JPH04273065A - 免疫分析方法およびその分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫分析方法およびそ
の分析装置に係り、特に生体試料中に含まれている抗原
，抗体，ハプテン等の分析対象物を標識化した後、標識
物をフローセルに導いて測光する免疫分析方法およびそ
の分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液の如き生体試料中の微量物質を測定
するために、抗原抗体反応を利用する分析方法が知られ
ている。この種の先行技術の１つである特開平１−１８
７４５９　号は、抗原抗体反応と光音響分光法を組合わ
せた分析方法を示している。

【０００３】すなわち、この特開平１−１８７４５９　
号では、内壁に抗体を固定化してある反応容器内に、分
析対象物である抗原を含むサンプルを加え、次いで、未
反応試料の洗浄除去、ラテックス又は無機酸化物の如き
微小粒子が結合された抗体を含有する液の添加，余剰抗
体の洗浄除去、および遊離液の添加の工程を経て、反応
容器内に遊離された微小粒子を含む浮遊液を生成する。 その後、浮遊液を光音響セルに移し、断続的にレーザ光
を照射して光音響セル内の圧力変化を検出することによ
って光音響信号を得ている。

【０００４】一方、特開昭６３−２１４６６８号は、高
感度免疫分析方法を提案している。この先行技術では、
蛍光物質を封入したマイクロカプセルと抗体を結合させ
た標識抗体を用いる。この例では固相が用いられない。 被検細胞を含むサンプルにマイクロカプセル標識抗体を
加え免疫結合させた後、遠心洗浄する。遠心洗浄後の再
浮遊液をフローサイトメータのシースフローセルに注入
する。細胞と標識抗体の複合体との免疫複合体がフロー
セルに照射されるレード光束を横切って流れる際に、マ
イクロカプセルからの蛍光が検出される。

【０００５】また、免疫分析との関連づけないが、シー
スフローセルの利用例としては、例えば特開平２−８０
９３７号に示されたものがある。この先行技術では、染
色した血球を収容した試料容器をサンプリング位置に移
送し、試料容器内の血球懸濁液をシースフローセルの入
口室へピペッティングノズルによって供給する。フロー
セルにはレーザ光が照射されており、染色細胞がレーザ
光束を横切る際に蛍光および散乱光を検出するよう構成
されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述した特開平１−１
８７４５９　号では光音響信号を検出しており浮遊液全
体の濃度に依存した信号を得ることになるので、分析対
象物が微小濃度である場合には高精度の測定が困難であ
る。固相を備えた反応容器に標識抗体を加えた場合には
、標識抗体が固相に結合している抗原に対して特異的結
合をするばかりでなく、固相表面にも非特異的に吸着さ
れ、この非特異的な吸着がされている標識抗体が通常の
洗浄操作によっては除去できないという問題がある。と
ころが、特開平１−１８７４５９号のように標識浮離液
として水酸化ナトリウム溶液を用いた場合には、特異的
結合がされている粒子標識物ばかりでなく、非特異的吸
着がされている粒子標識物も固相から遊離されるので、
これらを含む被測定液を光音響分光法で測定すると必然
的に測定誤差が大きくなる。

【０００７】特開昭６３−２１４６６８号に示された方
法は、固相を用いる必要がなく個々の標識からの検知信
号量は大きくなるが、遠心分離器を用いる洗浄が必要な
ため操作が面倒であり自動化が困難である。また特開平
２−８０９３７号では、免疫分析に適用する場合の配慮
がなされていない。

【０００８】本発明の目的は、試料中の分析対象物が微
量であっても正確かつ高感度な測定結果が得られる免疫
分析方法およびその分析装置を提供することにある。

【０００９】本発明の他の目的は、反応容器からフロー
セルに供給される被測定液内に、分析対象物と結合しな
かった非特異的吸着に基づく粒子標識物の混入が極めて
少ない免疫分析方法およびその装置を提供することにあ
る。

【００１０】本発明のもう１つの目的は、同じ形態の反
応固相を有する反応容器を複数用いて複数種の分析対象
物の測定を行い得る免疫分析方法およびその装置を提供
することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明では、抗原抗体反
応による標識物の量の計測を濃度としてではなく、標識
物の数として計測する。さらに、固相に非特異的に吸着
した標識抗体を区別して計測するために非特異的吸着の
標識抗体を遊離させずに、抗原抗体反応により結合して
いる標識物を選択的に遊離させた後、これを計測する。

【００１２】本発明における標識物としては、蛍光性の
微小粒子を用いるのが好適である。本発明に基づく免疫
分析方法は、概ね次の如きステップで操作される。すな
わち、受容体が結合された固相を有する反応容器に試料
を供給し、この試料中の分析対象物を上記受容体に結合
させること、未反応試料を反応容器から除去した後、蛍
光性粒子で標識された標識受容体をその反応容器に供給
し分析対象物を介して固相に標識受容体を結合させるこ
と、余剰の標識受容体を反応容器から除去した後、その
反応容器に標識遊離剤を含む遊離試薬を供給すること、
固相から遊離された蛍光性粒子を含む被測定液をフロー
セルに導入すること、そのフローセルを通る蛍光性粒子
に基づく蛍光を検出し、検出粒子数を計数すること、お
よび計数された粒子数に基づいて上記試料中の分析対象
物濃度を演算することが行われる。

【００１３】また、本発明の望ましい実施例では、次の
如き操作を含む。すなわち、受容体が核酸を介して結合
されている固相を有する反応容器に試料を供給し、この
試料中の分析対象物を上記受容体に免疫結合させること
、標識受容体を上記反応容器に供給し分析対象物を介し
て標識受容体を上記固相に結合させること、余剰の標識
受容体を反応容器から除去した後、制限酵素含有液をそ
の反応容器に供給し固相に結合されている核酸を切断す
ること、固相から遊離された標識物を含む被測定液をフ
ローセルに導入すること、およびそのフローセルを通る
上記標識物の数を計数することを含む。

【００１４】

【作用】固相に結合されている受容体としては、分析対
象物が抗原又はハプテンである場合には、それに特異的
に結合し得る抗体が用いられ、分析対象物が抗体である
場合には、それに特異的に結合し得る抗原が用いられる
。

【００１５】固相を備えた反応容器に生体試料を供給し
て分析対象物を固相に結合させた後、反応容器にはその
分析対象物と免疫結合し得る標識抗体が加えられる。そ
の後、余剰の標識抗体を含む液が反応容器から吸引排出
などによって除去されるが、このような洗浄除去操作に
よっては、固相表面に非特異的に吸着されている標識抗
体が脱離されず、反応容器内に残存する。

【００１６】特定の標識浮遊離剤を含む遊離試薬液を用
いることにより、固相表面に非特異的に吸着されている
標識抗体を実質的に遊離（解離）させることなく、固相
上の抗原抗体結合（免疫結合）を選択的に解離させるこ
とができる。だから、浮離試薬液の供給により免疫結合
していた標識物が反応容器内の液に選択的に遊離される
。特定の標識遊離剤の１つは、中性溶液中のカオトロピ
ックイオンである。カオトロピックイオンとしては、Ｃ
Ｃｌ３ＣＯＯ−，ＳＣＮ−，ＣＦ３ＣＯＯ−　等を用い
ることができる。

【００１７】受容体としての抗体又は抗原を固相に結合
するための核酸は、ここではオリゴヌクレオチドを含む
。反応容器内の固相側の抗体又は抗原は、試料供給時に
は二本鎖の核酸を介して固相に結合されている。

【００１８】多項目分析を行う場合には、同じ形態の固
相を有する反応容器が多数準備され、分析操作開始に伴
って分析対象物毎に割り当てられる特有の受容体を固相
に結合する。すなわち、各反応容器内の固相にはあらか
じめ同じ形態の一本鎖の核酸を固定化しておき、分析操
作時に各種の分析対象物に対応する受容体を持った相補
的な一本鎖の核酸を、分析対象物の種類毎に対応づけら
れている反応容器に割り当て通りに加え、各反応容器内
の固相上に二本鎖（塩基対）を形成せしめることにより
各種の受容体を結合する。これにより、その後種々の分
析対象物と免疫反応し得る多項目分析用反応容器群が準
備される。

【００１９】固相に核酸結合されている反応容器内で、
試料中の分析対象物を固相に免疫結合させた後、さらに
標識物を持った受容体が結合されるが、この場合の標識
物の固相からの脱離のための標識遊離剤としては制限酵
素が用いられる。制限酵素としては、制限エンドヌクレ
アーゼ，ホスホジェステラーゼ，ピロホフファターゼ，
ペプチターゼ，エステラーゼなどの加水分解酵素が好適
に用いられるが、他の既知の多くの制限酵素を用いるこ
ともできる。このような制限酵素によって核酸の二本鎖
が所定の部位で切断される。

【００２０】反応容器内の固相は、試験管やマイクロプ
レートの如き反応容器の内壁面、又は反応容器内に収容
されるガラスボール等の球状体の表面を、結合されるべ
き受容体に対し化学結合可能に表面処理されたものであ
る。

【００２１】標識物としては、蛍光性の微小粒子が好適
である。この蛍光性粒子は、ステックス粒子又は無機物
粒子の表面に蛍光性物質層を形成せしめたものを実用で
き、あるいは粒子形成組成物と蛍光性物質の混合物を粒
子化したものを実用できる。フローサイトメータによっ
て蛍光検出され、フローセルを通った粒子数が計数され
るが、この場合の蛍光性粒子の粒径は１０−５〜１０−
３ｍｍである。蛍光性粒子のために用い得る蛍光性物質
は、フルオレセイン，クマリン誘導体，ローダミン誘導
体，ダンシル，ウンベリフェロン等の既知物質である。

【００２２】核酸を切断して標識物を遊離した場合には
、フローセルに導かれる標識物含有体が切断された核酸
の一部と固相側にあった受容体と分析対象物と標識受容
体が合体された状態になっている。一方、分析対象物が
結合されなかった固相上の受容体に接続されている核酸
も制限酵素によって切断されてフローセルに導かれるが
、このような遊離物には標識物が結合されていないので
、フローセルにおいて蛍光検出されず、測定誤差を実質
的にもたらさない。

【００２３】従来のように濃度測定する場合には、結合
した量を統計的な平均値として計測するので、低濃度で
の検出感度が不足するうえに、試料等に含まれている妨
害因子の影響で測定値が試料ごとに変動し正確な測定値
を与えない。また、非特異的吸着の影響を免れるために
、抗原抗体結合を再解離させて測定しようとすると、解
離液組成が酵素反応条件と一致せず、解離させた試料を
そのまま測定できないなどの新たな課題も生ずる。解離
及び分離操作で測定液の希釈が起こり実質上の定量下限
が上がる。

【００２４】粒子を計数する方法では、粒子が１個から
計測できるので低濃度の抗原を測定するのに十分な検出
感度が得られる。すなわち、粒子それぞれが増幅された
信号を与えている。粒子を標識物として抗原抗体反応に
より結合した数を計測するので、計数値は直接抗原量を
反映する。

【００２５】微粒子を標識し、粒子を１個ずつ数える方
法では、もし妨害因子が粒子表面を覆い、蛍光強度を低
下あるいは増幅させても、設定しておいた一定のレベル
内の信号を計測するようにすれば、妨害因子の影響を免
れることができ、正確に計数できる。計測系のノイズも
影響しない。絶対個数を計れるので希釈の影響がなく、
また解離液組成のままでも測定できるので、測定に際し
ての新たな配慮がいらない。

【００２６】大気中には、数ミクロン以下の塵が多数存
在しており、これが外来粒子として測定液中に混入する
。試料に光を照射し試料に依る散乱光を計測する方法で
は、目的とする標識粒子と外来粒子とが区別できず外来
粒子量がバックグラウンドを上昇させる。いっぽう、蛍
光を計測する方法では、通常の環境には強い蛍光を持つ
外来粒子がないので、誤計数なく計測できる。したがっ
て、蛍光粒子を用い、粒子を１個ずつ計測する方法によ
り高感度検出が可能となる。

【００２７】核酸は、例えばＤＮＡの場合、構成単位の
ジオキシリボヌクレオチドが３′，５′−ホスホジエチ
ルエステル結合している。一方、抗体の主要部分をなす
蛋白質は、アミノ酸がポリペプチド結合により重合した
ものである。従って、核酸の結合様式は蛋白質の結合様
式とは全く異なるので、核酸を切断する反応条件では蛋
白質を変性，分解する可能性が極めて小さい。特に、制
限酵素と呼ばれるエンドヌクレアーゼを用いれば、核酸
の中の特定の塩基配列でのみ切断できるので、蛋白質部
分を切断せずに核酸部分のみを選択的に切断することが
できる。

【００２８】従って、核酸を介して抗体を固相上に結合
させておき、抗原抗体反応を経て抗原および標識抗体を
捕捉し、洗浄後、核酸部分で選択的に切断することがで
きる。この際、抗体や酵素を変性，分解させることなく
、目的とする抗原抗体反応に関与した標識物のみを固相
から離脱させることができる。抗原抗体反応によらず非
特異的吸着をしている標識物は、前記核酸を介さずに直
接固相に付着しているので、制限酵素の作用により遊離
することはない。これによって、非特異的吸着の影響を
排除して抗原量を測定することができ、また定量性を損
うこともない。制限酵素は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸
）を切断する酵素のうち、特定の塩基配列のみを認識し
て切断する機能を持つものである。この塩基配列は、認
識切断配列と呼ばれるがそれぞれの制限酵素に特有のも
のである。従って、結合に用いる核酸またはオリゴヌク
レオチドの塩基配列中に、使用する制限酵素の認識切断
配列が少なくとも１カ所挿入されておれば、制限酵素を
作用させて切断することができる。この条件を満たす塩
基配列を自由に設定することができる。

【００２９】

【実施例】本発明に基づく第１の実施例を図１〜図５を
参照して説明する。

【００３０】図１は、第１の実施例である免疫分析装置
の全体構成を示す概略図である。ターンテーブル３２は
、二列の容器列を載置することができ、内周側には血液
試料を収容した複数のサンプル容器３３がサークル状に
配列され、外周側には固相を有する複数の反応容器３４
がサークル状に配列されている。反応容器３４の固相に
は、後述するように相補オリゴヌクレオチドの一本鎖が
固定化されている。このターンテーブル３２は、コント
ローラ４６によって動作制御されるパルスモータ９２に
よって所望のサンプル容器３３および反応容器３４を、
ピペッティングノズル４３による吸入位置に停止するよ
う回転される。反応容器の列は恒温槽内を移動するよう
構成される。

【００３１】試薬テーブル３５上には、分析操作に必要
な各種の試薬液容器が載置される。すなわち、各種分析
項目Ａ，Ｂ，Ｃにそれぞれ対応する固定用抗体液を収容
した容器９０ａ，９０ｂ，９０ｃと、各種分析項目に対
応する蛍光性粒子標識抗体液を収容した容器３６ａ，３
６ｂ，３６ｃと、制限酵素を含む遊離試薬液収容容器３
８と、その他必要な緩衝液容器等が、試薬テーブル３５
に保持されている。コントローラ４６によって動作制御
されるパルスモータ９３は試薬テーブル３５を所望の角
度回転し、必要なタイミングで指定された試薬容器をノ
ズル４３による吸入位置に停止するよう位置づける。

【００３２】自動ピペット機構３９は、可動アーム４２
に取付けられたピペッティングノズル４３，アーム４２
を水平回転させるための回転駆動部４５，アーム４２を
上下動するための上下駆動部４４，チューブ４１を介し
てノズル４３に接続されたシリンジポンプ４０、および
押出液を兼ねた洗浄液槽３７を備えている。アーム４２
の動作に伴ってピペッティングノズル４３は、ターンテ
ーブル３２上の二箇所の吸入位置、試薬テーブル３５上
の試薬吸入位置、フローセル４７の注入室入口４８、お
よびノズル洗浄槽９４の上を回転半径として回転するこ
とができ、それぞれの位置で下降および上昇することが
できる。

【００３３】シースフローセル４７の内部構成は、既知
のフローサイトメータで用いられているものと同様であ
るが、上方には特開平２−８０９３７号に示されている
ものと同等の試薬注入室が開口されている。それ故、ノ
ズル４３は注入室入口４８内に侵入して被測定液をシー
スフローセル４７内に吐出することができる。送液ポン
プ９によってシース液槽６内のシース液が一定流量で送
液され、フローセル４７の内壁に沿って流れ排液溜９５
に排出される。フローセル内に導入された被測定液は、
シース液の流れの中央を流れる。

【００３４】レーザ光源４９は、発振波長が４８８ｎｍ
のアルゴンレーザを出射することができ、このレーザ光
束はビームエクスパンダ５０でビーム幅を広げられた後
、レンズ５１によって絞られ被測定液の流れに合焦点す
るようにシースフローセル４７に照射される。フローセ
ル４７からの蛍光の集光には顕微鏡用の対物レンズ５２
を用いている。光電検知器としてのフォトマルチプライ
ヤ５３の前に空間フィルタ５４及び波長選択フィルタ５
５を設け、散乱光およびラマン光を除去する。フォトマ
ルチプライヤ５３の出力をプリアンプ１８で増幅した後
、リニアアンプ１９で増幅し、下限波高弁別器２０ａお
よび上限波高弁別器２０ｂによりノイズを除去する。そ
の後２種の閾値の間にあるパルスをカウンタ５６で積算
する。

【００３５】トランス９６および高圧電源９７を介して
フォトマルチプライヤ５３には高電圧が印加される。試
料番号，計数結果，検量線，蛍光測定のヒストグラム、
等はディスプレイ５７，プリンタ２２，フロッピーディ
スク５８に出力する。またインターフェイス５９を介し
て、パーソナルコンピュータとも通信できる。

【００３６】信号処理のダイヤグラムを図２に示す。プ
リアンプの出力８０をパルス波高値により弁別する回路
２０を経て、パルス列８２を得る。これをカウンタ５６
で積算する。もう一方の信号処理経路では、出力８０を
平滑化回路８４を通し、パルス数を電圧変化に変換して
信号８５を得、電圧変化を電圧計８６で計測する。この
平滑化による計測は、例えば、ペンレコーダを接続して
、記録された値を読み取ることによっても行なえる。

【００３７】図１の分析装置による分析項目の一例は、
癌胎児性抗原ＣＥＡ（ＣａｒｃｉｎｏＥｍｂｒｙｏｎｉ
ｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）とジゴキシンとα−フェトプロテ
ィンＡＦＰである。この場合、試薬テーブル３５上の固
定用抗体液容器９０ａには、一本鎖のオリゴヌクレオチ
ドを結合した抗ＣＥＡ抗体を含む液が収容され、固定用
抗体液容器９０ｂには同様結合の抗ジゴキシン抗体を含
む液が収容され、さらに固定用抗体液容器９０ｃには同
様結合の抗ＡＦＰ抗体を含む液が収容される。また、標
識抗体液容器３６ａ，３６ｂ，３６ｃには、それぞれ蛍
光性微粒子で標識された抗ＣＥＡ抗体，抗ジゴキシン抗
体，抗ＡＦＰ抗体を含む液が収容されている。

【００３８】各分析項目に関する免疫結合の過程は似通
っているので、ここではＣＥＡの場合を例にとって反応
容器内における分析操作過程を説明する。ターンテーブ
ル３２上の反応容器３４は、分析操作開始前には、すべ
て同じ形態をしている。すなわち、図３に示すように、
ガラス製の反応容器３４の内壁が固相１０を形成してお
り、その固相には一本鎖のオリゴヌクレオチド１５が固
定されている。分析項目は操作開始後に加えられる固定
用抗体の種類によって特定されるので、操作開始前の反
応容器３４のそれぞれには、同一のオリゴヌクレオチド
１５が固定されている。オリゴヌクレオチド１５はアミ
ノ基を表面活性基として有する固相に結合される。

【００３９】一方、抗体液容器９０ａには、制限酵素Ｈ
ａｅ　　Ｉで切断できる塩基配列ＡＧＧＣＣＴを持つ合
成オリゴヌクレオチドに抗ＣＥＡ抗体をマレイミド・チ
オールカップリングにより結合してある固定用抗体を含
む液を準備しておく。ここで、Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃはヌクレ
オチドの構成単位であり、順次アデニン塩基，グアニン
塩基，チミン塩基，シトシン塩基を示す。

【００４０】分析操作が開始されると、ノズル４３によ
り抗体液容器９０ａから抗体が分取され、対応する反応
容器３４内に吐出することによって、当該反応容器をＣ
ＥＡ分析用であることを特定する。これによって、図３
に示すように、抗ＣＥＡ抗体１６の持っているオリゴヌ
クレオチド１７が、固相側の相補鎖を持つオリゴヌクレ
オチド１５に結合する。従ってこの反応容器３４は、Ｃ
ＥＡを認識できる。

【００４１】以上の処理をした反応容器を分析操作開始
前に準備しておく場合には、各分析項目を認識し得る反
応固相を有する反応容器とすることができる。他の分析
項目の特定も固相用抗体液を変えるだけで行うことがで
きる。

【００４２】このようにして準備された反応容器３４に
は、次いでサンプル容器３３からノズル４３によって分
取された試料が添加される。図４の（ａ）に示すように
、試料中のＣＥＡ１１は固相１０に固定化されている抗
ＣＥＡ抗体１６に結合する。この反応を１５分間行わせ
た後、反応容器３４から未反応の試料をノズル４３によ
って吸入し洗浄槽９４に排出する。次いで反応容器３４
に緩衝液を加え、ノズル４３で吸引排出し、このような
洗浄操作を複数回繰り返す。

【００４３】次いで、図４（ｂ）に示すように、蛍光性
物質としてのクマリン誘導体が含有されているラテック
ス粒子２１で標識された抗ＣＥＡ抗体２４を含む液を、
試薬テーブル３５上の容器３６ａからノズル４３で一定
容量吸入し対応する反応容器３４に吐出する。反応容器
３４は所定温度（３７℃）のもとで一定時間（１５分間
）ターンテーブル上で反応を維持する。これにより、標
識抗ＣＥＡ抗体２４がＣＥＡ１１に結合され、固相１０
に固定化される。このとき、図４（ｃ）に示すように、
ＣＥＡ１１と免疫結合しなかった標識抗ＣＥＡ抗体２４
ａの一部が固相１０の表面に直接吸着される。反応容器
３４内の余剰の標識抗体を含む液がノズル４３によって
吸入され、洗浄槽９４へ排出される。その後ノズル４３
によって反応容器内へ洗浄液が吐出され、さらにその洗
浄液を吸引排出する洗浄動作が繰り返される。

【００４４】次いで試薬テーブル３５の回転により吸入
位置に遊離試薬液容器３８が位置づけられ、その容器３
８内の制限酵素Ｈａｅ　　Ｉ　　２５を含む液がピペッ
ティングノズル４３により一定量吸入され、ターンテー
ブル３２上の対応する反応容器３４に吐出される。図４
（ｃ）および（ｄ）に示すように、反応容器内では固相
１０に結合されていたオリゴヌクレオチドの対の二本鎖
が所定の切断箇所で切断され、反応容器３４内の液に遊
離体が浮遊する。このような遊離反応のためにも所定の
時間（１５分間）が必要である。制限酵素２５によって
核酸の塩基対が途中で切断されることにより、反応容器
内には二種の遊離体が存在する。その１つは、標識物２
１を持った抗体２４と抗原１１と固定用抗体１６と核酸
の断片からなる蛍光検出可能な遊離体であり、もう１つ
は、免疫結合がされることなく固相上に残っていた固定
用抗体と核酸の断片からなる蛍光検出されない遊離体で
ある。これらの遊離体を含む被測定液は、ピペッティン
グノズル４３によって吸入されシースフローセル４７に
吐出される。制限酵素２５による遊離反応の際には、固
相１０に直接吸着されていた標識抗体２４ａが遊離され
ないので、被測定液に混入されない。

【００４５】クマリン誘導体が含まれているラテックス
粒子２１として粒径が０．１μｍ　のものを用い、上述
した試料の代りにＣＥＡ標準試料を用いて求めた検量線
例を図５に示す。定量直線性が高く、特に低濃度の定量
性に優れており、酵素反応を利用した検出法のような低
濃度での検量線の曲がりはなかった。粒子１個を１分子
に対応させて、検出下限を求めると、絶対量で、１０−
２２ｍｏｌ、濃度で１０−１８ｍｏｌ／ｌ以下であった
。

【００４６】図１の分析装置において、複数種の分析項
目を分析する場合にもターンテーブル３２上に設置する
反応容器３４は、同じ形態の固相を備えたものでよい。 入力装置からコントローラ（コンピュータ）４６に試料
と分析項目の関係を入力しておけば、コントローラ４６
は分析装置各部の動作を制御して必要な分析項目を所望
の順序で測定せしめる。例えば、測定項目をＡ，Ａ，Ｂ
，Ｃ，Ｂの順に測定したい場合、固定用抗体は、９０ａ
，９０ａ，９０ｂ，９０ｃ，９０ｂの順に各反応容器に
注入され、固定化される。分注される試料についても任
意の順序で測定されるようコントローラ４６は制御する
。なお、試料は必要に応じて希釈する。試料反応後、反
応容器３４を洗浄し、次いで標識抗体３６ａ，３６ｂ，
３６ｃを分注する。該標識抗体はそれぞれ測定項目Ａ，
Ｂ，Ｃに対応した抗体に標識物が結合されているので、
当初に指定した測定項目順Ａ，Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｂに従って
標識抗体も３６ａ，３６ａ，３６ｂ，３６ｃ，３６ｂの
順にコントローラ４６により自動的に選択される。

【００４７】次に、本発明に基づく第２の実施例を図６
〜図８を参照して説明する。図６の免疫分析装置は、マ
イクロプレートの内壁を固相として用いるものであり、
第１の実施例におけるターンテーブルの代りにＸ，Ｙ移
動機構を用いるものである。図６において、装置上面に
、反応用マイクロプレート６１，試料用マイクロプレー
ト６２，標識抗体６３，遊離液６４，洗浄液６５を設置
する。試薬部は冷却器６６により保冷し、反応部は加温
器６７により３７℃に保った。また、反応部及び標識抗
体６３は振動器６８により振盪できるようにした。

【００４８】光源６９として発振波長６３２．８ｎｍ　
のＨｅ−Ｎｅレーザ光源を用いた。測光部には外来光が
入らないように遮光板７０を設けた。

【００４９】レーザ光は、プリズム７１により整形しレ
ンズ７２により集光した。レンズ５２により蛍光を集め
、スペイシャルフィルタ５４，干渉フィルタ５５を通し
た後、半導体光検知器７３で検出した。アンプ７４で増
幅し、パルス波高弁別器２０で信号を選択してからカウ
ンタ５６に入力した。データ処理はコンピュータ４６で
行ないインターフェイス５９を接続し、外部の機器とも
通信できるようにした。

【００５０】出力は、プリンタ等のほか、ＩＣメモリカ
ード７５にも行なえるようにした。装置の初期設定もＩ
Ｃカードに記憶されておき、立ち上げを容易にした。

【００５１】蛍光性微粒子としてフルオレセインを含む
粒径０．１および０．２μｍの粒子を用いた。

【００５２】シース液等を含まれる気泡が影響しないよ
うに脱気装置７６，７７を設置した。

【００５３】シース液及び測定液を送液するために、シ
リンジポンプ４０を用いずに、加圧空気によりニューマ
ティックポンプを構成して用いても良い。この場合、脈
流が減少する効果がある。

【００５４】市販の蛍光性微粒子に抗体を結合させた標
識抗体を準備し、図６の分析装置を用いてＣＥＡの免疫
測定を行った例を図７の模式図で説明する。

【００５５】カルボキシル基を表面に導入してある蛍光
粒子（フルオレセイン含有；粒子径０．１μｍ，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃ．）２３に水溶性カ
ルボジイミドを用いて、抗ＣＥＡ抗体２４を結合した。

【００５６】ポリスチレン製マイクロプレート６１に抗
ＣＥＡ抗体２６を結合しておき反応固相とした。

【００５７】測定操作の前に、ＣＥＡの標準溶液を調製
し、試料２７とした。抗ＣＥＡ抗体２６を固定化したマ
イクロプレート６１の各ウェル２８に試料２７を添加し
て一定時間室温に放置した。洗浄後、蛍光粒子２３を標
識した標識抗体２９を加えて一定時間反応させた。十分
洗浄した後、カオトロピックイオン遊離液６４を加え、
抗原抗体反応でマイクロプレートに捕捉されている蛍光
粒子３１を遊離させた。遊離した蛍光粒子を含む液を被
測定液とし、被測定液中の微粒子数を計数した。ＣＥＡ
濃度に対する検量線例を図８のａに示す。

【００５８】比較のため、標識物として酵素の１つであ
る西洋ワサビ　　ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用い、
蛍光性基質を反応させてＰＯＤ量を検出する方法で、検
量線を作成した。この場合には、免疫反応後の標識物（
ＰＯＤ）を遊離させ別のマイクロプレートに移してから
酵素反応させて測定した場合（図８ｂで示す）と遊離さ
せずにそのままのマイクロプレートで酵素反応、蛍光測
定した場合（図８ｃで示す）を行った。

【００５９】明らかに、本発明の方法による結果ａが、
バックグラウンドが低く、かつ低濃度の検出感度の高い
ことが分かる。

【００６０】実施例１で説明した微粒子計数装置では、
光電子増倍管で得られた信号のパルス成分のみに注目し
、このパルス数を計数した。粒子数密度の低い試料では
、非常に定量性の高い測定値を与えることを既に説明し
たが、粒子数密度の高い試料ではレーザ光束内を２粒子
以上の粒子が同時に通過するようになり、数え落しによ
り計数率の低下を招く。一方、高濃度の試料では、発生
する蛍光強度が大きくなるので蛍光強度、つまり信号を
一定の時定数で平滑化してその直流成分を計測しても濃
度に比例した計測値を与えるようになる。したがって、
パルス数と直流成分値の双方を同時に測定すれば測定対
象濃度領域が拡大できる。これらの方式を採用し、免疫
測定を約２桁高感度化することができた。

【００６１】

【発明の効果】本発明によれば、試料中の分析対象物が
微量であっても正確で高感度な測定結果が得られるので
、免疫分析にとって多大に貢献する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例の概略構成図である。

【図２】図１の装置で二系統の信号処理を行うダイアグ
ラムである。

【図３】固相への受容体の固定化例を示す模式図である
。

【図４】反応容器内における反応状態を説明するための
模式図である。

【図５】図１の装置による検量線例を示す図である。

【図６】本発明の他の実施例の概略構成図である。

【図７】図６の装置でＣＥＡを測定するときの操作を説
明するための図である。

【図８】ＣＥＡ標準試料を測定した結果を比較した図で
ある。

【符号の説明】

１０…固相、１１，２７…分析対象物（ＣＥＡ）、１５
，１７…オリゴヌクレオチド、１６，２６…固相用受容
体（抗ＣＥＡ抗体）、２１…蛍光性ラテックス粒子、２
３，３１…蛍光性粒子、２４，２４ａ，２９，６３…標
識抗体、２５…制限酵素、３２…ターンテーブル、３３
…サンプル容器、３５…試薬テーブル、３６ａ，３６ｂ
，３６ｃ…標識抗体液容器、３８…遊離試薬液容器、４
２…可動アーム、４３…ピペッティングノズル、４６…
コントローラ、４７…シースフローセル、４８…注入室
入口、５６…カウンタ、６１，６２…マイクロプレート
、９０ａ，９０ｂ，９０ｃ…固定用抗体液容器、９４…
ノズル洗浄槽。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）受容体が結合された固相を有する反
   応容器に試料を供給し、この試料中の分析対象物を上記
   受容体に結合させること、（ｂ）未反応試料を上記反応
   容器から除去した後、蛍光性粒子で標識された標識受容
   体を上記反応容器に供給し上記分析対象物を介して上記
   固相に上記標識受容体を結合させること、（ｃ）余剰の
   標識受容体を上記反応容器から除去した後、上記反応容
   器に標識遊離剤を含む遊離試薬を供給すること、（ｄ）
   上記固相から遊離された蛍光性粒子を含む被測定液をフ
   ローセルに導入すること、（ｅ）上記フローセルを通る
   蛍光性粒子に基づく蛍光を検出し、検出粒子数を計数す
   ること、および（ｆ）計数された粒子数に基づいて上記
   試料中の分析対象物濃度を演算すること、を特徴とする
   免疫分析方法。
2. 【請求項２】請求項１記載の免疫分析方法において、上
   記受容体は抗体であり、上記分析対象物は抗体又はハプ
   テンであることを特徴とする免疫分析方法。
3. 【請求項３】請求項１記載の免疫分析方法において、上
   記蛍光性粒子は、ラテックス粒子又は無機物粒子の表面
   に蛍光性物質層を形成させたもの、又は粒子形成組成物
   と蛍光性物質の混合物が粒子化されたものであることを
   特徴とする免疫分析方法。
4. 【請求項４】請求項１記載の免疫分析方法において、上
   記蛍光性粒子の粒径は１０−５−１０−３ｍｍであるこ
   とを特徴とする免疫分析方法。
5. 【請求項５】請求項１記載の免疫分析方法において、上
   記遊離試薬はカオトロピックイオンを含むものであるこ
   とを特徴とする免疫分析方法。
6. 【請求項６】上記請求項１の分析操作を実行する免疫分
   析装置。
7. 【請求項７】（ａ）受容体が核酸を介して結合されてい
   る固相を有する反応容器に試料を供給し、この試料中の
   分析対象物を上記受容体に免疫結合させること、（ｂ）
   標識受容体を上記反応容器に供給し上記分析対象物を介
   して上記標識受容体を上記固相に結合させること、（ｃ
   ）余剰の標識受容体を上記反応容器から除去した後、制
   限酵素含有液を上記反応容器に供給し上記核酸を切断す
   ること、（ｄ）上記固相から遊離された標識物を含む被
   測定液をフローセルに導入すること、および（ｅ）上記
   フローセルを通る上記標識物の数を計数すること、を特
   徴とする免疫分析方法。
8. 【請求項８】請求項７記載の免疫分析方法において、上
   記核酸は塩基対を有するものであることを特徴とする免
   疫分析方法。
9. 【請求項９】請求項７記載の免疫分析方法において、上
   記核酸はオリゴヌクレオチドであることを特徴とする免
   疫分析方法。
10. 【請求項１０】請求項７記載の免疫分析方法において、
    上記固相は、上記反応容器の内壁又は上記反応容器に収
    容される球状体を、上記受容体に対し化学結合可能に表
    面処理したものからなることを特徴とする免疫分析方法
    。
11. 【請求項１１】上記請求項７に記載の分析操作を実行す
    る免疫分析装置。
12. 【請求項１２】（ａ）対を形成し得る核酸の一方が結合
    された固相を有している反応容器を複数準備すること、
    （ｂ）上記一方の核酸と相補的に結合し得る他方の核酸
    が結合されている第１の受容体を、上記複数の反応容器
    の内の第１の反応容器に供給すること、上記第１の受容
    体は試料中の第１の分析対象物に特異的に結合し得るも
    のである、（ｃ）上記他方の核酸と同じものが結合され
    ていて第２の分析対象物に特異的に結合し得る第２の受
    容体を、上記複数の反応容器の内の第２の反応容器に供
    給すること、および（ｄ）上記第１および第２の反応容
    器に試料を供給し、上記第１の反応容器内で上記第１の
    分析対象物の免疫反応を進め、上記第２の反応容器内で
    上記第２の分析対象物の免疫反応を進めること、を特徴
    とする免疫分析方法。
13. 【請求項１３】請求項１２記載の免疫分析方法において
    、上記免疫反応後の反応容器に標識受容体を供給するこ
    と、余剰の標識受容体を上記反応容器から除去した後、
    制限酵素含有液を上記反応容器に供給すること、および
    上記固相から遊離された標識物を含む液を被測定液とし
    てフローセルに導入すること、を特徴とする免疫分析方
    法。
14. 【請求項１４】上記請求項１３に記載の分析操作を実行
    する免疫分析装置。
15. 【請求項１５】反応容器内の固相に核酸を介して粒子標
    識を結合すること、上記反応容器に制限酵素を供給し上
    記核酸を切断すること、および上記切断後に核酸の一部
    を結合している粒子標識をフローセルへ導くこと、を特
    徴とする免疫分析方法。
16. 【請求項１６】内壁に固相を有する反応容器であって、
    受容体が核酸を介して上記固相に結合されている反応容
    器。