JPH04290961A - 迅速で簡単なマニュアルアッセイを行うためのデバイス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、試験液体中の分析物を検出及び
／又は測定するためのデバイス及びその使用、並びに試
験液体中の分析物を検出及び／又は測定するための方法
に関する。

【０００２】特異結合アッセイの分野は、診断分野にお
けるその重要性が認識されるにつれて、大きく広がりつ
つある。特定化合物を検出し且つその化合物を定量的に
測定することができるという特性を利用して、各種薬物
の投与のモニタリング、各種のホルモン失調の測定、生
理活性蛋白質の定量及び病原体の存在の診断ができる。 分離ステップの要否、標識により発生する信号の種類、
溶液中又は表面上での信号の発生及び定量測定方法に応
じて技法が区分される。

【０００３】アッセイを開発する場合、多くの要件を考
慮して試薬とプロトコルが創案される。１つの要件はア
ッセイを行う人の熟練の程度である。比較的未熟又は未
経験の人がアッセイを行っても妥当な定量結果を得るこ
とができるのが多くの場合望ましい。未熟な人が精巧な
器具を必要としないで迅速簡単な試験を用いて定量アッ
セイを行うことができることは特に望ましい。

【０００４】過去１０年間に、多くの所謂ディップステ
ィック・フィルターアッセイが開発された。その小片は
、従来の小片より良い結果を求めて、種々の形のあらゆ
る種類の紙片に亘り、たとえば免疫化学成分を被覆した
プラスチック片も開発されている。

【０００５】たとえば、欧州特許出願　ＥＰ０，１４９
，１６８号は、ガラス毛管を利用して行うことができる
免疫アッセイを記載している。少くとも２つの領域に別
々の担体材料を充填する。免疫化学反応により、試験液
体中での存在又は濃度を測定したい物質と免疫複合体を
形成することができる標識物質を有する免疫反応性成分
を第１の担体材料に結合させる。続いて、前記複合体を
毛管作用により第２の担体材料まで輸送し、そこで第２
の担体材料と結合している第２の免疫反応成分に結合さ
せた後固定化させる。その後で、このようにして固定化
した免疫複合体の量を、使用した標識化物質に応じて公
知の検出方法により測定することができる。この欧州特
許出願で使用された標識化合物は放射性同位体、酵素又
は蛍光物質である。

【０００６】前記免疫アッセイの欠点は、免疫化学反応
の後に、未反応の反応物から結合した固相を分離するた
めに、「結合／遊離分離（ｂｏｕｎｄ／ｆｒｅｅ　ｓｅ
ｐａｒａｔｉｏｎ）」として当業者に公知の幾つかの操
作を行なわなければならないことである。結合／遊離分
離の後試薬を添加する追加の作業ステップが必要とされ
、たとえば固相に結合した標識反応物を検出するために
ある物質を添加しなければならないこともある。アッセ
イ信号の増強を必要とする感受性の高いアッセイを行う
場合追加ステップは確かに必要になる。

【０００７】今回、驚くべきことに、デバイスを試験液
体と洗浄流体に接触させる操作と、しばらくしてから、
正確さと信頼度を損うことなく結果を測定する操作を実
施するだけですむデバイスを知見した。このデバイスに
より、結合／遊離分離ステツプの数及び試薬添加とかそ
の順序を考えずに、唯２つの操作ステップだけで複雑な
アッセイ、たとえばＥＬＩＳＡを行うことができる。

【０００８】従って、本発明は試験流体中の分析物（ａ
ｎａｌｙｔｅ）　を検出及び／又は測定するためのアッ
セイの実施用デバイスに係る。前記デバイスは、少くと
も部分的に半透性層と隣接する液体輸送用トラックを含
み、前記トラックには、アッセイ中に半透性層に沿って
、直接又は間接に分析物と結合し得る及び／又は直接又
は間接に分析物に対する反応物と結合し得るリガンドを
保有する可動性固相材料が輸送される。前記半透性層は
可動性固相材料を通過させることはできない。

【０００９】本発明は試験液体の分析物を検出及び／又
は測定する方法にも係る。前記方法は、本発明のデバイ
スを試験液体及び場合により輸送流体と接触させること
により、リガンドを有する可動性固相材料が、前記試験
液体及び同時に又は引続いて標識を有する反応物と接触
し、前記液体の１つ又は両方によりトラックを介して装
置の中で標識に対する検出系が置かれている位置に輸送
される。前記固相材料と直接又は間接に結合している標
識を検出して、結合の程度を直接又は間接に測定し、そ
の程度が測定又は検出される分析物の濃度の定性的又は
定量的な指標とされる。

【００１０】本発明は、本発明のデバイスを含み得る試
験用キットにも係る。場合により、試験用キットは、デ
バイスの中又はその外部に、標識とカップリングした免
疫化学試薬及びリガンドたとえば免疫化学試薬を保有す
る分散した又は分散し得る可動性固相材料を含有し得る
。別の態様としては、試験用キットは、デバイスの中又
はその外部に標識にカップリングした核酸配列及びリガ
ンドたとえば核酸配列を保有する分散した又は分散し得
る可動性固相材料を含有し得る。

【００１１】本発明のデバイスのトラックは、前記トラ
ック中の液体フラックスの速度を制御する暫定物質（ｐ
ｒｏｖｉｓｉｏｎ）　を含有し得る。このような暫定物
質はスクロースのように湿潤したときゆっくり溶解する
成分であり得る。

【００１２】デバイスの特定の実施態様は、トラックが
半透性であって少くとも部分的に吸収剤材料によって包
囲されている壁を有する毛細導管、たとえばポリエーテ
ルスルホン、ポリアミド、ポリイミド又は再生セルロー
スのような多孔性中空繊維であるデバイスであり、この
導管は可動性固相材料、たとえばリガンドで被覆した粒
子の含水懸濁液を毛管作用により前進させるため使用さ
れる。半透性壁は小孔を通して分子たとえば夾雑物や前
記被覆粒子より小さい粒子を通過させることができるが
、前記被覆粒子を通過させない。

【００１３】小孔はたとえば湾曲、平行又はほぼ垂直の
方向で半透性壁に存在し得る。

【００１４】毛細導管は試薬を含有するステーションで
終るか、又はそこから離れている。前記試薬は前記懸濁
液、標識若しくは非標識の特定反応物又は標識反応物を
検出するための特定基質であり得る。

【００１５】毛細導管はかようなステーション自体を含
有し得る。前記半透性壁は毛細導管の外部で試薬と接触
し得る。導管の外部の試薬は、たとえば湿潤したとき半
透性壁を横切って導管に浸透し得る。試薬は、試験液体
又は導管を介して輸送される輸送流体と接触して溶解又
は再懸濁する乾燥試薬であってもよい。

【００１６】結合／遊離分離を考慮して、毛細導管の半
透性壁が毛細導管外部の液体に対する吸収剤と接触し得
る。

【００１７】しかしながら、半透性壁自体が吸収剤を不
必要にするに十分な吸収能力を有していてもよい。

【００１８】一体の毛細導管よりもむしろ複数本の毛細
導管を使用し得る。

【００１９】本発明の別の実施態様では、毛細導管の代
りに多孔性マトリックスを使用して前記のデバイスと同
様に構成し機能させることができるが、このマトリック
スは前記被覆粒子を輸送することが可能であり且つ前記
半透性層と少くとも部分的に並んで接触していなければ
ならない。本発明のデバイスは免疫学的核酸ハイブリダ
イゼーション又は核酸増幅アッセイ系における結合／遊
離分離のために使用し得る。

【００２０】特定のデバイスについて図１を参照しなが
ら説明する。図１に示したデバイス１は管状の半透性膜
たとえば多孔性中空繊維２から成り、この中に乾燥した
分散性可動性固相材料、たとえば分析物に対するリガン
ドで被覆した凍結乾燥ポリスチレンラテックス粒子３が
充填されている。更に上方にさかのぼると、繊維毛管に
は乾燥した（たとえば凍結乾燥された）分析物に対する
標識反応物４が充填されている。多孔性中空繊維は、含
水液体を通過させない重合体層６により隔てられた吸収
剤材料５によって少くとも部分的に包囲されている。

【００２１】使用される標識に応じて、標識に対して反
応性のある乾燥基質７がデバイスの末端に置かれている
。この末端で、実施されるアッセイの検出及び／又は測
定が行なわれる。

【００２２】場合により、吸収剤材料を用いて包囲され
た多孔性中空繊維は、長円若しくは円形の管のようなケ
ーシング８、又は正方形若しくは長方形のケーシングを
備えており、そのケーシングの開放端部Ａ及びＢをキャ
ップ１０を用いて閉鎖してもよい。

【００２３】ケーシングは、少くとも測定又は検出を行
う位置では、透明材料から製造される。ケーシングとキ
ャップに適当な材料はガラス又はプラスチック、たとえ
ばポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリカー
ボネート若しくはポリ塩化ビニルである。

【００２４】可動性固相材料としては、ポリスチレンラ
テックス粒子３の代りに、液体フラックスにより輸送可
能であり且つリガンドで被覆可能である粒子が前記液体
中で分散液として存在することができ且つ半透性膜を通
過不能であるならば、それらを使用することができる。 本発明の可動性固相材料は分散された又は分散し得る固
相材料であり、分散し得る固相材料とは液体との接触に
より分散化するものである。前記粒子は微晶性セルロー
ス、ポリアクリルアミド球、安定化血球、試料自体の血
球、金属ゾル等である。かような粒子を、可動性固相材
料の輸送の際に、たとえば基質７が存在する位置への到
達を観察して試験が完了したことを確めるべく、ビルト
インの目に見える固有の対照として着色することもでき
る。

【００２５】図１の実施態様では、たとえば、ラテック
ス粒子を着色して、基質７が存在する位置への可動性固
相材料の到達を観察するようにし得る。前記リガンド、
即ち抗原若しくはその断片、抗体若しくはその断片又は
核酸配列を物理的吸着又は化学的結合、たとえば共有結
合のいずれかにより粒子に被覆することができる。

【００２６】凍結乾燥標識反応物４は、標識抗原若しく
はその断片、標識抗体若しくはその断片、又は核酸配列
とすることができる。これらの反応物は毛細導管の中又
は外側に置くことができる。導管の外側の反応物は、こ
れらの反応物が湿潤したとき溶解して前記半透性膜を横
切って導管に進入するように配置する。

【００２７】「標識」とは、前記の標識反応物が半透性
膜の孔を通過できる限り、酵素、染料ゾル粒子、金属ゾ
ル粒子又は他の有色分散粒子を意味するものと理解され
たい。

【００２８】染料ゾル粒子、金属ゾル粒子又は他の有色
分散粒子は直接検出できる標識物質として機能する。酵
素を標識として選んだ場合、酵素に対して反応性のある
乾燥基質７はデバイスの末端の検出又は測定サイトに存
在する。基質に代えて又は基質に追加して、標識の存在
を直接又は間接に感受する電子センサーを存在させ得る
。

【００２９】金属ゾル粒子を標識物質として使用する場
合、デバイスの未端７にたとえば結果の感受性を増強す
ることができる前記金属ゾルに対する強化物質を充填し
て、肉眼で見える又は比色計若しくは反射計により読取
り得る信号を得るようにすることができる。

【００３０】前記標識を免疫化学的活性物質にカップリ
ングする方法はそれ自体は公知である。カップリングは
直接又は間接であっても、化学的のたとえば共有結合に
よっても非化学的のたとえば吸着によるものであっても
よい。

【００３１】ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）酵素をしばしば適当な標識として使用する。この
ＨＲＰに対する基質は過酸化水素であって、それは色素
産生補基質、たとえば３，３′，５，５′−テトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）と混合しなければならない。

【００３２】吸収剤材料５はセルロース、綿、羊毛、絹
、ガラス繊維、ナイロン繊維、アクリル繊維、ポリエチ
レン繊維、ポリエステル繊維若しくはセラミックのよう
な材料、又は石膏のような硬化性材料から成り得る。 吸収剤材料は、チョーク、活性炭（ｎｏｎｔ）又はシリ
カゲルのような粉末又は顆粒から成り得る。

【００３３】場合により、吸収剤材料は、試験流体中の
夾雑成分に対する親和力を有する活性物質、たとえば免
疫化学活性物質を含有し得る。

【００３４】本発明のデバイスを使用して、各種の分析
物、抗原若しくはその断片、抗体若しくはその断片、ハ
プテン及び核酸配列を前記デバイスを用いて測定するこ
とができる。

【００３５】デバイスは尿、血清又は全血のような試験
液体中の分析物を測定するのに使用される。デバイスは
、所謂サンドイッチ反応、阻害又は競合又は阻止反応を
行うのに適当である。

【００３６】試験液体中の免疫化学活性物質を検出する
免疫学的アッセイを行うための本発明デバイスの使用の
好ましい実施態様について、更に詳細に説明する。

【００３７】本発明のデバイスを、その毛細導管の一端
を試験液体中に置くか又はこの端部を試験液体に浸漬し
、続いてそれを輸送液体中に置くことにより、試験液体
と接触させる。これによりアッセイ、たとえばＥＬＩＡ
（酵素結合免疫吸着アッセイ法）が自主的に行われる。 典型的アッセイ機序は次のようである。

【００３８】−液体に可動性固相材料、たとえばリガン
ドで被覆した凍結乾燥粒子を再懸濁させる。

【００３９】−試験液体及び／又は輸送液体により毛細
導管を介して可動性固相材料を前進させる。

【００４０】−同時に又は引続いて、前記液体により標
識反応物を前記被覆粒子と接触できるようにする。

【００４１】−この結果として、分析物が試験液体中に
存在する場合は標識反応物が粒子に結合する。

【００４２】−非結合分析物、非結合標識反応物及び夾
雑物のような非結合物質を導管から除去し、こうして半
透性膜（導管の外部の吸収物と接触している）を介する
液体流により粒子と分離する。

【００４３】−毛管を介して更に輸送することにより、
粒子を輸送する液体は、ＥＬＩＳＡの場合、基質の成分
を溶解し、その結果この基質が粒子と接触する。

【００４４】−この粒子に結合している標識は基質を変
化させて、肉眼で見えるか又は比色計若しくは屈折計で
計測できる反応生成物を生じる。

【００４５】前記の典型的なアッセイ機序は、標識とし
て酵素の代りに金属ゾル又は染料ゾルを用いても同様に
機能し得る。標識として金属ゾル又は染料ゾルを使用す
る場合、基質は不要であり得る。

【００４６】デバイスは従来のディップスティック・フ
ィルターアッセイに比較して多くの利点を有する。分散
固相材料、たとえば抗体で被覆したラテックス粒子は懸
濁されたままであるので、反応成分の間で常に最適な相
互作用が得られ、これにより更に高い感受性が得られ、
及び／又はインキュベーション時間を短縮できる。

【００４７】慣用の固相フィルター手法を使用すると、
固相フィルター材料と非特異的な相互作用が生じる。本
発明のデバイスを使用すると、半透性膜と相互作用する
夾雑成分が最終の検出過程を干渉することはあり得ない
。

【００４８】デバイスは、ヒト又は動物の起源のあらゆ
る種類の液体の生物試料に対して簡単で迅速なマニュア
ルアッセイとして使用することができる。体液、排泄物
、組織標本、唾液等又はそれらの液体抽出物を試料とす
ることができる。

【００４９】

【実施例】本発明について次に実施例を引用して説明す
る。

【００５０】実施例１ ８００ｎｍ　のポリスチレンラテックス粒子の表面上に
、抗−ＨＢＳ（Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対す
る抗体）をＦｒｉｔｚ　及びＲｉｖｅｒｓ（１９７２年
，Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１０８　，　１０８〜
１１１）の記載した方法により物理的吸着によりカップ
リングした。ＨＲＰをＷｉｌｓｏｎ及びＮａｋａｎｅ（
１９７８）に従って抗−ＨＢＳに接合させた。　３１０
μｍの内径を有し、　２００から５００ｍｍ　までの小
孔を有する厚さ７５μｍの管状ポリアミド膜から成るポ
リアミド多孔性中空繊維（ＰＨＦ）の１０ｃｍピースの
一端（Ａ）に、１ｃｍの長さにわたって前記のように製
造した抗−ＨＢｓを負荷したラテックス粒子の懸濁液を
充填した。端部（Ａ）から約５から６ｃｍのところには
、約１ｃｍの長さにわたって抗−ＨＢｓ／ＨＲＰ接合体
を充填した。１０ｃｍのピースを２つに切り、各半片の
一端に１ｃｍの長さにわたって液体試薬を充填し、液体
試薬を含む繊維を続いて凍結乾燥して、２つの半片をソ
ケットによって一緒にした。

【００５１】ＨＢｓＡｇに対する試験デバイスを組立て
るには、引続いて、内径　０．５ｃｍ、長さ約１１ｃｍ
の管状の透明容器のほぼ中心に前記繊維を入れた。管状
容器の、中空繊維の端部Ａに対応する１端は、１ｃｍの
長さにわたって円錐形であり、穴を有しており、それを
通って中空繊維の端が終りになるようにした。プラスチ
ック容器中の繊維の周辺の空間には粉末セルロースが充
填され、これは以下に示す順序で含水液体を通さない薄
い重合体層により隔離されている。

【００５２】毛管内の材料の順序 下端Ａ起点として １ｃｍ　　凍結乾燥ラテックス（３） ４ｃｍ　　空白 容器内に毛管周辺の材料の順序 下端Ａ起点として ２．０ｃｍ　　　　　　重合体（９） ６×０．４５ｃｍ　　粉末セルロース（５）６×０．０
５ｃｍ　　重合体（６） ２．０ｃｍ　　　　　　重合体（９） ６×０．４５ｃｍ　　粉末セルロース（５）６×０．０
５ｃｍ　　重合体（６） 容器内の端部Ｂ付近の毛管の頂部 １ｃｍ　　基質ステーション（７） 基質ステーションは、セラミック片に適宜の緩衝系中の
過酸素水素とＴＭＢの混合物を含浸し、続いて１８〜２
５℃で真空下にセラミック片を乾燥することにより形成
される。

【００５３】端部Ａと反対側の端部Ｂでは、繊維の開放
端をこの基質ステーションを用いて覆う。セラミックス
はラテックス球を通過させ得る。

【００５４】デバイスの端部Ａと端部Ｂとを、プラスチ
ックキャップ１０を用いて閉じる。

【００５５】試験は、１０分間の合計試験時間を要し、
前記のようにして構築されたデバイスを使用して行った
。 キャップ１０をデバイスからはずした。

【００５６】ほぼ垂直の位置で、デバイスの端部Ａを血
清試料中に３０秒間浸漬し、試料を約２ｃｍの長さに至
るまで導管に浸透させた。

【００５７】続いてデバイスの端部Ａを１５°の角度（
水平線からの偏り）で脱塩水に入れ、そのまま１０分間
置いた。続いて基質ステーションに発生した色を肉眼で
観察した。血清中のＨＢｓＡｇの希釈系列について前記
デバイスを用いて試験した。

【００５８】 　　これにより、本発明方法がＨＢｓＡｇの迅速で簡単
なマニュアルアッセイ（ｒａｐｉｄ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍ
ａｎｕａｌ　ａｓｓａｙ）　として妥当であることが明
らかである。

【００５９】実施例２ 実施例１に記載した方法と同様にして、抗−ｈＣＧ（ヒ
ト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対する抗体）を８
００ｎｍ　のラテックス粒子にカップリングして、ＨＲ
Ｐを抗−βｈＣＧ（ｈＣＧのβサブユニット上に位置す
るエピトープと反応する抗体）に接合させた。デバイス
を実施例１に記載したように構築した。ただし、ＨＢｓ
Ａｇ特異的試薬の代りに前記ｈＣＧ特異的試薬を用いた
。

【００６０】妊性空胎婦人の尿標本の混合物から成る希
釈剤を使用して、ｈＣＧの系統的希釈系列を作った。こ
の希釈系列について、前記のデバイスを使用し実施例１
に記載した試験操作と同様にして試験した。

【００６１】 　　このことは、デバイスを使用して尿試料中のｈＣＧ
の検出のための迅速で簡単なマニュアルアッセイを行う
ことができ、従って妊娠試験に非常に適していることを
示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のデバイスの断面図である。

【符号の説明】

１　　デバイス本体 ２　　半透性膜 ３　　可動性固相材料 ４　　標識反応物 ５　　吸収剤材料 ６　　重合体層 ７　　乾燥基質 ８　　ケーシング ９　　重合体 １０　　キャップ Ａ及びＢ　　容器端部

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　少くとも部分的に半透性層に隣接する
   液体輸送用トラックを含む試験液体中の分析物を検出及
   び／又は測定するためのアッセイの実施用デバイスであ
   って、前記トラックにはアッセイ中半透性層に沿って、
   分析物と直接又は間接に結合し得る及び／又は分析物に
   対する反応物と直接又は間接に結合し得るリガンドを保
   有する可動性固相材料が輸送され、前記半透性層は可動
   性固相材料を通過させることが不可能であることを特徴
   とする、前記デバイス。
2. 【請求項２】　　少くとも部分的に半透性層に隣接する
   トラックが多孔性中空繊維であることを特徴とする、請
   求項１に記載のデバイス。
3. 【請求項３】　　トラックが液体フラックスにより可動
   性固相材料を輸送することが可能なマトリックスである
   ことを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
4. 【請求項４】　　半透性層が吸収剤と接触していること
   を特徴とする、請求項１、２又は３に記載のデバイス。
5. 【請求項５】　　リガンド及び／又は分析物に対する反
   応物が免疫化学試薬であることを特徴とする、請求項１
   〜４のいずれか１項に記載のデバイス。
6. 【請求項６】　　可動性固相材料が重合体粒子であるこ
   とを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の
   デバイス。
7. 【請求項７】　　反応物が酵素にカップリングした抗体
   又は抗原を含有する酵素接合体であることを特徴とする
   、請求項６に記載のデバイス。
8. 【請求項８】　　反応物が免疫化学試薬を被覆した金属
   ゾル粒子であることを特徴とする、請求項６に記載のデ
   バイス。
9. 【請求項９】　　リガンドを有する可動性固相材料が試
   験液体と接触し、同時に又は引続いて標識を有する反応
   物と接触し、前記液体の１つ又は両方によりトラックを
   介してデバイス中の標識に対する検出系が置かれている
   位置に輸送されるように、請求項１に記載のデバイスを
   試験液体及び場合により輸送液体と接触させ、前記固相
   材料と直接又は間接に結合している標識を検出し、結合
   の程度を直接又は間接に測定し、その程度を測定又は検
   出される分析物の濃度の定性的又は定量的な指標とする
   ことを特徴とする、試験液体の分析物の検出及び／又は
   測定方法。
10. 【請求項１０】　　請求項１に記載のデバイスを含む試
    験用キット。