JPH04293487A - ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 - Google Patents

ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法

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JPH04293487A
JPH04293487A JP2406885A JP40688590A JPH04293487A JP H04293487 A JPH04293487 A JP H04293487A JP 2406885 A JP2406885 A JP 2406885A JP 40688590 A JP40688590 A JP 40688590A JP H04293487 A JPH04293487 A JP H04293487A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、３−ヒドロキシカルボ
ン酸のホモ−および／またはコポリマーを、天然または
キメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌を引き起こすことにより
、当該ポリマーを含むグラム陰性菌の細胞から遊離する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】３−ヒドロキシカルボン酸のホモ−およ
び／またはコポリマーとは、グラム陰性菌例えばアルカ
リゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　），アチオロジウ
ム（Ａｔｈｉｏｒｈｏｄｉｕｍ），シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　），リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ　），スピリリウム（Ｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）に
より生産され貯蔵され得るものを意味する。特に、これ
らは、３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）のおよび３−ヒド
ロキシ吉草酸（ＰＨＶ）のホモ−および／またはコポリ
マーである。 しかしながら、これらの細菌は、別のポリ（３−ヒドロ
キシカルボン酸）をも貯蔵し得る。ＰＨＢおよびＰＨＶ
の生産および貯蔵方法は、例えば、ヨーロッパ特許公開
第０，０１５，６６９号、ヨーロッパ特許公開第０，０
４６，３４４号およびヨーロッパ特許公開第０，０５２
，４５９号に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】Ｓｌａｔｅｒら，　Ｊ
．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７０，４４３１および次
頁　（１９８８）　から、細胞内でのＰＨＢの生産の原
因である酵素が、ＰＨＢを生産しない細菌細胞中に、例
えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）中に
クローニングされ得、そして適当なプラスミドを用いて
発現され得、この場合において、次にクローン化酵素が
細胞内でＰＨＢ合成を引き起こすことが知られている。
【０００４】微生物の細胞からポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）を遊離することは、当該ポリマーが容易に溶
解する抽出剤を用いて乾燥細胞から当該ポリマーを抽出
することにより引き起こされ得る。このような方法は、
例えば、ヨーロッパ特許公開第１５，１２３号に記載さ
れている。これは必然的に、先ず細胞を破壊し従って適
切な抽出剤に浸透性にすることを伴う。これらの方法の
欠点は、抽出剤により細胞からポリマーを溶解すること
のみならずある細胞成分、特に脂質が溶解し、次いでこ
れらの不純物をポリマーから分離する必要があることで
ある。
【０００５】ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）を湿っ
た細胞から遊離する一つの可能性は、ヨーロッパ特許公
開第１４５，２２３号に記載されている。これは、細胞
材料を酵素的におよび／または界面活性物質を用いて溶
解させ、その際当該ポリマーは溶解しないままであるこ
とを伴う。細胞材料の溶解は、この場合、数段階で行わ
れ、そしてそれでも溶解は不完全でありかつ溶解しない
細胞成分がポリマー中に残る。
【０００６】グラム陰性菌を、クローン化溶菌遺伝子の
発現により破壊することも同様に知られている。例えば
、ドイツ特許公開第３，７１５，８４０号は、大腸菌（
Ｅ．　ｃｏｌｉ　）細胞を、温度誘発プロモータにより
制御されるキメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌することを記
載しており、この場合、細胞は約３０〜７０分以内に溶
菌される。
【０００７】Ｗｉｔｔｅ，　Ｌｕｂｉｔｚ，　Ｅｕｒ．
　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１８０，　３９３及び次頁
　（１９８９）　は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　）を、バ
クテリオファージ溶菌遺伝子Ｅを用いて溶菌することを
研究しそして、溶菌の際に直径約３０〜１００ｎｍの小
さいトランスメンブラン溶菌トンネルの形成があり、当
該トンネルを通って細胞内容物が周囲の媒質中に拡散し
得ることを見出した。細胞は約３０〜６０分以内に溶菌
される。このトンネルは非常に小さいので、その大きさ
が細胞のほぼ全容積を満たすポリマーを遊離するために
当該方法を用いることは大規模では時間を消費しすぎる
。
【０００８】本発明者は、今や、驚くべきことに小さい
トンネルではなくて、その直径が細胞のほぼ全横断面か
らなる開口部の形成があり、細胞エンベロープはその原
形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細胞内に残
り、水性媒質中でポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆
粒の完全な分離が可能である、ポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）顆粒を、当該顆粒を含むグラム陰性菌の細胞
から、クローン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の
発現により遊離する方法を見出すことができた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、従って、溶菌
遺伝子発現の誘導前に、二重荷重カチオンのイオン強度
を０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌの間に上昇させ、溶菌遺
伝子の発現を、温度の上昇により引き起こし、細胞を回
収し、そして未だ湿った細胞を水または緩衝液中に再懸
濁し、その結果ポリマー顆粒が自然溶菌により遊離され
ることを特徴とする、クローン化された天然またはキメ
ラ溶菌遺伝子の発現によりポリ（３−ヒドロキシカルボ
ン酸）顆粒を含むグラム陰性菌の細胞からポリ（３−ヒ
ドロキシカルボン酸）顆粒を遊離する方法に関する。
【００１０】当該方法を実施するため、ポリ（３−ヒド
ロキシカルボン酸）を生産するグラム陰性菌に、適当な
クローン化溶菌遺伝子の発現による溶菌のために、生体
プログラムを組み込む。溶菌遺伝子は、天然溶菌遺伝子
、例えばバクテリオファージＰｈｉＸ１７４の溶菌遺伝
子Ｅまたはキメラ溶菌遺伝子であり得る。例えばプラス
ミドｐＳＨ２（第１図）またはｐＡＷ１３上のバクテリ
オファージＰｈｉＸ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅが
好ましくは使用される。プラスミドｐＡＷ１３の製造の
ため、λｐＬプロモーターの制御下に遺伝子Ｅを含む、
プラスミドｐＳＢ１２からのＰｓＨ／ＢａｍＨＩフラグ
メント（Ｂｌａｓｉら，　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．　１３１，　（１９８５），　１１０７及び
次頁）　をｐＡＣＹＣ１７７のＰｓＨ／ＢａｍＨＩ開裂
部位に挿入する。得られるプラスミドを次いでＰｓｔＩ
で切断し、その後ｂｌａ遺伝子の破壊のためにＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理する。この方法において得られる
プラスミドｐＡＷ１３は、λｐＬプロモーターの制御下
に溶菌遺伝子Ｅを運ぶ。ポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）を生産するそして溶菌のために生体プログラムを組
み込まれ得るグラム陰性菌の例は、アルカリゲネス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　），アルチオロジウム（Ａｌｔ
ｈｉｏｒｈｏｄｉｕｍ　），　　シュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　），　　リゾビウム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ　），　　スピリリウム（Ｓｐｉｒｉｌｌｉｕ
ｍ）　および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）であり、その中にＰＨＢ／ＰＨＶ−生産酵素をクロ
ーニングする。
【００１１】細菌細胞を、慣用の方法で、発酵する、即
ちポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の生産に適した基
質上に、例えばエネルギー源として炭水化物を用いて、
使用する細菌により約２８〜３７℃の温度で培養する。 この点について、温度うぃ溶菌遺伝子の温度感性プロモ
ーターが発酵の間に溶菌を引き起こさないように十分に
低く保つことに注意すべきである。
【００１２】次いで、二重荷重カチオン濃度を、例えば
ＭｇＳＯ４　、ＣａＣＯ３　等を添加することによって
、約０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１
〜０．３ｍｏｌ／ｌに増加する。溶菌は、温度を約４２
℃に上昇させることによって引き起こされ、その始まり
は二重荷重カチオンの高イオン強度によってなお妨げら
れる。細胞は穏やかな遠心分離により回収され、そして
湿った細胞材料は次いで水または水性の緩衝液中に再懸
濁され、その際細胞は自然に破壊しそして細胞質内容物
およびその中に含まれるポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）顆粒は数分以内に遊離される。水は、蒸留水、脱イ
オン水または水道水であり得る。使用され得る水性の緩
衝液は０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌ
、０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＫＨ２　／Ｋ２　Ｈ
ＰＯ４　緩衝液等である。
【００１３】遊離されたポリマー顆粒、細胞質内容物お
よび空の細胞エンベロープは、適当な分離方法によって
、例えば密度勾配遠心分離によって分離され得る。
【００１４】
【実施例】例１ クローニングベクターｐＳＨ２の構築（第１図）プラス
ミドｐＳＨ１（Ｓ．　Ｈａｉｓｔ，　ＰｈｉＸ１７４　
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｉｏｎｓ，　ｄｉｐｌｏｍａ　ｔｈｅｓｉｓ，　Ｍｕｎ
ｉｃｈ　１９８９）　を酵素ＦｓｐＩで適当な制限緩衝
液中で切断すると、平滑断面を持つ５６９７ｂｐおよび
１９６９ｂｐフラグメントを生じる。２つのフラグメン
トをゲル電気泳動によって分離しそして「Ｇｅｎｅ　Ｃ
ｌｅａｎ」（Ｂｉｏ　１０１Ｉｎｃ．　により供給され
る）を用いて精製する。
【００１５】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｐＳ
Ｋ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにより供給される）を
、平滑断面を形成する制限酵素ＳｓｐＩおよび５’−突
出断面を形成するＡｆｌＩＩＩを用いて適当な制限緩衝
液中で切断すると、１６９７ｂｐ、７１２ｂｐおよび５
５５ｂｐの３つのフラグメントを生じる。７１２ｂｐフ
ラグメントを「Ｇｅｎｅ　Ｃｌｅａｎ」を用いて溶離し
、そして５’−突出断面をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで
満たす。ｐＳＨ１からの５６９７ｂｐフラグメントをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて適当な緩衝液中でこの７１２
ｂｐフラグメントと結合する。
【００１６】例２：大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）ＰＣ１
３６３（Ｐｈａｂａｇｅｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，　
Ｕｔｒｅｃｈｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のトランスフ
ォーメーション 大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）ＰＣ１３６３のトランスフ
ォーメーションを既知の方法で、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓら　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，　ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９８２）に記載された方法
により行う。
【００１７】この目的のため、蒸留水（ｐＨ７）１００
０ｍｌ中ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５
ｇからなる栄養培地であるＬｕｒｅａ　Ｂｒｏｔｈ　５
ｍｌに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　）ＰＣ　１３６３　のプ
レ培養菌１ｍｌを接種しそして３７℃で振とうする。細
胞を遠心分離により回収しそして氷中で１５０ｍｍｏｌ
／ｌＫＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ２　および１ｍ
ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌからなるトランスフォーメー
ション緩衝液２５ｍｌ中で懸濁する。再開した遠心分離
後、細胞を２ｍｌのトランスフォーメーション緩衝液中
で再懸濁する。このサスペンション０．１ｍｌをプラス
ミドＤＮＡ（ｐＳＨ２（ｐ１５Ａ）およびｐＳＢ２０−
ＰＨＢ（ｐＨＢ１）（Ｓｌａｔｅｒら　Ｊ．　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．　１７０，　第４４３１頁及び次頁　（１
９８８））と混合しそして、約１時間後、１．２ｍｌの
Ｌｕｒｅａ　ｂｒｏｔｈ　を２８℃で添加する。トラン
スフォーマントは、プラスミドの抗生物質抵抗性標識に
従って選択される。
【００１８】例３：大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）ＰＣ１
３６３の発酵および溶菌（ｐＳＢ２０、ｐＳＨ２）Ｌｕ
ｒｅａ　Ｂｒｏｔｈ　１０ｍｌに例２と同様にして調製
されたＥ．　ｃｏｌｉ　のオーバーナイト培養菌（ｏｖ
ｅｒｎｉｇｈｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ）　を接種しそして光
学密度ＯＤ６００　が０．２〜０．９になるまで２８℃
で培養する。次いで２ｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４　溶液を
、最終濃度が０．２ｍｏｌ／ｌになるまで添加しそして
当該混合物を２８℃で３０分間インキュベートする。次
いで温度を４２℃に上昇させそして３０分後、細胞を遠
心分離により（７０００ｒｐｍ、５分）４℃で回収し、
そして細胞材料を１０ｍｌの蒸留水中で再懸濁する。溶
菌は懸濁の間に１０分以内に起こる。
【００１９】蔗糖を溶菌した細胞混合物に５５％の最終
濃度まで添加し、次いでそれを３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ
中５０、４５および４０％濃度の蔗糖溶液の層で覆う。 １６時間の遠心分離（４℃、３７，０００　ｒｐｍ、Ｓ
Ｗ４１Ｔｉ）　後、勾配を分別し、そしてタンパク質含
有量、密度およびＰＨＢ／ＰＨＶ含有量を測定する。１
．２４ｇ／ｍｌ（未溶菌細胞）、１．２２ｇ／ｍｌ（細
胞ゴースト）および１．２０ｇ／ｍｌ（ＰＨＢ／ＰＨＶ
）の密度を有する３つのフラクションが得られる。これ
により６０〜８０％のＰＨＢ／ＰＨＶ顆粒が遊離される
。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、その直径が細胞のほぼ
全横断面からなる開口部が形成され、細胞エンベロープ
はその原形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細
胞内に残るため、グラム陰性菌の細胞から水性媒質中で
ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を完全に分離す
ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、プラスミドｐＳＨ２の構築を遺伝子
地図を用いて示す図である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　　　溶菌遺伝子発現の誘導前に、二重
    荷重カチオンのイオン強度を０．０５〜０．５ｍｏｌ／
    ｌの間に上昇させ、溶菌遺伝子の発現を、温度の上昇に
    より引き起こし、細胞を回収し、そして未だ湿った細胞
    を水または緩衝液中に再懸濁し、その結果ポリマー顆粒
    が自然溶菌により遊離されることを特徴とする、クロー
    ン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の発現によりポ
    リ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を含むグラム陰性
    菌の細胞からポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を
    遊離する方法。
  2. 【請求項２】　　使用する溶菌遺伝子がバクテリオファ
    ージＰｈｉＸ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅである、
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】　　二重荷重カチオンの濃度が０．１〜０
    ．３ｍｏｌ／ｌの間に上昇される、請求項１記載の方法
    。
  4. 【請求項４】　　二重荷重カチオンの濃度が、ＭｇＳＯ
    ４　またはＣａＣＯ３　の添加によって上昇される、請
    求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】　　アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
    ｅｓ　）　がグラム陰性菌として使用される、請求項１
    記載の方法。
  6. 【請求項６】　　クローン化大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　
    ）がグラム陰性菌として使用される、請求項１記載の方
    法。
JP2406885A 1989-12-27 1990-12-26 ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 Expired - Lifetime JP2641326B2 (ja)

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Hopkins for the degree of Doctor of Philosophy of the University of Edinburgh in the Faculty of Science".

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