【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活
性を有する微生物のアラニンラセマーゼ活性を除
去する方法に関する。
Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素はＬ−アス
パラギン酸のみに使用してＬ−アラニンと炭酸ガ
スとを生成する反応を触媒する酵素である。
従来、上記Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
を利用するＬ−アラニンの製造法としては、Ｌ−
アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生
物を基質であるＬ−アスパラギン酸またはその塩
含有培地に培養する方法や該微生物の生産した酵
素を基質に作用させる方法等多数知られている。
しかしながら、一般に微生物の細胞壁の構成成分
としてＤ−アラニンが必須であるため、これらの
微生物は同時にアラニンラセマーゼ活性を有する
ことが知られており、Ｌ−アラニンの生成と共に
Ｄ−アラニンも副生してくる。従つてＬ−アスパ
ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物を用
いて光学純度の高いＬ−アラニンを効率よく製造
するためには該微生物のアラニンラセマーゼ活性
発現を阻止する必要がある。
しかしながら現在知られている酵素を高温で処
理する方法（酵素工学ハンドブツク、P.20，Ａ・
ワイズマン編1977年、講談社発行）ではアラニン
ラセマーゼ活性は抑えられるがＬ−アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素活性も共に抑えられるためＬ−
アラニンの生成量が低下するという難点があつ
た。
しかるに本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、
微生物の有するＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性には全く影響を与えることなく微生物のも
つアラニンラセマーゼ活性のみを選択的に失活さ
せる方法を見出した。
即ち、本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素活性を有する微生物又はその固定化
微生物を酸処理することにより当該微生物又は固
定化微生物のアラニンラセマーゼ活性を除去する
ことができる。
本発明方法において用いられるＬ−アスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物としては
上記活性を有する微生物であればいずれも用いる
ことが出来、かかる微生物としては、例えばシユ
ードモナス・ダクネーIAM1152、アセトバクタ
ー・ランセンスOUT8300、アクロモバクター・
ペスチフアーIAM1446、同ATCC23584、アルカ
リゲネス・フエーカリスATCC25094号等が好適
にあげられる。
これらの微生物は遊離菌体のまま用いることが
でき、該菌体をそれ自体公知の方法で固定化した
微生物であつてもよく、例えばポリアクリルアミ
ドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナン、フアー
セレラン等、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、
ポリビニルアルコールゲル、寒天ゲルで固定化し
た微生物をいずれも本発明の目的に用いることが
できる。上記の内ポリアクリルアミドゲルによる
場合は例えば特公昭53−1831号記載の通り微生物
菌体の水けん濁液にアクリルアミドモノマー、架
橋剤（例えばＮ，N′−メチレンビスアクリルア
ミド）、重合促進剤〔例えばβ−（ジメチルアミ
ノ）プロピオニトリル〕、重合開始剤（例えば過
硫酸カリウム）を加え、ゲル化させることにより
固定化微生物が得られる。また、カラギーナン、
フアーセレラン等の含硫多糖類による場合は例え
ば特開昭53−6483号に記載の通り微生物菌体をカ
ラギーナン水溶液にけん濁しこのけん濁液にゲル
化剤（例えば第４周期以上のアルカリ金属、アル
カリ土類金属、アンモニウムイオン等）を接触さ
せるか冷却してゲル化させることにより固定化微
生物が得られる。含硫多糖類としては分子内の硫
酸基含量10w／ｗ％以上、とりわけ硫酸基含量12
〜62w／ｗ％のものを用いるのが好ましい。その
他、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニ
ルアルコールゲル、寒天ゲル等による場合も、そ
れ自体公知の方法例えば特開昭51−144780号、特
開昭49−30582号、特開昭49−80285号、特開昭51
−133484号記載の方法に従つて当該微生物を処理
することにより容易に相当する固定化微生物を得
ることができる。これらの固定化微生物は例えば
立方体状（１辺約３mm程度）、球状（直径約３mm
程度）、繊維状（径約１mm程度）、膜状あるいは板
状等の適当な形状に成型すればつづいての処理操
作を効率よく実施できるので好ましい。
上記の如き微生物又は固定化微生物の酸処理は
当該微生物又は固定化微生物を酸溶液中に浸漬す
るか又は当該微生物又は固定化微生物を含有する
液中に酸を加えることにより実施できる。酸とし
ては例えば酢酸、乳酸、酒石酸等の有機酸、塩
酸、硫酸等の無機酸をいずれも用いることがで
き、とりわけ酢酸を用いるのが好ましい。これら
酸による処理はPH３〜６、とりわけ４〜5.5の条
件下に実施するのが好ましく、又酸は水溶液それ
自体だけでなく酸緩衝液をも用いることができ
る。
微生物又は固定化微生物含有液中に酸を加えて
実施する場合には前記酸を上記PH範囲となるよう
に酸の添加量を調整することにより行なう。更に
微生物又は固定化微生物の酸処理は約０〜60℃、
とりわけ約20〜50℃で実施するのが好ましい。接
触時間は微生物が遊離菌体の場合約３分〜24時
間、とりわけ約５分〜10時間程度とするのが好ま
しく、固定化微生物の場合には約10分〜５日間、
とりわけ約１〜48時間程度とするのが好ましい。
かくして得られたアラニンラセマーゼ活性の除
去された微生物または固定化微生物にＬ−アスパ
ラギン酸またはその塩を作用させるとＬ−アラニ
ンが得られ、またDL−アスパラギン酸またはそ
の塩を作用させるとＬ−アラニンとＤ−アスパラ
ギン酸が得られる。ここでＬ−アスパラギン酸ま
たはDL−アスパラギン酸の塩としては、例えば
それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、アンモニウム塩等が好ましい。酵素反応は、
０〜50℃の広い温度範囲で実施することができる
が、微生物の酵素の安定性を考慮して30〜40℃で
実施するのが好ましい。尚、上記酵素反応に際し
ては基質溶液にピリドキサールリン酸、ケト酸
（例えばピルビン酸、ａ−ケトグルタール酸等）
等を適宜添加することにより該酵素反応を一層促
進させることが出来、また更にコバルトイオン、
ニツケルイオン等の２価金属イオンを添加すると
微生物の酵素活性の安定性を高めることが出来
る。
上記において、遊離の微生物を用いる場合の反
応はバツチ法で実施するのが好ましい。又、固定
化微生物を用いる場合の反応は使用する固定化微
生物が水に不溶性であるため、バツチ法によるの
みならずカラム法によつて連続的に実施すること
が出来る。例えばカラム法による場合、該固定化
微生物をカラムに充填し、このカラムにＬ−アス
パラギン酸、DL−アスパラギン酸またはそれら
の塩を有する溶液を適当な速度で導通すればＬ−
アラニンのみ、あるいはＬ−アラニンとＤ−アス
パラギン酸とを含む流出液が得られる。なおこの
場合、酵素反応により生成する炭酸ガスのカラム
内への滞留を避けるため基質溶液はカラム下部よ
り上部に向けて流すのが好ましい。またバツチ法
による場合、該固定化微生物を上記基質溶液にけ
ん濁し、かく拌する如き方法によりＬ−アラニン
のみあるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸
とを含む反応液が得られる。この場合には反応終
了液から固定化微生物をろ過あるいは遠心分離す
る如き方法により取得すれば再びこれを反覆使用
することができる。これらの方法において、基質
としてDL−アスパラギン酸またはその塩を用い
る場合Ｌ−アラニンとＤ−アスパラギン酸とを含
む溶液が得られるが、これらの両者は例えば直接
晶析法、イオン交換樹脂処理等の公知の単離精製
操作を適宜組合せることにより容易に分離採取す
ることができる。上記反応を実施するにあたつて
反応進行率は固定化微生物の量、温度、反応時
間、基質の流速その他により影響される。例えば
カラム法による場合は使用する固定化微生物の量
に従い基質溶液の導通速度を、またバツチ法によ
る場合はその反応時間を適当に調整することによ
り反応進行率を100％にまで高める至適条件を見
出すことも容易である。
以上の如く、本発明方法は(1)Ｌ−アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物を酸処理す
るという極めて簡単な操作で該微生物のアラニン
ラセマーゼ活性を完全に除去できること；(2)該方
法は遊離の微生物にも固定化微生物にもともに適
用できること；(3)又、一旦除去されたアラニンラ
セマーゼ活性は長期間酵素反応を実施しても再び
出現することがないこと；(4)更にアラニンラセマ
ーゼ活性の除去された微生物を公知の方法で固定
化してもその得られる効果には何ら変りがない
等、種々のすぐれた特徴及び効果を有するもので
ある。又、本発明方法によりアラニンラセマーゼ
活性の除去された微生物あるいは固定化微生物を
用いてＬ−アスパラギン酸（又はDL−アスパラ
ギン酸）からＬ−アラニン（又はＬ−アラニンと
Ｄ−アスパラギン酸）を製造すれば生成物中に
DL−アラニンが含まれていないので再結晶等後
処理が不用であり、Ｌ−アスパラニンの工業的に
極めてすぐれた製造方法となるものである。
以下、実験例、実施例により本発明をさらに詳
細に説明する。
実験例 １
下記により調製した微生物を用いてＬ−アスパ
ラギン酸からＬ−アラニンを生成させ、その際副
生するＤ−アラニン生成物を比較した。
(1) 微生物の調製
（本発明方法による微生物の調製）
グルタミン酸ナトリウム3.2％、ミースト0.5
％、第１リン酸カリウム0.05％、硫酸マグネシウ
ム0.01％を含む培地（PH7.3）120mlを500ml容坂
口フラスコに入れ、これにシユードモナス・ダク
ネーIAM1152を植菌した。30℃で24時間培養し
たのち酢酸2.6mlを加えPHを4.75に調整し30℃で
１時間放置した。
（対照微生物の調製）
酢酸処理をしない以外は上記と同様にして微生
物を調製した。
(2) 実験方法
上記で得られた微生物各1gを、10-4Ｍピリドキ
サールリン酸と、0.05％ポリオキシエチレンオク
チルフエニルエーテルを含む1ML−アスパラギ
ン酸アンモニウム水溶液（アンモニアでPH6.0に
調整）70mlを入れた200ml容三角フラスコに加え
37℃にて振とう反応させ反応中の全アラニン量と
Ｄ−アラニン量を経時的に測定した。
尚、全アラニン量の測定はロイコノストツク・
チトロボラムATCC8081を用いるバイオアツセイ
により行ない、Ｄ−アラニン量の測定は豚腎より
調製したＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させ生
成したピルビン酸をヒドラゾンとして測定する方
法で行なつた。
(3) 結果
結果は後記図面に示す通りであり本発明方法に
より調製した微生物はＤ−アラニンを全く生成し
ないのに対し対照の微生物は22時間目におけるＤ
−アラニン生成量が約20％に達することが認めら
れた。
実験例 ２
下記により調製した固定化微生物を用い連続酵
素反応を実施し反応終了液中のＤ−アラニン生成
量を比較した。
(1) 固定化微生物の調製
（本発明方法による固定化微生物の調製）
実験例１(1)と同様の培地を500ml容坂口フラス
コ10本に120ml宛分注しこれにシユードモナス・
ダクネーIAM1152を植菌した。30℃で24時間振
とう培養したのちピリドキサールリン酸300mgを
添加しこれに酢酸26mlを加えPHを4.75に調整し30
℃で１時間放置した。これに3N水酸化ナトリウ
ム86mlを加えPH6.0に調整したのち遠心分離する
ことによりシユードモナス・ダクネー菌体20g
（湿重量）を集めた。
別にゲニユーゲルWG（商品名、コペンハーゲ
ンペクチンフアクトリー社製のカラギーナン、以
下同）4.03gを50℃の温水85mlに溶解しカラギー
ナン水溶液を調製した。この溶液に上記で得たシ
ユードモナス・ダクネーの菌体20gを生理的食塩
水20mlにけん濁したものを45℃にて添加混合し
た。４℃にて30分間放置したのち生成したゲルを
一辺３mmの立方体に成型することにより固定化シ
ユードモナス・ダクネーを得る。
（本発明方法の固定化微生物の調製）
上記と同様の培地、菌体を用いて上記と同様に
30℃で24時間振とう培養したのち遠心分離してシ
ユードモナス・ダクネー菌体20g（湿重量）を集
めた。
別にゲニユーゲルWG4.03gを50℃の温水85ml
に溶解しカラギーナン水溶液を調製する。この溶
液に上記で得たシユードモナス・ダクネーの菌体
20gを生理的食塩水20mlにけん濁したものを45℃
にて添加混合した。４℃にて30分間放置したのち
生成したゲルを一辺３mmの立方体に成型した。こ
のゲルを10mML−アスパラギン酸および２％塩
化カリウムを含む0.2M酢酸緩衝液（PH5.0）260
ml中に浸漬し37℃にて24時間放置した。その後２
％塩化カリウム水溶液で洗浄することにより固定
化シユードモナス・ダクネーを得る。
（対照微生物の調製）
上記本発明方法による微生物と同様にして調
製し、一辺３mmの立方体に成型した固定化微生物
を以後何ら処理することなく用いた。
(2) 実験方法
固定化シユードモナス・ダクネー40gをそれぞ
れ外とう管付カラム（内径1.6cm×長さ19cm）に
充填し、37℃にて10-4Ｍピリドキサールリン酸を
含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム溶液
（アンモニアにてPH6.0に調整）をカラム下部より
上方に向つて12ml／hrの流速で導通した。定常状
態に達した後、流出液中の全アラニンとＤ−アラ
ニン濃度を経時的に測定した。
尚、全アラニン量およびＤ−アラニン量の測定
は実験例１と同様にして行なつた。
(3) 結果
結果は下記表に示す通りであり、本発明方法に
より調製した固定化微生物はＤ−アラニンを全く
生成しないのに対し、対照の固定化微生物は約５
％のＤ−アラニンを生成することが認められた。
The present invention relates to a method for removing alanine racemase activity of a microorganism having L-aspartate β-decarboxylase activity. L-aspartate β-decarboxylase is an enzyme that uses only L-aspartic acid to catalyze a reaction that produces L-alanine and carbon dioxide gas. Conventionally, as a method for producing L-alanine using the above-mentioned L-aspartate β-decarboxylase, L-
Many methods are known, including a method of culturing a microorganism having aspartate β-decarboxylase activity in a medium containing L-aspartic acid or its salt as a substrate, and a method of allowing an enzyme produced by the microorganism to act on a substrate.
However, since D-alanine is generally essential as a component of the cell wall of microorganisms, it is known that these microorganisms also have alanine racemase activity, and D-alanine is also produced as a by-product along with the production of L-alanine. come. Therefore, in order to efficiently produce L-alanine with high optical purity using a microorganism having L-aspartate β-decarboxylase activity, it is necessary to prevent the microorganism from expressing alanine racemase activity. However, currently known methods of treating enzymes at high temperatures (Enzyme Engineering Handbook, P.20, A.
(ed. Wiseman, 1977, published by Kodansha), alanine racemase activity is suppressed, but L-aspartate β-decarboxylase activity is also suppressed, so L-
The problem was that the amount of alanine produced decreased. However, as a result of intensive research, the present inventors found that
We have found a method for selectively inactivating only the alanine racemase activity of microorganisms without affecting the L-aspartate β-decarboxylase activity of microorganisms at all. That is, according to the present invention, L-aspartic acid β
- By acid-treating a microorganism having decarboxylase activity or its immobilized microorganism, the alanine racemase activity of the microorganism or immobilized microorganism can be removed. As the microorganism having L-aspartate β-decarboxylase activity used in the method of the present invention, any microorganism having the above activity can be used. Examples of such microorganism include Pseudomonas dacne IAM1152, Acetobacter Lancens OUT8300, Achromobacter
Preferred examples include Pestifur IAM 1446, Pestifa ATCC 23584, and Alcaligenes faecalis ATCC 25094. These microorganisms can be used as free cells, or may be microorganisms in which the cells are immobilized by a method known per se, such as polyacrylamide gel, sulfur-containing polysaccharide gel (carrageenan, furcerelan, etc.). collagen gel, alginate gel,
Both microorganisms immobilized in polyvinyl alcohol gel and agar gel can be used for the purpose of the present invention. In the case of polyacrylamide gel, for example, as described in Japanese Patent Publication No. 53-1831, an acrylamide monomer, a crosslinking agent (e.g. N,N'-methylenebisacrylamide), a polymerization accelerator [e.g. [beta]-(dimethylamino)propionitrile] and a polymerization initiator (e.g., potassium persulfate) are added and gelled to obtain an immobilized microorganism. Also, carrageenan,
In the case of using a sulfur-containing polysaccharide such as fur-cerelan, for example, as described in JP-A No. 53-6483, microbial cells are suspended in an aqueous carrageenan solution, and this suspension is added with a gelling agent (e.g., an alkali metal of 4th period or higher, an alkali Immobilized microorganisms can be obtained by contacting the microorganisms (earth metals, ammonium ions, etc.) or by cooling to gel. As a sulfur-containing polysaccharide, the sulfate group content in the molecule is 10 w/w% or more, especially the sulfate group content 12
It is preferable to use 62 w/w%. In addition, when collagen gel, alginate gel, polyvinyl alcohol gel, agar gel, etc. are used, methods known per se are used, such as JP-A-51-144780, JP-A-49-30582, JP-A-49-80285, and JP-A-49-80285. 1978
Corresponding immobilized microorganisms can be easily obtained by treating the microorganisms according to the method described in No. 133484. These immobilized microorganisms are, for example, cubic (approximately 3 mm on a side) or spherical (approximately 3 mm in diameter).
It is preferable to form the material into an appropriate shape such as a fiber (approximately 1 mm in diameter), a membrane, or a plate because the subsequent processing operations can be carried out efficiently. The acid treatment of microorganisms or immobilized microorganisms as described above can be carried out by immersing the microorganisms or immobilized microorganisms in an acid solution, or by adding an acid to a liquid containing the microorganisms or immobilized microorganisms. As the acid, any of organic acids such as acetic acid, lactic acid, and tartaric acid, and inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid can be used, and it is particularly preferable to use acetic acid. The treatment with these acids is preferably carried out under conditions of pH 3 to 6, particularly 4 to 5.5, and not only an aqueous solution of the acid itself but also an acid buffer can be used. When an acid is added to a microorganism or a solution containing immobilized microorganisms, the amount of the acid added is adjusted so that the pH range is as described above. Furthermore, acid treatment of microorganisms or immobilized microorganisms is carried out at approximately 0 to 60°C;
It is especially preferred to carry out the reaction at a temperature of about 20-50°C. The contact time is preferably about 3 minutes to 24 hours, especially about 5 minutes to 10 hours when the microorganism is a free cell, and about 10 minutes to 5 days when the microorganism is immobilized.
In particular, it is preferably about 1 to 48 hours. When the thus obtained microorganism from which alanine racemase activity has been removed or the immobilized microorganism is treated with L-aspartic acid or a salt thereof, L-alanine is obtained, and when treated with DL-aspartic acid or a salt thereof, L-alanine is obtained. and D-aspartic acid are obtained. Here, as the salt of L-aspartic acid or DL-aspartic acid, for example, their sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonium salt, etc. are preferable. The enzymatic reaction is
Although it can be carried out in a wide temperature range of 0 to 50°C, it is preferably carried out at 30 to 40°C in consideration of the stability of the enzyme of the microorganism. In addition, during the above enzyme reaction, pyridoxal phosphate, keto acid (e.g. pyruvic acid, a-ketoglutaric acid, etc.) is added to the substrate solution.
The enzymatic reaction can be further promoted by appropriately adding cobalt ions, cobalt ions, etc.
Addition of divalent metal ions such as nickel ions can increase the stability of enzyme activity of microorganisms. In the above, when free microorganisms are used, the reaction is preferably carried out by a batch method. Furthermore, the reaction using immobilized microorganisms can be carried out continuously not only by the batch method but also by the column method, since the immobilized microorganisms used are insoluble in water. For example, when using a column method, the immobilized microorganisms are packed in a column, and a solution containing L-aspartic acid, DL-aspartic acid, or a salt thereof is passed through the column at an appropriate rate.
An effluent containing only alanine or L-alanine and D-aspartic acid is obtained. In this case, it is preferable to flow the substrate solution from the bottom of the column to the top in order to avoid retention of carbon dioxide gas generated by the enzyme reaction in the column. In the batch method, the immobilized microorganism is suspended in the substrate solution and stirred to obtain a reaction solution containing only L-alanine or L-alanine and D-aspartic acid. In this case, if the immobilized microorganisms are obtained from the reaction-completed solution by a method such as filtration or centrifugation, they can be used repeatedly. In these methods, when DL-aspartic acid or its salt is used as a substrate, a solution containing L-alanine and D-aspartic acid is obtained, but both of these can be obtained by direct crystallization, ion exchange resin treatment, etc. It can be easily separated and collected by appropriately combining known isolation and purification operations. In carrying out the above reaction, the rate of reaction progress is influenced by the amount of immobilized microorganisms, temperature, reaction time, substrate flow rate, and other factors. For example, when using the column method, the conduction rate of the substrate solution is adjusted according to the amount of immobilized microorganisms used, and when using the batch method, the reaction time is adjusted appropriately to find the optimal conditions to increase the reaction progress rate to 100%. It is also easy to find. As described above, the method of the present invention can (1) completely remove the alanine racemase activity of a microorganism having L-aspartate β-decarboxylase activity by an extremely simple operation of acid-treating the microorganism; The method can be applied to both free microorganisms and immobilized microorganisms; (3) Furthermore, the alanine racemase activity, once removed, does not reappear even if the enzymatic reaction is carried out for a long period of time; (4) It has various excellent characteristics and effects, such as the fact that even if microorganisms from which alanine racemase activity has been removed are immobilized by a known method, there is no change in the effect obtained. Furthermore, L-alanine (or L-alanine and D-aspartic acid) can be produced from L-aspartic acid (or DL-aspartic acid) using a microorganism from which alanine racemase activity has been removed or an immobilized microorganism by the method of the present invention. in the product
Since it does not contain DL-alanine, post-treatments such as recrystallization are not required, making it an extremely excellent method for producing L-asparanine industrially. Hereinafter, the present invention will be explained in further detail using experimental examples and examples. Experimental Example 1 L-alanine was produced from L-aspartic acid using a microorganism prepared as described below, and the D-alanine product produced as a by-product was compared. (1) Preparation of microorganisms (preparation of microorganisms by the method of the present invention) Monosodium glutamate 3.2%, Meast 0.5
%, monobasic potassium phosphate 0.05%, and magnesium sulfate 0.01% (PH7.3) (120 ml) was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, and Pseudomonas dacne IAM1152 was inoculated into the flask. After culturing at 30°C for 24 hours, 2.6 ml of acetic acid was added to adjust the pH to 4.75, and the mixture was left at 30°C for 1 hour. (Preparation of control microorganism) A microorganism was prepared in the same manner as above except that no acetic acid treatment was performed. (2) Experimental method 1 g of each of the microorganisms obtained above was added to 1 ML ammonium aspartate aqueous solution containing 10 -4 M pyridoxal phosphate and 0.05% polyoxyethylene octyl phenyl ether (adjusted to pH 6.0 with ammonia). Add to the 200ml Erlenmeyer flask containing 70ml
A shaking reaction was carried out at 37°C, and the total amount of alanine and the amount of D-alanine during the reaction were measured over time. In addition, the total alanine amount can be measured using Leuconostoc.
The amount of D-alanine was measured by bioassay using Titroborum ATCC8081, and the amount of D-alanine was measured by measuring pyruvic acid produced by the action of D-amino acid oxidase prepared from pig kidney as hydrazone. (3) Results The results are as shown in the drawings below; the microorganism prepared by the method of the present invention does not produce any D-alanine, whereas the control microorganism produces no D-alanine at 22 hours.
- It was observed that the amount of alanine produced reached approximately 20%. Experimental Example 2 A continuous enzymatic reaction was performed using the immobilized microorganism prepared as described below, and the amount of D-alanine produced in the reaction solution was compared. (1) Preparation of immobilized microorganisms (preparation of immobilized microorganisms by the method of the present invention) Dispense 120 ml of the same medium as in Experimental Example 1 (1) into ten 500 ml Sakaguchi flasks, and add Pseudomonas.
Dakune IAM1152 was inoculated. After culturing with shaking at 30°C for 24 hours, 300 mg of pyridoxal phosphate was added, and 26 ml of acetic acid was added to this to adjust the pH to 4.75.
It was left at ℃ for 1 hour. After adding 86 ml of 3N sodium hydroxide to this and adjusting the pH to 6.0, centrifugation was performed to obtain 20 g of Pseudomonas dacne bacteria.
(wet weight) was collected. Separately, 4.03 g of Genyugel WG (trade name, carrageenan manufactured by Copenhagen Pectin Factory, hereinafter the same) was dissolved in 85 ml of 50°C warm water to prepare a carrageenan aqueous solution. To this solution, 20 g of the Pseudomonas dacne cells obtained above were suspended in 20 ml of physiological saline and mixed at 45°C. After standing at 4°C for 30 minutes, the resulting gel was molded into a cube with sides of 3 mm to obtain immobilized Pseudomonas dacne. (Preparation of immobilized microorganisms according to the method of the present invention) In the same manner as above using the same medium and bacterial cells as above.
After culturing with shaking at 30°C for 24 hours, 20 g (wet weight) of Pseudomonas dacne cells were collected by centrifugation. Separately, add 4.03g of Genyugel WG to 85ml of 50℃ warm water.
Prepare a carrageenan aqueous solution by dissolving it in Add the Pseudomonas dacne cells obtained above to this solution.
Suspend 20g in 20ml of physiological saline at 45℃
The mixture was added and mixed at . After standing at 4°C for 30 minutes, the resulting gel was molded into a cube with sides of 3 mm. Transfer this gel to 10mL-0.2M acetate buffer (PH5.0) containing aspartic acid and 2% potassium chloride at 260 mL.
ml and left at 37°C for 24 hours. After that 2
Obtain immobilized Pseudomonas dacne by washing with % potassium chloride aqueous solution. (Preparation of control microorganism) An immobilized microorganism prepared in the same manner as the microorganism according to the method of the present invention described above and molded into a cube of 3 mm on a side was used without any further treatment. (2) Experimental method 40 g of immobilized Pseudomonas dacne was packed into a column with an outer jacket tube (inner diameter 1.6 cm x length 19 cm), and 1 ML ammonium aspartate solution containing 10 -4 M pyridoxal phosphate ( (pH adjusted to 6.0 with ammonia) was passed upward from the bottom of the column at a flow rate of 12 ml/hr. After reaching steady state, the total alanine and D-alanine concentrations in the effluent were measured over time. Incidentally, the total alanine amount and the D-alanine amount were measured in the same manner as in Experimental Example 1. (3) Results The results are shown in the table below. The immobilized microorganisms prepared by the method of the present invention do not produce any D-alanine, while the control immobilized microorganisms produce about 5% D-alanine.
% of D-alanine was observed.
【表】
実施例 １
(1) 微生物の調製
グルタミン酸ナトリウム3.2％、ミースト0.5
％、第１リン酸カリウム0.05％、硫酸マグネシウ
ム0.01％を含む培地（PH7.3）120mlを500ml容坂
口フラスコに入れ、これにシユードモナス・ダク
ネーIAM1152を植菌した。30℃で24時間培養し
たのち酢酸2.6mlを加えPHを4.75に調整し30℃で
１時間放置した。
(2) Ｌ−アラニンの製造
上記(1)で得た培養液100mlにポリオキシエチレ
ンオクチルフエニルエーテル0.05％を添加しＬ−
アスパラギン酸100gを加えて24時間反応させた。
生成したＬ−アラニンの結晶をろ取しろ液はアン
バーライトIR−120を充填したカラムで処理して
Ｌ−アラニンを回収した。ろ取して得た結晶と樹
脂処理により回収したＬ−アラニンを合せ活性炭
処理することにより、Ｌ−アラニン61.8gを結晶
として得る。回収率92.3％（Ｌ−アスパラギン酸
より）
m.P.297℃ （分解）
〔α〕23 D＋14.4°（Ｃ＝6.46，Ｎ−NCl）
実施例 ２
(1) 固定化微生物の調製
グルタミン酸ナトリウム3.2％、ミースト0.5
％、第１リン酸カリウム0.05％、硫酸マグネシウ
ム0.01％を含む培地（PH7.3）を500ml容坂口フラ
スコ10本に120ml宛分注しこれにシユードモナ
ス・ダクネーIAM1152を植菌した。30℃で24時
間振とう培養したのちピリドキサールリン酸300
mgを添加し、これに酢酸26mlを加えPHを4.75に調
整し30℃で１時間放置した。これに３規定水酸化
ナトリウム86mlを加えPHを6.0に調整したのち遠
心分離することによりシユードモナス・ダクネー
菌体20g（湿重量）を集めた。
別にゲニユーゲルWG4.03gを50℃の温水85ml
に溶解しカラギーナン水溶液を調製した。この溶
液に上記で得たシユードモナス・ダクネーの菌体
20gを生理的食塩水20mlにけん濁したものを45℃
にて添加混合した。４℃にて30分間放置したのち
生成したゲルを１辺約３mmの立方体に成型するこ
とにより固定化シユードモナス・ダクネー130g
（湿重量）を得た。
(2) Ｌ−アラニンの製造
上記(1)で得た固定化シユードモナス・ダクネー
40gを外とう管付カラム（内径1.6cm×長さ19cm）
に充填し37℃にて10-4Ｍピリドキサールリン酸を
含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム溶液
（アンモニアにてPH6.0に調整）500mlをカラム下
部より上方に向つて12ml／hrの流速で導通した。
流出液500mlを全量150mlになるまで濃縮しエタノ
ール150mlを加えた。析出晶をろ取し冷メタノー
ル30mlで洗浄することによりＬ−アラニン40.5g
を結晶として得る。
m.P. 297℃ （分解）
〔α〕23 D＋14.4°（Ｃ＝6.46，Ｎ−HCl）
実施例 ３
(1) 固定化微生物の調製
実施例２(1)で用いた培地と同様の培地を500ml
容坂口フラスコ10本に120ml宛分注しこれにシユ
ードモナス・ダクネーIAM1152を植菌した。30
℃で24時間振とう培養したのち遠心分離すること
によりシユードモナス・ダクネー菌体20g（湿重
量）を集めた。
別にゲニユーゲルWG4.03gを50℃の温水85ml
に溶解しカラギーナン水溶液を調製する。この溶
液に上記で得たシユードモナス・ダクネーの菌体
20gを生理的食塩水20mlにけん濁したものを45℃
にて添加混合した。４℃にて30分間放置したの
ち、生成したゲルを一辺３mmの立方体に成型し
た。このゲルを10mML−アスパラギン酸および
２％塩化カリウムを含む0.2M酢酸緩衝液（PH
5.0）260ml中に浸漬し37℃にて24時間放置した。
その後、２％塩化カリウム水溶液で洗浄すること
によりアラニンラセマーゼ活性を有しない固定化
シユードモナス・ダクネー130g（湿重量）を得
た。
(2) Ｌ−アラニンとＤ−アスパラギン酸の製造
上記(1)で得た固定化シユードモナス・ダクネー
40gを外とう管付きカラム（内径1.6cm×長さ19
cm）に充填し、37℃にて10-4Ｍピリドキサールリ
ン酸を含む1MDL−アスパラギン酸アンモニウム
水溶液（アンモニアにてPH6.0に調整）500mlをカ
ラム下部より上方に向つて15ml／hrの流速で導通
し、流出液500mlを約100mlとなるまで濃縮しPH
3.0に調整した。析出晶をろ取し冷水で洗浄する
ことによりＤ−アスパラギン酸30.4gを得る。
〔α〕25 D−24.9°（Ｃ＝２，5N−HCl）
Ｄ−アスパラギン酸をろ取したろ液をアンバー
ライトR4B（OH-型）樹脂カラムに導通した。
流出液を減圧濃縮しエタノールを加えることによ
り、Ｌ−アラニン19.0gを得た。
m.P. 297℃ （分解）
〔α〕23 D＋14.4°（Ｃ＝6.46，Ｎ−HCl）
実施例 ４
(1) 微生物の調製
実施例１(1)と同様にして得たシユードモナス・
ダクネーIAM1152の培養終了液120mlに6N塩酸
８mlを加えPH4.7に調整し30°で30分間放置した。
(2) Ｌ−アラニンの製造
上記(1)で得た培養液100mlを用い実施例１(2)と
同様に処理することによりＬ−アラニン61.9gを
結晶として得る。回収率92.4g（Ｌ−アスパラギン
酸より）
m.P.297℃ （分解）
〔α〕23 D＋14.4°（Ｃ＝6.46，Ｎ−HCl）[Table] Example 1 (1) Preparation of microorganisms Monosodium glutamate 3.2%, Meat 0.5
%, monobasic potassium phosphate 0.05%, and magnesium sulfate 0.01% (PH7.3) (120 ml) was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, and Pseudomonas dacne IAM1152 was inoculated into the flask. After culturing at 30°C for 24 hours, 2.6 ml of acetic acid was added to adjust the pH to 4.75, and the mixture was left at 30°C for 1 hour. (2) Production of L-alanine Add 0.05% polyoxyethylene octyl phenyl ether to 100 ml of the culture solution obtained in (1) above.
100 g of aspartic acid was added and reacted for 24 hours.
The produced L-alanine crystals were collected by filtration, and the filtrate was treated with a column packed with Amberlite IR-120 to recover L-alanine. The crystals obtained by filtration and the L-alanine recovered by resin treatment are combined and treated with activated carbon to obtain 61.8 g of L-alanine as crystals. Recovery rate 92.3% (from L-aspartic acid) mP297℃ (decomposition) [α] 23 D +14.4° (C = 6.46, N-NCl) Example 2 (1) Preparation of immobilized microorganisms Sodium glutamate 3.2%, Meest 0.5
%, potassium monophosphate 0.05%, and magnesium sulfate 0.01% (PH 7.3) was dispensed into 10 500 ml Sakaguchi flasks to 120 ml, and Pseudomonas dacne IAM1152 was inoculated into the flasks. After shaking culture at 30℃ for 24 hours, pyridoxal phosphate 300
26 ml of acetic acid was added thereto to adjust the pH to 4.75, and the mixture was left at 30°C for 1 hour. After adjusting the pH to 6.0 by adding 86 ml of 3N sodium hydroxide, 20 g (wet weight) of Pseudomonas dacne cells were collected by centrifugation. Separately, add 4.03g of Genyugel WG to 85ml of 50℃ warm water.
A carrageenan aqueous solution was prepared. Add the Pseudomonas dacne cells obtained above to this solution.
Suspend 20g in 20ml of physiological saline at 45℃
The mixture was added and mixed at . After standing at 4℃ for 30 minutes, the resulting gel was molded into a cube of approximately 3 mm on each side to immobilize Pseudomonas dacne (130 g).
(wet weight) was obtained. (2) Production of L-alanine Immobilized Pseudomonas dacne obtained in (1) above
40g into a column with outer jacket tube (inner diameter 1.6cm x length 19cm)
500 ml of a 1 ML ammonium aspartate solution (adjusted to pH 6.0 with ammonia) containing 10 -4 M pyridoxal phosphate was passed upward from the bottom of the column at 37°C at a flow rate of 12 ml/hr.
500 ml of the effluent was concentrated to a total volume of 150 ml, and 150 ml of ethanol was added. 40.5 g of L-alanine was obtained by filtering the precipitated crystals and washing with 30 ml of cold methanol.
obtained as crystals. mP 297℃ (decomposition) [α] 23 D +14.4° (C = 6.46, N-HCl) Example 3 (1) Preparation of immobilized microorganisms A medium similar to that used in Example 2 (1) was used. 500ml
The mixture was dispensed into 120 ml volumes into 10 Sakaguchi flasks, and Pseudomonas dacne IAM1152 was inoculated into the flasks. 30
After shaking culture at ℃ for 24 hours, 20 g (wet weight) of Pseudomonas dacne cells were collected by centrifugation. Separately, add 4.03g of Genyugel WG to 85ml of 50℃ warm water.
Prepare a carrageenan aqueous solution by dissolving it in Add the Pseudomonas dacne cells obtained above to this solution.
Suspend 20g in 20ml of physiological saline at 45℃
The mixture was added and mixed at . After standing at 4°C for 30 minutes, the resulting gel was molded into a cube with sides of 3 mm. The gel was washed in 0.2M acetate buffer (PH) containing 10mM aspartic acid and 2% potassium chloride.
5.0) It was immersed in 260ml and left at 37°C for 24 hours.
Thereafter, 130 g (wet weight) of immobilized Pseudomonas dacne having no alanine racemase activity was obtained by washing with a 2% aqueous potassium chloride solution. (2) Production of L-alanine and D-aspartic acid Immobilized Pseudomonas dacnae obtained in (1) above
Transfer 40g to a column with outer shell (inner diameter 1.6cm x length 19cm)
cm), and at 37°C, add 500 ml of 1MDL-ammonium aspartate aqueous solution (adjusted to pH 6.0 with ammonia) containing 10 -4 M pyridoxal phosphate from the bottom of the column upward at a flow rate of 15 ml/hr. Concentrate 500ml of the effluent to approximately 100ml and adjust the pH.
Adjusted to 3.0. The precipitated crystals were collected by filtration and washed with cold water to obtain 30.4 g of D-aspartic acid. [α] 25 D -24.9° (C=2,5N-HCl) The filtrate from which D-aspartic acid was collected by filtration was passed through an Amberlite R4B (OH - type) resin column.
The effluent was concentrated under reduced pressure and ethanol was added to obtain 19.0 g of L-alanine. mP 297℃ (decomposition) [α] 23 D +14.4° (C = 6.46, N-HCl) Example 4 (1) Preparation of microorganisms Pseudomonas obtained in the same manner as in Example 1 (1)
8 ml of 6N hydrochloric acid was added to 120 ml of the cultured solution of Dakune IAM1152, the pH was adjusted to 4.7, and the mixture was left at 30° for 30 minutes. (2) Production of L-alanine 100 ml of the culture solution obtained in (1) above was treated in the same manner as in Example 1 (2) to obtain 61.9 g of L-alanine as crystals. Recovery rate 92.4g (from L-aspartic acid) mP297℃ (decomposition) [α] 23 D +14.4° (C = 6.46, N-HCl)
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
図面は実験例１において本発明方法によりアラ
ニンラセマーゼ活性を除去した微生物と対照微生
物を用いてＬ−アラニンをバツチ法により生成さ
せた場合の、反応中に副生するＤ−アラニン量と
生成する全アラニン量を示す。図面中において
（）は本発明方法によりアラニンラセマーゼ活
性を除去した微生物を、（）は対照微生物を表
わす。
The figure shows the amount of D-alanine by-produced during the reaction and the total amount of D-alanine produced when L-alanine was produced by a batch method using a microorganism whose alanine racemase activity was removed by the method of the present invention and a control microorganism in Experimental Example 1. Indicates the amount of alanine. In the drawings, () represents a microorganism whose alanine racemase activity was removed by the method of the present invention, and () represents a control microorganism.