JPH04286959A - 金属イオンの錯化剤を含有する固相免疫検定法用洗浄溶液およびその使用 - Google Patents
金属イオンの錯化剤を含有する固相免疫検定法用洗浄溶液およびその使用Info
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- JPH04286959A JPH04286959A JP3312026A JP31202691A JPH04286959A JP H04286959 A JPH04286959 A JP H04286959A JP 3312026 A JP3312026 A JP 3312026A JP 31202691 A JP31202691 A JP 31202691A JP H04286959 A JPH04286959 A JP H04286959A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、金属イオン錯化剤を含有する固
相免疫検定法用洗浄溶液およびこの洗浄溶液の使用に関
する。
相免疫検定法用洗浄溶液およびこの洗浄溶液の使用に関
する。
【０００２】固相免疫検定法、たとえば酵素連結イムノ
ソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、その操作に１また
は２以上の洗浄工程を必要とする。これは、非特異的に
結合した物質たとえば免疫グロブリン、または過剰の試
剤たとえば酵素接合体を除去するために固相を洗浄溶液
で洗浄する必要があるからである。これが適当に行われ
れば検定の結果は、被検物質の濃度に相当する測定シグ
ナルになる（正確度）。理想的には、検定の結果は、同
一の被検物質の濃度について何回も反復した場合、同一
でなければならない（再現性）。洗浄は過去には、通常
、ピペットまたは洗浄コームを用いて手作業で行われて
いた。
ソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、その操作に１また
は２以上の洗浄工程を必要とする。これは、非特異的に
結合した物質たとえば免疫グロブリン、または過剰の試
剤たとえば酵素接合体を除去するために固相を洗浄溶液
で洗浄する必要があるからである。これが適当に行われ
れば検定の結果は、被検物質の濃度に相当する測定シグ
ナルになる（正確度）。理想的には、検定の結果は、同
一の被検物質の濃度について何回も反復した場合、同一
でなければならない（再現性）。洗浄は過去には、通常
、ピペットまたは洗浄コームを用いて手作業で行われて
いた。
【０００３】最近では、このような固相免疫検定法は装
置によって完結されるようになっている。これは、少な
くとも洗浄工程が装置によって行われることを意味する
。
置によって完結されるようになっている。これは、少な
くとも洗浄工程が装置によって行われることを意味する
。
【０００４】本明細書で用いられる装置の語は、その使
用により酵素免疫検定における洗浄工程の機械的実施が
可能となるすべての装置を意味し、これらの装置でＥＬ
ＩＳＡ検定の完結のための他の工程の実施が可能か否か
は関係ない。
用により酵素免疫検定における洗浄工程の機械的実施が
可能となるすべての装置を意味し、これらの装置でＥＬ
ＩＳＡ検定の完結のための他の工程の実施が可能か否か
は関係ない。
【０００５】たとえば、中性範囲の界面活性剤含有リン
酸緩衝液からなる既知の洗浄溶液は、これらの系ではあ
る種の欠点がある。洗浄工程を完結するためにこのよう
な装置を使用した場合、測定シグナルの正確度および再
現性の両者とも、ある時間後にのみ、すなわち、何個か
のプレートが完結した後に、はじめて許容されるレベル
に到達する（ＢＵＲＲＯＷＳ， Ｐ．Ｍら： Ｊ． Ｖ
ｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ． ８， ２０７〜２１６， １
９８４）。
酸緩衝液からなる既知の洗浄溶液は、これらの系ではあ
る種の欠点がある。洗浄工程を完結するためにこのよう
な装置を使用した場合、測定シグナルの正確度および再
現性の両者とも、ある時間後にのみ、すなわち、何個か
のプレートが完結した後に、はじめて許容されるレベル
に到達する（ＢＵＲＲＯＷＳ， Ｐ．Ｍら： Ｊ． Ｖ
ｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ． ８， ２０７〜２１６， １
９８４）。
【０００６】したがって、本発明は、ＥＬＩＳＡを完結
するための装置を使用するに際して、これらの装置を直
ちに使用しても、正しい結果の達成を可能にする方法を
見出すことを目的としたものである。被検物質の濃度と
よく相関する測定シグナルおよび得られる結果の再現性
が、正確な検定操作の評価基準と考えられる。
するための装置を使用するに際して、これらの装置を直
ちに使用しても、正しい結果の達成を可能にする方法を
見出すことを目的としたものである。被検物質の濃度と
よく相関する測定シグナルおよび得られる結果の再現性
が、正確な検定操作の評価基準と考えられる。
【０００７】驚くべきことに、この目的は、緩衝剤基剤
、ｐＨ、または他の添加物とは無関係に、金属イオンの
錯化剤が添加された適当な洗浄溶液の使用によって達成
されることが見出されたのである。
、ｐＨ、または他の添加物とは無関係に、金属イオンの
錯化剤が添加された適当な洗浄溶液の使用によって達成
されることが見出されたのである。
【０００８】すなわち、本発明は、金属イオンの錯化剤
を含有する不均一酵素免疫検定法用洗浄溶液に関する。
を含有する不均一酵素免疫検定法用洗浄溶液に関する。
【０００９】本発明はさらに、この種類の洗浄溶液の、
不均一酵素免疫検定法における使用に関する。
不均一酵素免疫検定法における使用に関する。
【００１０】本発明はまた、金属イオンの錯化剤を含有
する洗浄溶液をその少なくとも一つの洗浄工程において
使用する不均一酵素免疫検定法に関する。
する洗浄溶液をその少なくとも一つの洗浄工程において
使用する不均一酵素免疫検定法に関する。
【００１１】本発明における意味での錯化剤に包含され
る化合物は、本技術分野の熟練者にはそれ自体知られた
化合物であり、好ましくは高原子価金属イオンとの錯体
中に入る化合物である。
る化合物は、本技術分野の熟練者にはそれ自体知られた
化合物であり、好ましくは高原子価金属イオンとの錯体
中に入る化合物である。
【００１２】この場合、好ましい錯化剤は、生物学的分
解性が良好な化合物で、たとえば、ニトリロ三酢酸（Ｎ
ＴＡ）、イソリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、グル
コン酸、およびポリグルコン酸アセタールであり、ＮＴ
Ａがとくに好ましい。
解性が良好な化合物で、たとえば、ニトリロ三酢酸（Ｎ
ＴＡ）、イソリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、グル
コン酸、およびポリグルコン酸アセタールであり、ＮＴ
Ａがとくに好ましい。
【００１３】錯化剤は、０．０１ｍｍｏｌ／リットル〜
１００ｍｍｏｌ／リットルの濃度で添加される。０．１
〜２０ｍｍｏｌ／リットルの濃度が好ましく、１ｍｍｏ
ｌ／リットルの濃度がとくに好ましい。
１００ｍｍｏｌ／リットルの濃度で添加される。０．１
〜２０ｍｍｏｌ／リットルの濃度が好ましく、１ｍｍｏ
ｌ／リットルの濃度がとくに好ましい。
【００１４】錯化剤は、固相免疫検定用として以前から
知られている洗浄溶液または緩衝液に添加することがで
きる。これらの一例には、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ
４、ＮａＣｌ（０．４５％ｗ／ｖ）および０．１％（ｗ
／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０からなる、ｐＨ６．５の１０
ｍｍｏｌ／リットルリン酸塩緩衝液がある。この洗浄溶
液を本発明により、たとえば１ｍｍｏｌ／リットルのＮ
ＴＡと混合し、それを使用して、それによるＥＬＩＳＡ
の測定シグナルと再現性の改善が証明された。
知られている洗浄溶液または緩衝液に添加することがで
きる。これらの一例には、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ
４、ＮａＣｌ（０．４５％ｗ／ｖ）および０．１％（ｗ
／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０からなる、ｐＨ６．５の１０
ｍｍｏｌ／リットルリン酸塩緩衝液がある。この洗浄溶
液を本発明により、たとえば１ｍｍｏｌ／リットルのＮ
ＴＡと混合し、それを使用して、それによるＥＬＩＳＡ
の測定シグナルと再現性の改善が証明された。
【００１５】不均一酵素免疫検定法は、それ自体は、本
技術分野の熟練者によく知られている。これらは、抗原
および抗体の検出に使用することができ、たとえば、サ
ンドイッチまたは競合的免疫検定法のような付加検定法
とすることができる。さまざまな可能な実施態様が文献
に詳細に記載されている。本発明に包含される検定法中
では、ＥＬＩＳＡが好ましい。
技術分野の熟練者によく知られている。これらは、抗原
および抗体の検出に使用することができ、たとえば、サ
ンドイッチまたは競合的免疫検定法のような付加検定法
とすることができる。さまざまな可能な実施態様が文献
に詳細に記載されている。本発明に包含される検定法中
では、ＥＬＩＳＡが好ましい。
【００１６】このような酵素免疫検定法のマーカー酵素
自体は文献に開示されているが、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシ
ダーゼの使用がとくに好ましく、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼの使用が最も好ましい。不均一酵素免疫検定法の
固相は、それ自体は、本技術分野の熟練者によく知られ
ていて、凹面形状体たとえばチューブもしくはウエル、
凸面形状体たとえばビーズ、スター等、ならびに微粒子
（粒子径＜１，０００ｎｍ）たとえばラテックス粒子お
よび磁性粒子の使用が好ましい。この場合、マイクロタ
イタープレート型のウエル、ラテックス粒子および磁性
粒子がとくに好ましい。マイクロタイタープレートが最
も好ましい。
自体は文献に開示されているが、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシ
ダーゼの使用がとくに好ましく、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼの使用が最も好ましい。不均一酵素免疫検定法の
固相は、それ自体は、本技術分野の熟練者によく知られ
ていて、凹面形状体たとえばチューブもしくはウエル、
凸面形状体たとえばビーズ、スター等、ならびに微粒子
（粒子径＜１，０００ｎｍ）たとえばラテックス粒子お
よび磁性粒子の使用が好ましい。この場合、マイクロタ
イタープレート型のウエル、ラテックス粒子および磁性
粒子がとくに好ましい。マイクロタイタープレートが最
も好ましい。
【００１７】固相の材料は、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている。たとえばラテックス粒子の場合のよう
に固相の性質によってすでに決まっているのでなければ
、ポリスチレンの使用が好ましい。
く知られている。たとえばラテックス粒子の場合のよう
に固相の性質によってすでに決まっているのでなければ
、ポリスチレンの使用が好ましい。
【００１８】酵素免疫検定法に使用される緩衝系は本技
術分野の熟練者にはよく知られている。それぞれの場合
に用いられる緩衝系の性質がその場合に要求されるｐＨ
値に依存することも、本技術分野の熟練者にはよく知ら
れているとおりである。
術分野の熟練者にはよく知られている。それぞれの場合
に用いられる緩衝系の性質がその場合に要求されるｐＨ
値に依存することも、本技術分野の熟練者にはよく知ら
れているとおりである。
【００１９】不均一酵素免疫検定法の洗浄溶液に使用さ
れる界面活性剤も、同様に、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている（たとえば、ＶＯＬＬＥＲ， Ａ．ら：
Ｂｕｌｌ． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ
． ５３， ５５〜５６， １９７６）。非イオン性お
よび両イオン性界面活性剤の使用が好ましく、ポリオキ
シエチレン類がとくに好ましく、ＲＴｗｅｅｎ ２０が
最も好ましい。
れる界面活性剤も、同様に、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている（たとえば、ＶＯＬＬＥＲ， Ａ．ら：
Ｂｕｌｌ． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ
． ５３， ５５〜５６， １９７６）。非イオン性お
よび両イオン性界面活性剤の使用が好ましく、ポリオキ
シエチレン類がとくに好ましく、ＲＴｗｅｅｎ ２０が
最も好ましい。
【００２０】酵素免疫検定法に使用される中性蛋白質は
本技術分野の熟練者にはよく知られている。使用が好ま
しい例としては、血清アルブミン、ゼラチン、化学修飾
ゼラチンたとえばポリゲリン、および乳蛋白質たとえば
ラクトフェリンがある。ヒトおよびウシ血清アルブミン
、ポリゲリン、ならびにラクトフェリンがとくに好まし
い。ポリゲリンおよびラクトフェリンが最も好ましく、
後者はドイツ特許出願３６ ３８ ７６７号の記載に従
って製造される。
本技術分野の熟練者にはよく知られている。使用が好ま
しい例としては、血清アルブミン、ゼラチン、化学修飾
ゼラチンたとえばポリゲリン、および乳蛋白質たとえば
ラクトフェリンがある。ヒトおよびウシ血清アルブミン
、ポリゲリン、ならびにラクトフェリンがとくに好まし
い。ポリゲリンおよびラクトフェリンが最も好ましく、
後者はドイツ特許出願３６ ３８ ７６７号の記載に従
って製造される。
【００２１】所定の浸透圧に調整するために、酵素免疫
検定法に使用される溶液には中性塩たとえば食塩を添加
することは、本技術分野の熟練者にはよく知られている
。
検定法に使用される溶液には中性塩たとえば食塩を添加
することは、本技術分野の熟練者にはよく知られている
。
【００２２】上述の物質は、使用時は水溶液中で用いら
れるが、使用までは、凍結乾燥もしくは顆粒化した乾燥
混合物として保存することも、また最終的に希釈して用
いられる液状体もしくは濃厚液としておくこともできる
。
れるが、使用までは、凍結乾燥もしくは顆粒化した乾燥
混合物として保存することも、また最終的に希釈して用
いられる液状体もしくは濃厚液としておくこともできる
。
【００２３】本発明の好ましい実施態様における洗浄溶
液は、以下の組成を有する。 緩衝剤：０〜１００ｍｍｏｌ／リットル、好ましくは１
０〜２０ｍｍｏｌ／リットル、とくに好ましくは１０ｍ
ｍｏｌ／リットル 界面活性剤：０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０．
２％（ｗ／ｖ）、とくに好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）
中性蛋白質：０〜１％（ｗ／ｖ） 錯化剤：０．１〜２０ｍｍｏｌ／リットル、好ましくは
１〜５ｍｍｏｌ／リットル、とくに好ましくは１ｍｍｏ
ｌ／リットル
液は、以下の組成を有する。 緩衝剤：０〜１００ｍｍｏｌ／リットル、好ましくは１
０〜２０ｍｍｏｌ／リットル、とくに好ましくは１０ｍ
ｍｏｌ／リットル 界面活性剤：０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０．
２％（ｗ／ｖ）、とくに好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）
中性蛋白質：０〜１％（ｗ／ｖ） 錯化剤：０．１〜２０ｍｍｏｌ／リットル、好ましくは
１〜５ｍｍｏｌ／リットル、とくに好ましくは１ｍｍｏ
ｌ／リットル
【００２４】慣用の洗浄溶液の組成および
成分は本技術分野の熟練者にはよく知られているとおり
である。
成分は本技術分野の熟練者にはよく知られているとおり
である。
【００２５】以下の実施例は、本発明を例示するもので
あって、いかなる意味においても本発明を限定するもの
ではない。
あって、いかなる意味においても本発明を限定するもの
ではない。
【００２６】実施例１
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対するＩｇＭを
検出するＥＬＩＳＡを固相免疫検定法として選んだ。８
×１２フィールドに９６個の反応ウエルをもつポリスチ
レンマイクロタイタープレートを固相として使用した。 ヒト胎児線維芽細胞中で培養したＣＭＶ、およびＣＭＶ
感染していないヒト胎児線維芽細胞を、Ｋｒｉｓｈｎａ
らの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
１２， ４６〜５１， １９８０）によって処置した。 得られたプレパレーションを以下、それぞれ、ＣＭＶ抗
原および（陰性）対照抗原と呼ぶ。
検出するＥＬＩＳＡを固相免疫検定法として選んだ。８
×１２フィールドに９６個の反応ウエルをもつポリスチ
レンマイクロタイタープレートを固相として使用した。 ヒト胎児線維芽細胞中で培養したＣＭＶ、およびＣＭＶ
感染していないヒト胎児線維芽細胞を、Ｋｒｉｓｈｎａ
らの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
１２， ４６〜５１， １９８０）によって処置した。 得られたプレパレーションを以下、それぞれ、ＣＭＶ抗
原および（陰性）対照抗原と呼ぶ。
【００２７】次に、各マイクロタイタープレートの反応
ウエルにＣＭＶ抗原溶液０．１ｍｌおよび隣接反応ウエ
ルに対照抗原０．１ｍｌをピペットで加えて上述の著者
らの方法で被覆し、反応ウエルの列が交互にＣＭＶ抗原
溶液および対照抗原で被覆されるようにした。数個の検
定プレートをこれと同じ製造サイクルで調製した。
ウエルにＣＭＶ抗原溶液０．１ｍｌおよび隣接反応ウエ
ルに対照抗原０．１ｍｌをピペットで加えて上述の著者
らの方法で被覆し、反応ウエルの列が交互にＣＭＶ抗原
溶液および対照抗原で被覆されるようにした。数個の検
定プレートをこれと同じ製造サイクルで調製した。
【００２８】試験サンプル０．１５ｍｌの前希釈および
ピペットによる添加は、いずれの場合も常に、Ｃｈｏｕ
らの指示（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２５， ５２〜５５， １９８７）に従って、一方はＣ
ＭＶ抗原溶液で他方は対照抗原で被覆された隣接反応ウ
エルに、平行して行われるようにした。
ピペットによる添加は、いずれの場合も常に、Ｃｈｏｕ
らの指示（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２５， ５２〜５５， １９８７）に従って、一方はＣ
ＭＶ抗原溶液で他方は対照抗原で被覆された隣接反応ウ
エルに、平行して行われるようにした。
【００２９】ＥＬＩＳＡの完結は、Ｚｉｅｇｅｌｍａｉ
ｅｒら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ９， ２３
〜３３， １９８１）の記載した操作にほぼ完全に従っ
て、サンプルのインキュベーション（１）、接合体のイ
ンキュベーション（２）、および基質のインキュベーシ
ョン（３）を行い、反応工程（２）および（３）に先立
って洗浄工程を設けた。
ｅｒら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ９， ２３
〜３３， １９８１）の記載した操作にほぼ完全に従っ
て、サンプルのインキュベーション（１）、接合体のイ
ンキュベーション（２）、および基質のインキュベーシ
ョン（３）を行い、反応工程（２）および（３）に先立
って洗浄工程を設けた。
【００３０】検定プロトコール：ウイルス抗原による固
相のコーティング 洗浄工程（＊） 工程１：血清用希釈緩衝液中試験血清１５０μｌ（＊＊
） と接合体（ＤＢＳＣ）を３７℃でインキュベートす
る（ＩｇＧおよびＩｇＭのために） 洗浄工程 工程２：ＤＢＳＣ中、抗ヒトＩｇＧ ５０μｌとＡＰ接
合体を３７℃で６０分 洗浄工程 工程３：基質緩衝液中、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト（ｐ−ＮＰＰ）１００μｌ、２０〜２５℃で４５分工
程４：２Ｎ ＮａＯＨ ５０μｌ 光学的評価 ＊） 各場合とも３×２００μｌの洗浄緩衝液で５分
以内＊＊） 各場合に記載のウエルあたりの容量
相のコーティング 洗浄工程（＊） 工程１：血清用希釈緩衝液中試験血清１５０μｌ（＊＊
） と接合体（ＤＢＳＣ）を３７℃でインキュベートす
る（ＩｇＧおよびＩｇＭのために） 洗浄工程 工程２：ＤＢＳＣ中、抗ヒトＩｇＧ ５０μｌとＡＰ接
合体を３７℃で６０分 洗浄工程 工程３：基質緩衝液中、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト（ｐ−ＮＰＰ）１００μｌ、２０〜２５℃で４５分工
程４：２Ｎ ＮａＯＨ ５０μｌ 光学的評価 ＊） 各場合とも３×２００μｌの洗浄緩衝液で５分
以内＊＊） 各場合に記載のウエルあたりの容量
【００
３１】これらの洗浄工程は、洗浄コームを用いて手動で
行うことができるだけでなく、洗浄溶液保存容器に連結
したデバイスにより自動的に行うこともできる。 この点に関する現在の技術水準の例としては、ＤＹＮＡ
ＴＥＣＨのＵｌｔｒａｗａｓｈｅｒ ＩＩ、Ｆｌｏｗ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｗ
ａｓｈｅｒ、ＮＵＮＣのＩｍｍｕｎｏＷａｓｈｅｒ Ｎ
Ｋ ３５０、ＳＬＴ ＬＡＢＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳの
Ｅａｓｙ Ｗａｓｈｅｒ“ＥＡＷ ｐｌｕｓ”またはＢ
ｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅのＢｅｈｒｉｎｇ ＥＬＩＳＡ
ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを挙げることができる。最後に挙
げたデバイスがこの例に使用された。
３１】これらの洗浄工程は、洗浄コームを用いて手動で
行うことができるだけでなく、洗浄溶液保存容器に連結
したデバイスにより自動的に行うこともできる。 この点に関する現在の技術水準の例としては、ＤＹＮＡ
ＴＥＣＨのＵｌｔｒａｗａｓｈｅｒ ＩＩ、Ｆｌｏｗ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｗ
ａｓｈｅｒ、ＮＵＮＣのＩｍｍｕｎｏＷａｓｈｅｒ Ｎ
Ｋ ３５０、ＳＬＴ ＬＡＢＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳの
Ｅａｓｙ Ｗａｓｈｅｒ“ＥＡＷ ｐｌｕｓ”またはＢ
ｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅのＢｅｈｒｉｎｇ ＥＬＩＳＡ
ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを挙げることができる。最後に挙
げたデバイスがこの例に使用された。
【００３２】アルカリホスファターゼとの接合体ではな
く、抗ヒトＩｇＭとマーカー酵素としてのペルオキシダ
ーゼとの接合体を用いる点で、Ｚｉｅｇｅｌｍａｉｅｒ
らの指示には従わなかった。この酵素の基質としては、
あらかじめドイツ特許出願３５４１９７８号および３５
４１９７９号（１９８５年１１月１８日出願）の記載に
従って調製したテトラメチルベンチジンと過酸化水素を
選択した。発色は３０分後に０．１ｍｌの０．５Ｎ硫酸
で停止させ、適当な光度計、たとえばＴｉｔｅｒｔｅｋ
Ｒ， Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣ， Ｆｌｏｗ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓの装置またはＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒ
ｋｅのＢｅｈｒｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｐｒｏｃｅｓｓｏ
ｒを用いて、４５０ｎｍで測定した。最後に挙げた装置
がこの例に使用された。
く、抗ヒトＩｇＭとマーカー酵素としてのペルオキシダ
ーゼとの接合体を用いる点で、Ｚｉｅｇｅｌｍａｉｅｒ
らの指示には従わなかった。この酵素の基質としては、
あらかじめドイツ特許出願３５４１９７８号および３５
４１９７９号（１９８５年１１月１８日出願）の記載に
従って調製したテトラメチルベンチジンと過酸化水素を
選択した。発色は３０分後に０．１ｍｌの０．５Ｎ硫酸
で停止させ、適当な光度計、たとえばＴｉｔｅｒｔｅｋ
Ｒ， Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣ， Ｆｌｏｗ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓの装置またはＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒ
ｋｅのＢｅｈｒｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｐｒｏｃｅｓｓｏ
ｒを用いて、４５０ｎｍで測定した。最後に挙げた装置
がこの例に使用された。
【００３３】対照抗原で被覆された反応ウエル中の試験
サンプルで得られた測定シグナルを、ＣＭＶ抗原溶液で
被覆された反応ウエル中の同一サンプルで得られた測定
シグナルから差し引いた。この差（△Ｅ）を特異的シグ
ナル（特異的Ｏ．Ｄ．）と呼び、もっぱらこれを評価す
る。
サンプルで得られた測定シグナルを、ＣＭＶ抗原溶液で
被覆された反応ウエル中の同一サンプルで得られた測定
シグナルから差し引いた。この差（△Ｅ）を特異的シグ
ナル（特異的Ｏ．Ｄ．）と呼び、もっぱらこれを評価す
る。
【００３４】装置で完結する場合のＥＬＩＳＡシグナル
の特異的および再現性に対する洗浄溶液の効果の例示に
は、単純な実験配置を選択した。検定プレートを、２種
の試験サンプルのみの多重反復実験用に被覆した（ｎ＝
２４）。一方のサンプルの記号は、ＰＰ １６３５−３
、他方はＳ ８１−１８４ｃ１とした。４個の他の検定
プレートも同一のサンプル負荷で調整し、検定は５個の
すべてのアッセイプレートについて一緒に行った。
の特異的および再現性に対する洗浄溶液の効果の例示に
は、単純な実験配置を選択した。検定プレートを、２種
の試験サンプルのみの多重反復実験用に被覆した（ｎ＝
２４）。一方のサンプルの記号は、ＰＰ １６３５−３
、他方はＳ ８１−１８４ｃ１とした。４個の他の検定
プレートも同一のサンプル負荷で調整し、検定は５個の
すべてのアッセイプレートについて一緒に行った。
【００３５】この間、各アッセイプレート１〜５の順序
は洗浄工程を通じて変えないように注意した。
は洗浄工程を通じて変えないように注意した。
【００３６】まず最初に、特異的Ｏ．Ｄ．の算術平均に
出発して、各アッセイプレートについてのシグナル高を
洗浄順序の関数としてグラフに示した（図１Ａ）。特異
的Ｏ．Ｄ．はアッセイプレートの洗浄順序とともに増加
することが明らかに証明された。
出発して、各アッセイプレートについてのシグナル高を
洗浄順序の関数としてグラフに示した（図１Ａ）。特異
的Ｏ．Ｄ．はアッセイプレートの洗浄順序とともに増加
することが明らかに証明された。
【００３７】次に、特異的Ｏ．Ｄ．の相対標準偏差（Ｃ
Ｖ）に出発して、各アッセイプレートについてのシグナ
ルの変動を洗浄順序の関数としてグラフに示した（図２
Ａ）。ＣＶはアッセイプレートの洗浄順序とともに低下
、すなわち改善されることが明らかに証明された。
Ｖ）に出発して、各アッセイプレートについてのシグナ
ルの変動を洗浄順序の関数としてグラフに示した（図２
Ａ）。ＣＶはアッセイプレートの洗浄順序とともに低下
、すなわち改善されることが明らかに証明された。
【００３８】同じ実験的アプローチを、本発明により洗
浄溶液にＮＴＡたとえば０．１ｍｍｏｌ／リットルを加
えて行い、この洗浄溶液をデバイスによりアッセイに導
入すると、ＥＬＩＳＡの結果は、驚くべきことに、著し
く改善されることが見出されたのである。
浄溶液にＮＴＡたとえば０．１ｍｍｏｌ／リットルを加
えて行い、この洗浄溶液をデバイスによりアッセイに導
入すると、ＥＬＩＳＡの結果は、驚くべきことに、著し
く改善されることが見出されたのである。
【００３９】この場合には、特異的Ｏ．Ｄ．の平均はア
ッセイプレートの洗浄順序とは無関係に、ＣＭＶ−特異
的ＩｇＭの濃度に相当するシグナルレベルにあった（図
１Ｂ）。さらに、シグナルの変動はアッセイプレートの
洗浄順序とは無関係にきわめて低かった（図２Ｂ）。５
個の全アッセイプレートについて得られた測定の変動（
総ＣＶ）を調べると、本発明によって達成されたＥＬＩ
ＳＡの結果の再現性における改善はさらに明瞭になる。 現在の技術水準における洗浄溶液での総ＣＶは、使用さ
れた試験サンプルに依存して１８〜２０％である。本発
明によりＮＴＡを添加した洗浄溶液を使用した場合の総
ＣＶは、使用された試験サンプルに依存して７〜８％で
ある。
ッセイプレートの洗浄順序とは無関係に、ＣＭＶ−特異
的ＩｇＭの濃度に相当するシグナルレベルにあった（図
１Ｂ）。さらに、シグナルの変動はアッセイプレートの
洗浄順序とは無関係にきわめて低かった（図２Ｂ）。５
個の全アッセイプレートについて得られた測定の変動（
総ＣＶ）を調べると、本発明によって達成されたＥＬＩ
ＳＡの結果の再現性における改善はさらに明瞭になる。 現在の技術水準における洗浄溶液での総ＣＶは、使用さ
れた試験サンプルに依存して１８〜２０％である。本発
明によりＮＴＡを添加した洗浄溶液を使用した場合の総
ＣＶは、使用された試験サンプルに依存して７〜８％で
ある。
【００４０】実施例２
問題点を上述した既知の洗浄溶液を、その使用により問
題点を解決した本発明の洗浄溶液と比較するために別の
実験を行った。この場合も、ＣＭＶに対するＩｇＭを検
出する同じＥＬＩＳＡを用いて、同じ試験サンプル、Ｐ
Ｐ １６３５−３とＳ ８１−１８４ｃ１を多重反復実
験（ｎ＝２４）で測定した。しかしながら、この場合は
洗浄工程の実施には数種の異なる装置を使用した。最初
に完結したアッセイプレートがとくに著しい悪影響を受
けていたことから、各場合、単一のアッセイプレートの
みを異なる装置を用いて洗浄した。
題点を解決した本発明の洗浄溶液と比較するために別の
実験を行った。この場合も、ＣＭＶに対するＩｇＭを検
出する同じＥＬＩＳＡを用いて、同じ試験サンプル、Ｐ
Ｐ １６３５−３とＳ ８１−１８４ｃ１を多重反復実
験（ｎ＝２４）で測定した。しかしながら、この場合は
洗浄工程の実施には数種の異なる装置を使用した。最初
に完結したアッセイプレートがとくに著しい悪影響を受
けていたことから、各場合、単一のアッセイプレートの
みを異なる装置を用いて洗浄した。
【００４１】使用した装置は次のように分類できる。
Ａ＝Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの８重の多チ
ャンネルを用いた手洗浄、洗浄溶液は本発明のＮＴＡを
添加していないＢ＝Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ ＥＬＩＳＡ
ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを用いた自動洗浄、洗浄溶液は本発
明のＮＴＡを添加していないＣ＝Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ
ＥＬＩＳＡ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを用いた自動洗浄、洗
浄溶液は本発明のＮＴＡを添加
ャンネルを用いた手洗浄、洗浄溶液は本発明のＮＴＡを
添加していないＢ＝Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ ＥＬＩＳＡ
ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを用いた自動洗浄、洗浄溶液は本発
明のＮＴＡを添加していないＣ＝Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ
ＥＬＩＳＡ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを用いた自動洗浄、洗
浄溶液は本発明のＮＴＡを添加
【００４２】現在の技術水準における洗浄溶液および本
発明の洗浄溶液を各種の装置と組み合わせた場合のＥＬ
ＩＳＡの結果、すなわち特異的測定シグナルおよびその
再現性に対する効果を評価した。
発明の洗浄溶液を各種の装置と組み合わせた場合のＥＬ
ＩＳＡの結果、すなわち特異的測定シグナルおよびその
再現性に対する効果を評価した。
【００４３】すなわち、特異的Ｏ．Ｄ．の算術平均と相
対標準偏差を求めた。上述の配置Ａ〜Ｃでの結果をグラ
フとして示した（図３）。
対標準偏差を求めた。上述の配置Ａ〜Ｃでの結果をグラ
フとして示した（図３）。
【００４４】組み合わせＡは対照として使用された。す
なわち、どの特異的シグナルが検出するべき抗体の濃度
に相当するか、またアッセイ結果にはどの程度の再現性
があるかを示している。
なわち、どの特異的シグナルが検出するべき抗体の濃度
に相当するか、またアッセイ結果にはどの程度の再現性
があるかを示している。
【００４５】組み合わせＢは、低い特異的シグナルと貧
弱な再現性の結果を生じることが明らかである。
弱な再現性の結果を生じることが明らかである。
【００４６】組み合わせＣは、本発明の洗浄溶液の使用
により上述の悪影響が完全に除去されることを示してい
る。すなわち、特異的シグナルは検出すべき抗体の濃度
に相当するレベルに再び到達し、それにより結果の再現
性は保証されている。
により上述の悪影響が完全に除去されることを示してい
る。すなわち、特異的シグナルは検出すべき抗体の濃度
に相当するレベルに再び到達し、それにより結果の再現
性は保証されている。
【図１】装置を用いたＥＬＩＳＡの順序と結果（シグナ
ルの相互関係）を示す図であり、（Ａ）はＮＴＡ添加な
し、（Ｂ）はＮＴＡ添加のものである。
ルの相互関係）を示す図であり、（Ａ）はＮＴＡ添加な
し、（Ｂ）はＮＴＡ添加のものである。
【図２】装置を用いたＥＬＩＳＡの順序と結果（再現性
の相互関係）を示す図であり、（Ａ）はＮＴＡ添加なし
、（Ｂ）はＮＴＡ添加のものである。
の相互関係）を示す図であり、（Ａ）はＮＴＡ添加なし
、（Ｂ）はＮＴＡ添加のものである。
【図３】様々な洗浄操作を用いたＥＬＩＳＡの結果（シ
グナルおよび再現性に対するＮＴＡの影響）を示す図で
あり、（Ａ）は試験サンプルＰＰ １６３５−３、（Ｂ
）は試験サンプルＳ ８１−１８４ｃ１の場合を示す。
グナルおよび再現性に対するＮＴＡの影響）を示す図で
あり、（Ａ）は試験サンプルＰＰ １６３５−３、（Ｂ
）は試験サンプルＳ ８１−１８４ｃ１の場合を示す。
Claims (11)
- 【請求項１】 金属イオンの錯化剤を含有する不均一
酵素免疫検定法用洗浄溶液。 - 【請求項２】 錯化剤を０．０１ｍｍｏｌ／リットル
〜１００ｍｍｏｌ／リットルの濃度で含有する請求項１
記載の洗浄溶液。 - 【請求項３】 錯化剤は、たとえば、ニトリロ三酢酸
（ＮＴＡ）、イソリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、
グルコン酸、またはポリグルコン酸アセタールのような
良好な生物学的分解性を有する試剤である請求項１記載
の洗浄溶液。 - 【請求項４】 錯化剤はＮＴＡである請求項１記載の
洗浄溶液。 - 【請求項５】 緩衝剤を含有する請求項１記載の洗浄
溶液。 - 【請求項６】 界面活性剤を含有する請求項１記載の
洗浄溶液。 - 【請求項７】 不均一酵素免疫検定法における請求項
１記載の洗浄溶液の使用。 - 【請求項８】 酵素免疫検定法がＥＬＩＳＡである請
求項７記載の使用。 - 【請求項９】 酵素免疫検定法における洗浄工程は装
置によって行う請求項７記載の使用。 - 【請求項１０】 標識系はペルオキシダーゼである請
求項７記載の使用。 - 【請求項１１】 請求項１記載の洗浄溶液をその少な
くとも一つの洗浄工程において使用する不均一酵素免疫
検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4037776A DE4037776A1 (de) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | Waschloesung fuer festphasen-immunometrisches verfahren, die einen komplexbildner fuer metallionen enthaelt und ihre verwendung |
| DE40377768 | 1990-11-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04286959A true JPH04286959A (ja) | 1992-10-12 |
| JP3034104B2 JP3034104B2 (ja) | 2000-04-17 |
Family
ID=6419044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3312026A Expired - Fee Related JP3034104B2 (ja) | 1990-11-28 | 1991-11-27 | 金属イオンの錯化剤を含有する固相免疫検定法用洗浄溶液およびその使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5180664A (ja) |
| EP (1) | EP0488168B1 (ja) |
| JP (1) | JP3034104B2 (ja) |
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| AU (1) | AU653965B2 (ja) |
| CA (1) | CA2056278C (ja) |
| DE (2) | DE4037776A1 (ja) |
| DK (1) | DK0488168T3 (ja) |
| ES (1) | ES2108025T3 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US20060084184A1 (en) * | 2004-10-19 | 2006-04-20 | Renovar Incorporated | Reagents for urine-based immunological assays |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3892841A (en) * | 1973-07-11 | 1975-07-01 | American Cyanamid Co | Enhancing the visibility of immunodiffusion precipitin bands in human placental lactogen test |
| US4288343A (en) * | 1978-07-17 | 1981-09-08 | Beckman Instruments, Inc. | Method for increasing shelf-life of a serum bilirubin reference composition and composition produced thereby |
| JPS62502653A (ja) * | 1985-02-11 | 1987-10-15 | トラベノ−ル‐ジエネンテツク、ダイアグノスチクス | 安定化された酵素基質溶液 |
| DE3541979A1 (de) * | 1985-11-28 | 1987-06-04 | Behringwerke Ag | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet mit stabilisator, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
| DE3541978A1 (de) * | 1985-11-28 | 1987-06-04 | Behringwerke Ag | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
| US4859612A (en) * | 1987-10-07 | 1989-08-22 | Hygeia Sciences, Inc. | Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite |
| US5017474A (en) * | 1988-02-12 | 1991-05-21 | Eastman Kodak Company | Wash solution, test kit and method for the determination of an immunological ligand |
| US5077198A (en) * | 1988-04-14 | 1991-12-31 | Eastman Kodak Company | Diagnostic kit and method for rapid detection of antibodies |
| DE3914980A1 (de) * | 1989-05-06 | 1990-12-06 | Basf Ag | 2-methyl- und 2-hydroxymethyl-serin-n,n-diessigsaeure und ihre derivate |
-
1990
- 1990-11-28 DE DE4037776A patent/DE4037776A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-11-26 DE DE59108829T patent/DE59108829D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-26 EP EP91120185A patent/EP0488168B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-26 US US07/798,192 patent/US5180664A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-26 AT AT91120185T patent/ATE157170T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-26 ES ES91120185T patent/ES2108025T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-26 DK DK91120185.3T patent/DK0488168T3/da active
- 1991-11-27 CA CA002056278A patent/CA2056278C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-27 JP JP3312026A patent/JP3034104B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-27 AU AU88143/91A patent/AU653965B2/en not_active Ceased
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|---|---|
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| ATE157170T1 (de) | 1997-09-15 |
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| ES2108025T3 (es) | 1997-12-16 |
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