JPH04270965A - オリゴペプタイド吸着担体の調製方法、及びこれを使用したリポ多糖類の検定と除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オリゴペプタイド、即
ち、疎水性ポリペプタイド、もしくはポリミキシンを被
覆した担体に関するもの即ち、適切なサンプル中の細菌
や細菌性ＬＰＳを検出する新しい迅速な方法と手法、も
しくは水溶液中からＬＰＳ発熱因子を除去する目的、も
しくは傷口からＬＰＳ内毒素を除去する目的に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】細菌と細菌ＬＰＳは、食品や医薬の方面
で重要な問題を起す。例えば、少くとも約２００から約
３００個のサルモネラ菌で、容易ならない食中毒事件を
起すのに充分である。多くの細菌ＬＰＳは、動物や人間
に発熱を起す。従って、それらはよく“パイロジェン（
発熱因子）”と呼ばれている。それらは、細菌細胞内で
形成されるので、それらは又“エンドトキシン（内毒素
）”とも呼ばれている。ＬＰＳは、グラム陰性細菌の細
胞表面の主な抗原である。

【０００３】既知の技術により、細菌体やＬＰＳに対す
る多くの検出法がある。ある検出系は、細菌もしくは細
菌ＬＰＳと複合体を作る抗体を用いる。細菌体やＬＰＳ
に対する免疫測定法も存在する。これらの検出系は、抗
体を用いる方法である。ポリクローナル、モノクローナ
ルどちらにしても抗体は比較的高価な製品である。それ
らは室温において不安定でもある。従って、薬効を長び
かせるために、冷蔵庫に保存する必要がある。この冷蔵
保存の必要性自体やっかいである。

【０００４】ほとんどの抗体製品の品質は、各生産バッ
チごとに純度と全体吸着性両面においてばらつきがある
。このことは、商業上不適当である。どのバッチにおい
ても、最小限許容効果を保たねばならない。幾万バッチ
の内一つでも粗悪バッチがあっても大問題となる。この
様な一つの粗悪品がたくさんの検定キットのバッチを回
収する事になり高くつく。

【０００５】抗体を使う検定に代るものとして、知られ
ている技術は、培地鑑別法である。この種の方法は、サ
ンプルを食品もしくは溶液より得、適当な液体もしくは
固体の育成培養体に接種する。経過時間に従って、その
培養体に細菌のコロニーの成長状態を調べる。対照品の
、ある食料品（例えば、ニワトリの屠体）でもそれらを
無菌水溶液で洗って、その洗浄液を培養することにより
検査出来る。

【０００６】この方法は、働きはするが、重大な欠点が
ある。つまり、これは、ＬＰＳ（もしくは内毒素）を検
出するのではなくて、生きている細菌のみを検出するこ
とである。生きている細菌も培養過程で破壊されること
もあり、これらの菌は、検出されない。最悪の問題は、
培養が遅いことである。培地鑑別が完結するまでに１週
間か、それ以上の日数がかかる。更に、培地鑑別と同定
には熟練と訓練を受けた人員を要する。これも、この過
程を経費が高くつくものにしている。

【０００７】既知の技術は、細菌、ＬＰＳ汚染を検出す
るのに多くの抗体担体テスト法を提案している。マッテ
ィンリー（Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ）らは、ＦＯＯＤ　ＴＥ
ＣＨＮＯＬＯＧＹ，（１９８５）３９：９０−９４で、
マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐ
ｌａｔｅ）とモノクローナル抗体の組み合わせたものを
使って、細菌汚染の酵素免疫測定を行なう方法を詳説し
ている。食品中のサルモネラ菌の検査には、培養液中も
しくは培養地プレート上コロニーとして迅速にサルモネ
ラ抗原を検定する必要がある。ニトロセルローズ薄膜を
用いる標準ドットブロット測定（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　ａ
ｓｓａｙ）方法は、抗原を薄膜上にしみ込ませ、一定量
のわずかなサンプルを添加固定するのであるが、食品サ
ンプル中の病原菌を検査するには便利な方法である。し
かしながら、この方法は抗原を薄膜に吸着させた後、残
りの部分は完全にタンパク質で閉塞して抗体−酵素結合
体の非特異的吸着を防がねばならない。従って、その余
分な時間を、測定を完結するのに加えることになる。更
に、この薄膜は壊れ易く、大きなシートは移動と洗浄の
過程での取り扱いに特に注意が必要である。

【０００８】食肉加工業者は、生肉と最終製品にサルモ
ネラ菌汚染の検査を、その使用前や販売前に行うことが
北米では、義務づけられている。サルモネラの迅速な測
定は、製品品質の低下を少くするのみならず、この様な
測定中に付随する在庫費用も節約する。迅速な測定は、
サルモネラ中毒の早期予防とコントロールを可能にする
。この中毒は、人間の苦痛の面で、生産性の喪失、治療
、製品の回収、損害賠償訴訟、そして病状の確認等高価
に付く。現在、培養法による食品サンプル中の生きてい
るサルモネラ菌の、迅速な検出には損傷可能の面の回復
を計るため適当な前増菌培地（たとえば、培養肉汁や緩
衝ペプトン水（ＢＰＷ））中に、サンプル物質を接種し
、そしてそのサンプルをセレナイトシスティンやテトラ
チオネート肉汁の様な選択増菌培地にサンプルを移入し
、サルモネラ菌以外の菌の成長を阻害すると同時に、サ
ルモネラ菌類の高成長を計るものである。全過程を終了
するのに、少くとも４８時間はかかる。前増菌培地もし
くは、選択増菌培地のサルモネラ菌類は、次の酵素免疫
測定（ＥＩＡ）、生化学的あるいは血清学的検査もしく
はこれらの方法の組み合わせにより検定出来る。

【０００９】スコット（ＳＣＯＴＴ）とバークレー（Ｂ
ＡＲＣＬＡＹ）はＶＯＸ　ＳＡＮＧ（１９８７）５２：
２７２〜２８０で改良してグラム陰性の細菌の未熟突然
変異株よりの疎水性ＬＰＳに対する抗体を検出する方法
を考案した。この方法は、内毒素中毒を診断するために
血清中の内毒素に対する抗体を検出するために案出され
た。その変異株グラム陰性菌のＬＰＳは、セロタイプ（
Ｓｅｒｏｔｙｐｅ）の多糖類、Ｏ−抗原鎖が欠けている
。従って、交差反応性免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗内毒
素抗体の検出するＥＬＩＳＡ（酵素連結した免疫−吸収
測定）法で、ポリスチレン性マイクロタイタープレート
に充分満足に吸着することが出来なかった。

【００１０】このような未熟ＬＰＳは、自膠着によりプ
レートの表面に吸着出来なかった。従って、上記著者は
、溶液中で抗生物質のポリミキシンＢと未熟ＬＰＳとを
反応させた。その複合体は、沈澱物を生じた。その沈澱
したポリミキシンＢ−ＬＰＳ複合体は、ポリスチレンプ
レートに展着させると安定であることが判明した。この
展着した複合体は、内毒素に対する血清ＩｇＧ抗体と反
応した。

【００１１】上記詳述の方法は、抗体検出法で、直接細
菌ＬＰＳ抗原を検出できない。ＬＰＳ抗原の検出には、
不適当である。イセクッツ（ＩＳＳＥＫＵＴＺ）は、Ｔ
ＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣ
ＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ（１９８３）６１：２７５〜２８
１で、アガロースビーズに共有結合で固定化したポリミ
キシンＢを、溶液中のＬＰＳ発熱因子を除くのに使用し
たことを記述している。これは、カラムにビーズをつめ
た方法で行われた。この様なビーズは、高価で取り扱い
も不便であり、ポリミキシンの固定化のためにはビーズ
の化学的な活性化を行わねばならない。この様な欠点の
ため、アガロースビーズは現地テストキットとして不適
当である。

【００１２】人間や他の動物類では、皮膚の傷口や開口
した表皮剥離部に感染した多くのグラム陰性細菌性病原
菌は、ＬＰＳ内毒素を放出し、それが炎症、毒素血症や
多くの併発症を起し、そのために感染した個体に多大の
害を及ぼす。

【００１３】多くの細菌ＬＰＳは、動物や人間に発熱を
起す。従って、それらはよく“パイロジェン（発熱因子
）”と呼ばれている。それらは、細菌細胞内で形成され
るので、それらは“エンドトキシン（内毒素）”とも呼
ばれている。ＬＰＳは、グラム陰性細菌の細胞表面の主
な抗原である。

【００１４】ポリミキシンＢは、グラム陰性細菌を殺す
殺菌性の抗生物質である。ポリミキシンＢは、Ｎ−末端
基が８又は９個の炭素より成る脂肪族で、アシル化され
た短いペプタイド側鎖をもつ環ペプタイドである。ポリ
ミキシンＢが、アガロースビーズに共有結合で固定化し
た時に、ＬＰＳ発熱因子を吸着することが知られている
（イセクッツ〔Ｉｓｓｅｋｕｔｚ〕Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ　Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　（１９８３）６
１，２７５〜２８１を参照）。この著者は、アガロース
ビーズに共有結合で固定化したポリミキシンＢを用いて
、溶液中のＬＰＳ発熱因子を除去する方法を詳説してい
る。

【００１５】この方法は、ビーズをカラムにつめて行わ
れた。この様なビーズは、高価で取り扱いが困難である
。それらは容器中でなければならず、ポリミキシンを固
定化するためには、化学的に活性化しなければならない
。ポリミキシンは、ｐＨ２〜７の間で安定であり、煮沸
してもそれに耐える。ポリミキシンは、全てのグラム陰
性細菌（サルモネラ菌類、大腸菌、ブルセラアボータス
（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ）とカンピロバク
ター菌類を含む）のＬＰＳ抗原と反応することが出来る
。

【００１６】本出願人の特許出願中の出願番号２，０１
７，０９３　（出願日５月１７日１９９０年）によると
、ポリミキシンＢは、どの様な疎水性表面、即ち織、不
織、粗外孔性ポリエステル、布もしくはマット状に編ま
れた繊維にも単なる吸着により、直接結合することを示
した。ポリミキシンＢは、疎水的にポリエステルの様な
疎水性表面に、その脂肪酸基を通して吸着することが出
来る。上述特許出願によると、ポリミキシンＢは、疎水
性物質より作られた織、不織布やマットにした繊維に吸
着することを教えている。ポリミキシンＢは、ポリエス
テルに良く吸着するが、ポリプロピレン布、ポリアラミ
ッド布、もしくはナイロン布にはポリエステルに比べて
やや劣る。

【００１７】このポリミキシンＢの疎水性担体、即ち、
ＳＯＮＴＡＲＡ　８１００に直接結合することと、特許
出願中の出願番号５６４，９５０　（出願日４月２２日
１９８８年）に教示しているイオン性結合のものと対比
させてみたい。その明細書によると、少くともその一部
がセルロース性物質である担体は、選択された試薬と反
応して、イオン結合基を導入する。それを更にイオン性
の医薬品、例えばポリミキシンＢは、イオン的に、その
布担体に結合される。 そのイオン状の医薬は、布のイオン結合基から体液（創
傷部分からの）中のイオンとイオン交換して放出され得
る。この結果、その薬が有用な効果を表す。

【００１８】発熱因子は、人間のみでなく他の動物類に
も発熱作用を起す有毒物質で、多くの生きている細胞形
態、例えば細胞培養又は組織培養の体外（ｉｎｖｉｔｒ
ｏ）で育成している哺乳類の細胞にも有毒性を著してい
る。溶液もしくはいかなる製品でも、最終的に人間や動
物に注射するもの（例えば、薬剤品即ち注射用食塩水、
医薬品や抗生物質）もしくは繁殖用又、哺乳類の細胞も
しくは組織培養用の培養液の調製用に使うものは、発熱
因子をそれらより除去しなければならない。グラム陰性
細菌ＬＰＳ（内毒素とも言われ、細胞膜の外壁の主成分
は、よく直面する主な発熱因子の系統である。自然界の
ほとんど全てのグラム陰性菌は、発熱毒素性のＬＰＳを
作るが、その中には（その他多数の中でも）大腸菌やサ
ルモネラ菌類も入っている。溶液中よりＬＰＳ発熱因子
を除去する方法が考案されたが、その中の一つに抗生物
質ポリミキシンＢとＬＰＳ分子との親和性に基づいた方
法がある。

【００１９】イセクッツ（Ｉｓｅｋｕｔｚ）は、ＪＯＵ
ＲＮＡＬ　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＭＥＴ
ＨＯＤＳ（１９８３）６１：２７５〜２８１で、ポリミ
キシンＢをアガロースビーズに共有結合したものを使い
、カラムにつめた方法で溶液からＬＰＳ発熱因子を除去
することを詳説している。しかしながら、ポリミキシン
−アガロース担体を調製する方法は、こみ入っていてバ
ッチにより不均一のきらいがある。その理由は、アガロ
ースビーズにポリミキシンＢを固定化するために、化学
処理しなくてはならず、その処理の程度や物質性が各バ
ッチごとに異なる。原料、品質管理処理や化学処理が比
較的高価なので、この様な方法は高くつく。 正に現在、一般市場で売られている溶液より、発熱因子
を除去する製品は高価である。

【００２０】この価格が発熱因子を除去しなければなら
ない最終製品（例えば、医薬品類）の価格にしわ寄せに
なる。現在ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社は、ポリミキシンＢ−セ
ファロース４Ｂを提供している、即ちポリミキシンＢが
セファロース４Ｂに共有結合している製品である。この
製品は、ゲルの状態で提供され内毒素不純物を除くと言
明している。又、このゲルは、デオキシコーレート溶液
で洗うことにより再生すると言明している。この発熱因
子除去試薬は、上述したアガロースビーズに共有結合さ
せたポリミキシンＢと同じ不利な問題を持つ。このゲル
フィルターを用いることは、商業的に魅力的な工程とし
て考えられないことは明らかである。

【００２１】アラーチェク（Ａｌｅｒｃｈｅｋ）社は今
、ポリミキシンＢサルフェートとＬＰＳ結合共通ペプタ
イドをシリカに共有結合で固定化したものと、ＰＶＣ−
シリカ混合の誘導体の形とした親和性フィルターを提供
している。このフィルターは、微小多孔性のため、濾過
はタンゼンシャルフィルター（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　
ｆｉｌｔｅｒ）方式の器具を使用するために、かなり高
価な技術となる。

【００２２】

【発明が解決しようとする課題】抗体を最少限に使用す
るための比較的低価格で便利なグラム陰性細菌と、その
隨出するＬＰＳを検出するテスト方法とキットの必要が
あり、本発明は、この必要性に応じようとするものであ
る。

【００２３】これまでの既知の技術で問題なのは、細菌
と内毒素の検出、明確には、グラム陰性細菌とＬＰＳも
しくは発熱因子を検出する新しいテストキットが無いこ
とである。

【００２４】さらにもう１つ、既知の技術で問題なのは
、細菌とＬＰＳを検出するテストキットの調製方法とそ
の使用方法をも提供しなかったことである。

【００２５】既知技術で、これまでの問題は、ポリミキ
シンＢの既知の特性を利用して創傷からＬＰＳを吸収す
るような、創傷包帯を作り得なかったことである。

【００２６】既知技術での今までの問題は、ＬＰＳ発熱
因子の除去試薬が、その様な目的に使われる担体が全然
化学的修飾の必要なしで調製出来、それを用いて水より
ＬＰＳ発熱因子を除去する方法を提供し得なかったこと
である。

【００２７】既知の技術で他の問題点は、ＬＰＳ発熱因
子除去試薬が各バッチ毎に最小限の品質不均一性である
ようにしたＬＰＳ発熱因子除去試薬を調製する方法で、
水よりＬＰＳ発熱因子を除去する方法を提供し得なかっ
たことである。

【００２８】既知技術の他の問題は、ＬＰＳ発熱因子除
去試薬を調製する方法で、そのＬＰＳ発熱因子除去試薬
のＬＰＳ安定性が上るような水よりＬＰＳ発熱因子を除
去する方法を提供し得なかったことである。

【００２９】既知技術のもう一つの問題は、水よりＬＰ
Ｓ発熱因子を除去する方法で、ＬＰＳ発熱因子除去試薬
の調製が低価で出来るよな方法を提供出来得なかったこ
とである。

【００３０】

【課題を解決するための手段】本発明の技術的手法は、
ＬＰＳの酵素免疫測定法用、もしくはＬＰＳの放射免疫
測定法用、もしくはＬＰＳの蛍光免疫測定法用、もしく
は水溶液からＬＰＳ発熱因子を除去するために改良され
た装置と定義づけられるが、これらは次の組み合わせよ
り成る。 ａ）担体、例えばプラスチック、即ちポリスチレン、ポ
リカーボネート、ポリメタクリレート、もしくはポリ塩
化ビニール、又は織布、即ちレーヨン／ポリエステル混
紡布、ポリエステル織布、不織布、即ちレーヨン／ポリ
エステル不織布、もしくはポリエステル不織布、もしく
は紙を指し、テストされるサンプルを受容するのに適合
したもの；そして ｂ）オリゴペプタイド、例えば疎水性ポリペプタイド、
もしくはポリミキシン、即ちポリミキシンＢ、ポリミキ
シンＢ１　、ポリミキシンＢ２　、ポリミキシンＤ１　
、ポリミキシンＤ２　、もしくはポリミキシンＥを含む
。

【００３１】他のこの様な技術的方法は、疎水性粗多孔
布より成る創傷包帯として定義づけられる。この様な布
は、例として、合成繊維より形成されている、即ちポリ
エステル、ポリプロピレン、ポリアラミッド、もしくは
ナイロンを指し、それらはオリゴペプタイド、疎水性ポ
リペプタイド、もしくはポリミキシン、即ちポリミキシ
ンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキシンＢ２　、ポリ
ミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　、もしくはポリミ
キシンＥが疎水性的に表面にしっかりと安定に吸着して
いる。そしてその創傷包帯は、無毒性洗剤、即ちリジウ
ムデオキシコーレート、リジウムジメチルスルフォネー
ト、無水ソルビタル部分エステル化脂肪酸のポリオキシ
エチレン誘導体、アルキルアリルポリエーテルアルコー
ル類、アルキルアリルポリエーテルスルフォネート類や
、アルキルアリルポリエーテルサルフェート類で、出来
ればそれが１２１℃で１０〜２０分間高圧釜で殺菌した
ものを含有していることが望ましい。

【００３２】更に、もう一つのこの様な技術的方法は、
粗多孔性疎水性布より成るフィルターと定義出来る。こ
の様な布とは、例えば疎水性繊維より形成された布で、
その繊維はポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、もしくはナイロンから成り、それは又、オリゴペプ
タイド、疎水性ポリペプタイド、もしくはポリミキシン
、即ちポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキ
シンＢ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　
、又はポリミキシンＥで被覆されている。つまり、オリ
ゴペプタイドもしくは疎水性ポリペプタイド、もしくは
ポリミキシンが布に安定して吸着している。

【００３３】他のこの様な技術的手法は、ＬＰＳ免疫測
定用の改良された装置の調製の方法として定義されるが
、次の段階より成る。 ａ）担体を湿らせる。担体は、例えばプラスチック、即
ちポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレー
ト、又はポリ塩化ビニール、もしくは織布、即ちレーヨ
ン／ポリエステル混紡布、ポリエステル織布、不織布、
即ちレーヨン／ポリエステル不織布、もしくはポリエス
テル不織布、もしくは紙で、それらは、燐酸緩衝食塩水
中で、テストするサンプルを受容するのに適合したもの
である； ｂ）上記の担体を、ポリミキシンの溶液中で反応させる
。ポリミキシンは、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１
　、ポリミキシンＢ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミ
キシンＤ２　、又はポリミキシンＥで、燐酸緩衝食塩水
中に溶かしたものより成る。又、溶液の代表として、ポ
リミキシンＢの溶液もしくはポリミキシンサルフェート
の溶液は濃度がそれぞれ１ｍｌ当り約１〜１０ｍｇの範
囲内であって、約半時間から約２４時間反応させる；そ
して、ｃ）上記のポリミキシン処理担体を適当な洗剤液
で洗浄する。

【００３４】しかしながら、更に他のこの様な技術的手
法は、ＬＰＳ免疫測定用の改良された装置の調製の方法
として定義される、次の段階より成る。 ａ）レーヨン／ポリエステル混紡布、レーヨン／ポリエ
ステルの不織布、ポリエステル織布、又はポリエステル
不織布を燐酸緩衝食塩水で湿らせる； ｂ）当該布をブロットする； ｃ）その布をポリミキシン溶液中で反応させる。ポリミ
キシンは、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリ
ミキシンＢ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ
２　、又はポリミキシンＥの燐酸緩衝食塩水、即ち、ポ
リミキシンＢ溶液もしくはポリミキシンＢサルフェート
溶液は濃度がそれぞれ１ｍｌ当り約１〜１０ｍｇの範囲
内である。即ち燐酸緩衝食塩水中１ｍｌ当り約５ｍｇの
ポリミキシンＢサルフェート溶液約５０μｌ　を約半時
間から約２４時間にかけて反応させる； ｄ）上記のポリミキシン処理布を適当な洗剤液、例えば
商品名　ＴＷＥＥＮ（ツウィーン）２０───燐酸緩衝
食塩水で洗浄する。

【００３５】更に、他のこの様な技術的手法で、細菌Ｌ
ＰＳを検出する方法として定義されるものは、次の段階
より成る。 ａ）細菌のサンプルを洗剤中で加熱する。洗剤は、エチ
レンジアミンテトラ酢酸、リジウムコーレート、リジウ
ムデオキシコーレート、商品名ＴＲＩＴＯＮ（トライト
ン）Ｘ−１００又はリジウムドデシルサルフェートで、
培養液中に溶解している。その培養液は、燐酸緩衝食塩
水、もしくは適当な増菌培地即ち緩衝ペプトン水、もし
くは選択培地、即ちイースト抽出物、テトラチオネート
肉汁、セレナイトシスティン肉汁もしくは養分肉汁の入
った緩衝ペプトン水、洗剤は、即ちエチレンジアミンテ
トラ酢酸もしくはリジウムデオキシコーレートを指す；
ｂ）上述の溶液を、ＬＰＳの免疫測定用の装置と接触さ
せる。ここにいう装置とは、次に述べるものの組み合わ
せで、まず担体は、例えばプラスチック、即ちポリスチ
レン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、もしく
はポリ塩化ビニール、もしくは織布、即ちレーヨン／ポ
リエステル混紡布、ポリエステル織布、不織布、即ちレ
ーヨン／ポリエステル不織布、もしくはポリエステル不
織布、もしくは紙で、それらはテストするサンプルを受
容するように適合している：そして、ポリミキシン、即
ちポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキシン
Ｂ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　、又
はポリミキシンＥを含む； ｃ）上述の装置を洗浄する；そして、 ｄ）抗体標識結合体を加える。即ち、放射免疫測定法に
適した抗体放射性同位元素複合体、もしくは酵素免疫測
定法に適した発色源の添加により色素反応を起すように
工夫された抗体−酵素複合体、もしくは蛍光免疫測定に
適した蛍光標識複合体、もしくは化学発光免疫測定法を
前述装置に適する様な化学発光性標識複合体を指す。

【００３６】更に加えて、この様な技術的手法を定義す
れば、次に述べる様な段階を含んだ過程をいう。 ａ）増菌培養液中での食品サンプルの混合均質化法；ｂ
）前述のサンプルの培養： ｃ）前述のサンプルを、前述の免疫測定装置で測定する
。そして任意の後続段階も含めると：ｄ）段階的に希釈
した上述食品サンプルシリーズの調製：そして ｅ）増菌培地中の希釈したシリーズのサンプルの測定。

【００３７】更に、この様な技術的手法は、水溶液より
ＬＰＳ発熱因子を除去する方法として定義される。その
方法は、次の様である。水溶液を粗多孔疎水性布より成
るフィルターを通す。その布は、疎水性の繊維、即ちポ
リエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、もしくは
ナイロンより形成されており、それらはオリゴペプタイ
ド、疎水性ポリペプタイド、もしくはポリミキシン即ち
、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキシン
Ｂ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　、も
しくはポリミキシンＥ、で被覆されており、それにより
オリゴペプタイド、もしくは疎水性ポリペプタイド、も
しくはポリミキシンが布にしっかり安定して吸着してい
る。これら既述のフィルターは、調節バルブを有した垂
直のシリンダー型カラムにつめ込み、カラムの流速は１
時間当り約２５から約２００ｍｌ流すが、１時間当り５
０ｍｌが好ましい。これによりＬＰＳ発熱因子が既述フ
ィルターに吸着する。

【００３８】次に詳説するものは、いかに各個別の技術
手法が機能するか、又いかに全ての技術手法がお互いに
関連し合って上述した諸問題の解決に働いているかを解
説するものである。

【００３９】ＬＰＳ抗原を捕獲するために、ポリミキシ
ン布を使用する特典は、ブロット測定法で行わねばなら
ないブロッキングの段階を不必要にする。その理由は、
全ての結合基が、ポリミキシンによってすでに飽和され
ているからである。その上、大きなポリエステル布のシ
ートは、構造的に安定で、又、布の粗多孔性もあって洗
浄し易い。

【００４０】ポリミキシンＢは驚いたことに、直接どの
様な疎水性表面、例えばミクロタイタープレートや粗多
孔性ポリエステル布にも単純な吸着によって結合するこ
とが発見された。抗生物質は、この様にして固定化され
、自由にグラム陰性細菌もしくはＬＰＳと反応する。

【００４１】一般に知られている酵素免疫測定法と異り
、調製する担体、プレート、ディッシュ（ｄｉｓｈ）、
もしくは試薬短冊は抗体を全く必要としない。調製され
た担体は、抗体が付いていないので、冷蔵する必要はな
い。実用の際、担体短冊はサンプルと接触させた後、調
製された抗体標識結合体の溶液を、固体相上のポリミキ
シン−細菌もしくはポリミキシン−ＬＰＳ複合体に接触
させる。検出方法は、細菌もしくはＬＰＳ存在の有無を
信号するために抗体と複合体を作っても良い。

【００４２】本発明の抗原を捕獲するポリミキシン被覆
相を使用する酵素免疫測定法は、培養液中のグラム陰性
バクテリアが少くとも１ｍｌ中５×１０５　個までの定
量測定を提供できる。サルモネラ菌類を含んだこの様な
グラム陰性細菌は、食中毒の重大原因となる。

【００４３】本発明の方法は、簡易である。操作は迅速
で、再現性がある。一方、抗体は節約して使わねばなら
ないが、ポリミキシンは、市販の抗体調製品を用いるよ
りも、約１００倍安くあがる。ポリミキシンは、純品で
入手でき、バッチによる品質の不均一が生ずる抗体調製
のような問題は起きない。

【００４４】本発明によると、ポリミキシンＢサルフェ
ートで被覆した粗多孔ポリエステル布は、小さな使いす
てのプラスチックのカラムにつめ、それに種々の濃度の
サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＰＳ発熱因子の入っている
燐酸緩衝食塩水を重力流動により通した。発熱因子溶液
を流速１時間当り５０ｍｌでカラムを通すと、溶液から
はほとんどの発熱因子が効果的に除去された。それは、
リムラスアメーボサイトライセート（ｌｉｍｕｌｕｓ　
ａｍｏｅｂｏｅｙｔｅ　ｌｙｓａｔｅ　）検出システム
により定量された。ポリミキシンＢ被覆粗多孔疎水性布
は、医薬品溶液（例えば注射液）、菌培養液や他の溶液
で発熱因子の存在が好ましくない液から発熱因子を除去
するのに有用である。

【００４５】ポリミキシンは、一種のオリゴポリペプタ
イドで、特に緩衝水溶液中でＬＰＳと強い親和性を示す
。ポリミキシンは、バチルスポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ）により生成された抗体複合体
である。

【００４６】

【化１】

【００４７】ＤＡＢ＝α、γ−ジアミノブチル酸ポリミ
キシンＢ、ポリミキシンＢ１　とＢ２　の混合物ポリミ
キシンＢ１　、Ｃ５６Ｈ９８Ｎ１６Ｏ１３、Ｒ＝（＋）
−６−メチルオクタノイル；Ｘ＝フェニルアラニン； Ｙ＝ロイシン； Ｚ＝Ｌ−ＤＡＢ ポリミキシンＢ２　、Ｃ５５Ｈ９６Ｎ１６Ｏ１３、Ｒ＝
６−メチルヘプタノイル； Ｘ＝フェニルアラニン； Ｙ＝ロイシン； Ｚ＝Ｌ−ＤＡＢ ポリミキシンＤ１　、Ｃ５０Ｈ９３Ｎ１５Ｏ１５、Ｒ＝
（＋）−６−メチルオクタノイル；Ｘ＝ロイシン； Ｙ＝スレオニン； Ｚ＝Ｄ−セリン ポリミキシンＤ２　、Ｃ４９Ｈ９１Ｎ１５Ｏ１５、Ｒ＝
６−メチルヘプタノイル； Ｘ＝ロイシン； Ｙ＝スレオニン； Ｚ＝Ｄ−セリン コリスチン

【００４８】

【化２】

【００４９】ＤＡＢ＝α、γ−ジアミノブチル酸コリス
チンＡ、Ｃ５３Ｈ１００　Ｎ１６Ｏ１３、ポリミキシン
Ｅ１　 Ｒ＝（＋）−６−メチルオクタノイル ポリミキシンＥ、Ｃ５２Ｈ９８Ｎ１６Ｏ１３、Ｒ＝６−
メチルヘプタノイル

【００５０】ポリミキシンは、ｐＨ２から７の間で安定
で、沸騰させても安定である。ポリミキシンは、サルモ
ネラ菌類、大腸菌、ブルセラアボータス（Ｂｒｕｃｅｌ
ｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ）やカンピロバクター菌類を含む
全てのグラム陰性細菌からのＬＰＳ抗原と反応すること
が出来る。ポリミキシンはポリエステルの様な疎水性表
面に、その脂肪酸基を通して疎水的に吸着することがで
きる。ポリミキシンＢは、種々の担体に吸着するので、
それを使って本発明の酵素免疫測定（ＥＩＡ）に用いら
れ得る。このポリミキシンは、ポリ塩化ビニール、もし
くはポリカーボネート、そして特に最も一般的にマイク
ロタイターに使われている物質ポリスチレンから作られ
ているマイクロタイタープレートウェルの表面に吸着す
るので、測定に使い得る。

【００５１】ポリミキシンＢは、数種の物質より作られ
た、織布や不織布そしてマットにした繊維に吸着する。 ポリミキシンＢは、ポリエステルに一番良く吸着する。 ポリプロピレン布、ポリアラミド布や、又セルロース製
濾紙又は布、もしくはニトロセルロースメンブレンとの
吸着は、やや低下する。

【００５２】布は、疎水性繊維、即ちポリエステル、ポ
リエチレン、ポリプロピレンもしくはナイロン、そして
これらとレーヨンの混合したものより形成されたものが
望ましい。又、それが粗多孔性であることが望ましい。

【００５３】ここで、布に対して使っている言葉“粗多
孔性（マイクロポーラス）”は、繊維が疎水性合成ポリ
マー繊維で出来ていて、それが織、不織にかかわらず物
質的にも構造的にも安定な布で、約２００μｍ以上の厚
さと、孔穴（即ち繊維間の空間をさす）が直径にして約
２０μｍ以上のものを意味している。

【００５４】粗多孔性布は、物質的にもほとんど完全に
合成繊維より作られている。即ち、ポリプロピレン、ポ
リエチレン、ナイロンもしくはポリエステルもしくはそ
れのレーヨンとの混合物である。

【００５５】この様な粗多孔性の布は、次の様な特長を
持っている。それらはより大量のオリゴペプタイド、例
えばポリミキシン、即ち単位面積当りのポリミキシンＢ
１　を収容出来る。それらは、オリゴペプタイド、例え
ばポリミキシン、即ちポリミキシンＢを結合するより大
きな表面積を持っている。それらは、溶液に対する反流
動性が大変少ない：そしてそれらは強靱で耐久性両方を
持っている。この様な粗多孔性布は、それらの疎水性の
特長を持つ利点により吸着したり、又、オリゴペプタイ
ド、例えばポリミキシン、即ちポリミキシンＢを吸着す
ることが明らかになった。それはつまり、これらの布は
オリゴペプタイド、例えばポリミキシン、即ちポリミキ
シンＢ捕持するのに大きな表面積を提供出来るからであ
る。

【００５６】この様な粗多孔疎水性の布は、例えばポリ
プロピレンやポリエステルから作られているものは簡単
に市販で求められ、そして織物やフィルターとして多く
の商業的需要があるため、価格も適当である。粗多孔性
１００％ナイロン布も一般商品として市販され、カナダ
のオタワ地域でも求められる。粗多孔不織ポリプロピレ
ンフィルター布も一般商品として求められ、ＡＬＤＲＩ
ＣＩＩＣＨＥＭＩＣＡＬ　Ｃｏ．（アルドリック化学薬
品会社）より買える。 いろいろの不織、粗多孔ポリエステル布は、ＤｕＰｏｎ
ｔ　（デュポン社）より得られ、商標ＳＯＮＴＡＲＡ（
ソンタラ）として知られている。

【００５７】この様なＳＯＮＴＡＲＡ　の中で、目的の
ために好ましいのは品名ＳＯＮＴＡＲＡ　８１００と品
名ＳＯＮＴＡＲＡ　８４０７である。

【００５８】ＳＯＮＴＡＲＡ　８１００は、１００％ポ
リエステルで、１カード単位当り重量４０オンスである
。ＳＯＮＴＡＲＡ　８４０７は、７０／３０混比レーヨ
ン／ポリエステル混合で、１ｃｍ２　単位当り５．１ｍ
ｇの重さを持つ。ここで用いられている布に対して言わ
れている言葉“疎水性”とは、布が水をはじくことを意
味しており、水のばじく程度は孔の大きさと内在的なポ
リマー自身の特性に依存するものである。

【００５９】布に関して用いている言葉“不織”とは、
布が天然のもしくは合成の繊維が不規則に配置されて、
粘着物質、熱又は圧力もしくはニードリング（縫針）工
法により形成された布を意味している。

【００６０】ＴＲＩＴＯＮ（トライトン）は、ＲＯＨＭ
＆ＨＡＡＳ　Ｃｏ．（ロームアンドハース）の商標であ
り、アルキルアリルポリエーテルアルコール類、モノス
ルフォネート類、モノサルフェート類に基づく界面活性
剤に名づけられたものであり、それらは非イオン性、カ
チオン性、アニオン性タイプ；油溶性と水溶性タイプの
ものである。それらは粘着性のある液体、のり状、もし
くは水溶液状で売られている。界面活性剤には、洗剤、
乳化、湿化、拡散、分散活性を含むものである。

【００６１】ＴＷＥＥＮ（トウィーン）は、ＡＴＬＡＳ
　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ　ＩＮＣ．
（アトラス化学工業会社）の商標で、シリーズになって
いる。一般目的（多目的）乳化剤と、界面活性剤の各洗
剤の名前に用いられている。それらは、無水ソルビトー
ルで、部分エステル化された脂肪酸のポリオキシエチレ
ン誘導体である。一般的に、水溶性もしくは水に拡散し
やすく、有機溶媒中では溶解性が大きく異なる。

【００６２】ポリエステル布が、オリゴペプタイド、例
えば疎水性ポリペプタイド、好ましくはポリミキシン、
ポリミキシンＢで被覆（コート）されたものは、細菌Ｌ
ＰＳを結合する能力があることが判明しているので、ポ
リエステル布のシートがオリゴペプタイド、例えば好ま
しくは疎水性ポリペプタイドもしくはポリミキシン、ポ
リミキシンＢで被覆した包帯は開口傷にあてがって漿液
を吸収し、さらに漿液中にあるＬＰＳをも吸収する目的
に応用出来うる。これは、内毒素を極部循環系より除き
、より早く完全な回復をする予後を改善する。

【００６３】オリゴペプタイド（例えば疎水性ポリペプ
タイドもしくはポリミキシン、ポリミキシンＢが好まし
い）で被覆された疎水性粗多孔性布によるＬＰＳ内毒素
除去効果性は、傷口に適当な無害洗剤と同時にあてるこ
とにより効果を向上させることが出来うる。その理由は
、その洗剤がオリゴペプタイド（即ち疎水性ポリペプタ
イドもしくはポリミキシン、ポリミキシンＢ１　が布に
吸着していることが好ましい）にＬＰＳの親和力が向上
する様に複合体を作るからである。従って、本発明は疎
水粗多孔布にオリゴペプタイド、例えば疎水性ポリペプ
タイド、好ましくはポリミキシン、ポリミキシンＢが疎
水的に安定して吸着していてそれに共働的、効果的な量
の適当な無害の洗剤を吸収させた創傷包帯を提供するも
のである。適当な、この様な無害の洗剤には、リジウム
デオキシコーレート、リジウムジメチルスルフォネート
、無水ソルビトール部分エステル化脂肪酸のポリオキシ
エチレン誘導体、アルキルアリルポリエーテルアルコー
ル類、アルコールアリルポリエーテルスルフォネート類
とアルキルアリルポリエーテルサルフェート類がある。

【００６４】この発明により、粗多孔性、疎水性、例え
ばポリエステル布はオリゴペプタイド、即ち疎水性ペプ
タイド、好ましくポリミキシン、ポリミキシンＢで被覆
されているもので、それを１２１℃で１０〜２０分間高
圧釜で殺菌する（この処理は、オリゴペプタイド、即ち
疎水性ペプタイドもしくはポリミキシン、ポリミキシン
Ｂが好ましい、で被覆されたこの様な布のＬＰＳに結合
する能力には影響がなかった）。これにより、包帯の衛
生効果を高めることが出来る。

【００６５】この発明により、この粗多孔疎水性布は、
オリゴペプタイド、例えば疎水性ポリペプタイド、好ま
しくはポリミキシン、ポリミキシンＢが被覆されている
が、その被覆されているオリゴペプタイド、例えば疎水
性ポリペプタイド、好ましくはポリミキシン、ポリミキ
シンＢの抗生物質特性の利点を生かして極部殺菌薬とし
て働くことが明らかになった。

【００６６】ポリエステル布は、徐々に（疎水的に）オ
リゴペプタイド、即ち疎水性ポリペプタイド、例えばポ
リミキシン、即ちポリミキシンＢを簡単な被覆（コート
）方法を用いて吸着させることが出来る。この様なオリ
ゴペプタイド、即ちポリミキシン、例えばポリミキシン
被覆した布は、効果的にＬＰＳ抗原を捕獲することが出
来る。従って、この発明によりオリゴペプタイド、即ち
ポリミキシン、例えばポリミキシンＢ被覆ポリエステル
布は、ＬＰＳ発熱因子を溶液より除去する適当な方法の
一つである。

【００６７】本発明により、オリゴペプタイド即ちポリ
ミキシン、例えばポリミキシンＢ被覆（コート）ポリエ
ステル布は、他のＬＰＳ発熱因子除去装置を使用するよ
りも数段の利点があることが判明した。いくつかの利点
を上げれば、 （１）ポリミキシンＢ布は、布もしくは抗生物質の化学
的修飾を全く必要とせず、調製出来る簡便性；（２）オ
リゴペプタイド、即ちポリミキシン、即ちポリミキシン
Ｂ布のその簡単な調製方法のために品質のバッチ毎の変
化が少ない； （３）オリゴペプタイド、即ちポリミキシン、例えばポ
リミキシンＢ−ポリエステル布疎水的相互作用により安
定；そして （４）調製費が掛らず、それに関係する医薬品もしくは
他の溶液の商品価格を低くするのを助けることが出来る
。

【００６８】他のオリゴペプタイド、例えば疎水性ポリ
ペプタイドは、ＬＰＳ発熱因子に結合するが、又、更に
それは疎水粗多孔布に結合して、この発明の方法中に用
いるフィルターを提供することは確かである。

【００６９】発明した方法によると、細菌もしくはＬＰ
Ｓ汚染は、例えば次に述べる方法で検定される。品名Ｓ
ＯＮＴＡＲＡ　８１００の様なポリエステル不織布をま
ず取得した。 この布を６ｍｍ平方断片に切り、ポリミキシンＢで被覆
した。他の大きさの布を使っても良いことは、明らかで
ある。布は、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で湿らしブロッ
トした。

【００７０】ポリミキシン被覆は、次の様にして行った
。それぞれの布断片をＰＢＳ１ｍｌ中５ｍｇのポリミキ
シンＢサルフェート溶液５０μｌ　で６〜１６時間反応
させた後、商品名ＴＷＥＥＮ　２０を含んだ燐酸緩衝食
塩水で５回洗浄した。洗浄は、室温で行った。粗多孔性
フィルター上で吸引しながら洗浄した。全ての反応は、
室温で密閉したペトリ皿中で行った。

【００７１】ポリミキシン布酵素免疫測定法は抗体布酵
素免疫測定法と次の様な方法で比較した。この目的のた
めに、抗体布はポリミキシン布と同じ様にして調製した
。各布の断片は、５０μｌ　のポリクローナル抗体の市
販品（以後ＣＳＡ−１と略す）と反応させた。その濃度
は、ＰＢＳ１ｍｌ中５０μｌ　の抗体であった。反応時
間は、室温で１６時間であった。洗浄方法は、ポリミキ
シン被覆布の調製における洗浄の方法と同じようにして
行われる。

【００７２】サルモネラ抗原は、免疫測定検定用に調製
された。抗原は、サルモネラティフィムリウム（ＳＡＬ
ＭＯＮＥＬＬＡ　ＴＹＰＨＩＭＵＲＩＵＭ）族ＬＴ２を
選び緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）中で３７℃で振盪して細
菌数が１ｍｌ当り約１０９　個になる密度まで培養した
。培養液は、ＢＰＷで種々の菌体密度（生存数で決定）
に希釈し、そしてＰＢＳ中０．５Ｍエチレンジアミンテ
トラ酢酸（ＥＤＴＡ）０．１容量と混合した。各混合液
より１ｍｌずつ１００℃で１０分間熱した。ＥＤＴＡ−
熱処理により、細胞ＬＰＳが分離して非沈澱型になる。 この冷却した混合物をただちに酵素免疫測定の抗原源と
して使用した。

【００７３】ＬＰＳは、固定化したポリミキシンの表面
に吸着する。抗−ＬＰＳ抗体は、次に抗原と結合させる
のに用いた。

【００７４】ＣＳＡ−１抗体を測定用に選んだ。この特
定の抗体は、加熱殺菌したサルモネラ菌種細胞に対して
産出させた。

【００７５】このＣＳＡ−１抗体は、全ての知られてい
るサルモネラセロタイプと反応し、アフィニティ（親和
性）精製品として得られた。このポリクローンＣＳＡは
、ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ　ＡＮＤ　ＰＥＲＲＹ　ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＩＥＳ　ＩＮＣ（カーケガードアンドペリ
ー研究所）よりカタログＮｏ．０１−９１−９９で求め
られた。このＣＳＡ−１抗体は、酵素西洋ワサビパーオ
キシダーゼと結合体を作ることが出来る。この結合体も
同会社よりカタログＮｏ．０４−９１−９９で求められ
る。他の抗体をサルモネラ菌、もしくは他の細菌を標示
するのに用い得る。それらはモノクローナル抗体でもポ
リクロナール抗体であっても良い。色素発生酵素システ
ムはもちろんのこと、他の指示薬を使っても良い。例え
ば放射同位元素もしくは蛍光指示薬を使っても作用する
。

【００７６】結合体ＣＳＡ−１抗体−西洋ワサビパーオ
キシダーゼは、−２０℃ＰＢＳ１ｍｌ中０．１ｍｇの種
溶液として貯蔵した。使用時、その結合体は、０．０５
％商品名ＴＷＥＥＮ　２０を含んだＰＢＳ（略してＰＢ
ＳＴ）中に１対２０００の割合で希釈された。ポリミキ
シンと抗体を被覆した布は、ＰＢＳ中４℃で使用時まで
保存した。

【００７７】ポリミキシン布は使って酵素免疫測定（Ｃ
ＥＩＡ）する方法は、グラム陰性細菌やそのＬＰＳの検
出するのに強力な方法である。この様なＣＥＩＡ法の一
つは、以前に述べた方法で作られたポリミキシン被覆布
を用いる。各々被覆した布は、ＥＤＴＡ−熱−処理サル
モネラサンプル５０μｌ　と３０分間反応させた後、吸
水パッド、例えば使いすておむつ上に置き、全部で０．
５ｍｌのＰＳＴＳを滴下して５回洗浄した。その布は、
５０μｌ　のＣＳＡ−１抗体−西洋ワサビパーオキシダ
ーゼ結合体中で３０分間反応させ、上述の様にして洗っ
た。パーオキシダーゼは、各布片を０．８ｍｌの３，３
′，５，５′テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）パーオキ
シダーゼマイクロウェル基質システム中で６０分間振動
させて測定した。反応は０．２ｍｌの０．５Ｍリジウム
フルオライドを加えることにより停止した。吸光度は３
７０ｎｍ（Å３７０）で測定した。

【００７８】ポリミキシン吸着を用いる布酵素免疫測定
法（ＣＥＩＡ）は、又ドットブロット測定法としても行
える。この様な測定は、次の様に行える。ポリミキシン
布を４ｃｍ四方のシートに切り、各シートをＰＢＳ１ｍ
ｌ中ポリミキシンＢサルフェート５ｍｇの溶液２ｍｌで
被覆した後、前述した様にして３０ｍｌのＰＢＳＴで洗
浄した。１５μｌ　のＥＤＴＡ−熱処理したサルモネラ
菌サンプルは、布上に１ｃｍおきにピペットした。３０
分後、布は粗多孔フィルター上で吸引しながら洗浄し、
２ｍｌのＣＳＡ−１抗体−パーオキシダーゼ結合体（ペ
トリ皿中で）中で３０分間反応させ、ＰＢＳＴで以前に
述べた方法で洗浄した。パーオキシダーゼは、その布を
２ｍｌのＴＭＢメンブレンパーオキシダーゼ気質システ
ム中で、６０分間浸して検出した。布は、水で洗浄し、
結合したパーオキシダーゼ活性の特長である青い斑点（
白色に対して現われる）を検定した。これらのシートは
、室温で永久記録として保存出来る。

【００７９】ポリミキシンＢは、上記に代わるものとし
て、マイクロタイタープレートに被覆（コート）しても
よい。このプレートは、細菌ＬＰＳの酵素免疫測定に用
いることが出来る。その一つの方法として、ＰＢＳ中に
溶かしたポリミキシンＢサルフェート１ｍｌ当り５ｍｇ
の溶液２００μｌ　ずつを９６ウェルマイクロタイター
プレート（ＢＩＯ−ＲＡＤ　　ＬＡＢ、Ｎｏ．２２４−
００９６）の各ウェルに入れ、１６時間室温で反応させ
ポリミキシンをコートする。その後、ＰＢＳＴで８回洗
浄した。酵素免疫測定のため、各ウェルを５０μｌ　の
、ＬＰＳサンプルで３０分間室温で反応させた。各ウェ
ルは、上述の如くＰＢＳＴで洗い、その後５０μｌ　の
ＣＳＡ−１抗体−パーオキシデーズ結合体と３０分間室
温で反応させ、再びＰＢＳＴで洗浄した。パーオキシダ
ーゼは、それから各ウェル０．３ｍｌのＴＭＢパーオキ
シダーゼマイクロウェル基質システムと３０分間室温で
反応させた。次に、基質液を取り出して０．７ｍｌの０
．５Ｍ・ＮａＦ中に希釈してÅ３７０の吸光度を測定し
た。

【００８０】

【発明の効果】本発明の不可欠な構成要素により生まれ
た特有の効果を、好ましい具体化へ導く実施例を通して
詳述する。

【００８１】実施例Ａ ポリミキシンを布にコートするための最高濃度を測定し
た。布片を６ｍｍ平方に切り、これらを５０μｌ　の種
々の濃度のポリミキシンＢと１６時間反応させた。これ
らの布は、更に３０分間５×１０６　個のＥＤＴＡ−熱
処理したサルモネラ菌に対して１断片の布と反応させた
。（ＥＤＴＡは、エチレンジアミンテトラ酢酸の略）細
菌細胞の全く入っていないコントロール（標準サンプル
）を準備し、前者のサンプルと比較した。捕獲された抗
原は、抗体−パーオキシダーゼ結合体で検定した。

【００８２】結果は、図１に示した。図１によると、最
大ＣＥＩＡ値は布がポリミキシンＢ４〜６ｍｇ／ｍｌの
濃度でコートしたときであった。（ＣＥＩＡは、布酵素
免疫測定法の略）。従って、以降の実験はポリミキシン
をコートする場合の濃度５ｍｇ／ｍｌを用いた。コント
ロールは、テストした全てのポリミキシンＢ濃度にわた
って常に低い背景値を示した。ＥＤＴＡ−熱処理により
放出されたＬＰＳ抗原は、コートしていない布（ポリミ
キシンＢなし）にかなり吸着するが、多分それはＬＰＳ
の疎水性脂肪Ａ部分によると思われる。しかし、ＬＰＳ
がポリミキシン−コートした布に結合するのは、主に、
ＬＰＳ抗原と吸着したポリミキシン間の相互作用による
。それに対比して、普通の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用
のコートしたプレートを調製するには、何時間も要する
。非孔性の固体相上に捕獲された抗体が最大量吸着する
には、少くとも１６時間必要とする。この様な非孔性固
体相にマイクロタイタープレートも含まれる。ポリミキ
シンＢは、抗体よりずっと小さく、それが大きな表面の
粗多孔吸着物、例えばポリエステル布には、比較的早く
吸着する。

【００８３】実施例Ｂ ポリミキシンが、１ｍｌ当り５ｍｇのときの吸着のカイ
ネティクス（動力学）を、サルモネラ抗原のＣＥＩＡに
より室温で上述の如く行い検討した。結果を、図２に示
した。図２によると、ポリミキシンの吸着は迅速で、２
時間もあればＥＩＡに適したコートした布を作れること
を示した。２時間以降のＥＩＡ値は、ほんの少ししか増
加しないことが判明した。以後の実験では、６時間ポリ
ミキシンＢをコートする方法を用いた。もっと高いポリ
ミキシン濃度、もしくは高い温度ではコートした布は、
むしろ時間を短くして調製することが出来た。

【００８４】実施例Ｃ ポリミキシン布に、サルモネラＬＰＳ抗原が吸着するカ
イネティクスは、詳述した様に抗体−パーオキシダーゼ
結合体で抗原を検定することにより検討した。結果は、
図３に示した。図３によると、抗原捕獲がほぼ完結する
には２０〜３０分必要であるが、それよりずっと短時間
の５〜１０分でも充分ＥＩＡで測定可能な値に達するこ
とが判った。

【００８５】実施例Ｄ ポリミキシンＢ−布を用いたＥＩＡの感度と、抗体布を
用いたＥＩＡのそれとを比較した。ポリミキシン布は、
ポリミキシンＢか、抗サルモネラ抗体（ＣＳＡ−１）か
のどちらかでコート（被覆）された。コートされた布は
、種々の濃度のＥＤＴＡ−熱処理されたサルモネラ菌と
反応させ、捕獲された抗原は上記の如く抗体−パーオキ
シダーゼ結合体で検定した。

【００８６】結果は、図４に示した。図４によると、抗
体−ＥＩＡの方がポリミキシン布を使ってのＥＩＡより
も約１０倍高い感度を示した。検定の限度は、抗体−布
−断片当り５×１０４　個の菌で、ポリミキシン−布−
断片当り５×１０５　個の菌であった。この差はＬＰＳ
抗原のポリミキシンへの親和力がＣＳＡ−１抗体よりも
低いことによると考えられる。そのＣＳＡ−１抗体調製
品は、ＬＰＳ特異の抗体を含んでいるのみならず、又、
他の熱安定サルモネラ抗原を認識する抗体を含んでいる
。 これが一部サルモネラ菌に対する抗体−ＣＥＩＡがより
高い感度を示すのに影響していると思われる。

【００８７】実施例Ｅ サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＰＳを希酸加水分解して、
ＬＰＳの脂肪Ａ部分がはたしてポリミキシンＢ−布への
吸着に関与しているかどうか吟味した。この酸加水分解
は、脂肪Ａ部分を除去することが知られている。Ｈａｎ
ｃｏｋ（ハンコック）とＰａｘｔｏｎ（パクストン）が
（１９８８）Ｂａｉｔｅｒｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｒｆ
ａｃｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　ｉｎ　Ｍｏｄｅｒｎ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，
　Ｊｏｈｎ　ＷａｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，　Ｎ．Ｙ．に
報告している。

【００８８】脂肪Ａ部分の除去は、抗原がポリミキシン
−ＥＩＡで吸収値を出す能力を完全に失わせた。抗原の
濃度がもっと高い場合（７１０μｇ　／ｍｇ）でも同様
であったが、一方同じ調製品では抗体−ＥＩＡの元々の
活性の約８０％を示した。

【００８９】実施例Ｆ 脂肪Ａ部分が、ポリミキシンに結合する様子であるが、
他の物質で疎水性基を持っているものが、抗原サンプル
中に存在しているときにＬＰＳ−ポリミキシン相互作用
を阻害する可能性がある。従って、デオキシコーレート
とカプリレートがサルモネラＬＰＳのポリミキシン−Ｅ
ＩＡに与える影響を検討した。これら２つの薬品は、モ
デル疎水性物質である。

【００９０】結果は、表１に図表した。表１によれば、
これらの物質はそのＥＩＡシグナルにほとんど変化を起
こさなかったことを示している。このことは、脂肪Ａの
ポリミキシンに結合するのは非特異性疎水相互作用でな
いことを指示している。

【００９１】

【表１】

【００９２】細菌たとえばサルモネラの検出には、他の
グラム陰性細菌のＬＰＳの存在によって混同が起り得る
。この様な汚染物も又、ＣＥＩＡのポリミキシンと結合
し得る。この様な場合には、結果的にサルモネラＬＰＳ
が、より少量にポリミキシン布に結合する可能性がある
。間誤った反対のテストの結果も起り得る。この様な場
合にはポリミキシンＢ布のＬＰＳ結合許容量が目的種の
、例えばサルモネラ菌に対して非常に高くあるべきであ
る。それとも目的細菌ＬＰＳ濃度が有効検査のためには
充分高いことが必要である。

【００９３】実施例Ｇ 最適ＬＰＳ濃度を研究するために、種々のＬＰＳ濃度で
ポリミキシン布に吸着したサルモネラＬＰＳの量を検定
する実験を行った。結果は、表ＩＩに示した。表ＩＩに
よると、ＬＰＳの濃度が上るに従って、ＬＰＳの吸着率
が時間毎に上昇した。１ｍｌ当り１００ｍｇでは、ポリ
ミキシンＢ−布は、６ｍｍ平方断片当り４μｇ　のＬＰ
Ｓを吸着した。ポリミキシンＢ−布が高いＬＰＳ吸着容
量を示したので、他の細菌からのＬＰＳ存在下でもサル
モネラ菌ＬＰＳを検出することは可能のはずである。表
ＩＩには、正に大腸菌のＬＰＳがサルモネラ菌ＬＰＳの
１０倍量存在下でもポリミキシン−ＥＩＡがほんの最少
限のＥＩＡシグナルを失っただけで、充分検出出来るこ
とを示している。

【００９４】

【表２】

【００９５】上記の吸着したＬＰＳは、ポリミキシン布
片６ｍｍ平方当りに一時間反応させた結果結合したＬＰ
Ｓを、マイクログラム（μｇ　）単位で表したものであ
る。

【００９６】結果によると、ポリミキシン布はグラム陰
性細菌ＬＰＳの測定に用いられる良好な吸着体であるこ
とを示している。このシステムは、培養液中もしくは培
養プレート上の細菌確認に通常よく遭遇する程度の量の
抗原の定量と定質測定法として役立つことが出来る。Ｅ
ＩＡで抗体を使うのに比べて、当該方法は簡単で、迅速
のみでなく経済的で再現性があるといえる。

【００９７】実施例Ｈ 細菌サンプルを特別な処理を行うと、ポリミキシン布酵
素免疫測定の感度をコートした布免疫測定で経験したレ
ベルまでかなりの程度上げることが出来る。ポリミキシ
ン布酵素免疫測定（ＥＩＡ）の感度を改良するため、い
ろいろの洗剤をＥＤＴＡの代りに試みてみた。ＢＰＷ中
のＳ．ティフィムリウム懸濁液と種々の洗剤の中から選
ん一つをいろいろ異なった濃度にＰＢＳ中に溶解したも
のとを混合した。

【００９８】テストした洗剤は、リジウムデオキシコー
レート、リジウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）、商
品名ＴＷＥＥＮ　８０と商品名　ＴＲＩＴＯＮ　Ｘシリ
ーズの中からいろいろの一つを取り出し（Ｘ−１５、Ｘ
−４５、Ｘ−１００、Ｘ−１６５、そしてＸ−７０５）
たものであった。それら洗剤サンプル混合液は、１００
℃で１０分間熱したものをポリミキシン布ＥＩＡ用の抗
原種液として用いられた。結果は、図５に示した。図５
によると、０．１％のデオキシコーレートが多くの洗剤
をテストした中で、一番高いＥＩＡシグナルを作った。 商品名　ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００は、同じ最大濃度で
はややそれより低いシグナルを示し、他の　ＴＲＩＴＯ
Ｎ　Ｘシリーズのどのメンバーをテストしたどの濃度に
おいても、ＴＷＥＥＮ　８０が行った様なシグナルの上
昇は見られなかった。ＳＤＳは、サンプル中０．０１％
（Ｗ／Ｖ）の濃度でほんの少し上昇したものを示した。

【００９９】デオキシコーレート処理の影響を、以前の
ＥＤＴＡ処理のそれとを比較するために、Ｓ．ティフィ
ムリウム菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ）菌をＢＰＷに懸濁させ、いろいろのデオキシコ
ーレート、ＥＤＴＡと熱の組み合わせて処理した。その
サンプル混合液は、更に抗原捕獲にポリミキシン布か抗
体布のどちらかを用いたＥＩＡで検定した。

【０１００】結果は、表ＩＩＩ　に表した。表ＩＩＩ　
によると、サルモネラ菌をＥＤＴＡ含有もしくは含有し
ないデオキシコーレート存在下では、ポリミキシンＢと
抗体−布両方の場合において、最高のＥＩＡシグナル（
Å３７０吸光値）を示した。デオキシコーレートと熱を
組み合わせた処理は、ポリミキシン布ＥＩＡシグナルが
未処理のサンプルに比べて約１０倍の上昇を示した。Ｅ
ＤＴＡの存在下熱処理したものだけが最大のシグナルを
抗体−布の場合は示したが、ポリミキシン布ではこのシ
グナルの３０％以下しか示さなかった。サンプルの熱処
理は、ＥＤＴＡとデオキシコーレート処理のＥＩＡシグ
ナルを最大に高めるのに必要であった。

【０１０１】しかしながら、熱処理なしでデオキシコー
レート処理を行った場合、ポリミキシン布では未処理に
比べて約５倍のシグナル上昇を示した。ネガティブコン
トロール（抗原なしのコントロール）は、ポリミキシン
Ｂと抗体−布の全ての処理にわたって注意に値しないシ
グナル（Å３７０＜０．０５）しか示さなかった。使用
したサルモネラ菌のサンプルは、全てＢＰＷ中で１ｍｌ
当り５×１０６　個の菌の濃度であった。これらのサン
プルはデオキシコーレート（０．１％）、ＥＤＴＡ（５
０ｍｍ）と熱（１００℃、１０分間）のいろいろの組み
合わせで処理され、その後上述した如く、ポリミキシン
−又は抗体−布を用いたＥＩＡで測定した。

【０１０２】

【表３】

【０１０３】ポリミキシン布は、グラム陰性細菌のＬＰ
Ｓに対して特異的であるので、テストサンプル中に非サ
ルモネラ菌ＬＰＳが存在すると、サルモネラＬＰＳの捕
獲に阻害影響を与えると思われる。

【０１０４】実施例Ｉ ポリエステル布が、その大きな表面に充分のポリミキシ
ンを吸着することにより、非特異性ＬＰＳ存在下のＥＩ
Ａでも充分のサルモネラＬＰＳが捕獲出来ることが望ま
しい。このことは、次の様にして確認された。Ｓ．ティ
フィムリウムＬＰＳの溶液は、大腸菌ＬＰＳ溶液と混合
され、その後者がサンプル中に１０倍から１００倍過剰
に存在する様にした。そのＬＰＳサンプルは、更にデオ
キシコーレート熱処理を行い、ポリミキシン−布でＥＩ
Ａ測定した。使用した酵素は、サルモネラ菌種に対して
特異性をもったものである。

【０１０５】結果は、表ＩＶにまとめた。表ＩＶによる
と、ポリミキシンＢ−布ＥＩＡシグナルは、大腸菌ＬＰ
Ｓの入っていないサルモネラＬＰＳで得られるＥＩＡシ
グナルと比較して、サルモネラＬＰＳを大腸菌ＬＰＳが
その１００倍過剰の存在下で測定した場合、約２３％低
下した。そして、１０倍大腸菌過剰存在下では、約１７
％低下した。サルモネラ菌抗原なしで大腸菌ＬＰＳを測
定すると、ほんの少し背景値（バックグラウンド）より
も高いＥＩＡシグナルがあったがこれは多分結合体中に
少々相互反応性抗体が存在しているためと思われる。従
って、デオキシコーレート−熱処理を用いるポリミキシ
ンＢ−布ＥＩＡは、大腸菌ＬＰＳが過剰に存在する条件
下でほんの少しそのＥＩＡシグナルが低下するだけで、
サルモネラＬＰＳを検出することが出来た。

【０１０６】

【表４】

【０１０７】実施例Ｊ マイクロタイタープレートシステムを、ＬＰＳ抗原のＥ
ＩＡに用いるためにポリミキシンＢの固定化をテストし
た。しかしながら、マイクロタイタープレートのウェル
は、粗多孔性ポリエステル布に比較してほんの限定した
表面しかポリミキシンを吸着する場所がないのでサンプ
ル中に大腸菌ＬＰＳが存在する場合は、サルモネラＬＰ
Ｓを捕獲するのにずっと多大の阻害が起ることが予想さ
れた。結果は、上記表ＩＶに示した。表ＩＶによると、
ポリミキシンコート（被覆）したマイクロタイタープレ
ートで、サルモネラＬＰＳを測定した場合、そのＥＩＡ
シグナルは大腸菌ＬＰＳが１００倍過剰に存在する場合
、約７２％低下し、１０倍過剰の大腸菌存在下では約２
７％低下を記録した。この様に、サンプル中に過剰に大
腸菌ＬＰＳが存在する場合は、ポリミキシン−コートし
たマイクロタイタープレートは、ポリミキシン布に比べ
てサルモネラＬＰＳのＥＩＡはもっと深刻な阻害を受け
た。

【０１０８】実施例Ｋ 酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いて、ポリミキシンＢ布
とポリミキシンコートしたマイクロタイタープレートの
デオキシコーレート−熱処理したサルモネラＬＰＳ抗原
捕獲の動力学（カイネティックス）の比較を行った。Ｂ
ＰＷ中のＳ．ティフィムリウム菌体懸濁液にデオキシコ
ーレート−熱処理を行い、その後ポリミキシン−布もし
くはポリミキシン−コートしたマイクロタイタープレー
トのウェル（穴）といろいろの長さの時間で反応させた
。吸着した抗原は、ＥＩＡで測定した。酵素活性測定に
は、それら布片を、それぞれ空のマイクロタイタープレ
ートのウェルに入れ、そして表ＩＶに示している如くＴ
ＷＢを加えた。

【０１０９】結果は、図６に表した。図６によると、抗
原と反応後、約２．５分以内にポリミキシン布ＥＩＡは
注目に値する酵素反応シグナル（Å３７０＞０．２）を
示したが、一方ポリミキシン−プレートＥＩＡでは、顕
著なシグナルが現れるまで少くとも１０分間を要した。 図６は、又ポリミキシンコートなしでは布にしてもプレ
ートにしても、顕著なＥＩＡシグナルを示さなかったこ
とを報告している。

【０１１０】実施例Ｌ ポリミキシン布ＥＩＡの感度は、サルモネラ菌サンプル
をデオキシコーレートもしくはＥＤＴＡ存在中で熱処理
したものを用いて検定された。いろいろの菌体密度のＢ
ＰＷ中のＳ．ティフィムリウム懸濁液は、デオキシコー
レートもしくはＥＤＴＡ−ＰＢＳと混合した後、熱処理
をし上述したようにポリミキシンＢ布ＥＩＡ測定に用い
た。比較のため、ＥＤＴＡ存在下でサンプルを熱処理し
たものも又、抗体布で測定した。結果は、図７に示した
。図７によると、ポリミキシンＢ布ＥＩＡの検定限度は
、ＥＤＴＡ−熱処理を用いたサルモネラ菌数１ｍｌ当り
１０７　のレベルであったことを示している。ポリミキ
シンＢ布ＥＩＡの感度は、デオキシコーレート−熱処理
したサンプル用いて５×１０５　から５×１０６　でＥ
ＤＴＡ熱処理を用いた抗体布ＥＩＡのそれに近いもので
あった。

【０１１１】実施例Ｍ 当発明の方法は、種々の含品サンプル中のグラム陰性食
中毒性細菌の検出に応用した。ＥＩＡ方法は、抗原を捕
獲するのに抗サルモネラ抗体−コートした固体相（例え
ばポリスチレン製マイクロタイタープレート）を用いて
固体相測定の形をとることが出来る。そして、プレート
上に捕獲された抗原の検出には抗サルモネラ抗体−酵素
結合体を用いる。これに代るものとして、免疫メンブレ
ンフィルター法を用いても良い。その方法は少量の前増
菌培養液をメンブレンフィルター（例えばニトロセルロ
ース、もしくはポリスルフォンフィルター）を通して吸
引濾過し、さらにそのフィルターを選択寒天培地プレー
トの表面にのせてコロニーを形成させた。コロニーは、
更に又抗サルモネラ抗体−酵素結合体と反応させて検定
した。ここに述べた方法は、全く定性的結果のみ得られ
る。というのは、元のサンプル中のサルモネラ菌を前増
菌培養することに関係しているからである。サルモネラ
菌汚染の程度に関する情報は、特にその製品の広範なサ
ルモネラ汚染に悩まされている鶏肉業者にとって、その
細菌の蔓延をコントロールするのに有用である。

【０１１２】本発明のドットブロット測定過程と簡単な
増菌培養方法とを組み合わせると、サルモネラ菌類を２
４時間以内に検出することが出来る。ある状態下では、
この方法は食品サンプル１ｇ当り少くとも１〜１０個の
Ｓ．ティフィムリウム菌が接種していても検出すること
が出来る。カンピロバクター菌種も又、この発明の方法
を用いて検出されたし、又、他のグラム陰性病原菌も検
出されうるはずである。後者の細菌の場合は、もちろん
サルモネラ菌種を検出するのに使った抗体とは異るはず
である。本発明のドットブロット測定法は、種々の食品
類、例えば検定されるチーズ、チョコレート、鶏肉、牛
肉中のＳ．ティフィムリウムの接種の高低の程度は判別
出来うる。

【０１１３】実施例Ｎ ポリミキシンＢ−ＥＩＡは、食品懸濁液や増菌培養液の
ように、多種のサンプル類中ＬＰＳ抗原の検出に有効で
敏感な測定方法である。この実験では、食品サンプルは
まず増菌培地中で均一化（ホモジネ−ト）し、増菌培地
で段階的に希釈した後、菌体の成長を計り培養する。必
要な場合には、養分強化肉汁中で短時間成長させた後、
選択培養肉汁を加えることも出来る。その培養液は、そ
れからデオキシコーレートと伴に熱した後、サルモネラ
抗原の存在性を、例えば複数のサンプルを取り扱える様
なポリミキシンコートしたポリエステル布の大きなシー
トなど、適当な担体を用いたドットブロットＥＩＡによ
り検出される。この様な方法を用いて、増菌培養段階の
後、サルモネラ菌が検出出来ない最小限希釈法に基づい
て食品サンプル中の違った汚染の程度をそれぞれ判別出
来うるはずである。

【０１１４】実施例Ｏ 多種の食品をサルモネラ菌で接種し、当発明の測定の対
称としてみた。検出に用いた食品サンプルは、新鮮な胸
部鶏肉、牛赤肉、熟成チェダーチーズ、甘味を加えてい
ない製パン用固型チョコレート、均質化した牛乳、マヨ
ネーズと小麦粉である。鶏肉と牛肉は、食品加工機（フ
ッドプロセサー、ハイスピード発動１０秒、５回）用い
て練り込みペースト状にした後、サルモネラ菌を接種し
た。

【０１１５】チーズや製パン用固形チョコレートの様な
乾燥固型食品は、１ｇサンプル当り２ｍｌの養分強化肉
汁中で（ハイスピード発動１０秒、１０回）混合した。 粉末、液状そして半固型食品サンプル類は、混合を行わ
ず直接そのまま用いた。サルモネラ、ティフィムリウム
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株
ＬＴ２を、この試験目的に用いた。細菌は、斜面寒天培
地上で４℃で保存した。 使用前に菌は、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）中で培養した
後、希釈をＢＰＷで行って種々の菌体濃度液を作り、直
ちにそれらを食品サンプルに接種した。０．５％（ｗ／
ｖ）酵母菌抽出物で養分強化されたＢＰＷ（ＢＰＷＹＥ
）は、食品サンプル中のサルモネラ菌を培養するための
増菌培地として用いた。

【０１１６】１ｇの食品サンプルは、種々の数のサルモ
ネラ菌を含んでいるＢＰＷ１ｍｌで接種された。ＢＰＷ
ＹＥを加えて、このサンプルを最終量１０ｍｌとし、そ
の混合物をミキシングして完全に均質化を計った。その
均質サンプルは、更に段階的に０．５ｍｌずつを４．５
ｍｌのＢＰＷＹＥの入っている培養試験管（２．５×１
５ｃｍ）に移入することにより段階的に１０倍ずつ希釈
されたものを得た。試験管は、それから３７℃で約２０
時間振盪培養した後、ドットブロットポリミキシン−Ｃ
ＥＩＡによりサルモネラ菌の存在を検定した。

【０１１７】実施例Ｐ ドットブロットポリミキシンＢ布酵素免疫測定法は、色
々の食品中の細菌の存否を検定するのに用いた。ポリミ
キシン−布は、次の様にして用意された。ポリエステル
布（ＳＯＮＴＡＲＡ　８１００）を４×６ｃｍのシート
に切り、３ｍｌのポリミキシンＢサルフェート（ＰＢＳ
中５ｍｇ／ｍｌ）溶液で浸し、１６時間室温で培養した
。各シートは、１０ｍｌのＰＢＳＴで、６回フィルター
上で吸引下洗浄した。比較のためドットブロットＥＩＡ
を上述の如くポリミキシンでコートしたニトロセルロー
ス（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｅｈｖｅｌｌ，
　Ｎｏ．３３１７２）４×６ｃｍシート上でも行った。

【０１１８】増菌培養液１ｍｌずつを０．１ｍｌの１．
１％（ｗ／ｖ）デオキシコーレートと混合した後、１０
０℃で１０分間熱した。１０μｌ　のデオキシコーレー
ト−熱処理されたサンプルをポリミキシンコートした布
もしくはポリミキシンニトロセルロースシート上に１ｃ
ｍおきに分注し、これにより６×４ｃｍシート各々が１
ｃｍ間隔で全部で２４の整列したサンプルを収めた。シ
ートはそれから３０分間室温で反応させ、上述の如くＰ
ＢＳＴで洗った。シート上に捕獲されたサルモネラＬＰ
Ｓ抗原は、各シートを１ｍｌのＣＳＡ−１抗体パーオキ
シダーゼ結合体中に浸して３０分間室温で反応させるこ
とにより検出した。シートは、ＰＢＳＴで洗い、ブロッ
トした後、結合した酵素は各シートを１．５ｍｌのＴＭ
Ｂメンブレンパーオキシダーゼ基質システム中で１０分
間反応、（それはパーオキシダーゼと反応することによ
り不溶性の色素を形成する）により検定した。サルモネ
ラＬＰＳが結合した布もしくはメンブレンの部分は、白
地の上に明確な青斑点を形成した。

【０１１９】この様に上述した如く、当特許の過程は、
チーズの様な食品を機械的に混和した後でも作用出来る
。この様な混和の方法は、固型食品の固体内に捕われて
いる細菌体を放出するにも用いられる。培養肉汁と混和
し希釈することは、当発明の測定で検定するサンプルの
取り扱いを容易にする。サンプルも最適成育温度で培養
され得る。温和な洗剤を余分に加えることにより、脂肪
性もしくはろう状の食品物を溶かし、細菌体を放出する
作用をする。

【０１２０】サンプルは、更に選択性増菌培養肉汁で培
養する次の段階に用いても良い。この余分の段階は、比
較的多数の競争相手の細菌、例えば他の腸内細菌類がサ
ンプル中にある場合に使われる。例えばサルモネラ菌類
は、セレナイトシスティンもしくはテトラチオネート肉
汁で選択可能である。これらの培養液は、サルモネラ菌
が他の細菌類を凌駕して成長するのを促す。

【０１２１】実施例Ｑ ニトロセルロースメンブレンは、ドットブロット測定を
行うのに最も一般に使われている固体相である。従って
、ポリエステル布の性能は、ニトロセルロースメンブレ
ンのそれとドットブロットポリミキシン−ＥＩＡにおい
て比較してみた。サルモネラ菌をＢＰＷＹＥ中に、いろ
いろの菌体濃度に懸濁させたものをデオキシコーレート
で処理した後、１０μｌ　のサンプルを、ポリミキシン
を事前にコート又は、しない布もしくはメンブレン上に
ブロットした。各シート上に捕獲されたサルモネラ抗原
は、ＣＳＡ−１パーオキシダーゼ結合体を用いた後パー
オキシダーゼＴＭＢ基質で発展させて検出した。

【０１２２】結果は、表Ｖに表示した。表Ｖによると、
ポリミキシンでコートしたポリエステル布によるとサル
モネラ菌が懸濁液中に少くとも１０６　個１ｍｌ当り入
っているのを検出出来るが、一方全然コートしていない
布では１ｍｌ当り１０７　から１０９　個の間の菌がな
いと検出出来なかった。この感度の違いを見ても、デオ
キシコーレート−熱処理したＬＰＳ抗原の捕獲には、ポ
リミキシンをコートした布の方がより有用であることを
証明した。 ポリミキシン布上の抗体捕獲は、小さくて強く、輪かく
のはっきりした色の斑点を示したのに対し、コートして
いない布の場合は、より大きくてぼやけた斑点を示した
。これはポリミキシンがデオキシコーレート熱処理ＬＰ
Ｓ抗原にしっかり結合していることを示している。コー
トしていないニトロセルロースメンブレンは、菌が１ｍ
ｌ当り１０８　個あってほんのうっすらとした色素反応
しか示さなかった。ポリミキシンコートしたニトロセル
ロースは、１ｍｌ当り１０８　個の菌数を検出し得たが
、１ｍｌ当り１０７　個の菌数では弱い色素反応を示し
たのみであった。

【０１２３】従って、ポリミキシン布を、以後の食品サ
ンプルから増菌培養した培養液中のサルモネラ菌のドッ
トブロット測定の実験に使った。ドットブロットポリミ
キシン−ＥＩＡの感度は、サルモネラＬＰＳ抗原が、そ
れが食品サンプルより来ている非サルモネラグラム陰性
細菌の存在下でも、有効に検出されるために必要である
。

【０１２４】

【表５】

【０１２５】実施例Ｒ 食品工業側は、食品が食中毒細菌で汚染される問題を真
剣に考えている。特にサルモネラ菌類に対してはそうで
ある。迅速にテストする方法があれば、大変有用である
。現在、最も早いサルモネラ菌検出法でも少くとも４８
時間はかかる。

【０１２６】本発明は、この様なテストがほんの２４時
間で行えるものを提供することを目的としている。増菌
培養とドットブロットポリミキシン−ＣＥＩＡの組み合
わせを吟味した。酵母抽出物とＢＰＷ（ＢＰＷＹＥ）を
増菌培養液として用いた。その理由は、Ｓ．ティフィム
リウムは同じ環境下でＢＰＷのみで培養されるよりもＢ
ＰＷＹＥで３７℃で培養する方がずっと短い誘導期（Ｌ
ａｇｐｅｒｉｏｄ）を示すことが観察されたからである
。１ｇ当量の食品サンプルは、種々の菌数のＳ．ティフ
ィムリウムで接種され、ＢＰＷＹＥ中で約２０時間３７
℃で振盪した。その培養液は、更にデオキシコーレート
で処理され、そしてドットブロットポリミキシンＥＩＡ
によりサルモネラＬＰＳ抗原の測定をした。

【０１２７】結果は、表ＶＩ（以下）に表示した。表Ｖ
Ｉによると、これらの培養液（希釈していない）では少
くとも１０個のサルモネラ菌が、元のそれぞれの食品サ
ンプルに接種されていたことが検出された。そして、少
くとも１個の菌は、環境周辺どこでもテストすると検出
され得ることを示した。チョコレートサンプルからの、
増菌培養液を測定する場合は、その培養液をドットブロ
ット測定をする前にＰＢＳで１：１０に希釈することが
必要である。それを行わない場合は、接種した培養液で
も時々ドットブロット測定の結果が否定的なことが起っ
た。 多分チョコレートサンプル中の脂肪部分が測定を阻害し
たと思われる。他のテストした食品サンプルには、この
様な希釈は必要なかった。この増菌培養−ドットブロッ
トポリミキシン−ＥＩＡの組み合わせた方法は、食品サ
ンプル中のサルモネラの迅速な（２４時間以内）定性検
査に有用である。

【０１２８】

【表６】

【０１２９】実施例Ｓ ある場合には、ある種の食品（例えば鶏肉製品）中のサ
ルモネラ菌汚染の程度を査定することが望ましいことが
あり、このような場合には、むしろ定性的方法よりも定
量もしくは準定量する方法が必要になってくる。現在こ
れを成しうる簡単で迅速な方法は無い。もし違ったレベ
ルのサルモネラ菌を含んでいるサンプルを、段階的に希
釈していけば、終りには菌を含まぬある希釈に達するは
ずである。つまり、シリーズの希釈に対する菌の分配は
、ポアッリン分配則に従うべきだからである。ポアッリ
ン分配率によると、ある特定の希釈で一個の菌を受け取
れない確率（ＰＯ　）　は、サンプル中に存在する菌の
平均数（ｍ）が下るに従って上昇する。つまり、次の式
による：ＰＯ　＝ｅ−ｍ従って、段階的に希釈して、一
個の菌も受け取らぬ最小希釈度に基づけば、食品サンプ
ル中の違ったレベルの汚染も区別することが可能である
。それぞれ違った数のサルモネラ菌で接種された食品サ
ンプルは、次にＢＰＷＹＥ中に懸濁させそしてＢＰＷＹ
Ｅ中に段階的に希釈していき、その後約２０時間３７℃
で振盪した。その培養液は、ドットブロットポリミキシ
ン−ＣＥＩＡによりサルモネラＬＰＳ抗原の測定を行っ
た。

【０１３０】結果は、表ＶＩ（上記）に示した。表ＶＩ
によると、食品サンプルが高いレベルの接種されたサル
モネラ菌を含んでいると、サルモネラ未染培養液を作り
出すために（例えば最終希釈点）より多くの希釈を必要
とすることを示している。しかしながら、希釈最終点の
断定は、ポアッリン分配率に従っての菌体分配の成否に
依存するために、先のサンプル中の汚染の程度を査定す
る定量方法としてはあまり信頼することは出来ない。と
もあれこの方法は、サンプル中のサルモネラ汚染のレベ
ルが１００倍異る区別立てをはっきりと可能にしたので
、従って準定量方法として適していると思われる。希釈
最終点の断定の、より統計的な信頼が望まれる場合は、
元の懸濁サンプルの段階的希釈をくり返し行い、それを
測定することにより成就される。

【０１３１】実施例Ｔ 食品サンプルを混合均質化するのは、しばしばそれらの
食品細胞間質より、細菌を放出するために行われる。こ
の様に、自由になってからは、菌は培養液中で成長する
傾向がある。混合均質化がその菌体に相当の損傷を与え
、そのために当発明の方法によると、それらの測定に多
大の影響を与えかねないので、その影響を測定するため
の実験を行った。簡単に述べればチーズサンプル（１０
ｇ）を１５ｍｌのＢＰＷＹＥ中で食品加工機（ハイスピ
ード発動１０秒間、１６回）を用いて混合した。そして
１ｍｌの違った菌数のＳ．ティフィムリウム菌を含んで
いるＢＰＷＹＥを接種して混合した。食品加工機（ハイ
スピード発動１０秒間、１０回）で混合する前（混合し
ていぬ）と後（混合した）の混合物よりのサンプル（２
ｍｌ）を、ＢＰＷＹＥで１０ｍｌに調節し、それから段
階的にＢＰＷＹＥで希釈した後、培養した。その培養液
は、上述の如くドットブロットポリミキシン−ＥＩＡに
より測定した。結果は、表ＶＩＩ　に表した。

【０１３２】

【表７】

【０１３３】これらの実験に用いられた増菌培地（ＢＰ
ＷＹＥ）は、テストした種々の食品サンプル中のＳ．テ
ィフィムリウムの培養に大変満足に値する結果をもたら
した。鶏肉を例外として、これらのサンプルは、明らか
にこの培養液中で成育出来る様な非サルモネラ菌種は非
常にわずかしか含んでいない：これらの接種されていぬ
食品サンプルは、その開始サンプル懸濁液より１：１０
００以上に希釈すると全く濁りを生成しなかった。しか
しながら、非接種の鶏肉は、テストした元のサンプル懸
濁液からの全ての希釈液が一晩の培養後に濁りを生じた
ということは、多数の非サルモネラ菌汚染があることを
示している。非サルモネラ菌で、食品が相当に汚染され
ている場合は、選択培地によるサルモネラ自然分離培養
のために、例えばセレナイトシスティン肉汁（ＳＣＢ）
とテトロチオネート肉汁（ＴＢ）を使う必要がある。こ
れらの培養液は、通常非強化緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）
や培養肉汁（ＮＢ）の様な非選択性肉汁を用いたサンプ
ルの前、増菌培養した後に用いられる。検査の必要条件
次第で、増菌培養過程は当実験の様に非選択性肉汁のみ
を使って簡易化しても良い。これら増菌培養肉汁全ては
、食品からのサルモネラ菌類の培養に有用であるので、
それらがドットブロットポリミキシン−ＥＩＡによるサ
ルモネラＬＰＳ抗原の測定を阻害するかどうかを査定す
る必要があった。

【０１３４】実施例Ｕ Ｓ．ティフィムリウムＬＰＳは、多種類の増菌培養液中
に溶解し、それは更にデオキシコーレートで処理され、
そしてポリミキシンＢ−コートしたポリエステル布片を
使ったポリミキシン−ＥＩＡで測定した。結果は、表Ｖ
ＩＩＩに表示した。表ＶＩＩＩによると、ポリエステル
布上で測定はこれら全ての培養液中で（ＥＩＡシグナル
により判定した如く）どれも同等に効果的にＬＰＳ抗原
を検出出来ることを示している。この様に、ポリミキシ
ン−ＥＩＡはこれらの又他の増菌培養液中でのサルモネ
ラ菌の検出に適用出来うるであろう。多数のサンプルを
測定しなければならない時は、希釈培養方法で詳述した
様に、ドットブロット方式が定性結果を得るのに適当で
あると思われる。

【０１３５】

【表８】

【０１３６】以降の実施例は、ポリミキシンＢ−コート
した布の作り方を示す。実施例Ｖ ポリミキシンＢは、次の様にして布に被覆し得る。ポリ
エステル不織布、例えば商品名ＳＯＮＴＡＲＡ　８１０
０を６ｍｍ平方の断片に切り、ポリミキシンＢで被覆し
た。布はまず、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で湿らし、次
にブロット（水切り）した。各布片は、ＰＢＳ中に溶か
したポリミキシンＢサルフェート５ｍｇ／ｍｌ溶液５０
μｌ　を６から１６時間反応させ、ＴＷＥＥＮ　２０Ｔ
Ｍを含んだ燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した
。洗浄は、室温で粗多孔性フィルター上で吸引の下で行
われた。

【０１３７】実施例Ｗ ポリエステル布は、４ｃｍ平方のシートに切り、各シー
トはＰＢＳ中ポリミキシンＢサルフェート５ｍｇ／ｍｌ
の溶液２ｍｌで被覆し、それか３０ｍｌのＰＢＳＴで洗
浄した。

【０１３８】実施例Ｘ ポリエステル布（ＤｕＰｏｎｔ社、ＳＯＮＴＡＲＡ　８
１００）を、４×６ｃｍのシートに切り、３ｍｌのポリ
ミキシンＢサルフェート（５ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中）溶
液で湿らせ、１６時間室温で反応させた。各シートは、
フィルター上、吸引で１０ｍｌずつのＰＢＳＴで、全部
で約６回洗浄した。

【０１３９】実施例Ｙ ポリミキシンコートしたポリエステル布の作成。ポリミ
キシンＢサルフェート（Ｎｏ．Ｐ−１００４）、サルモ
ネラティフィムリウムＬＰＳ（Ｎｏ．Ｌ−６５１１）、
そしてＬＰＳ発熱因子を計る商品名Ｅ−ＴＯＸＡＴＥシ
ステム（Ｎｏ．２１０−Ａ）は全てＳＩＧＭＡ　ＣＨＥ
ＭＩＣＡＬ　Ｃｏ．（シグマケミカル社）より手に入れ
た。ここで使われた全てのガラス器具は、２５０℃で２
０時間熱して脱−発熱因子化を行った。発熱因子フリー
の蒸留水は、共通溶媒として用いられた。

【０１４０】ポリエステル布（ＤｕＰｏｎｔ社、ＳＯＮ
ＴＡＲＡ　８１００）を６ｍｍ平方に切り、それらは２
回蒸留水中で烈しく振って湿らせた後、それらをブロッ
トした。１ｇ分の布片（湿布の重さ）を５ｍｌのポリミ
キシンＢ溶液〔１０ｍｇのポリミキシン／ｍｌの０．０
１Ｍ燐酸緩衝（ｐＨ７．２）−０．８５％ＮａＣｌ液（
ＰＢＳ）〕中に入れ、１６時間室温で反応させた。ポリ
ミキシンで被覆された布片は、それからフィルター上で
１００ｍｌのＰＢＳで吸引しながら洗浄した後、ＰＢＳ
中４℃で使用時まで保存した。

【０１４１】ｇ，実用例 技術的方法を、今具体的に詳説することにより、当発明
の優先的具体例を参考にして当発明が再現可能となり得
る。

【０１４２】例１ 布が素材となっている酵素免疫測定布担体は、次の様に
して調製された。ポリエステル不織布（ＳＯＮＴＡＲＡ
　８１００）は、６ｍｍ平方断片に切り、ポリミキシン
もしくは抗体で被覆した。被覆する前に各布はＰＢＳで
湿らせ、ブロットした。ポリミキシンを被覆するには、
各布の断片をＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌのポリミキシンＢサ
ルフェート（ＳＩＧＭＡ　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　Ｃｏ．よ
り得た）溶液５０μｌ　を６から１６時間反応させた後
、粗多孔性フィルター上吸引下で全量５ｍｌのＰＢＳＴ
で５回に分けて洗浄した。全ての反応は、室温で密閉し
たペトリ皿中で行った。抗体を被覆する場合は、各布片
を５０μｌ　のＣＳＡ−１抗体（５０μｇ／ｍｌＰＢＳ
中）中で１６時間室温で反応させ、上述の如く洗浄した
。被覆した布は、ＰＢＳ中４℃で使用時まで保存した。

【０１４３】調製された布は更に例で後述する測定に用
いられる。下記の薬品は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ．より求めた。サルモネラ　　ティフィムリウ
ムＬＰＳ（Ｎｏ．Ｌ−６５１１）、大腸菌セロタイプ０
１２８：Ｂ１２ＬＰＳ（Ｎｏ．Ｌ−２７５５）、ポリミ
キシンＢサルフェート（Ｎｏ．Ｐ−１００４）、リジウ
ムデオキシコーレート（Ｎｏ．Ｄ−６７５０）、ＴＲＩ
ＴＯＮ（トライトン）Ｘ−１００（Ｎｏ．Ｔ−６８７８
）、リジウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（Ｎｏ．
Ｌ−５７５０）、とＴＷＥＥＮ（トウィーン）８０（Ｎ
ｏ．Ｐ−１７５４）。ＴＭＢマイクロウェルパーオキシ
ダーゼ基質システム（Ｎｏ．５０、７６−００）、ポリ
クロナル抗−サルモネラ（ＣＳＡ−１）抗体（Ｎｏ．０
１−９１−９９）とＣＳＡ−１抗体−パーオキシダーゼ
結合体（Ｎｏ．０４−９１−９９）、はＫｉｒｋｅｇａ
ａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　Ｉｎｃ（カーケガードアンドペリーラボラトリーズ
）より入手した。

【０１４４】例２ ポリミキシンＢ−被覆（コート）布を調製し、そして各
コートした布は５０μｇのＥＤＴＡ−熱処理したサルモ
ネラ菌サンプルと３０分間反応させた後、吸収パッド、
例えば使いすておむつ、の上にのせた後、５回滴下しな
がら全量０．５ｍｌのＰＢＳＴで洗浄した。そして布は
、次に５０μｌ　のＣＳＡ−１抗体−西洋ワサビパーオ
キシダーゼ結合体と３０分間反応させた後、上述の如く
洗浄した。パーオキシダーゼは、各布を０．８ｍｌの３
，３′，５，５′テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）パ
ーオキシダーゼマイクロウェル基質システム中で、６０
分間振盪して反応させた。反応は、０．２ｍｌの０．５
ＭＮａＦを加えることにより停止した。結果は、図１に
示した。

【０１４５】例３ ドットブロット測定は、次の様にして行った。ポリエス
テルは、４ｃｍ平方のシートに切り、そして各シートは
２ｍｌのＰＢＳ中のポリミキシンＢサルフェート５ｍｇ
／ｍｌ溶液で被覆し、それから３０ｍｌのＰＢＳＴで前
述の様にして洗浄した。１５μｌ　のＥＤＴＡ−熱処理
したサルモネラサンプルは、その布上に１ｃｍおきに分
注した。３０分間後にその布は、粗多孔性フィルター上
で吸引下で洗浄した後、２ｍｌのＣＳＡ−１抗体−パー
オキシダーゼ結合体とペトリ皿中で３０分間反応、更に
ＰＢＳＴで前述の方法で洗浄した。パーオキシダーゼは
、その布を２ｍｌのメンブレンパーオキシダーゼ基質シ
ステム中で６０分間浸すことにより検出した。布は水洗
し、固定化したパーオキシダーゼ活性の特徴である青い
斑点（白地に現れる）を吟味した。これらのシートは室
温に永久記録として保存出来る。

【０１４６】例４ ポリミキシン布にくっついているＬＰＳは、以前に示し
た様に５０μｌ　の５ｍｇ／ｍｌポリミキシン溶液でポ
リエステル布片（６ｍｍ断布）を被覆することにより検
定できる。そして粗多孔性フィルター上５ｍｌのＰＢＳ
で洗浄した。ポリミキシンＢ−布断片は、更に種々の濃
度でＰＢＳ中に溶解したＳ．ティフィムリウムの溶液１
ｍｌと（１ｍｌ溶液当り１０布断片）６０分間反応させ
た。ＬＰＳ溶液のサンプル（０．４ｍｌ）を取り出し、
次の様にして全糖量の測定をした。各サンプルに０．２
ｍｌの５％（ｗ／ｖ）フェノールを加え、次いで１ｍｌ
の濃硫酸を加えた。 混合液は、１０分間室温で放置、さらに３０℃で２０分
間反応させた。その４９０ｎｍの吸光度を測定し、ポリ
ミキシン布と反応させた前と後の糖質濃度はＬＰＳ溶液
の濃度に対する吸光度より成る標準曲線より計算して求
められた。この例の結果は、表ＩＩの通り。

【０１４７】例５ 被覆するための最適ポリミキシン濃度は、ポリエステル
布片（６ｍｍ平方）を１６時間５０μｌ　のいろいろの
濃度のポリミキシンと反応させて査定した。コートした
布は、（無菌コントロール）０個もしくは、５×１０６
　個のＥＤＴＡ−熱処理サルモネラ菌と３０分間反応さ
せた。捕獲された抗原は、抗体−パーオキシデーズ結合
体を使って検定された。結果は、図１に示した。

【０１４８】例６ サルモネラ菌種の、ポリミキシン−布酵素免疫測定（Ｅ
ＩＡ）に与えるデオキシコーレートやカプリレートの影
響は、次の様にして調べた。Ｓ．ティフィムリウムＬＰ
Ｓを０又は１０ｍｇＥＤＴＡ−ＰＢＳ緩衝液１ｍｌ当り
含む溶液、又同時にリジウムデオキシコーレート、リジ
ウムカプリレート、大腸菌ＬＰＳ、もしくは無薬品のど
れか１００μｇ／ｍｌ上記の緩衝液に含む溶液を１００
℃で１０分間熱した。これを冷却しそして例２と３で述
べた様に、ポリミキシン−ＥＩＡで測定した。結果は、
表Ｉに報告した。

【０１４９】例７ グラム陰性細菌ＬＰＳを検出するために、ドットブロッ
ト測定法を用いることが望ましい。従って、ポリミキシ
ン布をこの様なドットブロット測定法を用いることが検
討された。サルモネラ抗原の定性的検出は、次の様に行
った。種々の菌密度のＥＤＴＡ−熱処理されたサルモネ
ラ　　ティフィムリウム菌懸濁液のサンプル（１５μｌ
）を４ｃｍ平方のポリミキシン−布シートに滴下（スポ
ット）した。３０分後、このシートを洗浄し、次にパー
オキシダーゼ着色基質中で６０分間反応させた。１ｍｌ
当り５×１０７　個の菌を含む懸濁液は弱いが、明確な
着色反応（白地に青い斑点）を示し、一方菌数が１ｍｌ
当り５×１０８　個か以上を含む懸濁液は、特に明確な
着色反応を示した。（参照なし）プレート上に育成した
Ｓ．ティフィムリウムの一つの全コロニー（直径２ｍｍ
）を、１ｍｌの５０ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に懸濁
させ、１００℃で１０分間熱し、冷却した。この様な懸
濁液のサンプル（１５μｌ）は、ポリミキシン布上に強
烈に青い斑点を作った。サルモネラ菌の全然入っていな
いコントロール（標準）や１ｍｌ当り５×１０７　個以
下の菌を含むサンプルは、着色しなかった。ポリミキシ
ン−布を、ドットブロット測定形式で用いることは、一
般的にグラム陰性菌の検定に適用され得る。

【０１５０】例８ ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｉｓ　Ｒａｄ
　Ｌａｂｏ　Ｎｏ．２２４−００９６）の各ウェルをＰ
ＢＳ中のポリミキシンＢサルフェート５ｍｇ／ｍｌ溶液
２００μｌ　と室温で１６時間反応させて、ポリミキシ
ンで被覆した後ＰＢＳＴで８回洗浄した。酵素免疫測定
のため各ウェルは、５０μｌ　の洗剤−熱処理したＬＰ
Ｓサンプルと３０分間室温で反応させた。ウェルは、上
記の如く、ＰＢＳＴで洗い、次に５０μｌ　のＣＳＡ−
１抗体−パーオキシダーゼ結合体と３０分間室温で反応
させ、ＰＢＳＴで再び洗った。パーオキシダーゼは各ウ
ェルを０．３ｍｌのＴＭＢパーオキシダーゼマイクロウ
ェル基質システムと室温で３０分間反応させた後、その
基質を取り出し０．７ｍｌの０．５ｍＭ、ＮａＦ中に希
釈してÅ３７０吸光度を測定した。結果は、前記表ＩＶ
に記した。

【０１５１】例９ 大腸菌ＬＰＳ存在下で、サルモネラ菌ＬＰＳの検出は、
次の様に行った。Ｓ．ティフィムリウムＬＰＳ（０．２
又は２０μｇ／ｍｌ）のＢＰＷ中の溶液は、０又は２０
０μｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳの入っているＢＰＷと同じ
量混合した。そのサンプルは、次に０．１当量の１．１
％デオキシコーレートと混合した後１００℃で１０分間
熱し、そしてポリミキシン−布もしくはポリミキシン被
覆したマイクロタイタープレートを使ったＥＩＡにより
測定した。ポリミキシン−布ＥＩＡでは、パーオキシダ
ーゼは各布断片を空のマイクロタイタープレートのウォ
ルに入れ０．３ｍｌの基質とともに３０分間反応させる
ことにより測定した。基質はウェルより移して０．７ｍ
ｌの０．５ＭＮａＦ溶液中に希釈して、Å３７０吸光度
を測った。結果は、前表ＩＶに示した。

【０１５２】例１０ 食品のサルモネラ菌の存在を測定した。食品物は、次の
様にして用意した。１ｇの混合均質化した食品サンプル
は、種々の菌数のＳ．ティフィムリウムを含むＢＰＷＹ
Ｅ１ｍｌで接種し、それに無菌ＢＰＷＹＥを加えて最終
量１０ｍｌとした。その懸濁液はよく混合し、それを無
菌ＢＰＷＹＥ中に段階的に希釈して、それぞれ元の懸濁
液より１０倍ごと段階的に希釈したものを培養した。サ
ルモネラ菌は、上述の如くポリミキシン−ＥＩＡドット
ブロット測定法により元の（希釈していない）培養液と
段階的に希釈した培養液を測定した。ドットブロットの
結果は前記表ＶＩに示した。

【０１５３】例１１ 食品サンプル混合の細菌生存性に与える影響は、次の様
にして調べた。１０ｇの固型チーズをＢＰＷＹＥ中に懸
濁させ、そして混合してノリ状とした。このノリ状物質
は、種々の数のＳ．ティフィムリウムで接種し、完全に
混合した。サンプル（混合して）を取り出し、残りの接
種されたチーズはさらに食品加工機で混合し、２番目の
サンプル（混和した菌）を取り出した。これら２つのサ
ンプルは、次にＢＰＷＹＥと混合し、それから段階的に
無菌ＢＰＷＹＥで希釈したものを約２０時間培養した。 それら培養液は、ドットブロットポリミキシン−ＥＩＡ
で測定した。結果は、前記表ＶＩＩ　に示した。次にあ
げる実用例は、当該発明の新規利用を詳説する。

【０１５４】例１２ ポリミキシンＢ−被覆ポリエステル布（上述の如く調製
されたもの）は、病人がグラム陰性細菌病原体と環境的
な接触により、傷口が感染を受ける危険がある様な場合
に傷口を覆い、貼用することが出来る。

【０１５５】例１２（ａ） 例えば、火傷を受けた人はしばしばシードモナス　　エ
ルジノーサ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎ
ｅｓａ）による感染の危険がある。この様な患者は、ポ
リミキシンＢ−布より作った包帯から恩恵を受けると信
じる。

【０１５６】例１２（ｂ） いわゆる「けんか傷」で苦しんでいる人々は、腸内細菌
、例えばクレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）やエン
テロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）もしくはバ
クテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属の一部によ
り感染されやすい。この様な人々にとって、ポリミキシ
ンＢ−布より作られている包帯より受ける利益は大きい
事は確かである。これら各自の場合でも、ポリミキシン
Ｂ−被覆ポリエステル布を傷口にあてがうことは、感染
から起るいくつかの問題を軽減（例えば発熱因子や内毒
素の吸着）又吸着したポリミキシンの殺菌性を利用して
の感染の予防にもなり価値がある。

【０１５７】例１３ この発明のポリミキシンＢ−布によるＬＰＳ内毒素の除
去の効率は、適当な無毒洗剤を、それはＬＰＳと反応し
てＬＰＳの布にくっついているポリミキシンＢに対して
の親和力を高めるのであるが、この布と同時に傷口にあ
てがうことにより高まる。適当な、この様な無毒の洗剤
の例として、リジウムデオキシコーレート、ＳＤＳ（リ
ジウムジメチルサルフェート）、ＴＷＥＥＮ　８０そし
てＴＲＩＴＯＮＸシリーズ（Ｘ−１５、Ｘ−４５、Ｘ−
１００、Ｘ−１６５、そしてＸ−７０５）の中のいろい
ろな製品がある。ＴＲＩＴＯＮＸは、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａ
ｓ　Ｃｏ．のアルキルアリルポリエーテルアルコール類
、そのスルフォネート類とそのサルフェート類に基づい
た界面活性剤の商標である。それらは、非イオン性、カ
チオン性、もしくはアニオン性であって、又、油溶性か
水溶性のどちらかの性質をもっている。

【０１５８】例１４ ポリミキシンコートしたポリエステル布を用いて、水溶
液からＬＰＳ発熱因子の除去。１ｇのポリミキシンＢコ
ートしたポリエステル布断片（実施例Ａで調製）を、バ
ルブをつけた小さな使いすて用ポリプロピレン商品名Ｑ
ｕｉｋ−ＳＥＰ　カラム（Ｉｓｏｌａｂ．　Ｉｎｃ．　
Ｎｏ．ＱＳ−Ｕ）につめた。ＰＢＳ中に溶解したサルモ
ネラ　　ティフィリウムＬＰＳより成る発熱因子の溶液
をポリミキシンＢ−布カラムに重力流動で通した。流速
を調節する必要がある場合は、バルブを使って調製した
。カラムより流出したものを集め、その発熱因子含有を
、発熱因子検出用商品名Ｅ−ＴＯＸＡＴＥキットを使っ
て製造者の指示通り行って測定した。

【０１５９】例１５ 溶液からＬＰＳ発熱因子を除去する場合の発熱因子濃度
の影響。ポリミキシンＢ−被覆ポリエステル布が溶液よ
りＬＰＳ発熱因子を除く能力は、発熱因子除去が有効に
なる様に発熱因子溶液がしたたるように流すか、あるい
は、フィルトレーションする様にポリミキシンＢ布をカ
ラムにつめたものを用いて調べた。一例として、Ｓ．テ
ィフィムリウムＬＰＳの除去について調べた。

【０１６０】種々の濃度のＳ．ティフィムリウムＬＰＳ
を含む溶液５０ｍｌをポリミキシンＢ−布をつめたカラ
ムで、流速が一時間当り５０ｍｌになる様に通した。カ
ラムから流出した全てを集め、残ったＬＰＳ発熱因子を
Ｅ−ＴＯＸＡＴＥキットを使って測定した。表ＩＸによ
ると、１０μｇ／ｍｌ以下のＬＰＳ濃度投入量に対して
、ポリミキシンＢ布カラムは、大部分のＬＰＳを溶液か
ら能率よく除去した。投入濃度が１０μｇ／ｍｌ（もし
くはそれ以上）である溶液中のＬＰＳは、カラムを通す
流速を落すか、それともカラムにつめたポリミキシンＢ
布断片の量をふやすかどちらかによって、一層効果的に
除くことが出来るであろう。

【０１６１】

【表９】

【０１６２】例１６ 溶液からＬＰＳ発熱因子の除去に対する流速の影響。ポ
リミキシンＢ−布カラムを通すＬＰＳ溶液の流速が溶液
よりＬＰＳを除くカラムの効力に影響を与えると思われ
る。従って、ＬＰＳ除去の流速の影響を調べてみた。１
μｇ／ｍｌのＬＰＳ溶液５０ｍｌを、いろいろの流速で
必要に応じてバルブで変化させ得たが、ポリミキシンＢ
−布カラムを通した。カラムより流出したものは集めら
れ、上述の様にＬＰＳ発熱因子を測定した。表Ｘによる
と、最適流速５０ｍｌ／ｈでは、充分ＬＰＳが溶液より
除去されたが、流速がこれより早くなると、ＬＰＳがあ
る程度流出溶液に残る結果となった。ＬＰＳ除去に早い
流速を用いるには、時間の観点から望ましい。従って、
より多くのポリミキシンＢ−布をつめた、より長いカラ
ムを用いることが、さらに早い流速で、ＬＰＳの除去を
より効果的に達成するのに必要と思われる。

【０１６３】

【表１０】

【０１６４】これらの結果は、ポリミキシンＢコートし
たポリエステル布が、溶液よりＬＰＳ発熱因子を除去す
るのに適用出来ることを証明するものである。このシス
テムは、効果的で迅速で安く、このことは、現在使われ
ている他のシステムに対して商業的にも魅力的な代用品
となるはずである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、布酵素ＥＩＡによるＬＰＳ検出のため
のポリミキシン濃度の影響をグラフで表した。

【図２】図２は、ポリミキシンのポリエステル布に吸着
する時間的影響をグラフで表した。

【図３】図３は、ポリミキシン布による抗原の捕獲のカ
イネティックス（動力学）をグラフで示した。

【図４】図４は、ポリミキシンコートした布と抗体コー
トした布の種々の抗原の濃度への反応をグラフで表した
ものである。

【図５】図５は、ポリミキシン−布ＥＩＡ用の抗原の調
製における種々の洗剤の影響をグラフで示した。

【図６】図６は、ＬＰＳ捕獲のカイネティックスをグラ
フで表した。

【図７】図７は、ポリミキシンコートした布と、抗体コ
ートした布のＥＩＡにおける感度を比較したグラフであ
る。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　改良された装置、例えばリポ多糖類（
   ＬＰＳ）の酵素免疫測定法用、ＬＰＳの放射免疫測定法
   用、ＬＰＳの蛍光免疫測定法用、傷口よりＬＰＳ内毒素
   の除去用、もしくは水溶液中よりＬＰＳ発熱因子（パイ
   ロジエン）の除去用の装置で、次のａ）とｂ）の組み合
   わせよりなる装置： ａ）担体、例えばプラスチックとしてポリスチレン、ポ
   リカーボネート、ポリメタクリレート、もしくはポリ塩
   化ビニール、織布、例としてレーヨン／ポリエステル織
   布、ポリエステル織布、不織布、例としてレーヨン／ポ
   リエステル不織布、もしくはポリエステル不織布、もし
   くは紙で、それらは被検体を受容するのに適合したもの
   である；：そして ｂ）オリゴペプタイド、例えば疎水性ポリペプタイド、
   もしくはポリミキシン、例としてポリミキシンＢ、ポリ
   ミキシンＢ１　、ポリミキシンＢ２、ポリミキシンＤ１
   　、ポリミキシンＤ２　、もしくはポリミキシンＥ。
2. 【請求項２】　　疎水性粗多孔性布、例えば合成繊維、
   例えばポリエステル、ポリプロピレン、ポリアラミドも
   しくはナイロンなどの合成繊維から成形される疎水性粗
   多孔性布からなる創傷用包帯であって、オリゴペプチド
   、疎水性ポリペプチド、もしくはポリミキシン、例えば
   ポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキシンＢ
   ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　又はポ
   リミキシンが疎水的に且つ安定に結合した創傷用包帯で
   あって、好ましくは例えばナトリウムデオキシコーレー
   ト、ナトリウムジメチルスルフォネート、無水ソルビタ
   ン部分エステル化脂肪酸ポリオキシエチレン誘導体、ア
   ルキルアリルポリエーテルアルコール類、アルキルアリ
   ルポリエーテルスルホン酸、もしくはアルキルアリルポ
   リエーテルサルフェート類などの無毒性の洗剤を含み、
   好ましくは１２１℃で１０〜２０分間オートクレーブで
   殺菌した創傷用包帯。
3. 【請求項３】　　粗多孔疎水性布より成るフィルターで
   あって、例えば疎水性繊維より形成されたもので、繊維
   の例として、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピ
   レン、もしくはナイロンで、これらがオリゴペプタイド
   、疎水性ポリペプタイドもしくはポリミキシン、その例
   としてポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキ
   シンＢ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　
   、もしくはポリミキシンＥで被覆されており、従って、
   上述のオリゴペプタイド、もしくは上述の疎水性ポリペ
   プタイド、もしくは上述のポリミキシンが上述の繊維に
   安定して結合したものである、フィルター。
4. 【請求項４】　　ＬＰＳ免疫測定用もしくはＬＰＳ検定
   又は除去用の改良装置の調製方法であって、次の段階よ
   り成る調製方法： ａ）プラスチック、例えばポリスチレン、ポリカーボネ
   ート、ポリメタクリレートもしくはポリ塩化ビニール；
   織布、例えばレーヨン／ポリエステル混紡布、ポリエス
   テル織布；不織布、例えばレーヨン／ポリエステル不織
   布、もしくはポリエステル不織布；又は紙などの担体で
   あって、それらは燐酸緩衝食塩水中で検査するサンプル
   を受容するのに適合したものである担体を湿らせる；ｂ
   ）上記の担体を、ポリミキシンの溶液中で反応させ、ポ
   リミキシンは、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、
   ポリミキシンＢ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシ
   ンＤ２　、又はポリミキシンＥを燐酸緩衝食塩水中に溶
   かしたもので、例えば、ポリミキシンＢの溶液もしくは
   ポリミキシンサルフェートの溶液の濃度はそれぞれ１ｍ
   ｌ当り約１〜１０ｍｇの範囲内で、約半時間から約２４
   時間の反応時間を用いる；そして、 ｃ）上記のポリミキシン処理をした担体を、適当な洗剤
   で洗浄する。
5. 【請求項５】　　ＬＰＳ免疫測定用の改良装置の調製方
   法であって、次の段階より成る調製方法：ａ）レーヨン
   ／ポリエステル混紡布、レーヨン／ポリエステル不織布
   、ポリエステル織布又は、ポリエステル不織布を、燐酸
   緩衝食塩水で湿らせる； ｂ）当布をブロット（ｂｌｏｔ：濾紙上で余分の液を吸
   い取る）する； ｃ）その布を、ポリミキシン溶液中で反応させ、ポリミ
   キシンは、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリ
   ミキシンＢ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ
   ２　、又はポリミキシンＥで、燐酸緩衝食塩水中に溶か
   したもの、又その例として、ポリミキシンＢ溶液もしく
   はポリミキシンＢサルフェート溶液は、濃度がそれぞれ
   １ｍｌ当り約１〜１０ｍｇの範囲内であって、又その中
   の例として燐酸緩衝食塩水中１ｍｌ当り５ｍｇのポリミ
   キシンＢサルフェート溶液約５０ｍｌを、約半時間から
   約２４時間にかけて反応させる；そして ｄ）上記のポリミキシン処理布を、適当な洗剤液、例え
   ば商品名　ＴＷＥＥＮ（ツウィーン）２０（Ａｔｌａｓ
   　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　社製）─
   ──燐酸緩衝食塩水で洗浄する。
6. 【請求項６】　　細菌性ＬＰＳを検出する方法であって
   、次の段階よりなる方法： ａ）細菌のサンプルを、洗剤中で加熱し、洗剤は、エチ
   レンジアミンテトラ酢酸、リジウムコーレート、リジウ
   ムデオキシコーレート、商品名ＴＲＩＴＯＮ（トライト
   ン）Ｘ−１００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ社製）、又はリジ
   ウムドデシルサルフェートを培養液中に溶かしたもので
   あり、培養液は例えば燐酸緩衝食塩水、又は適当な増菌
   培地を指し、又適当な増菌培地とは、緩衝ペプトン水又
   は選択性培地を指し、更に後者は酵母菌抽出含有緩衝ペ
   プトン水、テトラチオネート肉汁、セレナイトシスティ
   ン肉汁又は培養肉汁（代用ブイヨン）、上記洗剤は、エ
   チレンジアミンテトラ酢酸又はリジウムデオキシコーレ
   ートを指す；ｂ）上述の溶液を、ＬＰＳの免疫測定用の
   装置と接触させ、ここに言う装置とは、担体とポリミキ
   シンの組み合わせより成るものであり、担体としては、
   プラスチック、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ
   メタクリレート又はポリ塩化ビニール、織布は、レーヨ
   ン／ポリエステル混紡布、ポリエステル織布、不織布、
   即ちレーヨン／ポリエステル不織布、もしくはポリエス
   テル不織布、又は紙を指し、それらは被検体を受容する
   のに適合したものであり、そして、ポリミキシン、即ち
   ポリミキシンＢ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキシンＢ
   ２　、ポリミキシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　又はポ
   リミキシンＥを指す； ｃ）上述の装置を洗浄する；そして、 ｄ）抗体標識結合体を加え、即ち、この結合体とは放射
   免疫測定法に適した抗体放射性同位元素複合体、もしく
   は酵素免疫測定法に適した発色源の添加により色素反応
   を起す様に工夫された抗体・酵素複合体、もしくは蛍光
   免疫測定に適した蛍光標識複合体、もしくは化学発光免
   疫測定法を前述装置に適する様な化学発光性標識複合体
   を指す。
7. 【請求項７】　　更に、次に述べる段階を含む請求項４
   の方法： ａ）増菌培地中で、食品サンプルの混合均質化する；ｂ
   ）前述のサンプルを培養する； ｃ）前述のサンプルを、前述の免疫測定装置で測定し、
   そして、任意の継続段階も含め； ｄ）段階的に希釈したシリーズの上述食品サンプルを調
   製し；そして ｅ）増菌培地中の希釈したシリーズのサンプルの測定。
8. 【請求項８】　　水溶液中からＬＰＳ発熱因子を除去す
   る方法であって、その方法は、当水溶液を粗多孔疎水性
   布より成るフィルターを通し、即ち、その布は疎水性繊
   維より形成されており、その繊維とは、ポリエステル、
   ポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはナイロンであ
   って、これらはすでにオリゴペプタイド、疎水性ポリペ
   プタイド、もしくはポリミキシン、即ち、ポリミキシン
   Ｂ、ポリミキシンＢ１　、ポリミキシンＢ２　、ポリミ
   キシンＤ１　、ポリミキシンＤ２　、もしくはポリミキ
   シンＥで被覆されるものを言い、さらに、上述したオリ
   ゴペプタイド、もしくは上述した疎水性ポリペプタイド
   、もしくは上述したポリミキシンが繊維にしっかりと安
   定に吸着したものを言い、これら既述のフィルターは、
   調節バルブを有した垂直のシリンダー型カラムにつめ込
   み、カラムの流速は約２５から約２００ｍｌ１時間当り
   で流すが、一時間当り５０ｍｌが好ましく、これにより
   、ＬＰＳ発熱因子が既述フィルターに吸着する。