JPH04271774A

JPH04271774A - 塩基配列決定装置

Info

Publication number: JPH04271774A
Application number: JP5784091A
Authority: JP
Inventors: Katsuji Murakawa; 村川　克二; Hideki Kanbara; 秀記神原; Masahiko Fujita; 雅彦藤田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1991-02-28
Filing date: 1991-02-28
Publication date: 1992-09-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子を構成する核酸
の塩基配列を分析・表示する遺伝子塩基配列表示装置に
関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子診断では、検体が着目するＤＮＡ
塩基配列を持つか否かを調べることが課題である。この
ための方法としては、ラジオアイソトープあるいは蛍光
色素等で標識を付した特定の配列を持つＤＮＡプローブ
を作成し、これが検体とハイブリダイズするか否かによ
り、着目塩基配列の有無を調べたり、注目領域の塩基配
列そのものを解読したりする方法がある。特に、後者の
塩基配列を決定する方法は、確実な情報が得られるので
広く用いられ始めている。従来、ある遺伝子の塩基配列
を決定するには、ＤＮＡの調製のためにクローニングを
行う必要があった。クローニングを行うと、元の遺伝子
の塩基配列の多様性の有無にかかわらず、塩基配列はあ
る１つのクローンについて決定される。しかし、ある遺
伝子の塩基配列は、必ずしも１種類だけではなく、幾つ
かの変異を含んでいる場合がある。例えば、対立遺伝子
は母親由来のものと父親由来のものの２つの遺伝子が対
になっており、個人識別のために有用な情報を持ってい
る。対立遺伝子をクローニングによって単離し、塩基配
列を決定した場合には、２つある塩基配列のうち、どち
らか一方の塩基配列のみしか得られない。しかし、最近
では、酵素を用いてＤＮＡを簡単に増幅することのでき
るＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）法が開発され、簡単に特定部位のＤＮＡの
塩基配列を決定できるようになってきた。この方法では
、元の遺伝子の配列に多様性がある場合でも、それを保
持したままＤＮＡを増やし、塩基配列を決定することが
できる。通常、遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列は、
４種の核酸塩基アデニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グア
ニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）の並びで表示している。クローニングしたＤＮＡを塩基配列決定した場合は、一
義的に塩基配列が決定されるので、上述の４種の文字で
表示が可能であるが、対立遺伝子の如く配列に多様性が
ある遺伝子を対象とする場合は、上述の４種の文字だけ
では１個体の遺伝子の塩基配列を簡単には表示できない
。対立遺伝子の塩基配列を表示する場合は、従来は、例
えば、プロシーディングス　オブ　ナショナル　アカデ
ミー　オブ　サイエンス，ＵＳＡ，８５巻（１９８８年
），第７６５２〜７６５６頁（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，８５（１９８８），ｐｐ．７６
５２−７６５６に記載されている如く、各々の対立遺伝
子の個々の要素の配列を表示し、注目する個体がそのう
ちのどの要素の組み合せから成る接合体であるかを表示
するようにしている。ここでは、遺伝子が複数の配列を
持つ場合には、それぞれの塩基配列を列記するようにし
ていた。また、米国遺伝子データベースにおいては、図
４に示す如きＤＮＡ塩基表示記号を用いて、塩基配列決
定の際に一義的に決定できなかったあいまいな塩基につ
いて、例えば、当該塩基がＧかＣか判別できないときに
はＳ，ＡかＣか判別できないときにはＭという如く表示
することにしている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術の前者、
すなわち、核酸塩基名に対応する文字を用いる表示方法
は、もともと、塩基配列が１種類であることを前提とし
ているものである。しかし、対立遺伝子の如く塩基配列
に多様性がある遺伝子を上述のＰＣＲ法で増幅して塩基
配列を決定しようとすると、複数の配列が混合された状
態で観測されるため、この方法では対応できなくなる。また、上記従来技術の後者、すなわち、図４に示す如き
表示記号を用いる表示方法は、塩基種が特定できない（
すなわち、あいまいな）場合に、前述のＲ，Ｙ，Ｍ等の
「可能性を示す記号」で代用して表示するというもので
あり、上と同様に、複数の配列が混合された状態で観測
される場合には対応することができない。この技術にお
ける記号の使用方法は、後述する本発明に係る表示方法
と見掛け上類似しているが、本発明は多種塩基の混合で
あるものを対象として、複数の塩基をまとめて表示する
ことを目的とする点で異なるものである。しかし、例え
ば、個人識別を目的とした塩基配列決定の場合は、対立
遺伝子の２つの塩基配列の両方が個々に必要であるとは
限らず、複数の配列が混合された状態が表現できれば十
分であることが多い。このような場合、多種塩基の混合
であることを踏まえた、新しい配列表記方法の導入と、
それによるデータ処理が有効である。一方、前述の如く
、従来のＤＮＡ断片分離パターンから塩基配列を自動決
定する装置においては、塩基配列が単一であることを前
提としていたため、同塩基長に２種以上の核酸断片が検
出された場合には、ある塩基長に対応する核酸断片がそ
れぞれの塩基長に１種類であるように、データ処理によ
って再分析するようになっている。このため、塩基配列
の決定を行う遺伝子が複数の配列から成るものの場合、
不必要なデータ処理が行われるという不都合があった。本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その目的と
するところは、従来の技術における上述の如き問題を解
消し、対立遺伝子等の複数塩基配列の検出に適したデー
タ処理を行い、複数塩基配列の表示を行うことを可能と
する遺伝子塩基配列表示装置を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、末
端が異なる塩基種になる如く調製された複数種類の核酸
断片試料について、該核酸断片試料のそれぞれを特定塩
基長毎に分離する手段と、該手段により分離された塩基
長の断片が存在するか否かを検出する手段と、該手段に
よる検出結果に基づいて前記核酸断片試料を調製する基
になった核酸断片試料の塩基種の配列を分析し表示する
手段を有する塩基配列決定装置において、前記分析・表
示手段を、同一の塩基長に複数種類の核酸断片が検出さ
れた場合に、当該塩基長に前記複数種類の塩基種それぞ
れが同時に存在することを示す固有記号を表示する如く
構成したことを特徴とする遺伝子塩基配列表示装置によ
って達成される。

【０００５】

【作用】本発明に係る遺伝子塩基配列表示装置において
は、対応する複数の塩基配列のうちの１つの配列のある
位置の塩基とそれに対応する他方の配列の同位置の塩基
が、どの塩基種の組み合せから成るかを１つの記号で表
わすようにしたので、この記号により、各々の要素の個
別の塩基配列が不明の場合でも、ある個体の対立遺伝子
の如き複数の塩基配列をまとめて表示することが可能に
なる。また、予め、塩基配列の決定を行う遺伝子が単一
な配列を持つものか否かを入力し、この情報を保持して
おくことを可能としたことにより、試料の塩基配列の多
様性に応じたデータ処理に基づく塩基配列の決定が可能
になる。

【０００６】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面に基づいて詳細
に説明する。個人識別に用いる領域として、ＨＬＡ（Ｈ
ｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）が注
目されている。この領域は、母親由来の遺伝子と父親由
来の遺伝子とが対になっている対立遺伝子である。塩基
配列決定に必要なＤＮＡ断片群をゲル電気泳動法で分離
，検出すると、図２に示す如き２つの遺伝子の配列の重
なったデータが得られる。図２は、ＨＬＡのＤＱＡ領域
をＰＣＲ−ダイレクトシーケンシングした結果の一部を
示している。これは、ＤＮＡ断片を蛍光標識してＤＮＡ
シーケンサを用いて実時間計測して得たもので、縦軸は
蛍光強度、すなわち、ＤＮＡ断片の個数に対応し、横軸
は泳動時間でＤＮＡ断片の長さに相当する。図のピーク
を時間軸方向に順に読んでいくことにより、塩基配列を
決定することができる。通常は、１つの塩基長には末端
塩基の種類は１つだけが対応するが、図２では２つの塩
基が対応している。このようなデータからは、単純に塩基配列を決定するこ
とはできない。しかし、前述の如く、個人識別では、２
つの末端塩基を１セットとして、これがどのような順で
現われるかを表示すれば十分である。そこで、ここでは
、対立遺伝子の一方の遺伝子のある塩基と、それに対応
する他方の遺伝子の塩基が、ＡとＡの場合：ＡＡとＣの場合：ｍＡとＧの場合：ｒＡとＴの場合：ｗＣとＣの場合：ＣＣとＧの場合：ｓＣとＴの場合：ｙＧとＧの場合：ＧＧとＴの場合：ｋＴとＴの場合：Ｔの如く表示することにする。なお、ここでは、便宜上、
現在、遺伝子データベースで用いられている不確定の塩
基を表わす記号と同じものの小文字を使用しているが、
これは一例であり、別の表示方法によっても良いことは
言うまでもない。

【０００７】この表示方法を用いると、例えば、ＴＧＴ
ＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＡＡＡＴＴＧＣＧＴという配列の
遺伝子と、ＴＧＴＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＧＴという
配列の遺伝子から成るヘテロ接合体の対立遺伝子の検出
パターンを解釈して（図４参照）、ＴＧＴＴＴｓＴＣＡ
ＧＴＧＣＡｍｍｙＴＧＣＧＴのように表示することがで
きる。本実施例で着目しているＨＬＡ−ＤＱＡ領域は、
遺伝子の配列が現在８通り知られている。観測されるの
は、この組み合せなので、計算上３６通りの組み合せ配
列がある。新しい表示が、元の塩基配列のどの組み合せ
であるか、すなわち、父親および母親由来の個々の配列
を見分けるのは、組み合せの数に限りがあるので容易で
ある。以下、本実施例に係る遺伝子塩基配列表示装置の
構成を、詳細に説明する。図３は、本実施例に係る遺伝
子塩基配列表示装置の概略構成を示すブロック図である
。図３中、１０は分離手段、２０は検出手段、３０は分
析・表示手段を示している。分離手段１０は、末端が異
なる塩基種になる如く調製された複数種類の核酸断片試
料について、蛍光発色団を付加したプライマーを用いて
サンガー反応を行うことにより、核酸断片試料のそれぞ
れを特定塩基長毎に分離する機能を有するものである。検出手段２０は、サンガー反応の生成物の電気泳動の移
動度から、上述の分離手段１０で分離された塩基長の断
片が存在するか否かを検出する機能を有するものである
。分析・表示手段３０は、入力部３１から入力される後
述する情報に基づいて、塩基配列を決定するとともに、
その結果を表示部３２に表示する機能を有するものであ
る。

【０００８】上述の分析・表示手段３０の入力部３１か
ら入力される情報は、本実施例の特徴的動作である図１
に示すアルゴリズムを起動させるか否か、すなわち、本
実施例に係る遺伝子塩基配列表示装置による遺伝子塩基
配列の自動決定を行うか否かを決定するための情報であ
る。以下、この情報を利用して、本実施例に係る遺伝子塩基
配列表示装置による遺伝子塩基配列の自動決定を行う場
合の動作を説明する。まず、前述の分離手段１０および
検出手段２０により、末端が異なる塩基種になる如く調
製された複数種類の核酸断片試料について、目的塩基種
の分離および存在検出を行う。この結果が得られた段階
で、分析・表示手段３０による分析に移る。ここでいう
分析は、いわゆるデータ処理であり、その前提として、
図１のステップ４１で、同一塩基長に複数の末端が異な
る塩基種の核酸断片のピークがある場合に、ステップ４
２で、試料が対立遺伝子の如く複数の配列を持つ可能性
があるか否かを判定し、試料が対立遺伝子の如く複数の
配列を持つ可能性がある場合には、ステップ４３に進ん
で、同一塩基長にある複数塩基種を読み取って、これを
５〜６頁に示した表示方法により、表示部３２に表示す
る。また、ステップ４２で、試料が対立遺伝子の如く複
数の配列を持つ可能性がないと判定された場合には、ス
テップ４４に進んで、同一塩基長には１種のみの核酸断
片がくるようにデータ補正を行う従来の方法に基づくデ
ータ処理方法により、１つの塩基種を読み取って、これ
を表示部３２に表示する。上記実施例によれば、末端が
異なる塩基種になる如く調製された複数種類の核酸断片
試料について、同一塩基長にある複数塩基種を読み取る
動作と、同一塩基長には１種のみの核酸断片がくるよう
にデータ補正を行って１つの塩基種のみを読み取る動作
とを選択的に行うことが可能になり、高度に自動化され
た遺伝子塩基配列表示装置を実現することができる。す
なわち、得られたＤＮＡ断片検出パターンから塩基配列
の決定を自動的に行う場合、予め、塩基配列の決定を行
う遺伝子が対立遺伝子であるとの情報により、同時に観
測される２つの塩基配列が、不確定な塩基ではなく、２
種の塩基配列を持つ遺伝子に由来するものであることを
判断できるようになる。

【０００９】上記実施例においては、２つの塩基配列の
組み合せを例に挙げたが、３つ以上の場合も同様に記号
を定義することにより、本発明を適用することが可能で
あることは言うまでもない。すなわち、本発明は、種々
の遺伝子の多様性に対応することが可能である。また、
単に遺伝子に限らず、他の核酸の領域にも適用できるこ
とも言うまでもない。なお、上述の実施例においては、
同じ塩基種が重なっているものについては、従来と同じ
記号を使用しているので、塩基種が異なっている部分だ
けを簡単に見つけることができる点も特徴である。更に
、上記実施例においては、塩基種のみの定性的表示を行
う例を示したが、必要に応じて、その存在比を数値を用
いて表示することも可能である。

【００１０】

【発明の効果】以上、詳細に説明した如く、本発明によ
れば、対立遺伝子等の複数塩基配列の検出に適したデー
タ処理を行い、複数塩基配列の表示を行うことを可能と
する遺伝子塩基配列表示装置を実現できるという顕著な
効果を奏するものである。

【００１１】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例の特徴的動作であるアルゴリ
ズムを示す図である。

【図２】実施例のＨＬＡのＤＱＡ領域をＰＣＲ−ダイレ
クトシーケンシングした結果の一部を示している。

【図３】実施例に係る遺伝子塩基配列表示装置の概略構
成を示すブロック図である。

【図４】米国遺伝子データベースにおけるＤＮＡ塩基表
示記号を示す図である。

【符号の説明】

１０　　分離手段２０　　検出手段３０　　分析・表示手段３１　　入力部３２　　表示部４１〜４４　　処理ステップ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　末端が異なる塩基種になる如く調製さ
れた複数種類の核酸断片試料について、該核酸断片試料
のそれぞれを特定塩基長毎に分離する手段と、該手段に
より分離された塩基長の断片が存在するか否かを検出す
る手段と、該手段による検出結果に基づいて前記核酸断
片試料を調製する基になった核酸断片試料の塩基種の配
列を分析し表示する手段を有する塩基配列決定装置にお
いて、前記分析・表示手段を、同一の塩基長に複数種類
の核酸断片が検出された場合に、当該塩基長に前記複数
種類の塩基種それぞれが同時に存在することを示す固有
記号を表示する如く構成したことを特徴とする遺伝子塩
基配列表示装置。
【請求項２】　　前記分析・表示手段が、同一の塩基長
に前記複数種類の核酸断片が存在し得るか否かを示す情
報を入力・保持する手段と、該手段に保持されている情
報に基づいて前記検出手段による検出結果を分析する手
段と、同一の塩基長に前記複数種類の核酸断片が存在し
得る場合には該複数種類の核酸断片の末端の塩基種を決
定し、また、同一の塩基長に前記複数種類の核酸断片が
存在し得ない場合には、当該塩基長に存在すべき１種類
の核酸断片のみが検出されるときには検出された１種類
の塩基種を決定し、当該塩基長に２種類以上の核酸断片
が検出されるときには、該検出結果を、塩基長に対応す
る核酸断片は各塩基長に１種類となる如く再分析するも
のであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子塩基配
列表示装置。
【請求項３】　　前記核酸断片試料のそれぞれを特定塩
基長毎に分離する手段が、遺伝子を構成する４種の核酸
塩基アデニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）
およびチミン（Ｔ）の塩基種毎に、それぞれ特定塩基長
毎に分離するものであることを特徴とする請求項１また
は２記載の遺伝子塩基配列表示装置。