 それらの菌株は又、それらがエキソポリサツカ
ライドをカプセルとして産生するこことにおいて
特に特徴付けられる。次の表は新規菌株をP.メン
ドシナ（P.mendocina）の基準株（NCIB
10541）及びP.アエルギノザ（P.aeruginosa）と
比較するものである。
（Azotobacter vinelandii）以外の微生物でアル
ギン酸型のポリサツカライドを生産できる細菌に
関する。 アルギン酸、親水性コロイド状炭水化物酸は、
Ｄ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸単位よりな
る可変性ブロツク共重合体である。アルギン酸の
アルカリ塩は水に可溶であり、その様なアルギン
酸塩の溶液の際立つた特徴はそれらの低濃度にお
ける高粘度である。カルシウム又はマグネシウム
イオンのような二価イオンを溶液に添加すると、
ゲル化を起こす。アルギン酸塩の独特な物性は、
乳化剤、安定剤及び増粘剤として広範囲の工業的
用途を与えている。それらは特に食品工業、医薬
品、紙及び繊維加工及び農業において特に有用で
ある。 アルギン酸塩及びアルギン酸は或る種の海草の
抽出により工業的に得られてきた。代替源は微生
物的アルギン酸産生者のアゾトバクター・ヴイネ
ランデイ（Azotobacter vinelandii）である。ア
ルギン酸塩型のポリサツカライドを産生すること
が注目されているもう一つの微生物はシユードモ
ナス・アエルギノザ（Pseudomonas
aeruginosa）である。A.ヴイネランデイ及びP.
アエルギノザにより産生されるポリサツカライド
は、分子が部分的にアセチル化されていることを
除いては海草から得られているものと同様であ
る。 しかしながら、アゾトバクター・ヴイネランデ
イ（Azotobacter vinelandii）からのアルギン酸
塩の製造においては、或る種の問題が生ずる。粘
稠な重合体を高収率において適当な濃度で製造す
るためには、発酵の厳格なコントロールが必要で
ある。他方、嚢胞性繊維症患者における第二次感
染として伴われるので、源泉として望ましくな
い。シユードモナスその他の種例えばP.プチダ
（P.putida）及びP.メンドシナ（P.mendocina）
は安全な源泉ではあるものの、通常相当な量のエ
キソポリサツカライドを産生しないので通常は使
用することができない。 英国特許出願第2026515A号はその様なポリサ
ツカライドの製造方法において、シユードモナス
（Pseudomonas）の通常は非−ムコイド種をβ−
ラククタム又はアミノ−グリコシド抗生物質に耐
性を有し、ポリサツカライド生産者である菌株を
選択するためにその様な抗生物質で処理すること
を特徴とする方法を開示している。この方法は滅
多にポリサツカライド生産者とはならない非病菌
性シユードモナス（Pseudomonas）の菌株を利
用可能とする。しかしながら、残る問題は菌株の
安定性の欠陥である。これまでのところ、この方
法では、通常は非ムコライド性であるシユードモ
ナス属菌の、安定な菌株、すなわち、工業的方法
を実行するのに十分な時間、連続的発酵装置内に
おいてポリサツカライド産生能力を有する菌株を
選択することは不可能であることが判明してい
る。 我々は、目的ポリサツカライドを良好な収量で
産生し、連続発酵においても安定であるシユード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas
mendocina）の三種の新たな菌株を得た。 本発明においては、NCIB 11687，11688及び
11689よりなる群から選ばれるシユードモナス・
メンドシナ（Pseudomonas mendocina）菌株の
生物学的に純粋な培養菌及びNICB 11687，
11688及び11689よりなる群から選ばれるシユード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas
mendocina）菌株を含有する培養液において、該
培養液がＤ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸残
基の部分的にアセチル化された可変性ブロツク共
重合体より構成されるポリサツカライドを資化性
炭素源の浸水好気性発酵により産生する能力を有
することを特徴とする培養液も又提供される。上
記新菌株は次のようにして得られた。P.メンドシ
ナ（P.mendocina）NCIB 10541を最少阻止濃度
（MIC）よりも高い水準においてカルベニシリン
に曝露し、耐性ポリサツカライド−産生菌株を選
択した。この方法は英国特許出願2026515Aに開
示されたものである即ち、対数増殖期にあるP.メ
ンドシナ（P.mendocina）NCIB 10541の培養液
を普通ブロス内において系列稀釈し、カルベニシ
リン（Beechams Pharmaceuticals，Worthing）
を含有する普通平板寒天上に最初100mg-1の倍
量の０〜1000mg-1の範囲で塗り延ばした。これ
はMICの近似的表示を与えるものであつたが、
それは更に２mg-1の倍量のより狭い範囲におけ
る第二回目の測定により決定された。P.メンドシ
ナ（P.mendocina）NCIB 10541の対数増殖培養
液の普通ブロス内の系列稀釈を1.5倍のMICのカ
ルベニシリンを含有する普通平板寒天上に塗り延
ばした。これらの平板は30℃における36時間のイ
ンキユベーシヨン後、調べられ耐性粘液性クロー
ンをそれらの隆起した光輝性外観に基づいて選択
し、２％のグルコースを添加した最小寒天培地
（Ｃ源を含有しない塩類培地：Jayasuria GCN
1955 J.Gen.Microbiol.12 419〜28）上で生育す
ることにより精製した。 これらの選択菌株を次いで突然変異剤と次のよ
うに接触させた。対数増殖期の選択菌株の培養液
を遠心分離により採取し、PH6.0において0.5Mト
リス−マレイン酸緩衝液中で洗浄し、この緩衝液
の９ml中に0.5×109箇（ml-1）の密度で再懸濁し
た。同一緩衝液に溶解したＮ−メチル−Ｎ−ニト
ロ−ニトロソグアニジン（Sigma Chemicals）
を20mg-1の最終濃度まで添加した。この混合物
を30℃において30分間インキユベートし、菌体を
次いで遠心分離により採取し、最少塩類培地内で
洗浄し、１％のグルコースを含有する塩類培地
100ml中に再懸濁した。カルベニシリン増菌から
最も有望な菌株を突然変異剤に曝露した。この突
然変異は多数の極めて大きな粘液性クローンを産
生し、それを精製し、振盪フラスコ培養における
ポリサツカライド生産性の分析を行つた。最も有
望なものが選択され、1981年10月22日に国立工業
細菌寄託機関（National Collection of
Industrial Bacteria）（NICB）に11687号、
11688号及及び11689号の番号で寄託した。最も安
定な、従つて最も好ましい菌株はNCIB 11687で
ある。 本発明に従つて使用される菌株はシユードモナ
ス・メンドシナ（Pseudomonas・mendocina）
のエキソポリサツカライド産生菌株であり、下記
の特性を有する。 単菌及び双菌として存在する0.7〜0.8×1.4〜
2.8μmの桿状菌。主として単毛極性鞭毛による運
動性有り。莢或いは補欠体を産生せず。グラム陰
性。 細胞内カロテノイド色素の生産の結果としての
黄色コロニー、ややべとつき有り。拡散性色素非
生産。 卵黄反応陰性、カタラーゼ陽性。 有機生育因子不要求。各種有機化合物を生育用
単一炭素源として利用可能。例えばアルギニン、
ゲラニオール、グリコレート、エチレングリコー
ル、プロピレングリコール及びザルコシンなど。
但し、グリコース及びフラクトース二糖類及びマ
ンニトール以外のペントース類ヘキソース類は利
用せず。 硝酸塩を用いた培地以外は偏性好気性。41℃に
おいて生育、しかし、４℃において不生育。生育
最適温度約35℃。 それらの菌株は又、それらがエキソポリサツカ
ライドをカプセルとして産生するこことにおいて
特に特徴付けられる。次の表は新規菌株をP.メン
ドシナ（P.mendocina）の基準株（NCIB
10541）及びP.アエルギノザ（P.aeruginosa）と
比較するものである。
【表】
【表】
製造されたポリサツカライドは、本明細書に添
付した第１図に示される赤外線吸収スペクトルよ
り証明されるように典型的なアセチル化アルギン
酸塩である。 本発明によるポリサツカライドの製造方法は、
任意のシユードモナス菌−支持培地中において行
うことができる。本発明の方法は、この技術にお
いて公知の固定−容量定常状態フアーメンターの
連続的稀釈により連続的に行うのが便利である
（例えばHerbert，Elesworth及びTelling.1656
年、Journal of General Microbiology 14、
601）。典型的な培地としては、複合ブロス、例え
ば１％普通ブロス、或いは化学的に規定された
（「塩類」）、補助的炭素源例えばグリセロールのよ
うなアルコール、グルコースのような糖或いはグ
ルコン酸のような糖酸を有する培地などが挙げら
れる。培養温度は約30℃であるべきであり、培地
のPHは連続培養の際に約7.0に維持されるべきで
ある。培養条件は好気性生育に好ましいものでな
ければならず、ポリサツカライド産生の最適速度
は溶解酸素濃度を飽和濃度の18〜25％の範囲に維
持することにより得られることを見出した。この
範囲より下においてはポリサツカライド濃度は減
少し、又この範囲を越えるとポリサツカライド濃
度は維持されるが、しかし、炭素転換効率（即ち
炭素源のポリサツカライドへの転換効率）がおそ
らく二酸化炭素への酸化が増大するために低下す
る。連続培養は窒素制限下即ち培地中の窒素源が
培養液が定常状態において制限的栄養素であるよ
うな条件において行うのが便利である。 我々は、本発明のP.メンドシナ（P.
mendocina）の新菌株が良好なしオロジー特性を
有するポリサツカライドを産生する能力を有する
ものであることを見出した。上記本発明の方法が
実施されると、比較的低粘度の低分子量の生成物
が得られ、例えばManutexF（Alginate
Industries Ltd）のような印刷一等級のアルギン
酸塩と同様な特性を有するものである。この低分
子量生成物は印刷用途においても又有用な低い擬
塑性を有する。英国特許明細書第1548078号はA.
ヴイネランデイ（A.vinelandii）をプロテアーゼ
の存在下において培養することによる改良された
粘度を有するアルギン酸型のポリサツカライドの
製法を記載している。プロテアーゼの存在はポリ
サツカライドの粘度の低下の原因である微生物に
より産生されるアルギン酸リアーゼを不活性化或
いは除去するようである。本発明によるP.メンド
シナ（P.mendocina）の新規菌株はアルギン酸リ
アーゼの産生により余り深刻には影響されない
が、しかし、それにも拘らずポリサツカライドの
製造に際して培地中にプロテアーゼを導入するこ
とが有用であることが見出された。アルギン酸リ
アーゼに必要な作用を有する任意のプロテアーゼ
を利用することができるが、最も適したものは例
えばデンマークのコペンハーゲンのNovo
Industri Ａ／Ｓによりアルカラーゼ（Alcalase）
及びノイトラーゼ（Neutrase）の商標により販
売されている細菌及び真菌プロテアーゼのような
微生物源に由来するプロテアーゼである。連続培
養においては、中性或いは弱アルカリ性PHにおい
てその最適活性を示す酵素を使用することが特に
好ましい。 その様なプロテアーゼの添加（例えば約0.1〜
2Anson 単位／の水準）においてはManutex
R.S.（Alginate Industries Ltd）と同様な特性を
有する高分子量、高粘度微生物の製造に導く。 以下本発明を実施例により更に説明する。 実施例 １〜４ 連続培養用に修正された５の発酵容器（実効
容積＝2.5）を付属したLH Engineering Ltd.
型１／1000実験室発酵モジユールを使用した。使
用された培地は表２に記載されている。発酵PH
は、2M NaOHの自動添加により7.0に維持され、
温度は30℃に設定された。発泡はシリコーン消泡
剤の添加によりコントロールされた。空気は１
min-1で供給され、培養液は溶解酸素濃度を約飽
和濃度の20％に維持するように300〜750rpmの撹
拌速度で混合した。培地をフアーメンターに入
れ、振盪フラスコ内において１％（ｗ／ｖ）グル
コースを含有する最小培地に生育された対数増殖
後期のNCIB 11687菌株の培養液100mlを接種し
た。 培地の追加はバツチ培養液が定常期に到達して
から開始された。稀釈速度は培地の流速を変える
ことにより望ましい数値に調整された。生育制限
栄養素は栄養素の濃度を二倍に増大し、菌体濃度
の増大を得ることにより示された。 培養液粘度の測定はWells−Brookfield HAT
の円錘及び平板マイクロ粘度計を25℃の温度にお
いて用いて行われた。プロテアーゼを使用した連
続培養ブロスに対してはHBTモデルを使用した。
見かけ粘度は3.75〜750s-1の剪断速度の範囲にわ
たつて求められ、コンシステンシイ指数Ｋ（1s-1
の剪断速度における見かて粘度）は見かけ粘度対
剪断速度の両対数プロツトの外挿により得られ
た。 連続培養ブロスから得られた試料のより詳細な
レオロジー的調査は円錘及び平板系統を有する
Contraves Rhemat−30回転粘度計を用いて行わ
れた。１％のポリサツカライド溶液を(a)蒸留水、
(b)EDTA／100mMに溶解してCitenco頂部−撹拌
機を用いて１時間連続撹拌して調製した。溶液を
30剪断速度及びコンシステンシー指数において調
べ剪断速度対粘度のプロツトから得られた流動挙
動指数を得た。 菌体及びエキソポリサツカライドはキレート化
剤の存在下においてのみ分離することができた。
培養液（40ml）を5M NaCl（0.8ml）及び0.5M
Na4、EDTA（0.8ml）と混合し10分間放置後
24000ｇにおいて40分間遠心分離した。上澄液を
除去し、2575mlイソプロパノールに添加した。混
合後10分間放置し、得られた沈澱を予め秤量した
ガラスフアイバーデイスク（Whatman GF／Ａ）
上で過し、これを24時間真空乾燥し再秤量し
た。 結果を表３及び表４にまとめて示す。同様な結
果がNCIB 11688及び11689菌株を用いても得ら
れる。 実施例５ プロテアーゼ添加効果 実施例４に対して説明された培養条件を繰返し
たが、しかし各種量のノイトラーゼ（Neutrase）
（Novo Industri Ａ／Ｓ）を含有する培地を使用
した。生成物のレオロジーは表５及び６に記載す
る。 表 ２ 連続培養培地 （NH4）2HPO4 1.25ｇ-1 K2HPO4 1.25 〃 Ca（OH）2 0.05 〃 Mg（OH）2 0.07 〃 MgSO4・7H2O 0.15 〃 クエン酸 0.99 〃 酵母エキス 0.2 〃 MnSO4・4H2O 1.1ｍ-1 FlSO4・7H2O 3.56 〃 2nSO4・7H2O 0.7 〃 CuSO4・5H2O 0.25 〃 CoSO4・7H2O 0.28 〃 H3BO4 0.06 〃 デキシム（Dexyme） 112ｇ-1 （グルコース分析値 90 〃 ）
付した第１図に示される赤外線吸収スペクトルよ
り証明されるように典型的なアセチル化アルギン
酸塩である。 本発明によるポリサツカライドの製造方法は、
任意のシユードモナス菌−支持培地中において行
うことができる。本発明の方法は、この技術にお
いて公知の固定−容量定常状態フアーメンターの
連続的稀釈により連続的に行うのが便利である
（例えばHerbert，Elesworth及びTelling.1656
年、Journal of General Microbiology 14、
601）。典型的な培地としては、複合ブロス、例え
ば１％普通ブロス、或いは化学的に規定された
（「塩類」）、補助的炭素源例えばグリセロールのよ
うなアルコール、グルコースのような糖或いはグ
ルコン酸のような糖酸を有する培地などが挙げら
れる。培養温度は約30℃であるべきであり、培地
のPHは連続培養の際に約7.0に維持されるべきで
ある。培養条件は好気性生育に好ましいものでな
ければならず、ポリサツカライド産生の最適速度
は溶解酸素濃度を飽和濃度の18〜25％の範囲に維
持することにより得られることを見出した。この
範囲より下においてはポリサツカライド濃度は減
少し、又この範囲を越えるとポリサツカライド濃
度は維持されるが、しかし、炭素転換効率（即ち
炭素源のポリサツカライドへの転換効率）がおそ
らく二酸化炭素への酸化が増大するために低下す
る。連続培養は窒素制限下即ち培地中の窒素源が
培養液が定常状態において制限的栄養素であるよ
うな条件において行うのが便利である。 我々は、本発明のP.メンドシナ（P.
mendocina）の新菌株が良好なしオロジー特性を
有するポリサツカライドを産生する能力を有する
ものであることを見出した。上記本発明の方法が
実施されると、比較的低粘度の低分子量の生成物
が得られ、例えばManutexF（Alginate
Industries Ltd）のような印刷一等級のアルギン
酸塩と同様な特性を有するものである。この低分
子量生成物は印刷用途においても又有用な低い擬
塑性を有する。英国特許明細書第1548078号はA.
ヴイネランデイ（A.vinelandii）をプロテアーゼ
の存在下において培養することによる改良された
粘度を有するアルギン酸型のポリサツカライドの
製法を記載している。プロテアーゼの存在はポリ
サツカライドの粘度の低下の原因である微生物に
より産生されるアルギン酸リアーゼを不活性化或
いは除去するようである。本発明によるP.メンド
シナ（P.mendocina）の新規菌株はアルギン酸リ
アーゼの産生により余り深刻には影響されない
が、しかし、それにも拘らずポリサツカライドの
製造に際して培地中にプロテアーゼを導入するこ
とが有用であることが見出された。アルギン酸リ
アーゼに必要な作用を有する任意のプロテアーゼ
を利用することができるが、最も適したものは例
えばデンマークのコペンハーゲンのNovo
Industri Ａ／Ｓによりアルカラーゼ（Alcalase）
及びノイトラーゼ（Neutrase）の商標により販
売されている細菌及び真菌プロテアーゼのような
微生物源に由来するプロテアーゼである。連続培
養においては、中性或いは弱アルカリ性PHにおい
てその最適活性を示す酵素を使用することが特に
好ましい。 その様なプロテアーゼの添加（例えば約0.1〜
2Anson 単位／の水準）においてはManutex
R.S.（Alginate Industries Ltd）と同様な特性を
有する高分子量、高粘度微生物の製造に導く。 以下本発明を実施例により更に説明する。 実施例 １〜４ 連続培養用に修正された５の発酵容器（実効
容積＝2.5）を付属したLH Engineering Ltd.
型１／1000実験室発酵モジユールを使用した。使
用された培地は表２に記載されている。発酵PH
は、2M NaOHの自動添加により7.0に維持され、
温度は30℃に設定された。発泡はシリコーン消泡
剤の添加によりコントロールされた。空気は１
min-1で供給され、培養液は溶解酸素濃度を約飽
和濃度の20％に維持するように300〜750rpmの撹
拌速度で混合した。培地をフアーメンターに入
れ、振盪フラスコ内において１％（ｗ／ｖ）グル
コースを含有する最小培地に生育された対数増殖
後期のNCIB 11687菌株の培養液100mlを接種し
た。 培地の追加はバツチ培養液が定常期に到達して
から開始された。稀釈速度は培地の流速を変える
ことにより望ましい数値に調整された。生育制限
栄養素は栄養素の濃度を二倍に増大し、菌体濃度
の増大を得ることにより示された。 培養液粘度の測定はWells−Brookfield HAT
の円錘及び平板マイクロ粘度計を25℃の温度にお
いて用いて行われた。プロテアーゼを使用した連
続培養ブロスに対してはHBTモデルを使用した。
見かけ粘度は3.75〜750s-1の剪断速度の範囲にわ
たつて求められ、コンシステンシイ指数Ｋ（1s-1
の剪断速度における見かて粘度）は見かけ粘度対
剪断速度の両対数プロツトの外挿により得られ
た。 連続培養ブロスから得られた試料のより詳細な
レオロジー的調査は円錘及び平板系統を有する
Contraves Rhemat−30回転粘度計を用いて行わ
れた。１％のポリサツカライド溶液を(a)蒸留水、
(b)EDTA／100mMに溶解してCitenco頂部−撹拌
機を用いて１時間連続撹拌して調製した。溶液を
30剪断速度及びコンシステンシー指数において調
べ剪断速度対粘度のプロツトから得られた流動挙
動指数を得た。 菌体及びエキソポリサツカライドはキレート化
剤の存在下においてのみ分離することができた。
培養液（40ml）を5M NaCl（0.8ml）及び0.5M
Na4、EDTA（0.8ml）と混合し10分間放置後
24000ｇにおいて40分間遠心分離した。上澄液を
除去し、2575mlイソプロパノールに添加した。混
合後10分間放置し、得られた沈澱を予め秤量した
ガラスフアイバーデイスク（Whatman GF／Ａ）
上で過し、これを24時間真空乾燥し再秤量し
た。 結果を表３及び表４にまとめて示す。同様な結
果がNCIB 11688及び11689菌株を用いても得ら
れる。 実施例５ プロテアーゼ添加効果 実施例４に対して説明された培養条件を繰返し
たが、しかし各種量のノイトラーゼ（Neutrase）
（Novo Industri Ａ／Ｓ）を含有する培地を使用
した。生成物のレオロジーは表５及び６に記載す
る。 表 ２ 連続培養培地 （NH4）2HPO4 1.25ｇ-1 K2HPO4 1.25 〃 Ca（OH）2 0.05 〃 Mg（OH）2 0.07 〃 MgSO4・7H2O 0.15 〃 クエン酸 0.99 〃 酵母エキス 0.2 〃 MnSO4・4H2O 1.1ｍ-1 FlSO4・7H2O 3.56 〃 2nSO4・7H2O 0.7 〃 CuSO4・5H2O 0.25 〃 CoSO4・7H2O 0.28 〃 H3BO4 0.06 〃 デキシム（Dexyme） 112ｇ-1 （グルコース分析値 90 〃 ）
【表】
【表】
【表】
添付の図面は本発明により製造されるポリサツ
カライドの赤外線吸収スペクトルのチヤートであ
る。
カライドの赤外線吸収スペクトルのチヤートであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ NCIMB 11687，11688、及び11689よりなる
群から選ばれるシユードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）菌株の生物学的に
純粋な培養菌。 ２ NCIMB11687，11688、及び11689よりなる
群から選ばれる少なくとも１つのシユードモナ
ス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）菌
株を含有する培養液において、該培養液がＤ−マ
ンヌロン酸及びＬ−グルロン酸残基の部分的にア
セチル化された可変性ブロツク共重合体より構成
されるポリサツカライドを資化性炭素源の液中好
気性発酵により産生する能力を有することを特徴
とする培養液。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8132783 | 1981-11-02 | ||
| GB8132783 | 1981-11-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58107174A JPS58107174A (ja) | 1983-06-25 |
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| JP57193278A Granted JPS58107174A (ja) | 1981-11-02 | 1982-11-02 | ポリサツカライドの製法 |
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