JPH04287689A

JPH04287689A - 固定化酵素によるアルコールのアシル化方法

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Publication number: JPH04287689A
Application number: JP3340796A
Authority: JP
Inventors: Manfred Schudok; マンフレート・シユドク; Gerd Fuelling; ゲルト・フユリング; Gerhard Kretzschmar; ゲールハルト・クレツチユマル
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1990-12-24
Filing date: 1991-12-24
Publication date: 1992-10-13
Anticipated expiration: 2015-12-11
Also published as: ATE141950T1; DE59108123D1; DK0492497T3; EP0492497A2; US5387514A; JP3117157B2; EP0492497B1; CA2058185A1; EP0492497A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】光学活性なアルコールは、生物活性物質、
たとえば医薬、天然物質、穀類有害生物殺滅剤のまたそ
のほか液晶成分の重要なキラル前駆体であることが多い
。

【０００２】したがって、酵素的なラセミ体分割すなわ
ち光学活性なアルコールの製造を保証する経済的な製造
方法は、きわめて重要である。同じことが、プロキラル
化合物の酵素による立体的識別、たとえば２−置換１，
３−プロパンジオールの鏡像異性ヒドロキシ基のエステ
ル化についてもいえる。さらに、酵素触媒によるアシル
化は、化学的アシル化と異なり、ある種の一級および二
級アルコールのようなとくに感受性の高い基質の場合、
重要である。

【０００３】本発明の方法によって、その製造が容易に
なり、さらに経済的になる薬剤には、ＮＳＡＩＤ（非ス
テロイド性抗炎症剤）、β−遮断剤、気管支弛緩薬、抗
真菌剤、ピレスロイド、テトラミゾール、テトラハイド
ロゾリン、（Ｒ）−（−）−トモキセチン、および（Ｓ
）−（＋）−フルオキセチン、ならびにプロスタグラン
ジン、および炭水化物のような製品がある。プロテアー
ゼ、たとえばレニンの、インヒビターの合成のための合
成用ブロックは、酵素過程の使用によりかなり簡単に得
られるようになる。

【０００４】ビニルエステルが、溶媒たとえばテトラヒ
ドロフランの存在下にアルコールを添加すると、酵素触
媒でエステル交換できることは既に知られている（Ｍ．
　Ｄｅｇｕｅｉｌ−Ｃａｓｔａｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ，　
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　２８（９）：
９５３−９５４，１９８７）。酵素としては、ブタ膵臓
リパーゼが使用された。しかしながら、立体選択性は認
められなかった。

【０００５】ビニルエステルとの溶媒なしでの選択的酵
素触媒エステル交換反応に基づく、ラセミアルコールの
酵素的分離も知られている。使用された酵素は、ブタ肝
臓および膵臓、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ムーコル
（Ｍｕｃｏｒ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）お
よびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）からのリ
パーゼである（ＥＰ　０３２　１９　１８）。

【０００６】さらに、エステル交換のためにカルボン酸
エステル（Ｇ．　Ｃａｒｐａｎｉ，　Ｆ．　Ｏｒｓｉｎ
ａ，Ｍ．　Ｓｉｓｔｉ　＆　Ｌ．　Ｖｅｒｏｔｔａ，　
Ｇａｚｚ．　Ｃｈｉｍ．　Ｉｔａｌ．，　１１９：４６
３−４６５，１９８９）およびアシル化のために環状カ
ルボン酸無水物（Ｙ．　Ｔｅｒａｏ　ｅｔ　ａｌ，　Ｃ
ｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．，　３７：１６５３
−１６５５，１９８９）が使用できることも知られてい
る。

【０００７】欧州特許出願ＥＰ　０　２５　４２　４３
では、キラル化合物がプロキラルジオールから、ヒドロ
ラーゼの存在下に酢酸ビニルとの反応で光学的に純粋に
製造されている。これは２個の鏡像異性一級ＯＨ基の一
方のみの選択的エステル化によって達成される。

【０００８】固定化リパーゼが脂肪、油脂および類似化
合物の加水分解およびエステル交換に使用できることも
知られている（Ｍ．　Ｍｉｔｔｅｌｂａｃｈ，Ｊ．　Ａ
ｍ．　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，６７：１６８−
１７０，１９９０）。

【０００９】Ｈｓｕ　ｅｔ　ａｌ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３１（４４）：６４０３−６４０
６，１９９０）は、ＸＡＤ−８に固定化されたシュード
モナスからのリパーゼを用いる二級アルコールの反応を
記載していて、基質の反応速度の増大を見出している。しかしながら、この文献には、活性の喪失を無視できる
固定化酵素の有用な寿命（安定性）または熱安定性につ
いては全く記述がない。

【００１０】今回驚くべきことに、固定化シュードモナ
スリパーゼを用いるアルコールのＯ−アシル化が、酵素
をポリスチレンベースの吸着性樹脂のような疎水性担体
に結合させることにより固定化すると、とくに効率的に
実施できることが見出されたのである。

【００１１】したがって、本発明は式Ｉ

【化３】〔式中、Ｒ１は水素、ハロゲンで置換されていてもよい
Ｃ１〜Ｃ１８−アルキル、またはフェニルもしくは（Ｃ
１〜Ｃ３）−アルコキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルで
あり、Ｒ２は水素もしくはメチルである〕で示されるビ
ニルエステル、もしくは式ＩＩ

【化４】（Ｒ１は上述の意味であり、Ｒ７はすべてが同一である
場合にはフッ素、塩素もしくは水素であり、２個のＲ７
が水素である場合にはＲ７はフッ素、塩素、臭素もしく
はシアノおよび水素であり、Ｒ７の１個のみが水素であ
り他の２個が同一の場合にはＲ７はフッ素もしくは塩素
および水素である）で示されるカルボン酸エステル、ま
たは環状カルボン酸無水物の１つのコハク酸もしくはグ
ルタール酸無水物を、固定化シュードモナスリパーゼの
存在下にアルコールと反応させるアルコールのアシル化
方法において、ポリスチレンベースの吸着性樹脂に固定
化されたシュードモナスリパーゼを使用することを特徴
とする方法に関する。

【００１２】本発明は、以下に詳細に、とくにその好ま
しい実施態様について説明する。本発明は、さらに、特
許請求の範囲によって定義される。

【００１３】本発明の方法によれば、ビニルもしくはメ
チルビニルエステル、または式ＩＩのカルボン酸エステ
ルもしくは環状カルボン酸無水物を、それ自体を溶媒と
しても作用させまたは他の有機溶媒に溶解させて、ケト
ン、アルデヒドまたはアルコールおよびアシルラジカル
に切断させると、後者が、添加されたアルコール（基質
）を酵素的にアシル化する。

【００１４】適当な担体材料はポリスチレンベースの吸
着性樹脂である。すべての担体は市販品を入手できる。

【００１５】本発明で使用されるポリスチレンベースの
担体材料は、細孔容積２５〜７５％、好ましくは３５〜
５５％、表面積１００〜１０００ｍ２／ｇ、好ましくは
２００〜７５０ｍ２／ｇ、細孔径２５〜１３００Å好ま
しくは５０〜２５０Åである。

【００１６】酵素としてはシュードモナスリパーゼ〔Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃａｐａｃｉａからのリパーゼＰ
（ＦＰまたはＰＳとも呼ばれる）Ａｍａｎｏ　Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，　Ｎａｇｏｙａ，　Ｊａｐａ
ｎ〕が使用される。

【００１７】酵素を固定化するためには、担体１０ｍｌ
あたり０．０１〜２ｇ好ましくは０．１〜１．５ｇの酵
素を、ｐＨ５〜９好ましくはｐＨ６〜８の０．００５〜
１Ｍリン酸カリウム緩衝液中、１〜２０時間撹拌する。この反応時間ののち、ガラス濾斗を通して緩衝液を濾過
し、酵素／担体混合物を大量の水、アセトンおよび酢酸
ビニルで洗浄する。担体はこの状態でそのまま使用でき
るし乾燥状態で保存もできる。

【００１８】酵素とともに負荷する担体の量は、そのバ
ッチの規模、アルコールの反応性、期待される反応時間
、および変換の所望のレベルに依存して、自由に選択さ
れる。これは予備的な試験によって容易に決定すること
ができる。

【００１９】購入できない式Ｉのビニルおよびメチルビ
ニルエステルは、簡単な方法で、たとえば酢酸ビニルの
、適当なカルボン酸との貴金属触媒エステル交換によっ
て製造できる。このエステル交換の好ましい触媒は、Ｐ
ｄ＋である。

【００２０】ビニルエステルはまた、アセチレンのＨｇ
２＋触媒付加によっても合成できる。

【００２１】式ＩＩのカルボン酸エステルは、環状カル
ボン酸無水物（コハク酸およびグルタール酸無水物）も
同様に、購入できるか、または標準的な方法で製造でき
る。

【００２２】購入できないアルコールは、たとえば大部
分購入できる相当するケトンから、または相当するケト
ンのα−ハロゲン化ついでアルコールへの還元によって
得られる。購入できない他のアルコールまたはケトンは
、文献公知の方法で簡単に、たとえばグリニャール反応
または他の慣用の付加反応で製造できる。

【００２３】アルコールの語は、式ＩＩＩ

【化５】〔式中、Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８−アルキルまたはＣ３〜Ｃ
１０−シクロアルキルであり（これらの基はハロゲンで
置換されていてもよい）、Ｒ４はエポキシ−Ｃ１〜Ｃ５
−アルキル（エポキシ基は式ＩＩの基におけるＯＨ基に
対してβ−位にある）であるか、またはＲ４はＣ１〜Ｃ
１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ
１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルケニル（こ
の場合、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびシク
ロアルケニル基は、ＣＯＯＨ、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ
、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニルまたはフェニルで
置換されていてもよく、一方フェニル基はハロゲン、Ｎ
Ｏ２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシで置換されていて
もよい）であるか、またはＲ４はアリールもしくはヘテ
ロアリール（この場合アリールもしくはヘテロアリール
基はＣ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、
ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮまたはＮ−ＰＧで置換されてい
てもよく、ＰＧはアミノ保護基である）であるか、ある
いは、Ｒ３およびＲ４は両者で、式ＩＶａ、ｂ

【００２４】

【化６】（式中、ｎは１、２または３であり、Ｒ５およびＲ６は
互いに同種または異種であって、水素、Ｃ２〜Ｃ４−ア
ルケニルまたはＣ１〜Ｃ４−アルキルであるか、Ｒ５お
よびＲ６は両者でフェニルまたはナフチルに融合してい
ることを示し、この場合フェニルまたはナフチル基はＣ
１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ＮＯ２
、ＣＮまたはハロゲンで置換されていてもよく、またア
ルキレン鎖のメチレン単位はカルボニル基で置換されて
いてもよい）である〕で示されるアルコール、または式
Ｖ

【００２５】

【化７】（式中、Ｒ８はハロゲンまたはアルキル基であり、Ｒ９
はアルキル、アラールキル、アリール、ベンジルまたは
ナフチルメチル基である）のアルコールを意味する。

【００２６】基質として、すべての多価アルコールを使
用することもできる。

【００２７】式ＩＩＩのアルコール中のハロゲンの語は
、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素、とくに塩素およ
び臭素を意味する。「アリール」の語は、たとえば、フ
ェニル、ナフチル、フェナンスリル、アンスリルおよび
フルオレニル、とくにフェニル、ナフチルおよびフェナ
ンスリルを意味する。「ヘテロアリール」の語は、たと
えば、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、ピリミ
ジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾリル、イソキ
サゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリルお
よびインドリル、とくにフリル、チエニル、ピロリルお
よびピリジルを意味する。アミノ保護基、「ＰＧ」は、
ペプチド化学において慣用されているアミノ保護基、た
とえばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ベンゾイル、
ベンジル、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フ
ルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンズヒ
ドリル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）、トシル
、メトキシメチル（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニル（
ＴＨＰ）、アセチルを意味するが、さらにはアルキルま
たはシクロアルキル基たとえば、Ｎ−メチル、Ｎ，Ｎ−
ジメチルも包含される。「フェニルに融合」または「ナ
フチルに融合」の語は、式ＩＩＩの基のＣ−Ｃ結合がフ
ェニルまたはナフチル基の一部であるフェニルまたはナ
フチル基を意味する。任意の置換基、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４
、Ｒ５およびＲ６は好ましくはモノ置換される。

【００２８】炭素原子３個もしくはそれ以上を有するア
ルキルおよびアルケニル基ならびに炭素原子４個もしく
はそれ以上を有するアルキニル基は、直鎖状でも分岐状
でもよい。

【００２９】アシル化されるアルコールは、ビニルエス
テルの容量に基づいて、濃度０．０５〜２００％、好ま
しくは０．５〜１０％で使用される。

【００３０】アルコールのアシル化には、少なくとも０
．５モル当量のビニル基を使用しなければならない。

【００３１】アルコールの反応は、回分式または連続法
で行われる。

【００３２】アルコールのラセミ分割は、本発明の方法
においては、慣用の方法に比べて、活性が少なくとも９
０％増大して実施することができる。

【００３３】担体上に固定化された酵素は、連続過程に
おける数か月もの使用後にさえも、活性の喪失はほとん
ど示さず、固定化酵素を使用しない場合と反応進行およ
び反応相には変化はない。これは、反応を加熱下に行う
場合でも同様である。

【００３４】固定化シュードモナスリパーゼを用いる回
分式反応の場合には、式Ｉのビニルエステルもしくは式
ＩＩのカルボン酸エステルまたは環状カルボン酸無水物
、好ましくは酢酸ビニルまたはビニルエステルの溶液を
（非極性）有機溶媒に導入し、反応させるアルコールを
添加する。適当かつ好ましい溶媒は、エーテルであり、
とくに対称および非対称、分岐状および直鎖状ジアルキ
ルエーテルが使用できる。同じく、適当かつ好ましい溶
媒は炭化水素であり、とくに直鎖状、分岐状または脂環
式のＣ４〜Ｃ８の炭化水素が使用できる。担体上に固定
化されたシュードモナスリパーゼを懸濁液に加え、一定
の温度で撹拌または振盪する。反応の完了はＴＬＣ、Ｇ
ＣまたはＨＰＬＣによってチェックされる。固定化酵素
をついで濾過し、溶媒（上述）または酢酸ビニルで完全
に洗浄し、溶液を真空中で濃縮する。ラセミ体分割の場
合には、残留物として得られるアルコール／エステル混
合物を、シリカゲル上クロマトグラフィーまたは抽出、
結晶化もしくは蒸留によって分離する。他のアシル化生
成物の場合は、多くの場合、十分な純度で得られ、した
がって、精製は不要である。

【００３５】反応を連続法で実施する場合には、担体上
に固定化されたシュードモナスリパーゼ　Ｐ／ＥＰ／Ｐ
Ｓをガラスカラムに充填し、反応を行う溶媒、すなわち
酢酸ビニル、他のビニルエステルまたは他の有機溶媒で
洗浄する。

【００３６】ついで基質溶液を、一定の速度、一定の温
度で通過させる。

【００３７】担体（ｍｌ）と固定化リパーゼ（ｇ）と酢
酸ビニル（ｍｌ）と基質（容量％）の比は、酢酸ビニル
を用いる場合（すなわち、さらに溶媒を添加しない場合
）、５〜１００：１：５〜１０，０００：０．５〜２０
０の範囲である。

【００３８】反応をビニルエステル中で実施する場合に
は、アシル化するアルコールは０．０５〜２００容量％
の濃度で使用される。

【００３９】変換のレベルは、事実上、所望により、滴
下速度を調節することによって、制御することが可能で
、これは予備試験によって容易に決定される。

【００４０】空間−時間収率は上述のパラメーターに直
接依存するが、とくにカラムディメンションすなわちカ
ラム内の担体に固定化された酵素の量に依存する。

【００４１】カラムディメンションは自由に選択できる
が、実験室規模では、１０〜５００ｍｌのオーダーとす
ることが好ましい。担体に固定化された酵素５０ｍｌの
好ましいカラム充填で、基質溶液の濃度は１％、流速　
１０滴／分で、約０．５〜３００ｇ／リットル／ｈの空
間−時間収率が達成される。

【００４２】処理時の反応温度は−１０〜＋１００℃、
好ましくは０〜６０℃である。

【００４３】反応時間は、反応させるアルコールの性質
、その濃度および担体上に固定された酵素の量に依存し
、１ｈ〜４週の間で変動する。３ｈ〜３日であることが
好ましい。

【００４４】本発明の方法で生じたアセトアルデヒドま
たはアセトン生成物、およびアシル化のために遊離した
アルコール、ならびに選択的アシル化の場合に生成した
鏡像異性アルコール（基質）すなわちカルボン酸エステ
ルおよび非反応アルコールは、すべての慣用方法を用い
て既知の方法で、ただし各場合について予備試験をして
、好ましくはシリカゲル上クロマトグラフィーまたは他
の上述の方法の１種によって分離することができる。

【００４５】

【実施例】一般的方法酵素を固定化するには、担体材料は、酵素の固定化後、
ａ）非処理で、またはｂ）ついでグルタールアルデヒド
で架橋して用いられる（表１）。

【００４６】ａ）の場合、担体にリパーゼを固定化する
には、担体５０ｍｌをリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
、１００ｍｌに懸濁し、リパーゼＰ　５００ｍｇを加え
る。混合物を室温で３時間撹拌し、濾過し、水で完全に
洗浄する。

【００４７】ｂ）のついで架橋する場合、処理はａ）に
記載したと同様に実施し、指示した固定化時間ののち、
４ｍｌのグルタールアルデヒド溶液（濃度２５％）で架
橋を行う。１時間後に、担体上に固定化された酵素を濾
過し、水洗する。

【００４８】好ましい担体としては次のような特徴を有
する担体を挙げることができる。

【００４９】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｒ
ＸＡＤ−２　　　　　　ＲＸＡＤ−４　　細孔容積（％
）　　　　　　　　　　　　４２　　　　　　　　　　
　　　　５１　　密度　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．０２　　　　　　　　　　　１
．０２　　表面積（ｍ２／ｇ）　　　　　　　　３３０
　　　　　　　　　　　　７５０　　細孔径（Å）　　
　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　
　　　５０

【００５０】担体は水中に、または乾燥状態
で保存することができる。

【００５１】反応させるアルコール５００ｍｇを酢酸ビ
ニル２０ｍｌに懸濁する。これに固定化リパーゼを加え
、混合物を一定の温度で撹拌する。

【００５２】反応完了後、固定化酵素を濾過して除く。残った溶液を真空中で完全に蒸発させる。

【００５３】残留物中に存在するアシル化生成物は、標
準的方法、たとえばシリカゲルクロマトグラフィーによ
って分離することができる。

【００５４】出発原料および得られた生成物、変動可能
な工程パラメーター（酵素の量、担体の量、アルコール
の量、ビニルエステルの量、反応温度、反応時間）なら
びに生成物の特性および化学的収率を表２〜５に掲げる
。

【００５５】活性の正確な決定には、担体に結合した酵
素の量を正確に測定する必要がある。

【００５６】本発明の方法に関して本明細書に記載した
試験における基本的な前提は、シュードモナスリパーゼ
が塩含量３７％または蛋白質６３％（重量％）の単一な
蛋白質であるということである。この塩含量は透析によ
って測定される。

【００５７】固定化収率の測定には、２０ｍｌのＸＡＤ
−２担体および２ｇのシュードモナスリパーゼを用いて
既述の試験を実施する。固定化および洗浄溶液を集めて
合し、凍結乾燥する。酵素と緩衝塩からなる残留物１．
７７ｇがこのプールから得られる。純粋な緩衝液の凍結
乾燥後に得られる重量から、使用された緩衝液の量の中
の塩の量は０．３８ｇであることがわかっている。

【００５８】したがって、残留物の１．７７ｇから、ひ
とつには緩衝塩の０．３８ｇと、次に酵素の塩０．７４
ｇ（＝３７％、上記参照）を差し引く必要がある。

【００５９】残った量０．６５ｇが固定化されなかった
酵素の量に相当する筈である。

【００６０】残留物をついで透析すると、少量の塩がま
だ存在し、したがって残っている酵素の量は、理論量の
０．６５ｇではなく、０．５８ｇである。すなわち、固
定化された酵素の量は０．６１〜０．６８ｇである。こ
れは固定化収率が５１％であることを意味する。

【００６１】この計算を、例示のためにもう一度、表２
〜５に掲げた実施例１の場合（フェニルエタノール）に
ついて行う。

【００６２】５０ｍｇのリパーゼＰ（市販品を入手）×
０．６３　　実際のリパーゼＰ酵素含量×０．５１　　
固定化収率 →１６ｍｇ　　担体上に固定化されたリパーゼ５０ｍｇ
の遊離リパーゼ ×０．６３　　実際のリパーゼＰ酵素含量→３１．５ｍ
ｇ　　実際のリパーゼＰ酵素量１６ｍｇの固定化酵素は
３３．４％の変換率を与え、遊離の酵素３１．５ｍｇは
２０．７％の変換率を与える：→活性：３２０％

【００６３】酵素的なラセミ体の分割は、上述のように
酢酸ビニルの存在下のみでなく、他のビニルエステル、
たとえばクロロ酢酸、ラウリン酸およびフェニル酢酸の
ビニルエステルの存在下にも実施できる。このためには
、担体に固定化したリパーゼＰをガラスカラムに充填し
、以後の反応で溶媒として用いられるｔ−ブチルメチル
エーテル１５０ｍｌで洗浄する。

【００６４】次にカラムに、それぞれ２５０ｍｌのｔ−
ブチルメチルエーテル２５０ｍｌに溶解した基質および
ビニルエステルの溶液を負荷する。この溶液をカラムを
徐々に通過させ、溶液が完全に通過したのちの組成をガ
スクロマトグラフィーで測定する。

【００６５】使用された量、通過および反応時間、なら
びに結果は表６に示す。

【００６６】酢酸エチルによるエステル交換：酢酸エチ
ル０．５ｍｌを、ｔ−ブチルメチルエーテル（１０ｍｌ
）中２．５％濃度のフェニルエタノールおよび５ｍｌの
ＸＡＤ−２上固定化酵素（酵素の理論量：５０ｍｇ）と
室温で撹拌する。この反応は５日後にフェニルエタノー
ルの５０％変換を示した。

【００６７】非固定化酵素による対照実験では７日後に
も明らかに低い変換率を示した。

【００６８】変換はＴＬＣで測定した。

【００６９】一級ＯＨ基のエステル化例：ゲラニオール
を酢酸ビニル１０ｍｌ中２．５％の濃度に溶解し、ＸＡ
Ｄ−２上固定化酵素５ｍｌ（酵素の理論量５０ｍｇ）を
加えて室温で撹拌する。わずか１時間後に固定化酵素で
は定量的なアシル化が達成されたが、遊離酵素ではさら
に５０％の時間を要した。

【００７０】ｄｌ−パントラクトンのアセチル化例−連
続法における高温での長期安定性の試験：４００ｍｌの
ＸＡＤ−２上固定化リパーゼＰを、熱制御可能なジャケ
ット付きガラスカラムに充填する。０．１％濃度のｄｌ
−パントラクトン溶液（酢酸ビニル／ｔ−ブチルメチル
エーテル　１：９中；総容量２リットル）を、流速０．
１１ｍｌ／分、５０℃においてカラムを通過させる。カ
ラム容量はその後の同速度でのｔ−ブチルメチルエーテ
ルによる洗浄で補整する。反応溶液のＧＣ分析で、第１
回目の試行ではパントラクトンアセテートへの変換率は
７１．６％を示す。洗浄したカラムは乾燥状態で室温に
おいて保存し、新たな試行の開始に際してはその都度５
時間前に温度を平衡化させた。以後の５カ月間にさらに
１１回の連続反応を同様の様式で行う。５カ月後に行っ
た１２回目の試行におけるパントラクトンアセテートへ
の変換率は７０．７％を示している。

【００７１】

【表１】

【００７２】

【表２】

【００７３】

【表３】

【００７４】

【表４】

【００７５】

【表５】

【００７６】

【表６】

【００７７】本発明の方法は、アルコールのラセミ体の
分割のための慣用方法に比較して以下の利点を有する。Ａ）　　酵素活性の増大により、空間−時間収率が著し
く上昇する。Ｂ）　　固定化酵素のきわめて長い有用寿命は、とくに
生物触媒の経済的な利用を可能にする。Ｃ）　　酵素活性の耐容性が高い（表１，下記（ａ）参
照）。Ｄ）　　固定化酵素の高い熱安定性。

【００７８】トルエン中０．５％濃度のフェニルエタノ
ール溶液１０ｍｌを遊離リパーゼ１００ｍｇまたは固定
化酵素１ｍｌと混合し、ついで各場合０．１ｍｌのフェ
ニル酢酸ビニルエステルを加える。遊離のリパーゼは室
温で５時間撹拌後３．２％の変換率を示し、同じ時間１
１０℃で還流したのちには最早活性を示さないのに対し
、固定化リパーゼは１１０℃でなお１〜２％の変換率を
示す。変換率はＧＣ試験（ＲＣｈｒｏｍｓｏｒｂ　上　
Ｒｅｏｐｌｅｘ）。

【００７９】（ａ）　　ラセミ体フェニルエタノール２
５０ｍｇを酢酸ビニル２０ｍｌ中、固定化リパーゼ２ｍ
ｌと５０℃で６時間振盪する。ついで変換率をＧＣで測
定し、固定化酵素を濾過して除き、酢酸ビニルで完全に
洗浄する。次の日に同一条件で新たな反応を実施する。（ｂ）　　この方法を０．２ｇの遊離酵素を用いて同様
に行う。

【００８０】（ａ）　　最初の試行では６時間後に４８
．７％の変換がみられる。第１０回目の試行では６時間
後に２１．２％の変換がみられる。

【００８１】（ｂ）　　最初の試行では６時間後に４６
．１％の変換がみられる。７回目以後の試行では生成物
は最早認められない。

【００８２】酵素の活性は長期にわたって確認される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　式Ｉ【化１】〔式中、Ｒ１は水素、ハロゲンで置換されていてもよい
Ｃ１〜Ｃ１８−アルキル、またはフェニルもしくは（Ｃ
１〜Ｃ３）−アルコキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルで
あり、Ｒ２は水素もしくはメチルである〕で示されるビ
ニルエステル、もしくは式ＩＩ【化２】（Ｒ１は上述の意味であり、Ｒ７はすべてが同一である
場合にはフッ素、塩素もしくは水素であり、２個のＲ７
が水素である場合にはＲ７はフッ素、塩素、臭素もしく
はシアノおよび水素であり、Ｒ７の１個のみが水素であ
り他の２個が同一の場合にはＲ７はフッ素もしくは塩素
および水素である）で示されるカルボン酸エステル、ま
たは環状カルボン酸無水物の１つのコハク酸もしくはグ
ルタール酸無水物を、固定化シュードモナスリパーゼの
存在下にアルコールと反応させるアルコールのアシル化
方法において、ポリスチレンベースの吸着性樹脂に固定
化されたシュードモナスリパーゼを使用する方法。
【請求項２】　　反応は回分式で行われる請求項１記載
の方法。
【請求項３】　　反応は連続法で行われる請求項１記載
の方法。
【請求項４】　　細孔容積２５〜７５％、表面積１００
〜１０００ｍ２／ｇ、細孔径２５〜１２００Åのポリス
チレンベースの吸着性樹脂を担体材料として使用する請
求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】　　担体は、その上に酵素をカップリング
したのち、ａ）固定化のための処置をせず、またはｂ）
ついでグルタールアルデヒドで架橋する、いずれかの形
で使用することができる請求項１〜４のいずれかに記載
の方法。
【請求項６】　　反応温度は−１０〜＋１００℃とする
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】　　反応温度は−０〜＋６０℃とする請求
項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】　　請求項１〜７のいずれかに記載の方法
で得られるキラルな合成用ブロックの、プロテアーゼイ
ンヒビターの合成のための使用。
【請求項９】　　請求項１〜７のいずれかに記載の方法
で得られる光学的に純粋なアルコールの、ＮＳＡＩＤ、
β−遮断剤、気管支弛緩薬、抗真菌剤、ピレスロイド、
テトラミゾール、テトラハイドロゾリン、（Ｒ）−（−
）−トモキセチン、（Ｓ）−（＋）−フルオキセチン、
プロスタグランジンまたは炭水化物の製造のための使用
。
【請求項１０】　　ＮＳＡＩＤはイブプロフェンおよび
ナロキサン、β−遮断剤はニフェナロールおよびペンブ
トロール、気管支弛緩薬はトルブテロールおよびビトル
テロール、抗真菌剤はチオコナゾール、ピレスロイドは
アレスリンである請求項９記載の使用。