JPH0427384A

JPH0427384A - 蟻酸脱水素酵素の製造法

Info

Publication number: JPH0427384A
Application number: JP13074390A
Authority: JP
Inventors: Michio Miyazawa; 宮澤　道雄; Yasuo Hibino; 泰雄日比野
Original assignee: Central Glass Co Ltd
Current assignee: Central Glass Co Ltd
Priority date: 1990-05-21
Filing date: 1990-05-21
Publication date: 1992-01-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、蟻酸脱水素酵素産生微生物をメタノールを炭
素源として培養することにより、有機合成反応に有用な
蟻酸脱水素酵素を効率的に生産する方法を提供する。

（従来の技術）近年、酵素的反応を有機合成、とりわけ光学活性な化合
物の不斉合成に応用する例が多くみられるようになった
。栄養補給用輸液の成分や、医薬品の合成中間体として
有用な天然型あるいは非天然型の各種Ｌ−アミノ酸は、
対応するアミノ酸脱水素酵素を用いて合成される。たと
えば、「酵素の新機能開発］　（講談社すイエンティフ
ィック刊、福井三部監修、山田秀明編）４１−４２頁、
「不斉合成バイオリアクター」（学会出版センター刊、
鈴木周−監修、前田英勝ら著）６５−６７頁および７６
−８４頁には、Ｌ−ロイシンをロイシン脱水素酵素によ
って合成する反応が紹介されている。あるいは、Ｌ−フ
ェニルアラニン他をフェニルアラニン脱水素酵素によっ
て合成する反応が提案されている（浅野泰久、「新規微
生物酵素の開発と有機合成への応用」、有機合成化学協
会誌、第４７巻第８号７４９−７５９　（１９８９）　
）。

これらの天然、非天然型アミノ酸が対応するケト酸から
アミノ酸脱水素酵素によって変換され生成する反応には
、補酵素としてニコチンアデニンジヌクレオチド・還元
型（以下ＮＡＤＨと略記する）が必要とされる。ＮＡＤ
Ｈは反応に伴って酸化型（以下ＮＡＤ”　と略記する）
に変換される。しかし、ＮＡＤＨは高価であるため、こ
の反応を行なう際には補酵素再生のため、すなわちＮＡ
Ｄ”をＮＡＤＨに再生利用するための酵素反応が系内に
組み込まれた兵役系の反応が必要となる。

これらＮＡＤ”依存性脱水素酵素による反応において補
酵素再生系の酵素として、蟻酸脱水素酵素が頻繁に用い
られている。この酵素はメタノールを炭素源として資化
する微生物がその体内で、メタノールを代謝して生成し
た蟻酸を最後に二酸化炭素へ変換し、その際にＮＡＤ’
をＮＡＤＨに変換する。この酵素を用いるすぐれた長所
として、！１）　　蟻酸アンモニウム溶液の型で、アミノ酸生成
反応に必要なアンモニウムイオンも同時に供給可能であ
る、（２）副産物である二酸化炭素は、気体となって、
反応系から除去され、目的の反応の進行する方向へ平衡
が移動するという特色を挙げることができる。

（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、蟻酸脱水素酵素を有する微生物としては
、メタノール資化性酵母カンジダ、ボイディニが広く知
られているが、その蟻酸脱水素酵素は比活性が低いため
工業的に適用する場合には、大量の菌体を得る必要があ
る。

これまでに、カンジダ、ボイディニを効率的に大量培養
した報告例としては、８０リツトル培養槽で培養を行な
い、粗抽出液の段階で６２００ユニツトの活性を得た例
がある（シュフチらによる、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、６２．１５１−１６０）。しかしながら、生産した
酵素を工業的な反応に供する為には、さらに生産性を向
上させる必要がある。

ここでメタノール資化性微生物を大量培養する際の大き
な問題点は、培養条件の管理の難しさ、とりわけ炭素源
として供給するメタノール濃度の管理の難しさである。

すなわち、蟻酸脱水素酵素は、メタノールが資化される
際に誘導されるため、他の炭素源が豊富に存在するなら
ば、盛んに増殖したとしても、蟻酸脱水素酵素の生産自
体は増さないため、蟻酸脱水素酵素の生産のためには、
メタノールが唯一の炭素源であるような条件で好気的に
培養しなければならない。

しかし一方、他のたとえばグルコース、グリセロールの
ような炭素源を用いる培養の場合には、培地に過剰に添
加することによって微生物の生育が阻害されるという現
象は、著しく過剰な量でない限りにおいては普通はみら
れないのに対して、メタノールは菌体に対して有毒であ
るため、増殖のために必要である量よりも過剰に与えた
場合には、著しく増殖を阻害する要因となってしまう。

そのため、効率的な蟻酸脱水素酵素の生産を行うために
は、培地中のメタノールの濃度を追跡して、常に適性濃
度に近い値に維持する必要がある。特に、培地中のメタ
ノールが不足している場合であっても、過剰量を添加す
ることば絶対に避けなければならない。

そこで培地中のメタノール濃度を追跡するため今日量も
迅速かつ正確である方法としては、ガスクロマトグラフ
ィー（ＧＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）による分析がある。しかし、−日から数日に及ぶ
培養のあいだ、常にＧＣ装置またはＨＰＬＣ装置を一定
条件で絶えず運転し続けることは、コスト、労力双方の
点からみて実用的ではない。また、試料を分析に供して
濃度の値を得るまでには一点あたり少なくとも数十分を
要するため、測定結果を直ちに培養条件の設定に用いる
ような自動制御への応用が困難である。

また、培養液中のメタノール濃度を迅速に定量可能であ
り、かつ滅菌可能、再利用可能であるような測定電極は
現在のところ全く知られていない。

そのため、培地中のメタノール濃度をなんらかの指標に
基づいて適正に維持して、効率良くメタノール資化性微
生物を増殖させる方法が求められている。

（問題点を解決するための手段）そこで、本発明者らは種々検討を加えた結果、メタノー
ルを唯一の炭素源として好気的に培養を行なう際に、メ
タノール濃度管理のための指標として、培地中のメタノ
ール濃度を直接追跡することなく、培地中の溶存酸素濃
度を利用することが可能であることを見出だした。これ
ら培地中の溶存酸素濃度は、醗酵用培養槽に通常装備さ
れる酸素電極によって測定可能である。

すなわち、本発明者らが得た知見によれば、培地中にメ
タノールが充分に存在する間は、微生物が盛んにメタノ
ールを二酸化炭素まで資化し、それに伴い酸素を盛んに
消費するため、培地中の溶存酸素濃度は相対的に低い値
を示す。

その後、炭素源であるメタノールが完全に消費された段
階では酸素の消費もまた停止し、培地中の溶存酸素濃度
値は速やかに上昇することが明らかとなった。そしてこ
こで充分量のメタノールが添加されることにより、再び
酸素の消費が始まり溶存酸素濃度は低下する。

以下本発明を詳述する。

本発明の培養は、メタノール資化性微生物それぞれの培
養法に従って行なわれる。

たとえば、メタノール資化性酵母カンジダ、ボイディニ
種では培地温度２５〜３０℃、好ましくは２８℃におい
て２４〜７２時間通気撹拌を行ないながら好気的に培養
される。

溶存酸素濃度の測定は、醗酵槽に通常装備される酸素電
極によっておこない、通常は培養開始前に校正が実施さ
れる。すなわち、無酸素溶液として多くは亜硫酸ナトリ
ウム飽和水溶液に当電極を浸漬した際の計器による読み
取り値を０％、培養に用いる培地に充分な通気撹拌を加
えた後に、当電極を浸漬したさいの読み取り値を１００
％として、溶存酸素濃度を以下相対値に提示する方法で
測定される。

校正後の電極を培養槽に装着し培養を開始する。菌体の
増殖がすすみ、菌体による酸素消費量が増すことに伴い
、充分な通気撹拌を行なってもなお酸素電極により測定
される溶存酸素濃度は低下していく。

しかし、培地中のメタノールが完全に消費され培地がメ
タノールを欠いた時点で、溶存酸素濃度は培養開始の時
点の値近くまで速やかに上昇する。

ここでメタノールを、増殖を阻害しない濃度範囲内での
量を添加することにより、微生物は再び盛んにメタノー
ルを責化し始め、炭素源以外の因子によって増殖が制限
されるまでは、この方法でメタノールの添加を繰り返す
ことで密度の高い増殖を達成することが可能となる。

なお、メタノール濃度が適正濃度の上限を超えた場合に
は微生物の生育は著しく阻害されるため、あらかじめ予
備的な検討によって、用いる微生物各々についての適正
濃度の上限を求めておくことが必要である。カンジダ、
ボイディニの場合メタノール濃度は、増殖およびＦＤＨ
生産量が最大となるためには１〜１．５％にすることが
望ましい。

培養進行中の菌体増殖量は、適当に希釈した培養液の濁
度を、分光光度計により波長６０００ｍで測定すること
により求めることができる。

培養液中のメタノール濃度は、必要により培養液の遠心
上清をガスクロマトグラフィー分析に供することで正確
に測定することができる。

培養終了後、菌体を遠心分離により回収し、１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液に懸濁し、超音波破砕を行なった後
、水可溶性画分について酵素活性の測定を行なった。蟻
酸脱水素酵素の活性ハ、１００μモルの蟻酸ナトリウム
、３．０μモルのＮＡＤ”、２００８モルのリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，５）に供試試料を適当量加え、全
量を３−として測定した。対照は、蟻酸ナトリウムを除
き、分光光度計により吸光度３４０ｎｍの初期増加速度
より求めた。蟻酸脱水素酵素１ユニツト（ｔＪ）は、１
分間に１μモルの蟻酸を酸化する酵素量として定義され
る。

以上述べた、酸素電極による測定値を用いてメタノール
添加量を制御する方法は、簡便な操作で蟻酸脱水素酵素
の生産の効率を高めることを可能とし、本酵素の製造に
おいて有用であるまた、該方法はメタノール資化性酵母
の培養に限るものではなく、他のメタノール資化性微生
物に対しても有効性が推定される。

以下、実施例により本発明を説明するが、これらの例に
よって隈定されるものではない。

実施例１カンジダ、ボイディニ槓酵母の培養に用いた培地の組成
は、以下の通り。塩化アンモニウム０．４１℃量％、リ
ン酸２水素カリウム０．１重量％、リン酸水素２カリウ
ム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５重量
％、ビタミン混液（※）を１容積％、初ｐＨを６．８と
した培地である。

（※ビタミン混液；チアミン、リボフラビン、パントテ
ン酸、ニコチン酸各１０００　ｔｔ　ｇ／　（１、バラ
−アミノ安息香＃　２００μｇ／Ｉｔ、葉酸、ビオチン
各１０μｇ／ｌであるように調製した混合液）上記組成
の培地４リツトルに、酵母エキスを０．１重量％添加し
、初濃度０．８％（ｗ／ｖ）となるようにメタノールを
添加し、１０１容ジャーファーメンタ−にて２８℃で８
４時間カンジダ、ボイディ二種酵母を培養した。培養中
の菌体濁度、酸素電極により測定した培養液中の溶存酸
素濃度および培養液中に途中添加したメタノールの累積
濃度並びに培養液中のメタノール濃度の経時変化を第１
図に示す。

なお、培養終了時に得られた菌体は湿菌体重で２５６グ
ラム、蟻酸脱水素酵素活性は総括性で１８３０　ｖであ
った。

比較例１実施例１で用いたものと同一の培地４リツトルに、酵母
エキスを０．１重量％添加し、初濃度１％（Ｗ／Ｖ）と
なるようにメタノールを添加し、ついで１０１容ジャー
ファーメンタ−にて２８℃で４５時間、カンジダ、ボイ
ディニ種酵母を培養した。培養中の菌体濁度、及び培養
液中のメタノール濃度の経時変化を第２図に示す。

なお、培養終了時に得られた菌体は湿菌体重で４９グラ
ム、蟻酸脱水素酵素活性は総括性で４００Ｕてあった。

比較例２実施例１で用いたものと同一の培地５０ｄに、０．０５
重量％、０．１重量％、０．５重量％各濃度となるよう
に粉末酵母エキスを添加し、０％、１％、２％各濃度と
なるようにメチルアルコールを添加したのち、２００−
容三角フラスコにて、旋回培養機（２１Ｏｒｐｍ）中で
２８℃４８時間カンジダ、ボイディニ種酵母を培養した
。培養終了時の菌体濁度を第１表に、培養液量あたりの
蟻酸脱水素酵素活性を第２表に示し、た。

第１表　培１１４８時間後の菌体濁度（Ａｈｏｏ）第２
表培養４８時間後の蟻酸脱水素酵素活性（ＩＩ／１）（発
明の効果）本発明における酵素生産菌の培養においては、酸素電極
による測定値を指標として、培地中のメタノール濃度を
制御することにより、菌体の高密度培養が可能となり酵
素の生産性を高くすることができる。また、簡便な操作
で酵素の高い生産性を達成しうるため、他のメタノール
資化性菌の培養においても適用しうるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の実施例および比較例にお
ける培地に添加したメタノールの累積濃度、溶存酸素お
よび菌体濁度の経時変化を示すグラフである。第１図泪養時間（？Ｌ）第２図培養時間（ｈ）

Claims

【特許請求の範囲】１）培養法による蟻酸脱水素酵素の製造においてメタノ
ール資化性微生物を用い、培地の溶存酸素濃度を指標と
してメタノールを逐次添加することを特徴とする蟻酸脱
水素酵素の製造法。２）微生物が、メタノール資化性酵母カンジダ、ボイデ
ィニ（￥Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ￥）である
請求項１記載の蟻酸脱水素酵素の製造法。