JPH04281784A - Ｃｈｏ細胞の培養方法およびその細胞生育生成物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換えＣＨＯ細
胞の培養方法およびその細胞生育生成物の製法に関する
。さらに詳しくは、連続孔構造を形成している多孔マイ
クロキャリアを用いた遺伝子組換えＣＨＯ細胞の高密度
培養方法およびその細胞生育生成物の効率的な製法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】培養表面積／容積の値が小さい従来のフ
ラスコやローラーボトルを用いた単層培養法に比べ、マ
イクロキャリアを用いた培養方法は、少ない容積で培養
表面積を拡大させ、同時に培養容積当たりの細胞密度を
高く保つことができるため、付着依存性細胞であるＣＨ
Ｏ細胞の培養において、現在広く採用されている。

【０００３】付着依存性細胞を攪拌によって浮遊してい
るビーズ上で培養できることを最初に報告したのは　Ｖ
ａｎ　Ｗｅｚｅｌである。〔　Ａ．Ｌ．ｖａｎ　Ｗｅｚ
ｅｌ，　“　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｓｔｒａｉ
ｎｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　Ｃｅｌｌｓ　ｏｎ　Ｍ
ｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓｉｎ　Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ
　Ｃｕｌｔｕｒｅ　”，Ｎａｔｕｒｅ，　２１６，　６
４　（１９６７）〕

【０００４】彼は、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　　により市販さ
れているジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）置換デキス
トランビーズ（　ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５
０　）　を１ｍｇ／ｍｌの濃度で用いることにより、均
一な懸濁マイクロキャリアシステムで、ヒトの二倍体繊
維芽細胞のような付着依存性細胞を大量に培養できるこ
とを示した。しかし、　ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　
Ａ−５０　を１〜２ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で使用すると
、毒性が現れ、細胞生産量は比例的に増大しないことが
判った。

【０００５】その後、ＭＩＴの　Ｄ．Ｗ．Ｌｅｖｉｎｅ
，　Ｄ．Ｉ．Ｃ．Ｗａｎｇ，　Ｗ．Ｇ．Ｔｈｉｌｌｙ　
はマイクロキャリアの荷電容量を０．１〜４．５　ｍｅ
ｑ／ｇの範囲内に制御すれば、多種類の付着依存性細胞
を良好に生育させ得ることを発見した（特公昭５７−３
５９５３，特公昭５６−１４２７０，特公昭５７−５５
１４）。

【０００６】このように改良されたマイクロキャリアは
、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ　により　Ｃｙｔｏｄｅｘ　Ｉ　　という名で工業的
に製造されている。化学的には、このマイクロキャリア
は、デキストラン鎖に共有結合したジエチルアミノエチ
ル基を有することにより、約１．５　ｍｅｑ／ｇの荷電
容量を持つ架橋デキストランマトリックスから製造され
る。この改良されたマイクロキャリアの市販により、マ
イクロキャリア培養法が大きく進展し、現在では、１０
０種以上の細胞種がマイクロキャリア上で培養できるこ
とが示されている。

【０００７】マイクロキャリア培養法は、インターフェ
ロンの生産、各種ウイルスの生産、モノクローナル抗体
の生産、胎児性癌抗原の生産等に応用されている〔細胞
培養技術；福井三郎，杉野幸夫編，講談社サイエンティ
フィク（１９８５）〕。Ｃｌａｒｋ　と　Ｈｉｒｔｅｎ
ｓｔｅｉｎ　　は、マイクロキャリアシステムを用い、
細胞生育のための培養法を至適化し、ヒト繊維芽細胞１
０６　個当たり３×１０４　単位のＩＮＦ−βの収量を
得たと報告している〔　Ｊ．Ｍ．Ｃｌａｒｋ　ａｎｄ　
Ｍ．Ｄ．Ｈｉｒｔｅｎｓｔｅｉｎ，　Ｊ．ＩＮＦ　Ｒｅ
ｓ．，　１．　３９１　（１９８１）　〕。

【０００８】マイクロキャリア自体はさらに改良が進め
られ、細胞の高密度培養を目指して培養表面積／容積の
値を大きくするとともに、細胞がマイクロキャリアビー
ズ内部まで進入し増殖できるように、大孔径の多孔構造
体からなるマイクロキャリアが開発された。

【０００９】Ｋｊｅｌｌ　Ｎｉｌｓｓｏｎ　らは、８％
のゼラチン水溶液に微小ベンゼン液滴を含有させた状態
で造粒した後、ベンゼンを除去し架橋させて、多孔構造
からなるゼラチンマイクロキャリアを開発した。この多
孔ゼラチンマイクロキャリアを用いて、ＢＨＫ細胞およ
びＶｅｒｏ細胞を攪拌培養した結果、開孔のないゼラチ
ンマイクロキャリアに比べ、両細胞とも約２倍の細胞数
を得ることができた。〔　ＫｊｅｌｌＮｉｌｓｓｏｎ　
，Ｆｅｒｅｎｃ　Ｂｕｚｓａｋｙ　ａｎｄ　Ｋｌａｕｓ
　Ｍｏｓｂａｃｈ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｖ
ｏｌ．４，　１１　（１９８６）〕このように大孔径の
多孔構造体からなるマイクロキャリアが、細胞培養密度
を向上させるのに有用であることは明らかであるが、Ｋ
ｊｅｌｌ　Ｎｉｌｓｓｏｎ　らの方法では、十分に培養
表面積／容積の値が上げられていない。

【００１０】大孔径の多孔構造体からなるマイクロキャ
リアが細胞培養密度を向上させるのは、マイクロキャリ
ア容積当たりの培養表面積を大きくするからであるが、
同一開口径であれば、強度を損なわないかぎり、開口部
を隔てる壁の厚みが薄ければ薄いほど、培養表面積およ
びマイクロキャリアの内部培養有効容積を大きくできる
。そのようなマイクロキャリアとして、膜で隔てられた
径が約２μｍより大きい多数の空胞を有し、該空胞は隣
接した空胞間を隔てる膜の開口部により互いに連通した
連続孔構造を形成しているマイクロキャリアを開発され
た（特開昭６４−４３５３０，特開平２−２０７７８５
，特開平２−２０８３３１）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、マイ
クロキャリアを用いて、遺伝子組換えＣＨＯ細胞を高密
度に培養して、その細胞生育生成物を効率よく得る方法
を提供するにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、本発明者が
開発した前記のマイクロキャリア、すなわち、膜で隔て
られた径が２μｍより大きい多数の空胞を有し、該空胞
は隣接した空胞間を隔てる膜の開口部により互いに連通
した連続孔構造を形成しているマイクロキャリアについ
て、さらに検討を進め、このマイクロキャリアを用いて
遺伝子組換えＣＨＯ細胞の培養を行ったところ、驚くべ
きことに、従来のマイクロキャリア培養法に比べ、１０
倍近い効率で目的物質である細胞生育生成物が得られる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】すなわち、本発明は、膜で隔てられた径が
２μｍより大きい多数の空胞を有し、該空胞は隣接した
空胞間を隔てる膜の開口部により互いに連通した連続孔
構造を形成しているマイクロキャリアを用いて、細胞培
養媒体中で懸濁液を形成させ、これに遺伝子組換えＣＨ
Ｏ細胞を接種して細胞培養液とし、これを細胞生育条件
下に維持することを特徴とする遺伝子組換えＣＨＯ細胞
の培養方法である。また、本発明は、上記培養液から細
胞生育生成物を採取することを特徴とする遺伝子組換え
ＣＨＯ細胞の細胞生育生成物の製法である。

【００１４】本発明で用いる大孔径多孔マイクロキャリ
アの空胞の大きさは、径が約２μｍより大きく、好まし
くはその大部分が５μｍ以上、さらに好ましくは１０μ
ｍ以上である。これより小さいときは、大孔径多孔マイ
クロキャリア中での細胞や培養液の自由な移動が実現で
きない。空胞の大きさの上限は、特に制限されるもので
はないが、現状のマイクロキャリアよりも有効表面積を
大きくするため、２００μｍ以下に設定され、さらに好
ましくは１００μｍ以下である。

【００１５】空胞隔膜の厚みや構造に関しては、各空胞
を互いに連結するための連結口が開口されているべきこ
と以外は、特に制限されるものではないが、該開口の大
きさは、空胞に比べ余り小さすぎないことが好ましく、
細胞の進入を可能にするため、１μｍ以上または空胞径
の１／３０程度が望ましい。開口があまりに大きすぎる
と、粒子構造体の強度が不足して、使用時の破壊につな
がり好ましくないため、空胞径の約１／３程度以下、特
に約２／３程度以下であることが望ましい。

【００１６】隔膜には上記の大口径の開口部の他に、さ
らに微細な孔構造が見られることもあるが、培養液の流
通を促進するためむしろ望ましい。本発明で用いる大孔
径多孔マイクロキャリアの空胞を隔てる膜の厚さは、特
に制限されるものではないが、空胞径の１／４以下また
は５μｍ以下、好ましくは３μｍ以下、さらに好ましく
は１μｍ以下である。

【００１７】本発明で用いる大孔径多孔マイクロキャリ
アの平均粒子径は１００〜１０００μｍが好ましい。１
００μｍより小さいと、マイクロキャリア１個当たりの
細胞保持数が少なく、培地との分離も困難になる。また
、１０００μｍより大きいと、マイクロキャリア中心部
の細胞に栄養分や酸素などが十分に供給されず、培養環
境が悪化するため、高密度培養には適当でなくなる。

【００１８】また、大孔径多孔マイクロキャリアの平均
空隙率は８０〜９９％が好ましい。さらに好ましくは９
０〜９８％である。平均空隙率が８０％未満であると、
細胞の保持空間が十分でなく、高密度培養には適当でな
い。特に、大孔径多孔マイクロキャリアを構成する高分
子物質の比重が１．１より大である場合には、高分子物
質が２０％以上を占めると、マイクロキャリアの比重が
大きくなりすぎ、緩やかな攪拌懸濁培養が困難になる。 逆に平均空隙率が９９％を越えると、大孔径多孔マイク
ロキャリアの強度が低下し、長期間の攪拌懸濁培養にお
いては、変形、破損の恐れが出てくる。

【００１９】本発明で用いる大孔径多孔マイクロキャリ
アを構成する膜は、実質的に高分子物質より形成されて
いる。ここで高分子とは、ゴム、多糖類、タンパク質、
水溶性合成高分子、有機溶媒可溶性合成高分子が好まし
いが、特に限定はなく、無機高分子でも本発明の範疇に
含まれる。高分子物質の具体例を挙げると、天然植物系
化合物、例えば、セルロースおよびその誘導体、アラビ
アガム、トラガガントガム、カラギーナン、アガー、グ
アガム、カラヤガム、ローカストビーンガム、ペクチン
、ガラクタン、マンナン、プルランまたはキサンタンガ
ム、天然動物系化合物、例えば、ゼラチン、カゼイン、
カゼインカリウム塩、カゼインナトリウム塩、またはコ
ンドロイチン硫酸ナトリウム塩、コラーゲン、エスラチ
ン、フィブロイン、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、
澱粉系半合成高分子化合物、例えば、カルボキシメチル
澱粉、メチルヒドロキシプロピル澱粉、デキストリン、
デキストラン、アルギン酸系半合成高分子化合物、例え
ば、アルギン酸プロピレングリコールエステルまたはア
ルギン酸塩、合成高分子化合物、例えば、ポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエ
ーテル、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸、
ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、
ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル等またはそのそ
れぞれのモノマーと他のビニルモノマーとの共重合体な
ど、ポリアミド、ポリエステル、ポリアラミド等の縮重
合体およびエポキシ反応物、およびポリウレタンその他
の付加重合体などがある。以上に掲げた具体例としての
高分子物質の誘導体、塩、架橋体、ブレンドも含まれ、
高分子は特に制限されるものではないが、特にセルロー
スおよびセルロース誘導体由来のものが好ましい。

【００２０】大孔径多孔マイクロキャリアを形成する高
分子の平均分子量は、特に制限されるものではない。ま
た、高分子中に金属、低分子量無機物、低分子量有機物
、気体が混在していても、それが本発明の目的を損なわ
ない限り許される。大孔径多孔マイクロキャリアの形状
は、通常、球形、長球形ないしは偏平球形から選ばれる
が、特殊なものとしては、円柱形、円筒形、立方形、長
方形、鞍形等の形状とすることも許される。

【００２１】本発明で用いる大孔径多孔マイクロキャリ
アは、一例として、高分子溶液を望みの形状に成形しつ
つ溶液の固化温度以下に冷却して凍結させ、次いで、溶
媒を抽出除去するか、または溶解能力を失わせる方法に
よって製造される。

【００２２】上記製造方法によれば、製造時に高分子溶
液には多孔化材などの異物を入れる必要がないため、微
小な均一径の液滴を容易に作ることができ、粒径コント
ロールを任意に行うことができる。空胞の径と形状は、
基本的に溶液中の溶媒などが凍結固化する際に形成する
溶媒などの結晶の大きさと形状により決まる。したがっ
て、高分子溶液の種類、温度などの凍結固化条件を変化
させることにより、空胞の形状および孔径を調整するこ
とができる。

【００２３】本発明で用いる大孔径多孔マイクロキャリ
アは、遺伝子組換えＣＨＯ細胞の付着性および増殖性を
改善するために、各種の表面修飾をすることも可能であ
る。一例として、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネク
チン等によるコーティング、正荷電基、負荷電基の導入
、疎水基あるいは親水基の導入による表面の親水性コン
トロール、さらには各種細胞接着因子、例えば、ＲＧＤ
（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのトリペプチド）を共有結合
で導入することなどがあるが、特に制限されるものでは
ない。

【００２４】原理的に、マイクロキャリア培養は大変融
通のきく手法で、培養は実際どんな細胞培養容器でも行
える。マイクロキャリアは、例えば、ペトリ皿、プラス
チックバッグ、チューブ、中空繊維、スパイラルフィル
ム、Ｊｅｎｓｅｎ式スパイラルフィルム、ジャイロジェ
ン、カラム、マルチウェルトレイ、マルチプレート、培
養瓶およびローラーボトル等〔　Ｍ．Ｗ．Ｇｌａｃｋｅ
ｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．，　１，　１０５　（１９８３）　等〕、従来の容
器の表面積を増加させるために使用できる。しかし、攪
拌懸濁培養に使用する場合には、各マイクロキャリアご
との細胞培養環境を均一にコントロールできることによ
り、高密度培養を目指したマイクロキャリア手法の利点
が十分に発揮できる。どんな場合でも、培養容器は無毒
性で、滅菌されていなければならない。

【００２５】マイクロキャリア培養のための容器は、培
養の目的と培養量とに応じて選ぶ。実験室規模のマイク
ロキャリア培養は、普通５リットル以下であり、様々な
容器が使われる。大規模マイクロキャリア培養は、約５
リットル〜数千リットルの範囲であり、ガス圧やｐＨの
ようなパラメーターをモニターできる特別設計の容器が
必要である。このような適宜な培養において、マイクロ
キャリアの量としては、数個〜数百個／ｍｌ程度を用い
ればよい。

【００２６】攪拌懸濁培養に使用するマイクロキャリア
用培養槽としては、一例としてＢｅｌｌｃｏ　　社製５
００ｍｌ容スピナーフラスコが挙げられる。このスピナ
ーフラスコに温度センサー、ｐＨ電極、溶存酸素電極、
多孔性テフロンチューブ、培地給排用ノズル、マイクロ
キャリア沈殿管、サンプル採取口等を必要に応じて装着
させた装置を組み立てて使用すればよい。同時に細胞培
養用コントローラー（　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｆｅｒｍｅｎｔ
ｏｒ　ＭＯＤＥＬ　ＡＩＳ−１２，　ＡＢＬＥ社）等を
用いれば、ｐＨはＣＯ２　ガスまたはＮａＨＣＯ３　溶
液で、溶存酸素は多孔性テフロンチューブを介して、空
気または純酸素を供給することにより制御できる。

【００２７】細胞は、生産目的とする細胞生育生成物の
生産遺伝子を導入した。遺伝子組換えＣＨＯ細胞を用い
る。培養は、通常、以下の方法で行うが、特に限定され
るものではない。

【００２８】マイクロキャリアは適当なガラスビンに、
カルシウムイオンとマグネシウムイオンを除いた　Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ　のリン酸緩衝溶液（以下、ＰＢＳという
）と共に入れ、数分間時々緩やかに攪拌する。上澄を静
かに取り除き、マイクロキャリアを新しいＰＢＳで緩や
かに攪拌して洗う。再びＰＢＳを捨て、新たなＰＢＳを
１ｇのマイクロキャリアに対して１００ｍｌ加えて、純
水を用いたオートクレーブにより（１２０℃，２０分間
）マイクロキャリアを滅菌する。表面修飾処理方法によ
っては、オートクレーブよりも７０％エタノールで滅菌
したほうがよい場合もある。この場合は、上述のＰＢＳ
洗浄と同じように、７０％エタノールで３回洗浄した後
、室温で一昼夜放置し、さらに３回ＰＢＳで洗浄する。

【００２９】滅菌したマイクロキャリアは、使用に先立
ち、沈降させて上澄液を除き、血清の入っていない約３
７℃に加温した培地を１ｇのマイクロキャリアに対して
１００ｍｌ加えて洗う（　Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｍｉ
ｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ　）　。

【００３０】細胞のマイクロキャリアへの接着において
は、各種の方法があるが、マイクロキャリアと細胞およ
び培地を培養槽に入れ、間歇攪拌や　Ｆｉｃｏｌｌ　法
〔小林　　組織培養　１５　（１９８９）〕等の手法に
より、できるだけ均一に接着させることが重要である。 用意する細胞の濃度としては、例えば、１×１０７　〜
５×１０８　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとして適宜調製したもの
を用いて、接着時細胞濃度として、例えば、１×１０５
〜１×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度になるように使用
すればよい。

【００３１】攪拌懸濁培養においては、細胞接着完了後
、マイクロキャリアが全て懸濁状態に保たれるのに必要
十分な速度に攪拌速度を設定する。培養開始後、必要に
応じて培養液の間歇的あるいは連続的な交換を行うと共
に、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度等を適当な条件、例えば
、３７℃付近、ｐＨ７．４付近にコントロールすること
によって、細胞を良好な生育条件下に維持し、培養液よ
り目的とする細胞生育生成物を採取する。この生成物の
採取、精製にあたっては、ゲル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を適宜選択し
組合わせて、常法により行えばよい。

【００３２】培養条件によっては、細胞数は増加しても
、目的とする細胞生育生成物が期待したほど得られない
現象が見られることもある。その場合でも、培養条件の
最適化等を行うと共に、交換した培養液中の細胞生育生
成物の量をチェックし、所望の量を生産した時点で採取
を行う。その所望生産量は、目的によって異なる。

【００３３】

【発明の効果】本発明の遺伝子組換えＣＨＯ細胞の培養
方法およびその細胞生育生成物の製法は、径が２μｍよ
り大きい大孔径多孔マイクロキャリアを用いるため、細
胞接着性および増殖性が良く、マイクロキャリア内部で
細胞の培養を行うため、攪拌による剪断力が細胞に損傷
を与えることもない。また、内部多孔表面を細胞接着面
として有効に利用することにより、細胞培養濃度を飛躍
的にあげると同時に、生産目的物である細胞生育生成物
の収量を大きく向上させることができる。要するに、本
発明の方法によれば、従来のＣＨＯ細胞の培養方法の欠
点を克服したうえ、細胞培養濃度および細胞生育生成物
の収量を大幅に向上することができる。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を実施例について具体的に説明
する。粒子の径は、光学顕微鏡により適当な倍率に設定
して写真に撮り測定した。未乾燥マイクロキャリアは液
体窒素で急速冷却して、構造を保ったまま凍結した後、
０．１トルの真空中で凍結乾燥後、金スパッタリング処
理をして、走査電子顕微鏡で適当な倍率に拡大し、開孔
径の観察測定を行った。マイクロキャリア内部の開孔径
と膜厚は、上述のように液体窒素で凍結した後、同温度
で割段を行い、そのまま真空中で乾燥以降の処理を施し
、走査電子顕微鏡で観察測定を行い求めた。粒子径、開
孔径については、それらが真球や真円でない場合は、最
も短い直径をもって定義した。

【００３５】実施例１ 精製リンターを原料として調製した５℃における粘度２
ポイズ、セルロース濃度２％、銅濃度１．２％、アンモ
ニア濃度４％のセルロース銅安溶液を、二流体ノズルを
用いて窒素ガスと共に５００ｃｃ噴霧し、−４０℃に冷
却したシリコンオイル（ＳＨ２００，１．５ｃｓ，東レ
社）１０リットル中に攪拌しながら受けた。その後、シ
リコンオイルを−２０℃に昇温し、２０分間攪拌を続け
、−３５℃に冷却した４０％硫酸１０リットルを投入し
た。硫酸投入後、８時間攪拌を続け、２０℃に昇温させ
、シリコンオイルを除去して残りを抜き出し水洗したと
ころ、大量のセルロース球状粒子が得られた。次に、分
級ふるいで粒子径１８０〜２１０μｍの粒子のみを取出
し、表面修飾により、若干の正荷電を導入した後、凍結
乾燥を行い、大孔径多孔マイクロキャリアを得た。別途
、走査電子顕微鏡で粒子の表面および断面を観察すると
同時に写真に撮り、開孔径と膜厚を測定した。粒子表面
内部共に２０〜４０μｍの径の空胞で構成されており、
空胞間の隔膜の厚みは１〜２μｍであった。

【００３６】実施例２ １．培養槽 マイクロキャリア用培養槽として５００ｍｌ容スピナー
フラスコ（　Ｂｅｌｌｃｏ　社）に、温度センサー（外
径３φ，ＡＢＬＥ社）、ｐＨ電極（ＤＰＡＳ／３２５型
，Ｉｎｇｏｌｄ　　社）、溶存酸素電極（１０ＡＮ型，
ＡＢＬＥ社）、多孔性テフロンチューブ（内径３ｍｍ、
外径４ｍｍ、長さ１ｍ、コイル状，ＡＢＬＥ社）、培地
給排用ノズル、マイクロキャリア沈殿管（恒温ジャケッ
ト付き沈殿管，ＡＢＬＥ社）、サンプル採取口（内径３
φ，ＡＢＬＥ社）を装着させた装置を組み立てて使用し
た。ｐＨはＣＯ２　ガスまたはＮａＨＣＯ３　溶液で、
溶存酸素は多孔性テフロンチューブを介して空気または
純酸素を供給することにより、細胞培養用コントローラ
ー（　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ　ＭＯＤＥＬ
　ＡＩＳ−１２，　ＡＢＬＥ社）で制御した。

【００３７】２．マイクロキャリア マイクロキャリアは、実施例１の大孔径多孔マイクロキ
ャリア２ｇを常法にしたがって（　Ｐｈａｒｍａｃｉａ
，　Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕ
ｒｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ
）膨潤させた後、滅菌して使用した。

【００３８】３．細　　胞 細胞は、Ｍ−ＣＳＦ生産遺伝子組換えＣＨＯ細胞を使用
した。

【００３９】４．接　　着 マイクロキャリアへの細胞の接着は　Ｆｉｃｏｌｌ　法
（小林　　組織培養１５　（１９８９）〕により行った
。一方の５００ｍｌ容スピナーフラスコ培養槽には、４
％　Ｆｉｃｏｌｌ　（ファルマシア社）、５％牛胎児血
清（　Ｂｉｏｃｅｌｌ社）、１５０μｇ／ｍｌプロリン
（和光純薬社）含有ＤＭＥ培地（Ｆｌｏｗ社）２５０ｍ
ｌ中に実施例１の大孔径多孔マイクロキャリア及びＭ−
ＣＳＦ生産遺伝子組換えＣＨＯ細胞（１×１０８　個）
を混入し、マグネチックスターラー上、１０ｒｐｍ　で
攪拌しながら接着させた。

【００４０】５．培　　養 接着完了後、ＤＭＥ培地をさらに２５０ｍｌ添加し、攪
拌速度を２５ｒｐｍ　に上げて培養（３７℃，ｐＨ７．
４，無菌空気と純酸素の混合通気）を開始した。培養２
日目より連続的に培地を交換しながら培養を行った。培
養１日目よりマイクロキャリアを含む培養液を採取し、
マイクロキャリア上の細胞数を核染色法（Ｓａｎｆｏｒ
ｄ，　Ｋ　１１　７７３　Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ）
で、また、培養液中のＭ−ＣＳＦ活性はマウス骨髄細胞
コロニー形成法〔　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，　４４，
　２８７−３００　（１９６６）〕によって測定した。 ２０日間の培養経過を図１に示した。

【００４１】さらに、大孔径多孔マイクロキャリアの内
部で増殖した細胞の正確な数を、核染色法でカウントで
きたかどうかを観察するため切片を作成した。細胞数を
核染色法でカウント前後の培養１８日目のマイクロキャ
リアをＰＢＳで２回洗浄した。そのマイクロキャリアを
２％グルタルアルデヒドにいれ、４℃で３時間放置して
細胞を固定した。次に、過剰のグルタルアルデヒドを除
くために水洗し、水溶性メタクリル樹脂に除々に置換し
てゆき、１００％樹脂置換後、６０℃、１２時間で樹脂
を固化した。超ミクロトームにて厚さ１μｍの切片を作
成後、トルイジンブルー染色を行うことにより、細胞の
みを染色した。このようにして作成した切片を１００例
、光学顕微鏡で観察したところ、核染色法でカウントし
た後の大孔径多孔マイクロキャリアの内部には、カウン
ト前の約４０％の細胞が残っていることが判った。した
がって、図１に示した細胞数は、大孔径多孔マイクロキ
ャリアの内部で増殖した細胞の正確な数を核染色法でカ
ウントできていないため、実際よりかなり低めの数値を
示していることが判った。

【００４２】比較例１ 培養槽および細胞は、実施例２と同一のものを用いた。 マイクロキャリアは、Ｃｙｔｏｄｅｘ　Ｉ（ファルマシ
ア社）２ｇを常法にしたがって（　Ｐｈａｒｍａｃｉａ
，　Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕ
ｒｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ
）膨潤させた後、滅菌して使用した。マイクロキャリア
への細胞の接着は、Ｆｉｃｏｌｌ法〔小林　　組織培養
　１５　（１９８９）〕により行った。

【００４３】マイクロキャリア培養槽には、８％　Ｆｉ
ｃｏｌｌ　、５％牛胎児血清、１５０μｇ／ｍｌプロリ
ン含有ＤＭＥ培地２５０ｍｌ中に、Ｃｙｔｏｄｅｘ　Ｉ
　およびＭ−ＣＳＦ生産遺伝子組換えＣＨＯ細胞（１×
１０８　個）を混入し、マグネチックスターラー上、１
０ｒｐｍ　で攪拌しながら接着させた。

【００４４】接着完了後、ＤＭＥ培地をさらに２５０ｍ
ｌ添加し、攪拌速度を２５ｒｐｍ　に上げて培養を開始
した。 培養２日目より、連続的に培地を交換しながら培養を行
った。培養１日目より、マイクロキャリアを含む培養液
を採取し、マイクロキャリア上の細胞数を核染色法（　
Ｓａｎｆｏｒｄ，　Ｋ　１１　７７３　Ｊ．Ｎａｔ．Ｃ
ａｎｃｅｒ　）　で、また、培養液中のＭ−ＣＳＦ活性
はマウス骨髄細胞コロニー形成法〔　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍ
ｅｄ．，　４４，　２８７−３００　（１９６６）〕に
よって測定した。

【００４５】２０日間の培養経過を図２に示した。実施
例２と比較例１の結果および図１と図２とから、以下の
ことがわかる。実施例２の方が比較例１より細胞密度が
少なくとも３倍高い。また、Ｍ−ＣＳＦ生産性で８倍高
く、いずれにおいても、実施例１の大孔径多孔マイクロ
キャリアの方が優れていることが明らかであった。

【００４６】実施例３ １．培養槽 マイクロキャリア用培養槽として　Ｂｅｌｌｃｏ　社製
５００ｍｌ容スピナーフラスコに、温度センサー、ｐＨ
電極、溶存酸素電極、多孔性テフロンチューブ（内径３
ｍｍ、外径４ｍｍ、長さ１ｍ、コイル状，ＡＢＬＥ社）
、培地給排用ノズル、マイクロキャリア沈殿管、サンプ
ル採取口を装着させた装置を組み立てて使用した。ｐＨ
はＣＯ２　ガスまたはＮａＨＣＯ３溶液で、溶存酸素は
多孔性テフロンチューブを介して空気または純酸素を供
給することにより、細胞培養用コントローラーで制御し
た。

【００４７】２．マイクロキャリア マイクロキャリアは、実施例１の多孔性マイクロキャリ
ア２ｇを常法にしたがって（　Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　
Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ
　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ）膨
潤させた後、滅菌して使用した。

【００４８】３．細　　胞 細胞は、インターフェロン生産遺伝子組換えＣＨＯ細胞
を使用した。

【００４９】４．接　　着 マイクロキャリアへの細胞の接着は　Ｆｉｃｏｌｌ　法
〔小林　　組織培養１５　（１９８９）〕により行った
。５００ｍｌ容スピナーフラスコ培養槽には、４％　Ｆ
ｉｃｏｌｌ　、５％牛胎児血清、１５０μｇ／ｍｌプロ
リン含有ＤＭＥ培地（Ｆｌｏｗ社）２５０ｍｌ中に、実
施例１の多孔マイクロキャリアおよびインターフェロン
生産遺伝子組換えＣＨＯ細胞（１×１０８　個）を混入
し、マグネチックスターラー上、１０ｒｐｍ　で攪拌し
ながら接着させた。

【００５０】５．培　　養 接着完了後、ＤＭＥ培地をさらに２５０ｍｌ添加し、攪
拌速度を２５ｒｐｍ　に上げて培養を開始した。培養２
日目より、連続的に培地を交換しながら培養を行った。 培養１日目よりマイクロキャリアを含む培養液を採取し
、マイクロキャリア上の細胞数を核染色法（　Ｓａｎｆ
ｏｒｄ，　Ｋ　１１　７７３　Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅ
ｒ　）で測定した。培養経過を図３に示した。１６日間
の培養で細胞密度は１×１０７　ｃｅｌｌｓ　／ｍｌに
達し、接種細胞密度の約５０倍の細胞を得ることが可能
であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細胞培養の経過およびその生成物活性
の経過図を示す。

【図２】比較例における細胞培養の経過およびその生成
物活性の経過図を示す。

【図３】本発明における細胞培養の経過図を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　膜で隔てられた径が２μｍより大きい
   多数の空胞を有し、該空胞は隣接した空胞間を隔てる膜
   の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成してい
   るマイクロキャリアを用いて、細胞培養媒体中で懸濁液
   を形成させ、これに遺伝子組換えＣＨＯ細胞を接種して
   細胞培養液とし、これを細胞生育条件下に維持すること
   を特徴とする遺伝子組換えＣＨＯ細胞の培養方法。
2. 【請求項２】　　膜で隔てられた径が２μｍより大きい
   多数の空胞を有し、該空胞は隣接した空胞間を隔てる膜
   の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成してい
   るマイクロキャリアを用いて、細胞培養媒体中で懸濁液
   を形成させ、これに遺伝子組換えＣＨＯ細胞を接種して
   細胞培養液とし、これを細胞生育条件下に維持し、該培
   養液から細胞生育生成物を採取することを特徴とする遺
   伝子組換えＣＨＯ細胞の細胞生育生成物の製法。