JPH0428689B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン共重
合体と、特定した抗原とから形成された複合体及
びその製造方法に関する。この複合体は特異的抗
原に対する抗体の産生を抑制することにより機能
する。抗原とは、個体中に導入されるとその個体
による抗体の産生を引き起こしそしてこれらの抗
体と特異的に反応する巨大分子であると定義され
る。 免疫系統を含んで成る器管、細胞及び分子の基
礎的機能は異物（foreign substances）を認知し
そしてそれを体から除去することである。これら
の異物は、この異物と該異物に応答して産生され
る抗体との間の反応により除去される。一般に、
この機能は効果的に且つ宿生を害することなく達
成される。しかしながら、或る場合においては、
たとえば制御されない反応（アレルギー疾患）又
は異常反応〔自己免疫疾患（autoimmune
disease）〕の如き病原性疾患をもたらし得る障害
が起こることがある。これらの両疾患の発病学は
環境的抗原（allergens）又は自己抗原（self−
antigens）に対する抗体の産生に直接又は間接に
関係している。更に、免疫系統の機能は異物を認
知し且つ除去することであるので、遺伝的に同一
でない（即ちallogenic）受容体個体へ供与体か
ら健康な組織及び器官を移植することはアログラ
フト（allograft）反応の故に達成することが困
難である。 個体は抗原との接触（及びそれに対する抗体の
産生）の結果として変化した状態（altered
state）を経験するならば、その抗原又は構造的
に同様な物質とのその後における接触は病理学的
反応を誘発する。かかる個体は１種又はそれより
多くの特異的反応誘発性（reaction−
provoking）抗原に関して過敏性
（hypersensitive）であると言われる。これらの
個体が適当な抗原を吸入又は摂取するとき、顕著
な且つ共通の発現には枯草熱（hay fever）、端
息（asthma）又は蕁麻疹（hives）が包含され
る。この形態のアレルギー（“atopy”）を発現さ
せる傾向は遺伝性である（hereditable）。 抗原に対する個体の最初の抗体反応は後におけ
る暴露により誘発される反応よりは小さいそして
いくらか異なつた抗体反応を誘発する。抗原に対
する最初の暴露は第一次（primary）反応を誘発
する。第一次反応における抗体水準がもはや検出
され得ない点まで下がつた後同じ抗原とのその後
における遭遇は通常高められた第二次〔既往症の
（anamnestic）〕反応を誘発する。 このアトピーの発現は個体内におけるレアギン
（reagin）と呼ばれる或る種の組織感作性IgE抗
体の産生により関与される。これらのIgE抗体は
種々の体組織中に存在する細胞項の受容体
（receptors）に対する高い親和力を有する。この
受容体は体全体にわたる結合組織中の毛管と密接
に関連して見出される乳腺細胞（mast cells）上
に及び好塩基性白血球（basophilic leukocytes）
（blood cells）上にある。乳腺細胞及び好塩基体
（basophils）は、高含量の薬理学的活性中介体
（mediators）、たとえば細胞質顆粒
（cytoplasmic granules）中に濃縮されたヒスタ
ミン、セロトニン、（５−ヒドロキシトリプタミ
ン）及びキニン（塩基性ペプチド）を含有する。
乳腺細胞及び好塩基体に固定されているIgE抗体
の抗原との接触はIgE抗体の架橋を誘発すること
ができる。この架橋は化学的中介体を放出する乳
腺及び好塩基体の脱顆粒化を放出する乳腺及び好
塩基体の脱顆粒化を引き起こしそして先に述べた
アレルギー反応の発現を生ぜしめる。 アトピーの発現は細胞に結合した（IgE）抗体
の産生に依存しているが、免疫系統にとつて重要
な他の種類の抗体はIgG種である。これらのIgG
抗体は循環抗体（circulating antibody）又はブ
ロツキング抗体（blocking antibody）と言われ
る。IgG抗体は抗原と組合わせることもできる。
この組合せは、抗原が細胞に結合したIgEと反応
する能力をブロツキングし、次いでIgE抗体を架
橋することによつて抗原を不活性化させることが
できる。 アレルギー疾患を治療する普通の方法は、少量
の増加していく量の抗原を間欠的に、たとえば１
週間毎に、且つ乳腺細胞又は好塩基体の脱顆粒化
の誘発を回避する投与量で、繰り返し注入するこ
とによつて個体を免疫する〔脱感作する
（desensitizing）〕ことから成る。繰り返し注入は
ブロツキングIgG抗体の水準を増加させるが細胞
に結合したIgE抗体の水準を増加させないと考え
られている。 この脱感作方法は多くの欠点を伴なう。一貫し
て治療学的利益を達成することは困難でありそし
て治療は面倒くさい。更に、環境的抗原にさらす
ことはIgE抗体のその後の産生を引き起こし、
IgE抗原反応及びその後のIgE架橋の可能性は常
に存在する。 自己免疫疾患は、個体が自己抗原に対する抗体
の産生により免疫学的に反応する自己免疫反応か
ら生じる病理学的状態である。自己免疫性は体の
殆んどすべての部分に影響することができ、そし
て一般に自己抗原とIgG抗体間の反応を含む。代
表的自己免疫疾患は甲状腺、胃粘膜、副腎、皮
膚、赤血球及び滑膜（synovial membranes）を
包含することができる。 或る種の自己免疫疾患に対しては、非特異性の
免疫抑制治療、たとえば全体Ｘ線照射、又は細胞
毒性（cytotoxic）薬剤の投与が使用されて限ら
れてはいるが好結果を得ている。かかる治療の欠
点には使用される薬剤の毒性及びかかる治療の後
に続く種々のガン特にリンパ腫（lymphomas）
及び細網細胞肉腫（reticulum cell sarcoma）
の増加した出現率が包含される。更に、慢性の免
疫抑制に対する非特異性の試薬の使用は、通常の
環境下では問題を引き起こさない環境的菌類
（fungi）、バクテリア及びウイルスからの重症の
感染に対する患者の敏感性を大きく増加させる。
本明細書に開示された発明は特異的であり且つ不
快な（offending）抗原に対する抗体反応を抑制
するにすぎない。 抗原抽出物による環境的アレルギーの治療のブ
ロツキング脱感作方法及び自己免疫疾患の非特異
性免疫抑制と対照的に、本発明は特異的抗原に対
する抗体の産生の抑制による特異的免疫学的耐性
の長期持続状態を誘起する手段を提供する。 免疫学の分野における従来技術の観点から、抗
原とハプテン間の区別を認識することは重要であ
る。既に定義した如く、抗原は抗体の産生を引き
起こしそして産生した抗体と特異的に反応する。
対照的にハプテンはそれ自体抗体産生を刺激しな
いが一旦産生された抗体と結合する小分子として
定義される。更に一般に細胞免疫
（cellularimmunity）を誘発せず、他のハプテン
に対する担体として働かずそして免疫原性担体上
に導入された時のみ抗体産生を誘発する。抗−ハ
プテン抗体反応は厳密な担体特異性を有する。ハ
プテンに対する第二次反応はそれが同じ担体上に
投与される時に誘発され得るにすぎず、もしそれ
が免疫学的に無関係の担体上に導入されるならば
個体はハプテンに対する免疫学的記憶を何ら示さ
ず、そして典型的な第一次反応を与える。 第二次反応に対する能力が多年にわたつて持続
し得る故に、それは長期に持続する免疫を与える
ことができる。第一次反応は抗体がよりゆつくり
と現われる故に防御性が小さい（less
protective）。一連の報告書において、本発明者
及びその共同研究者の一人は、適当なハプテンが
結合したＤ−グルタミン酸：Ｄ−リジンを使用し
て、長期のハプテン特異性骨髄由来の細胞耐性の
系統を証明しそして特徴づけた。 〔ｊ．Exp．Med．，Vol.134，pp.201228
（1971）；Vol.136，pp.14041429及びpp.426−438
（1972）；Vol.138，pp.312−317（1973）；Vol.139，
pp.1446−1463（1974）及びProc．Natl Acad．
Sci．U.S.A.Vol.71，pp.3111−3114参照〕。 これらの研究は、２，４ジニトロフエニル
（Dnp）ハプテンに対して特異的である抗体種の
抗体産生細胞の骨髄由来のリンパ球先駆体におけ
る耐性の誘発に成功したことを示した。この研究
はDnpとＤ−グルタミン酸：Ｄ−リジン（以後Ｄ
−GLと称する）の複合体（conjugate）の使用を
含む。 本発明者と共同研究者の一人による最近の研究
はヌクレオシドデターミナント
（nucleosidedeterminants）に対する耐性はヌク
レオシドとＤ−GLとの複合体を使用することに
よつて得られ得ることを証明した〔J.Immunol.，
Vol.114，pp.872−876（1975）参照）。ヌクレオシ
ドの研究は、複素環塩基及び５炭糖から構成され
ているヌクレオシドの混合物に対する耐性の誘発
を取り扱つた。この研究はDNP−Ｄ−GLに対す
る耐性の誘発に類似している。 これらの免疫学的研究は、Ｄ−GL共重合対の
如き適当な非免疫性担体にカツプルした時に単一
デターミナントとして機能する化学成分に対する
抗体反応の抑制を証明する点で利益があるが、抗
原に対する免疫治療学的適用は開示されていな
い。ペニシリンアレルギー及び主要な抗原性デタ
ーミナント（antigenic determinant）、〔ベンジ
ルペニシロイル（BPO）〕の使用に関するここで
の実験的結果はProc．Natl Acad．Sci．U.S.
A.Vol.73，No.６，pp.2091〜2095（1976）に開示さ
れている。 本発明は、(1)Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン共
重合体と、インシユリン及びサワギク抗原Ｅより
なる群から選ばれた抗原とから形成された複合体
及び(2)Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン共重合体
と、インシユリン及びサワギク抗原Ｅよりなる群
から選ばれた抗原とから形成された複合体の製造
方法であつて、Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン共
重合体と該抗原とを反応混合物中で反応させる工
程よりなることを特徴とする方法である。 本発明の複合体は、特異的に不快な抗原に対す
る免疫学的耐性を誘発する作用を有している。こ
の抗原はＤ−GL共重合体にカツプリングしてい
る。達成された免疫学的耐性は、個体が、個体へ
の抗原の導入に応答して抗体を産生しないような
特異的非反応性状態と定義することができる。誘
発される耐性は、 (1) 抗原−Ｄ−GLで処理された個体が一次の抗
原−特異性抗体反応を発現させることができな
いこと。 (2) 抗原−Ｄ−GL複合体の、進行する抗−抗原
抗体反応（anti−antigen antibody response）
を阻害する能力；及び (3) 抗原によつて先にプライムされた（primed）
個体が、抗原−Ｄ−GL複合体による処理に続
いて第二次抗ー抗原反応（anti−an−tigen
response）を引き起こすことができないこと によつて発現せしめられる。 この抑制は特異的抗体反応に対する有効な抑制
作用を有する或る量の抗原−Ｄ−GL複合体をそ
の個体に投与することによつて達成される。この
明細書において使用された用語“個体”とは、人
間又は人間に対するモデルである実験動物を意味
する。本発明の複合体の使用に対する医学的指示
は、個体内での特異的抗原に対する抗体反応を抑
制することが所望される何れかの条件である。用
語“抗体反応の抑制”又はその用語の均等ないか
なる用語も、特異的抗原に対する免疫学的耐性の
意義ある程の増加を意味する。この抑制は個体に
抗体反応を抑制又は減少せしめる投与量又は一連
の投与量を投与することにより達成される。その
量は個体により又は指示によつて変わるけれど
も、余計な実験を行なうことなく医師によつて容
易に決定される。皮下投与が好ましい。複合体を
投与するための投与形態は製薬科学において認知
された方法により製造することができる。 ペニシリンの如き医薬品に対する過敏症反応
（Hypersensitivity reactions）人間において良く
知られているアレルギー疾患である。ペニシリン
に関して説明されている関与する機構は一般にア
レルギーに対するモデルと考えることができる。
特異的抗原−抗体反応の抑制の完全な研究を行な
うために、ペニシリンモデルのアレルギーが使用
された。 ペニシリンは比較的不安定であり、そしてその
溶液の大部分はペニシロイル並びにタンパク質の
アミノ基及びスルフヒドラール基の他の置換基を
形成する高度に反応性誘導体である、少なくとも
少量のペニシリネートを含有する。最も広範囲に
使用されたペニシリンである結晶性カリウムベン
ジルペニシリンＧ（KPG）から誘導されたペニシ
リンＧはカルボキシル基に結合したベンジル基を
有し、ペニシリンＧの主要な抗原デターミナン
ト、即ち抗体−抗原反応の特異性を決定する抗原
分子の限られた部分はベンジルペニシロイル（以
後BPOと称する）である。 本発明の抗原−Ｄ−GL複合体を製造する方法
はＤ−GL共重合体をアルカリ溶液中に溶解しそ
してこのアルカリ溶液を約２〜３モル当量の抗原
と反応させることを含む。反応混合物を約10℃乃
至30℃の温度で約１時間保持する。反応混合物の
PHはアルカリ物質、たとえばKOH又はNaOHの
添加により約10−12の範囲に保持する。抗原複合
体を公知技術、たとえば透析により洗浄し精製す
る。それぞれ約34000、約50000及び約64000の分
子量並びにグルタミン酸：リジンのモル比60：40
をを有する適当な共重合体がマイルズラボラトリ
ーズ（Miles Laboratories）、Inc.，1127 Myrtle
Street，ELkhart，Indiana，46514から入手でき
る。 本発明の複合体の免疫特異性特徴を決定するた
めに、抗原に対する高力価のIgE、IgG、及び
IgM抗体反応が抗原キーホールアオガイ
（keyhole limpet）ヘモシアニン（KLH）の腹腔
内（i.p）注入によつてマウス中に誘発された。
次いで反応において産生された抗体の量は以後に
記載したアツセイ法により測定された。第一次免
疫の前又は後に本発明に従う抗原−Ｄ−GLによ
るかかるマウスの処理は液素性（humoral）及び
細胞水集の両方で測定したIgE及びIgG種のその
後の抗−抗原抗体反応の顕著な抑制をもたらす。 BPO−担体複合体 (a) BPO−KLH及びBPO−BSA BPOをＪ．Clin．Invest．47pp.556−567
（1968）及びInt．Arch．Allergy，39、pp.156−
171（1970）に記載されたキーホールアオガイヘモ
シアニン（KLH）及びウシ血清アルブミン
（BSA）にカツプリングさせた。複合体の蛋白質
濃度はキエルダール法窒素分析（BPO基により
寄与された窒素の量に対する補正を伴なつて）に
より決定された。複合体はペナマルデート
（penamaldate）濃度を決定することによりBPO
含有率をアツセイされた。ペナマルデート測定は
BPO−Ｄ−GL複合体の分光光度法による定量的
決定を含む。〔Methods in Immunology and
Immunochemistry，Academic Press，pp.141−
142（1967）参照〕。得られたBPO／KLH及び
BPO／BSAのモル比は BPO₄₅−BSA（〓−NH₂に当量のカリウムベン
ジルペニシリン10当量）； BPO₁₀−KLH（〓−NH₂に当量のカリウムベン
ジルペニシリン10当量）；50〓−NH₂基で評価し
て100000のKLHのサブユニツトの分子量） (b) BPO−SRBC〔ヒツジ赤血球（Sheep
Ergthrocytes）〕血清BPO−特異的IgG抗体を
試験するのに使用するために、BPOをＪ．
Immunol．96、pp.707−718（1966）に記載の
方法によつてSRBCにカツプリングした。 前記の如くして製造したBPO−担体はマウ
スの免疫又は以後に詳細に述べる抗−BPO抗
体の測定に際し使用した。 免疫化手順 マウスを0.5ml無菌塩溶液（sterile saline）中
の容量のAl（OH）₃ゲル〔みようばん〕４mg上に
吸着れたBPO−KLH1μgの腹腔内（i.p）注入に
より免疫した。第一次注入後２〜４週間目に強化
注入（Boosterinjections）が腹腔内に与えられ
た。みようばん２mgと混合した1μgBPO−KLH
により強化注入を行なつた。 第一次及び第二次免疫の後にいろいろな間隔で
マウスを後方眼窩叢（retro−orbital plexus）か
ら出血させそして血清抗体水準を下記に示した如
く決定した。 抗−BPO抗体の測定 血清IgE抗体 受働皮膚アナフイラキシス（PCA） PCA法は所定群のマウスから血清をプールし
そして外血清を２％正常ラツト血清中で逐次に希
釈する（２倍）ことを含む。種々の希釈率の各々
の0.1ml分量を試験ラツトの毛をそつた背側皮膚
（dosal skin）に皮内に注入した。４−24時間の
感作期間の後、この方法によつてIgE抗体にもを
測定するPCA反応を、リン酸塩緩衝食塩水中に
溶解した1.0％のエバンス青染料（Evans'
bluedye）中のBPO−BS±の静脈内注入（毛を
そつたラツト体重250gmにつき１mg）により誘発
せしめた。PCA力価は５mm直径ブルーイング反
応を生ぜしめる血清のもつとも高い希釈率の逆数
として表わされる。 〔Life Science，81、pp.813820（1969）参照〕 血清抗−KLH抗体の測定 血清IgE抗−KLH抗体水準は前記したPCA反
応により決定された。IgG抗−KLH抗体はJ.
Immunol.114、pp.872−876（1975）中に記載の^I25
Ｉ−標識された単量体KLHを使用してラジオイ
ムノアツセイにより決定した。 下記実施例により本発明の複合体の製造を説明
する。 実施例１（参考例） BPO−Ｄ−GL複合体 約50000の平均分子量及びグルタミン酸：リジ
ン残基モル比60：40を有するＤ−GL共重合体の
1g分量を0.1m炭酸ナトリウム溶液（PH＝11.5）中
に溶解した。PHを1NaOHの添加により約10−12
に維持した。２〜３モル当量のカリウムベンジル
ペニシロイルを加え、そして反応混合物を約10〜
30℃の温度に約１時間保持した。 得られるBPO−Ｄ−GL複合体を透析精製によ
り未反応ペニシリン塩から分離した。この透析は
１％ジエチルアミノエチルセルロース（DEAE）
を含有する0.1M炭酸水素ナトリウムの種々の変
化及び最終的にリン酸塩緩衝された食塩水に対す
る種々の変化を含む。 前記した方法によるBPO−Ｄ−GL複合体の分
析はBPO−Ｄ−GLモル比がBPO₄₀−Ｄ−GL（２
当量のカリウムベンジルペニシリン／当量〓−
NH₂）であることを示した。産生したBPO−Ｄ
−GL複合体はベンジルニシロイル又はその誘導
体対共重合体のモル比が少なくとも40：１であつ
た。 BPOに対する高力価IgE，IgG及びIgM抗体反
応はBPO−KLHの腹腔内注入により誘発され
た。第一次免疫化の前又は後の何れかにおいて本
発明に従うBPO−Ｄ−GLにより後記する如く、
かかるマウスの治療は、液素性及び細胞水準の両
方で測定したIgE及びIgG種のその後における抗
−BPO抗体反応の顕著な抑制をもたらした。 BPO−Ｄ−GL処理が第一次免疫化に先行する
場合にBPO−Ｄ−GLによるBPO−特異性耐性の
誘発 液素性免疫反応の分析 二つの群の正常なBALB／ｃマウスを４投与
量の食塩水又は500μgのBPO−Ｄ−GLにより３
日間隔で皮下に注入した。この治療法は、(1)皮下
経路の方がＤ−GL複合体による耐性誘発に対し
ては腹腔内よりと同じ程又はそれより良好である
こと及び(2)２回のBPO−Ｄ−GLの500μg投与量
が顕著ではあるが不完全な程度の耐性をもたらす
ことを証明した予備実験をベースとして選ばれ
た。最後の投与後１週間目に、動物はみようばん
４mgと混合した感作性抗原BPO−KLH1μgで第
一次の免疫を行ない、免疫工程はかるマウス中に
おける良好なIgE，IgM及びIgG第一次抗−BPO
抗体反応を誘発することが見出された。すべての
動物を１週間間隔で出血させそしてそれらの血清
の抗−BPO及び抗−KLH抗体の分析を行なつ
た。第一次免疫後28日目に、両群のマウスはみよ
うばん２mgと混合した1μgのBPO−KLHで第二
次挑戦が行なわれた。７日後それらは出血せし
め、そして殺した。工程成績及び血清抗体反応の
データを表に要約した。対照動物は14日までに
良好な第一次IgE抗−BPO抗体反応を発現せし
め、それは21日までにピークに達した。これらの
動物は28日目の第二次挑戦に続いて35日目に鋭い
既往症反応を示した。対照的に、BPO−Ｄ−GL
で予備処理したマウスは28日の第一次経過にわた
つて検出可能なIgE抗−BPO反応を生ぜずそして
第二次挑戦に続いてほんの近い量の抗体を産生し
たにすぎない。処理したマウスと対照マウス間の
IgE抗−KLH抗体力価を35日観察期間にわたる比
較は耐性特異性を示した。 J.Immunol.111、638−640頁（1973）に記載のヒ
ツジ赤血球にカツプリングしたBPOを使用して
受働血球凝集反応（passive hemagglutination）
により血清BPO−特異性IgM及びIgG抗体を決定
した。IgG及びIgM種の抗−BPO抗体反応は前記
したIgE種の結果に類似していた。BPO−Ｄ−
GLで処理したマウスは全免疫期間及びその後の
第二次挑戦の期間にわたつて対照に比較して顕著
に低い水準のIgG抗−BPO血清抗体を示した。 脾細胞（spleen cells）を無菌条件下に除去し、
そしてScience１ 140、405−411頁（1963）に記
載の方法によつてBPO−特異性血小板形成性細
胞に対して分析した。 異種養子皮下アナフイラキシス反応
（heterologous adoptive cutaneous
anaphylaxis reactions）をJ.Immunol.111、638
−640頁（1973）に記載の如くして行なつた。デ
ータはIgG及びIgM種の実質的により僅かなBPO
−特異性抗体が未処理対照マウスと比例して
BPO−Ｄ−GLで処理したマウスの脾細胞中に存
在していることを示した。 【表】 第二次挑戦は28日目に投与した。 先に免疫されたマウスにおけるBPO−Ｄ−GL
の投与によるBPO−特異的耐性の誘 ３つの群のBALB／ｃマウスを、みようばん
４mgと混合したBPO−KLH1μgにより腹腔内に
て免疫した２週間後、この群を出血せしめ、次い
で食塩水、500μgのBPO−Ｄ−GL腹腔内又は
500μgのBPO−Ｄ−GLs.c.にて隔日にて２回（14
日及び16日に）処理した。18日目に、すべての動
物をみようばん２mgと混合したBPO−KLH1μg
で第二次挑戦し、そしてその後の３週間にわたり
７日間隔で出血させた。第二次免疫後21日目に、
動物を殺しそしてそれらの脾細胞をBPO−特異
的斑（plaque）形成性細胞に対して分析した。 血清抗体反応の工程成績及びデータを表に要
約する。３つの群のマウスはすべてBPO−Ｄ−
GL処理のすぐ前に比較し得る水準のIgE抗−
BPO抗体を示した。BPO−KLHによる第二次挑
戦に続いて、未処理対照マウスは７日及び14日は
高原状で挑戦後21日までいくらか傾斜した既往症
のIgE反応を示した。対照的に、BP0−Ｄ−GLで
処理された２つの群はBPO−KLHによる第二次
免疫に反応せずそして更に循環しているIgE抗体
−BPO抗体水準の減少を示し、これは皮下にて
BPO−Ｄ−GLで処理した群において最も顕著で
あり；後者の群のIgE力価は21日目に何も検出で
きなくなるまで漸進的に減退した。21日間の観察
期間にわたり処理マウスと対照マウスとの間の比
較し得るIgE抗−KLH抗体力価は耐性特異性を示
した。 IgG種の抗−BPO抗体反応における同様な発見
が得られた。かくしてBPO−Ｄ−GLにより処理
したマウスは対照と比較しておれらのIgG抗−
BPO反応において実質的に抑制された。 【表】 脾細胞試験は処理されたマウスの脾中のIgG及
びIgM種のBPO−特異的抗体の水準が未処理対
照の脾におけるよりも低いことを示した。 上記のことから、本発明は特異的抗原に対する
免疫学的耐性の状態が適当な抗原−Ｄ−GL複合
体の投与により個体中に誘起され得る方法を与え
る。耐性はIgE並びにIgG及びIgM抗体種におい
て示される。更に、試験結果は耐性が処理期間に
動物の免疫状態にかかわりなく確立され得ること
を示す。 実施例（参考例） BPO−Ｄ−GL複合体 平均分子量約64000及びグルタミン酸：リジン
残基モル比60：40を有するＤ−GL共重合体1g分
量及びカリウムベンジルペニシロイル0.5g分量を
0.1M炭酸ナトリウム溶液中に溶解した。PHを
1NNaOHの添加により10−12間に保持した。反
応混合物を約30℃の温度で約１１／２時間維持した。 得られるBPO−Ｄ−GL複合体を１％DEAEセ
ルロースを含有する0.1MNaHCO₃に対して透析
による未反応ペニシリン塩から分離した。透析は
約１週間の期間進行せしめられた。 前記した方法により得られたBPO−GL複合体
の分析はBPO：Ｄ−GLモル比がBPO₆₃−Ｄ−
GLであることを示した。 実施例 インシユリン−Ｄ−GL複合体 豚インシユリン50mg分量を3.1のPHで0.01Mエ
チレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）中に溶解
した。溶解したインシユリンを同じEDTA溶液
に対して一夜透析した。透析媒体は2.5×10^-5
MEDTAを含有する約9.5のPHの0.033Mホウ酸塩
緩衝液に変えた。トルエン−２，４−ジイソシア
ネート（TDIC）を０℃のインシユリン溶液に加
えた。反応混合物を約30分間０℃にて激しく攪拌
し、次いで約２〜４℃の温度で10分間12000gに
て遠心分離した。上澄液を栓をした試験管中にデ
カントし、そして試験管を氷浴中に入れた。反応
を氷浴温度に更に１時間進行せしめた。 平均分子量64000及びグルタミン酸：リジンモ
ル比60：40を有するＤ−GL共重合体50mg分量を
2.5×10^-5MEDTAを含有する0.033Mホウ酸塩緩
衝液（PH9.5）中に溶解した。PHを2NNaOHより
約10−12に調節した。 Ｄ−GL溶液をインシユリン溶液に加えた。反
応混合物に加えられたインシユリン対Ｄ−GLの
モル比は10：１であつた。反応を約35〜40℃で１
時間進行せしめた。次いで反応混合物を2.5×
10^-5MEDTAを含有する0.1M（NH₄）₂CO₃に対し
て透析し、そして溶出剤として2.5×10^-5
MEDTAを含有する0.01MNH₄HCO₃を使用して
セフアデツクス（Sephadex）675カラム（Ｇ−
75）上で未反応部分から複合体を分離した。この
複合体を含有する分画物はさらに蒸留水に対して
透析し凍結乾燥した。複合体と反応成分の溶出の
位置は標準物質を用いて確認された。 実施例（参考例） ヌクレオチド−Ｄ−GL複合体 こうし胸腺（Calf thymus）DNAのデオキシ
リポヌクレアーゼ（DNase）による消化、そ
れに続くDEAE Sephadex A25カラム上での分
画によりオリゴデオキシヌクレオチド（三量体及
び／又は四量体）を製造した。この処理は、
5mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（“TRIS”）−7M尿素緩衝液（PH＝7.6）中の
0.4MLiCl線状勾配を使用することを含んだ。溶
出剤として蒸留水を使用してクロマトグラフイー
法により、尿素を生成したオリゴデオキシヌクレ
オチドから除去した。 生成したオリゴデオキシヌクレオチドを、約
64000の平均分子量及びグルタミン酸：リジンモ
ル比60：40を有するＤ−GL共重合体と反応させ
る。反応はカツプリング剤として１−エチル−３
−ジイソプロピルアミノカルボジイミド塩酸塩
（EDC）を使用して蒸留水中で行なう。 得られる複合体を２〜４℃で約１週間の透析に
より不純物及び未反応出発物質から分離する
〔Ｊ．of Immun．，96、373（1966）〕。こうし胸
腺DNAをデオキシリボヌクレアーゼにより消
化し、それに続いて該原料を約10000の分子量カ
ツト−オフを有する濾過器中を通過せしめること
によりオリゴヌクレオチドもまた製造れた。好適
器はロームアンドハース社（Rohm and Haas
Co.，Independence Mall West Philadelphia，
Pennsylvania，19105）の部門、アミコン
（Amicon）から商標名PM−10の下に入手でき
る。液をオリゴデオキシヌクレオチドのリース
として使用した。 ヌクレオチドは複素環式塩基、五炭糖及びホス
フエートから成る。核酸は、ホスホージエステル
結合により相互に結合した４の異なつたヌクレオ
チドから成る。オリゴヌクレオチドはホスホージ
エステル結合により相互に結合している10より少
ないヌクレオチドから成る。このジエステル結合
はヌクレオチドを比較的複雑な化学物質ならしめ
る。核酸に対して特異的抗体は塩基及び／又は糖
のみならずこれらのヌクレオチドを含有するホス
フエートバツクボーンに対しても特異的である。
故に、非免疫原性担体（たとえばＤ−GL）に結
合した少さいオリゴヌクレオチドを使用すること
によつて、自己免疫疾患の病理学的状態に直接関
連した核酸様環境が得られる。対照的に、ホスホ
ージエステル結合を含まないヌクレオシドに対す
る耐性の先行技術による誘発はハプテン−Ｄ−
GL耐性、たとえば、Dnp−Ｄ−GLにより密接に
関連している。オリゴデオキシヌクレオチドに対
する耐性の誘発は核酸に対する耐性の誘発に等し
いと考えることができる。 実施例 サワギク抗原Ｅ−Ｄ−GL複合体 64000の平均分子量及びグルタミン酸：リジン
モル比60：40を有するＤ−GL共重合体50mg分量
を蒸留水２ml中に溶解した。溶液を氷浴中で０℃
に冷却しそして攪拌した。Ｎ−エチル−５−フエ
ニルイソキサゾリウム3′−スルホネート
（Woodward's Reagent）50mg分量を蒸留水0.5ml
中に溶解し、Ｄ−GL溶液に加えて、攪拌を０℃
で約１時間続行した。PHを2NNaOHにより7.5−
8.0に上昇せしめた。 Worthington Biochemicals，Inc，Freehoed， New Jersey，07728から入手できるサワギク抗
原Ｅの５mg分量を蒸留水中に溶解し、Ｄ−GL−
ウツドワーズ試薬溶液に加えた。抗原Ｅは37800
の分子量を有し、窒素は17.1％であり、炭水化物
は0.2％であつた。Ｓ値は3.05であり、１cmにお
ける１％溶液の吸光係数（280μ）は11.3であつ
た。 混合物を６℃で24時間攪拌した。反応混合物を
溶出剤として0.1MNH₄HCO₃を含めて、
0.01MNH₄HCO₃を使用してセフアデツクスＧ−
100カラム上で分画した。複合体を含んでいる第
一ピークを含む管をプールし、複合体をさらに蒸
留水に対して透析し、そして凍結乾燥した。複合
体の成分は、後の分画物中に溶出した。複合体と
反応成分の溶出の位置は標準物質を用いて確認さ
れた。 本発明は、いかなる抗体機能障害に関しても病
理学的発現の治療に対して治療学的意義を有す
る。先に示した如く、多数の個体が環境的抗原に
対して過敏症であるので、これらのアレルギー症
状を軽減するべき治療方法は大きな治療学的価値
がある。本発明により、特異的な感作性抗原に対
答するIgE及びIgG抗体産生は大巾に抑制される。 従つて、本発明の抗原−Ｄ−GL複合体及び治
療は、アレルゲンとして表示される広い範囲の環
境的抗原を含む。たとえば、代表的アレルゲンは
ペニシリンの如き医薬；インシユリンの如きホル
モン；サワギク、ベルムダー草、果樹園草及びア
モシー草の如き花粉、クリサンテムムロイカンテ
ムムの如き花の花粉及び棒の木の如き樹木花粉；
すずめ蜂（bee wasp）及び蛇の毒液；馬鱗屑の
如き動物のふけ（danders）；猫土皮の如き動物
上皮；ハツドドツク、おらんだいちごの如き食品
タンパク質アレルゲン、ハウスダストダニ；パン
酵母〔麦酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）
の如き菌類；アルテルナリアテヌイスの如きカビ
類；ジフテリアの如き毒素；破傷風の如きトキソ
イド；オバルブミンの如きタンパク質；トリプシ
ン、キモトリプシン及びフイチンの如き酵素；及
びこれらのアレルゲンの誘導体を包含するがそれ
に限定するものではない。 過敏症の個体にアレルゲー症状を生ぜしめる前
記した環境的アレルゲンに加えて、本発明は自己
免疫疾患の治療に対して治療学的価値を有する。
自己免疫疾患は個体の体の殆んどすべての部分に
影響を及ぼすことができる。いくらかの反応は器
官−特異性抗体を志向し、そして特定の細胞種類
たとえば悪性貧血（pernicious anemia）におけ
る胃粘膜の壁細胞に向けることができる。他の反
応は広く分布した抗原に向けられ、そして伝染性
疾病、たとえば全身系紅斑性狼療（systemic
lupus erythematosus）（SLE）に関連している。
更に他の疾病においては反応はこれらの極端の中
間、たとえば慢性の糸球体腎炎
（glomerulonephritis）及び肺出血（pulmonary
hemorrhages）により特徴づけられたグツドパス
チユア病（Goodpasture's disease）であり、抗
体は腎糸球体（Kidney glomeruli）及び肺実質
（lung parenchyma）の基礎膜に付着している。 抗体は、アセチルコリン受容体部位に対する抗
体が神経インパルスの伝達を阻害する筋無力症
（myasthenia gravis）において生じる如く、特
異的細胞受容体に対しても産生される。抗体はイ
ンシユリン受容体部位に対して形成されることが
できて細胞に対するインシユリンの結合を阻止し
（blocking）、それによりホルモンの正常な作用を
妨害する。 代表的な自己免疫疾病及び対応抗原は、 【表】 本発明の方法によれば、自己免疫疾病の軽減は
前記した種々の自己免疫疾病において包含された
適当な抗原をＤ−GLにカツプリングさせること
により達成され得ることは明らかである。自己抗
原に対するIgG抗体の産生の抑制は治療学的に価
値がある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン共重合体と、
   インシユリン及びサワギク抗原Ｅよりなる群から
   選ばれた抗原とから形成された複合体。 ２ 該共重合体が約34000〜64000の平均分子量及
   び約60：40のグルタミン酸：リジンモル比を有す
   る特許請求の範囲第１項記載の複合体。 ３ Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン共重合体と、
   インシユリン及びサワギク抗原Ｅよりなる群から
   選ばれた抗原とから形成された複合体の製造方法
   であつて、Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン共重合
   体と該抗原とを反応混合物中で反応させる工程よ
   りなることを特徴とする方法。 ４ 該反応混合物を約10〜12のPHに維持する特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 該共重合体が約34000〜64000の平均分子量及
   び約60：40のグルタミン酸：リジンモル比を有す
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。