JPH04268453A - フローサイトメトリーによる赤芽球の分類方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フローサイトメーター
を用いて赤芽球の分類や計数を行うための方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】特開昭６３−１３４９５８号公報におい
て、低張酸性の螢光料溶液と、その浸透圧と液性を変化
させる溶液とを用いる二段染色法が開示されている。そ
して、その染色された血液試料をフローサイトメーター
に供し螢光信号、散乱光信号を得、図６に示すような螢
光強度対側方散乱光強度の二次元分布図を得、白血球の
５分類を行っている。図６中の１〜６はそれぞれリンパ
球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、ノイズ成分の集
団を示している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】特開昭６３−１３４９
５８号公報には、赤芽球の分類、計数については記載が
ない。

【０００４】赤芽球は赤血球の前身の細胞であり通常は
骨髄中に存在し流血中には存在しないものである。とこ
ろが、ある種の疾患においては流血中にも認められるよ
うになる。（例えば貧血や白血病において）このように
赤芽球を測定することは臨床的に意義のあることである
。

【０００５】本発明は、上記発明に改良を加え、赤芽球
の分類を行うことができる方法を提供することを目的と
する。

【０００６】赤血球系細胞は浮遊液の浸透圧に応じて、
細胞膜を通して水を流入出させて細胞内の浸透圧を調整
する機能を有している。すなわち、浮遊液の浸透圧が細
胞内部の浸透圧よりも低い場合には細胞膜を通して水を
内部に流入させ、逆に浮遊液の浸透圧の方が高い場合に
は細胞膜を通して水を外部に流出させる。

【０００７】本発明は、このような赤血球系細胞の特性
を利用し赤血球系有核細胞内に特定の染料を取り込ませ
その核を染めてフローサイトメーターで測定し他の細胞
と容易に弁別できるようにしたものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、酸性低張性の
螢光染料溶液である第１液と、その浸透圧、液性を変化
させる溶液である第２液とを用いる二段染色によるフロ
ーサイトメトリー法であり、上記第１液に、赤芽球の内
部に侵入しその核を特異的に螢光染色する染料を含み、
フローサイトメーターから得られた二次分布において、
赤芽球群を他の細胞群から分画することにより、赤芽球
分類結果を算出することを特徴としている。

【０００９】具体的には、本発明は ａ）．赤芽球の内部に侵入しその核を螢光染色する第３
の染料およびｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる
低張な第１液と、血液とを混合する工程；ｂ）．第１液
の酸を中和し、溶液ｐＨを染色ｐＨに保つための緩衝剤
および溶液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整する
ための浸透圧調整剤からなる第２液と、前記ａ工程で得
られた試料液とを混合する工程；ｃ）．前記ａ、ｂ工程
にて得られた試料液をサンプルとしてフローサイトメー
ターに供し、個々の細胞について螢光および散乱光など
複数の信号を測定する工程；ｄ）．検出された複数の信
号から２軸をそれぞれ赤螢光、散乱光とする二次元分布
を得る工程；およびｅ）．上記二次元分布において、赤
芽球の分布領域を設定し、その領域の細胞数を計数する
工程からなる、フローサイトメトリーによる赤芽球の分
類方法に関する。

【００１０】本発明の方法において第１液の染料として
使用できる染料の例は次のとおりである。

【００１１】第１の染料：アストラゾンイエロー３Ｇ第
２の染料： アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １，１′−ジメチルチオカルボシアニン１，１′−ジエ
チルチオカルボシアニン１，１′−ジエチル−９−メチ
ルチオカルボシアニンブロミド ２−〔γ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
リリデン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−４
，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨージド ＴＡ−２ アストラゾンオレンジＲ 第３染料： プロピディウムイオダイド、エチディウムブロマイドお
よびＭ−２６４ なお、本発明の第１液および第２液については以下の条
件を満すことが好ましい。

【００１２】（ａ）色素濃度 色素濃度については、第１液、第２液混合後の最終濃度
が次の濃度範囲内になるように第１液に含有されていれ
ばよい。

【００１３】なお、ベーシックイエロー１１、アストラ
ゾンオレンジＲについては、それぞれＡｌｄｒｉｃｈ製
、東京化成製のものを用いた。

【００１４】ベーシックイエロー１１の濃度を所定値以
上にすると好塩基球による強度が他の白血球による強度
よりも増大し、さらに高濃度にすると好酸球による強度
も増大する。また、他の白血球の強度はベーシックイエ
ロー１１濃度の増加に対して、ほとんど増大しない。好
塩基球および好酸球を他の白血球から螢光強度によって
分離するためには、ベーシックイエロー１１の濃度を７
０〜１００ｐｐｍ以上とすれば良い。

【００１５】アストラゾンオレンジＲは濃度１００ｐｐ
ｍ以上でリンパ球・好中球の螢光強度とノイズとが分離
できるようになり、２００ｐｐｍ以上で分離が良好にな
る。３００ｐｐｍ以上ではリンパ球・好中球とノイズと
の分離は、ほぼ一定となり、また、アストラゾンオレン
ジＲ濃度の上昇に伴い、好塩基球および好酸球の螢光強
度が若干低下するので、アストラゾンオレンジＲ濃度は
３００ｐｐｍ程度が好ましい。

【００１６】プロピディウムアイオダイドについてはシ
グマ社製のものを用いたが、２．５μｇ／ｍｌ（２．５
ｐｐｍ）以下では染色が弱すぎて二次元分布において赤
芽球と他の白血球との分離が悪く、逆に１００μｇ／ｍ
ｌ以上では信号検出時にＳ／Ｎ比が悪くなる。（螢光信
号とバックグランドとの差が小さくなり、信号検出がし
にくくなる。）エチディウムブロマイドの場合も含有量
の選定については同様に考えればよい。

【００１７】（ｂ）第１液ｐＨ 第１液ｐＨは、赤血球を溶血させるために５．０以下が
良いが、血小板の凝集を防ぐためには３．５以上が必要
である。

【００１８】（ｃ）第１液緩衝剤 第１液緩衝剤としては、クエン酸、マレイン酸、ジグリ
コール酸などｐＫａが４．５付近の緩衝剤なら使用可能
である。たとえばジグリコール酸を用いたとき、ジグリ
コール酸濃度５ｍＭ以下では、好塩基球の螢光強度に若
干の低下が見られ、５０ｍＭ以上では赤血球の溶血不良
が見られる。最適なジグリコール濃度は約１０ｍＭであ
る。

【００１９】（ｄ）第２液浸透圧 第２液に添加する浸透圧補償剤（たとえば塩化ナトリウ
ム）の量を変化させて、最終浸透圧を１６７〜３８７ｍ
Ｏｓｍ／ｋｇの間に変えても、分画パターンに変化は無
い。第２液浸透圧は最終浸透圧がほぼ等張（２８０ｍＯ
ｓｍ／ｋｇ）となるようにすれば良い。

【００２０】（ｅ）第２液緩衝剤 第２液緩衝剤としては、ホウ酸、トリス、トライシンな
どｐＫａが８．５〜９．０付近の緩衝剤が使用できる。 たとえばトライシンを用いたとき、トライシン濃度５０
ｍＭ以下では、好塩基球および好酸球の螢光強度が低下
する。好ましいトライシン濃度は３００ｍＭ程度である
。

【００２１】さて、白血球より発せられる前記螢光信号
および側方散乱光信号のうち、螢光信号は、細胞化学的
特定を反映するものであり、染料と各白血球との相互作
用により、各白血球から異なる強度の信号が得られる。

【００２２】一方、側方散乱光信号は細胞内情報を反映
するものである。すなわち、細胞内の細胞核が大きいほ
ど、また、顆粒が多いほど細胞内での光の反射が強まり
、側方散乱光強度は増大する。したがって、リンパ球は
、その内部に顆粒が存在しないかあるいは少いので、散
乱光強度は一番小さく、好中球は、その内部に顆粒が多
く存在し、また、大きな核を持つので、散乱光強度は大
きくなる。好酸球の散乱光強度は好中球のそれにほぼ匹
敵する。単球、好塩基球による散乱光強度はリンパ球と
好中球の中間にある。

【００２３】したがって、螢光信号と側方散乱光信号と
を組み合わせることにより、後に詳細に述べるように白
血球の５分類が可能となる。

【００２４】本発明に使用されるフローサイトメーター
の光学系の一具体例を第１図に示された図面に基いて説
明する。第１図は側方散乱光と赤螢光と緑螢光とを測定
する場合を示している。このフローサイトメーターの光
学系１０に使用された光源は、波長；４８８ｎｍ、出力
；１０ｍＷのアルゴンイオンレーザー１２である。レー
ザー１２から発せられた光は、シリンドリカルレンズ１
６によって絞られ、フローセル１４中を流れる測定用試
料を照射する。

【００２５】測定用試料中の染色された白血球がレーザ
ー光によって照射されると、白血球からは散乱光と螢光
が発せられる。

【００２６】このうち、側方へ発せられた散乱光と螢光
はコンデンサレンズ１８によって集められ、アパーチヤ
２０を通過したのち、ダイクロイックミラー２２に達す
る。ダイクロイックミラー２２は側方散乱光２４を反射
し、螢光２６を透過させる。ダイクロイックミラー２２
によって反射された側方散乱光２４は光電子増倍管２８
によって測定される。ダイクロイックミラー２２を透過
した螢光２６のうち赤螢光３２はダイクロイックミラー
３０によって反射させられ、緑螢光３８のみが透過させ
られる。反射された赤螢光３２はカラーフィルム３４を
通過したのち、光電子増倍管３６によって測定される。 透過した緑螢光３８はカラーフィルター４０を通過した
のち光電子増倍管４２によって測定される。

【００２７】ところで、測定用試料中の赤血球は非常に
弱い螢光しか発しないので、螢光強度を測定する限りに
おいては、赤血球が白血球と同時に検出部を通過（同時
通過）しても、白血球の測定には妨害を与えない。しか
し、散乱光を測定する場合には、赤血球は白血球と同レ
ベルの強度の散乱光を発するため、白血球の計数に対し
て妨害を与える。このとき、螢光と散乱光を同時に測定
し、一定レベル以上の強度の螢光を発したもののみを白
血球とすることはできるが、白血球と赤血球が同時通過
したときは、白血球による散乱光に赤血球による散乱光
が重畳されるので、正しい白血球の散乱光強度を測定す
ることができない。第１図に示したフローサイトメータ
ーの光学系１０では、希釈倍率をたとえば２０倍とし、
赤血球と白血球との同時通過が起こる確率を減少させ、
赤血球による妨害の程度を実用上無視できる程度におさ
えた測定用試料をフローセル１４に流すようにしている
。

【００２８】

【作用】第１液は低浸透圧である。このため、血液試料
を第１液に懸濁させると、赤血球系細胞は内部に水を浸
透させ膨化する。そして細胞膜の組織が緩み内容物は外
部に漏れ出る。成熟赤血球は核を持たないので、その膜
だけが残りゴースト化する（溶血）。赤芽球も同様に膨
化し内容物は漏れ出るが、核を有しているので膜内に残
る。第３の染料は赤芽球内に侵入しその核を染める。

【００２９】一方白血球細胞は白血球系細胞と異なり、
第３の染料は細胞内部に入らない。その後、第２液が加
えられ等張で染色に好適な状態にされる。

【００３０】このようにして染められた細胞は、フロー
サイトメーターにより測定され、得られた二次元粒度分
布において赤芽球群が他の細胞群から分画されて計数さ
れる。

【００３１】また、第１液に第１、第２の染料を含む場
合、第１、第２の染料は白血球内部に入り細胞を染める
ので、白血球の分類も行える。

【００３２】

【実施例】本発明は、特開昭６３−２８２６９８号公報
に記載した発明（実施例２、２：２ステップ法）の改良
であり、下記実施例により詳しく説明されるがそれらに
限定されるものではない。

【００３３】

【実施例１】下に試薬組成を示す。第１の染料は好酸球
、好塩基球の両方を選択的に螢光染色し、第２の染料は
白血球の核を螢光染色し、第３の染料は赤芽球内部に侵
入しその核を螢光染色する。

【００３４】 第１液（ｐＨ：４．０、浸透圧：３０ｍＯｓｍ／ｋｇ）
　　・第１の染料　　ベーシックイエロー１１　　　　
　　　　　　　　３８５ｍｇ／ｌ　　・第２の染料　　
アストラゾンオレンジＲ　　　　　　　　　　　　３３
０ｍｇ／ｌ　　・緩衝剤　　　　　　ジグリコール酸−
水酸化ナトリウム　　　　１０ｍＭ　　・第３の染料　
　プロピディウムアイオダイド　　　　　　１０．５μ
ｇ／ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　（２．５〜１００
μｇ／ｍｌが好適）第２液（ｐＨ：９．８、浸透圧：２
０００ｍＯｓｍ／ｋｇ）　　・緩衝剤　　　　　　トラ
イシン−水酸化ナトリウム　　　　　　３００ｍＭ　　
・浸透圧調整剤　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　
　　　　　　　　　７５０ｍＭ上記第１液及び第２液を
使用して以下のように白血球分類のための螢光および散
乱光の測定を行った。

【００３５】まず、健康な人の血液を抗凝固処理し、該
抗凝固処理された血液１００μｌと上記第１液１８００
μｌとを均一に混合し、撹拌後２５℃で約２０秒インキ
ュベーションする。その後さらに上記第２液を２００μ
ｌ加え、撹拌後２５℃で約４０秒間インキュベーション
する。この測定用サンプル液は最終的にｐＨ８．６〜８
．７、浸透圧約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ（等張）となる。

【００３６】このようにして赤血球を溶血させ各白血球
を染めたサンプル液を調製し、そのサンプル液をフロー
サイトメーターに供し、白血球からの螢光、散乱光を測
定した。

【００３７】

【実施例２】第１、第２の染料を削除した第１液を用い
た以外は上記実施例１と同様にして測定した。

【００３８】測定結果を示す。なお、測定試料はいずれ
も健康な人のものである。

【００３９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　〔分布パターン〕　　　　〔検体測定結果〕　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　（末梢血）（骨髄穿刺
液）　　＜実施例１＞の方法　　　　　　　　第２、３
図　　　　　　　　第４図　　　　　　第５図　　　　
従来法　　　　　　　　　　　　　　　　　　第６図　
　　　　　　　　　　　第７図　　　　　　第８図　　
＜実施例２＞の方法　　　　　　　　第９図　　　　　
　　　　　　　第１０図　　　　第１１図第６図は従来
の試薬、すなわち第３の染料を含有しない第１液を用い
て測定した場合に得られる緑色螢光強度、側方散乱光強
度を２軸とする二次元分布状態の説明図である。１〜６
はそれぞれリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球
、白血球ゴーストの分布領域である（なお、赤色螢光強
度、側方散乱光強度を２軸とする二次元分布図も似た分
布パターンを示す）。第７図、第８図は実際の測定結果
である。

【００４０】第２、３図は同試料を＜実施例１＞におけ
る試薬を用いて測定した場合の二次元分布状態の説明図
であり、それぞれ縦軸を緑色螢光強度、赤色螢光強度と
したものである。図中９が赤芽球の分布領域である。第
４図、第５図は実際の測定結果である。

【００４１】健康人の末梢血を試料とした場合、試料中
には赤芽球は存在しないので、第４図（実施例１）と第
７図（従来法）はほとんどおなじ分布パターンとなって
いる。

【００４２】第５、８図は試料を骨髄から採取された骨
髄穿刺液とした場合の二次元分布図である。骨髄穿刺液
には赤芽球が多く含まれている。第３の染料を含有する
低張酸性の第１液を用いることにより、赤血球は溶血さ
れ、また、有核の赤芽球は第３の染料に染まり赤色螢光
を発する。白血球は第１、２の染料に染まり、赤色螢光
、緑色螢光を発する。しかし、赤芽球と白血球とは二次
元分布図において出現領域が異なる。よって、二次元分
布図において赤芽球を他の白血球から分画するのに支障
はない。さらに、白血球の５分類もできる。

【００４３】第５図に示すように本方法では赤色螢光の
領域Ｉに赤芽球が出現しており、従来法では領域Ｉに赤
芽球は出現していないことがわかる。

【００４４】実施例２においては、実施例１の第１液か
ら第１の染料であるベーシックイエロー１１と第２の染
料であるアストラゾンオレンジＲを除いて、染料として
は第３の染料だけを含むようにして上記と同様の調製し
た第１液を用いた。

【００４５】第９図は分布パターンの説明図である。赤
芽球９だけが第３の染料に染まり赤螢光を発する。１０
はその他の粒子である。第１０、１１図はそれぞれ試料
を末梢血、骨髄穿刺液としたときの赤色螢光強度対側方
散乱光強度の二次元分布図である。第１０図では赤芽球
が存在していないので赤色螢光信号は得られていない。 第１１図では赤芽球だけが螢光を発していることがわか
る。赤芽球は実施例１と同様に領域Ｉに出現している。 白血球は出現していないので、領域１の粒子を計数する
ことにより赤芽球の計数値が求められる。つまり、第３
の染料だけでも赤芽球の分類、計数をすることが可能で
あった。

【００４６】また実施例１のように第１、第２の染料を
含有させた場合には赤芽球だけでなく、実施例１に記載
のように白血球の５分類も行うことができる。

【００４７】

【発明の効果】本発明においては第３の染料を含有させ
たので、二次元分布上で赤芽球を他の細胞と分けて分布
させることができ、赤芽球の含有率、数を精度よく求め
ることができる。

【００４８】また、第１、第２の染料も含有させること
により同時に白血球の分類も行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、この発明に使用されるフローサイト
メーターの光学系の一具体例を示す概略図である。

【図２】実施例１における試薬を用いて測定した場合の
二次元分布状態の説明図であって、縦軸を緑色螢光強度
とするものである。

【図３】実施例１における試薬を用いて図２の場合と同
じ試料を測定した場合の二次元分布状態の説明図であっ
て、縦軸を赤色螢光強度とするものである。

【図４】図２および３の説明図に対応する実際の測定結
果であって、末梢血を試料とした測定結果を示すグラフ
である。

【図５】図２および３の説明図に対応する実際の測定結
果であって、骨髄穿刺液を試料とした測定結果を示すグ
ラフである。

【図６】第３の染料を含有しない第１液を用いて測定し
た場合に得られる緑色螢光強度、側方散乱光強度を２軸
とする二次元分布状態の説明図である。

【図７】図６の説明図に対応する実際の測定結果であっ
て、末梢血を試料とした測定結果を示すグラフである。

【図８】図６の説明図に対応する実際の測定結果であっ
て、骨髄穿刺液を試料とした測定結果を示すグラフであ
る。

【図９】赤芽球だけが第３の染料に染まり赤螢光を発す
ることを示す、二次元分布状態の説明図である。

【図１０】図９の説明図に対応する実際の測定結果であ
って、末梢血を試料とした場合の測定結果を示すグラフ
である。

【図１１】図９の説明図に対応する実際の測定結果であ
って、骨髄穿刺液を試料とした場合の測定結果を示すグ
ラフである。

【符号の説明】

１　　リンパ球の分布領域 ２　　単球の分布領域 ３　　好中球の分布領域 ４　　好酸球の分布領域 ５　　好塩基球の分布領域 ６　　赤血球ゴーストの分布領域 ７　　領域Ｉ ８　　赤芽球の分布領域 ９　　赤芽球以外の粒子の分布領域 １０　　フローサイトメーターの光学系１２　　レーザ
ー １４　　フローセル １６　　シリンドリカルレンズ １８　　コンデンサーレンズ ２０　　アパーチャー ２２　　ダイクロイックミラー ２４　　側方散乱光 ２６　　螢光 ２８　　光電子増倍管 ３０　　ダイクロイックミラー ３２　　赤螢光 ３４　　カラーフィルター ３６　　光電子増倍管 ３８　　緑螢光 ４０　　カラーフィルター ４２　　光電子増倍管

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記工程ａ〜ｅからなることを特徴と
   するフローサイトメトリーによる赤芽球の分類方法：ａ
   ）．赤芽球の内部に侵入しその核を螢光染色する第３の
   染料およびｐＨを酸性域に保つための緩衝剤、からなる
   低張な第１液と、血液とを混合する工程；ｂ）．第１液
   の酸を中和し、溶液ｐＨを染色ｐＨに保つための緩衝剤
   と溶液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整するため
   の浸透圧調整剤とからなる第２液と、前記ａ工程で得ら
   れた試料液とを混合する工程；ｃ）．前記ａ、ｂ工程に
   て得られた試料液をサンプルとしてフローサイトメータ
   に供し、個々の細胞について螢光および散乱光など複数
   の信号を測定する工程；ｄ）．検出された複数の信号か
   ら２軸をそれぞれ赤螢光、散乱光とする二次元分布を得
   る工程；およびｅ）．上記二次元分布において、赤芽球
   の分布領域を設定し、その領域の細胞数を計数する工程
   。
2. 【請求項２】　　第１液の第３の染料がプロピディウム
   アイオダイド、エチディウムブロマイドまたはＮ−メチ
   ル−４−（１−ピレン）ビニル−プロピディウムアイオ
   ダイドである請求項１の方法。
3. 【請求項３】　　好酸球と好塩基球の両方を選択的に螢
   光染料する第１の染料および白血球の核を螢光染料する
   第２の染料を第１液に含有している請求項１の方法。
4. 【請求項４】　　第１液の第１の染料がアストラゾンイ
   エロー３Ｇである請求項３の方法。
5. 【請求項５】　　第１液の第２の染料が下記群より選択
   されたものである請求項３の方法： アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １，１′−ジメチルチオカルボシアニン１，１′−ジエ
   チルチオカルボシアニン１，１′−ジエチル−９−メチ
   ルチオカルボシアニンブロミド ２−〔γ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
   リリデン）プロペニル〕 −１−エチル−４，５−ベンゾオキサゾリウムヨージド
   アストラゾンレッド６Ｂ ペイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−４
   ，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ＴＡ−２ アストラゾンオレンジＲ
6. 【請求項６】　　二次元分布が側方散乱光と赤色螢光強
   度を２軸とするものである、請求項１ないし５のいずれ
   かの方法。