JPH04295407A - イネ科作物の病害防除微生物および病害防除方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、イネ科作物の病害、特
にイネ幼苗腐敗症及びイネもみ枯細菌病の防除に有効な
新規微生物及びこの微生物を用いてイネ科作物の病害を
防除する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イネもみ枯細菌病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　　ｇｌｕｍａｅ）によって引き起こされる病気
であるイネもみ枯細菌病は、日本、韓国、中国などの他
、東南アジアのイネ栽培地域に広く分布し、イネの収量
に重大な被害を与えている。当初、本病原細菌は、イネ
の穂のみに病気を起こす細菌であると考えられていたが
、その後の研究により本細菌はイネの幼苗に対しても病
原性を示すことが明らかにされた。幼苗に対する被害は
、水稲栽培の特殊性に基づく育苗箱の普及に伴ってわが
国の重大な問題となっている。従って、イネもみ枯細菌
病菌についてこれまで発生生態の解明、栽培法と発病と
の関係及び防除法の開発など広範囲な研究が実施されて
いる。しかしながら、今なお伝染経路や侵入感染機構に
不明な部分もあって、まだ的確な防除法は確立されてい
ない。現在、防除対策としては塩水選による罹病もみの
除去、各種薬剤による種子消毒、及びカスガマイシン・
キャプタン水和剤、ポリカーバメイト水和剤などの育苗
箱施用等が挙げられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしこれらの薬剤は
、効果の不安定なこと、病菌菌株によって効果の異なる
こと、及び生育抑制の薬害が現れるなどのことから、実
用化にあたっては、さらに検討しなければならないのが
現状である。また抵抗性品種の利用も考えられているが
、本細菌病に対する抵抗性遺伝子がイネに存在するか否
かも明確ではない。このように現在までに行われている
防除法は、充分な効果を挙げていないのが現状であり、
新しい防除法の開発が望まれている。

【０００４】近年、土壌伝染性の植物病害を防除する手
段の一つとして、より自然に立脚した生物的防除方法の
開発が重要視されている。中でも各種抗菌物質産生性の
根圏微生物の利用に関する研究は世界各国で進められて
おり、幾つかの成功例が報告されている。また病原性細
菌から病原性を喪失あるいは除去した非病原性変異菌株
を利用した研究も多い。これら非病原性菌株の中には病
原性菌株と同様に宿主内で増殖し、生態学的に病原性菌
株とほぼ同様な挙動を示すものも存在する。このような
非病原性菌株で予め宿主植物体を前処理することにより
、その後接種した病原性細菌の侵入を防ぎ、或いは増殖
を抑制することにより、発病を抑制する可能性が考えら
れる。本発明者らは、このような考えに基づいて、非病
原性イネもみ枯細菌病菌を利用することによってイネも
み枯細菌病を生物的に防除する方法について検討を重ね
、本発明をなすに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、イ
ネ科作物の病害防除に有効で病原性のない新規シュード
モナス　　グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｇｌｕ
ｍａｅ）に関する。また、さらに本発明は、この新規シ
ュードモナスグルメをイネ種子に接種するかあるいは土
壌に散布することによってイネ科作物の病害を防除する
方法に関する。本発明におけるイネ科作物の病害とは、
イネ幼苗腐敗症及び／またはイネもみ枯細菌病をいう。 本発明における新規シュードモナス　　グルメは、微工
研に、微工研菌寄第１２１０５号として寄託されている
。また、本発明では、この菌株を放射線、化学薬品等で
変異させた菌株も、イネ科作物の病害が防除でき、病原
性のない限り、本発明の菌株のなかに包含される。

【０００６】この新規シュードモナス　　グルメをイネ
種子に接種する場合は、菌株濃度が１０８　〜１０１２
ｃｆｕ／ｍｌの懸濁液に、イネ種子を浸漬することによ
り行うことが好ましい。また、新規シュードモナス　　
グルメを土壌に散布して防除する場合は、１０７　〜１
０１０ｃｆｕ／ｇ−土壌の菌体濃度になるように散布す
ることが好ましい。

【０００７】本発明者らは、福岡地方の田で生育させた
イネからイネもみ枯細菌病に侵されたもみを選別し、こ
れを７０％のエタノール水溶液に数秒浸漬した後、有効
塩素濃度３％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に５分間浸
し、滅菌蒸留水で水洗した後、すりつぶし、これをＰＳ
Ａ平板培地に展開して、これからイネもみ枯細菌を４７
菌株分離した。

【０００８】これらのイネもみ枯細菌は、次の菌学的性
質を有する。桿菌状で、極毛を有する。好気性で、生育
適温は３０〜３５℃、４０℃でも生育可能。コロニーは
灰白色を呈する。キング培地で生育可能。ゼラチン液化
、硝酸塩還元、リトマスミルク還元、アンモニア産生、
硫化水素産生、カタラーゼ、レシチナーゼは、いずれも
プラス。インドール産生、ＭＲ反応、オキシターゼは、
いずれもマイナス。

【０００９】次に、このなかからイネばかりでなく他の
植物体にも病原性を持たない点でのみ菌学的性質が相違
し、その他の点ではイネもみ枯細菌病と同様の性質を示
す非病原性イネもみ枯細菌の選択を行なった。

【００１０】この選択についてさらに詳細に説明する。 １．非病原性イネもみ枯細菌病菌の選択イネもみ枯細菌
病菌はイネの幼苗及び穂を侵す病原細菌であるため、た
とえ発病抑制効果が認められても、これをそのまま生物
的防除に利用することは危険である。しかし、この菌は
ｉｎ　　ｖｉｔｒｏにおいて病原性を喪失し易い性質を
もっており、保存中あるいは継代培養中に病原性を喪失
することもある。一方、本発明者らは、この菌がイネに
対する病原性の他、ジャガイモ、ニンジン等の組織切片
を腐敗させる性質を有する事を見出した。 そこで全ての作物に対して非病原性の菌株を選抜する目
的で本菌の各種作物に対する病原性を検討した。

【００１１】植物材料としては、ジャガイモ（メークイ
ン）、ニンジン（品種不明）及びトマト苗（東光）、イ
ネ種子（あそみのり）を実験に供試した。各種野菜組織
に対する腐敗能の検定は次の方法で行った。各種野菜組
織を３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）に１
５分間浸漬することによって表面殺菌を行い、その後滅
菌水で充分に水洗して滅菌メスで厚さ約５ｍｌに切断し
、これをろ紙を敷いた直径９ｃｍの滅菌シャーレに置き
、滅菌水を５ｍｌ入れ、ＰＳＡ斜面培地に３０℃で４８
時間培養したイネもみ枯細菌病菌を切断面の中央部に１
白金耳量接種した後、３０℃に４８時間静置し、腐敗能
の有無を検討した。トマト苗に対する病原性の検討は、
ＰＳＡ斜面培地に３０℃で４８時間培養したイネもみ枯
細菌病菌の各菌株を滅菌した白金耳で斜面からかきとり
、これを予め７０％エタノールで表面殺菌したトマト苗
（播種後３週間）の茎に多針接種することにより行った
。イネに対する病原性の検討は次のように行った。 すなわち、供試品種あそみのりの種子を３％次亜塩素酸
ナトリウム（アンチホルミン）で３０分間消毒後、充分
水洗し、２５℃で２日間浸種した。この種子６０粒を直
径９ｃｍの滅菌シャーレにとり、これに濃度約１０９　
ｃｆｕ／ｍｌの細菌懸濁液１５ｍｌを注入し、３０℃で
２４時間浸漬接種した。その後、オートクレーブで滅菌
したくみあい培土（三井東圧製）８０ｇを入れ、滅菌蒸
留水３０ｍｌを灌水した、６０×６０×４５ｍｍのプラ
スチック製容器に播種し、種子がかくれる程度に同くみ
あい培土で覆土し、３２℃の接種箱中（湿度１００％）
で２日間育苗した。さらに、２５℃の空調温室で緑化し
た後接種１５日目に発病の有無と程度を調査した。

【００１２】

【表１】

【００１３】結果は表１に示した通りである。イネに対
して病原性を示さない菌株が１５菌株存在した。トマト
に対する病原性は供試した全ての菌株で認められなかっ
た。各種野菜組織に対して腐敗能を示さずかつトマト、
イネに対しても病原性を示さない菌株８菌株、即ち、Ｎ
７５０４，Ｎ７５０３，ＹＮ７８１０，ＹＮ７８０５，
ＹＮ７８２５，７５０，７５２，８０５が選抜できた。 また、ジャガイモに対する腐敗能とイネに対する病原性
との間には供試した４７菌株において高い関連性が認め
られた。これらの１５菌種は継代培養あるいは保存中に
イネに対する病原性が喪失したものと考えられる。そし
てこれらの非病原菌は、ジャガイモ等その他の植物に対
しても病原性を示すことはない。

【００１４】次に、これら非病原性細菌がイネもみ枯細
菌病菌で起こるイネ幼苗腐敗症の発病を抑制することが
できるか否かについて検討した。 ２．非病原性イネもみ枯細菌病菌によるイネ幼苗腐敗症
の発病抑制効果 病原性菌株４菌株（Ｋｕ８１１１、２、Ｓｏ−１、Ｋｙ
ｕ８２−３４−２）及び非病原性菌株５菌株（Ｎ７５０
３、Ｎ７５０、ＹＮ７８１０、ＹＮ７８２５、８０５）
を実験に供試した。イネ品種はあそみのりを用いた。非
病原性イネもみ枯細菌病菌によるイネ幼苗腐敗症の発病
抑制効果の検定を次の方法で行った。すなわち、水保存
菌をＹＰＤＡ斜面培地に移植し、３０℃で４８時間培養
後、滅菌蒸留水１０ｍｌに懸濁（濃度：約１０９　ｃｆ
ｕ／ｍｌ）、これをＹＰＤ液体培地２００ｍｌに加え、
３０℃で４８時間振とう培養した。その後、３，６００
×ｇで２０分間遠心を行い、得られた菌体を滅菌蒸留水
に約１０１０ｃｆｕ／ｍｌになるように懸濁し、これに
メチルセルロースを１．５％になるように加えた。イネ
種子は３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）で
３０分表面殺菌した後、滅菌水で充分に洗浄し、メチル
セルロースを含む細菌懸濁液に３０℃で２４時間浸漬処
理した。対照として細菌を含まない１．５％メチルセル
ロース液に浸漬した種子を用いた。病原性菌株は、非病
原性菌株と同様に培養後、約１０８　ｃｆｕ／ｍｌの濃
度になるように滅菌水で調節し、これを接種源とした。 非病原性菌株及び病原性菌株の菌濃度は実験の度にＹＰ
ＤＡ平板培地を用い、希釈平板法に従って求めた。非病
原性菌株液に浸漬したイネ種子は、滅菌したくみあい培
土（三井東圧製）約８０ｇの入った６０×６０×４５ｍ
ｍのプラスチック製容器に６０粒ずつ播種し、覆土（２
０ｇ）した後、接種源である病原性菌株の細菌懸濁液を
１０ｍｌずつ灌注接種した。処理した容器は、３２℃じ
４８時間接種箱（湿度：１００％）に入れて催芽させた
後、２５〜３０℃の空調温室なるいは２８℃の植物育成
チャンバー内に置き、緑化させた。灌水は１日１回行っ
た。発病度の判定は接種後１５日目に行った。全ての実
験は２回以上反復した。発病度の検定は、図１に示すよ
うに病徴の激しさの度合いによって、０〜５の６段階（
発病度０は健全苗、１は健全苗と背丈は変らないが葉身
にクロロシスが現れたもの、２は健全苗より背丈が低く
、葉鞘基部のネクロシスが見られるもの、３は葉身のク
ロロシス、葉鞘基部にネクロシスに加えて、全身が異常
形態を呈しているもの、４は本葉第１葉しか展開してお
らず全体的に退緑したもの、５は腐敗枯死したもの）に
分けて調査し、発病度は各区６０粒の平均値をもって示
した。

【００１５】実験の結果を表２に示す。この表から明ら
かなように、非病原性菌株でイネ種子を浸漬処理するこ
とによってイネ幼苗腐敗症の発病が抑制されることが明
らかとなった。しかし、その発病抑制効果の程度は非病
原性菌株−病原性菌株の組み合わせによって著しく異な
り、全く発病抑制効果の見られないものから高い発病抑
制効果を示すものまで存在した。すなわち、病原性菌株
Ｓｏ−１に対しては、非病原性菌株Ｎ７５０３、Ｎ７５
０、ＹＮ７８２５、８０５によって発病が抑制された。 他方、ＹＮ７８１０で処理しても抑制効果は得られなか
った。病原性菌株２に対しては、Ｎ７５０３、８０５で
発病抑制効果が認められたが、Ｎ７５０、ＹＮ７８１０
、ＹＮ７８２５では全く抑制されなかった。病原性菌株
Ｋｙｕ８２−３４−２に対しては、非病原性菌株Ｎ７５
０３で処理した場合だけに発病抑制効果が認められ、非
病原性菌株Ｎ７５０、ＹＮ７８１０、ＹＮ７８２５、８
０５で処理しても発病は抑制されなかった。さらに病原
性菌株Ｋｕ８１１１に対しては、Ｎ７５０３、ＹＮ７８
１０、８０５で発病抑制効果が認められ、Ｎ７５０では
弱く、ＹＮ７８２５では効果は得られなかった。この結
果、非病原性菌株Ｎ７５０３でイネ種子を処理すること
によってイネ幼苗腐敗症の発病を抑制できることが確認
された。

【００１６】

【表２】

【００１７】３．浸漬処理用の菌濃度と発病抑制効果と
の関係 そこで、この非病原性菌株Ｎ７５０３の菌濃度と発病抑
制効果との関係について検討した。非病原性菌株として
Ｎ７５０３を、また病原性菌株としてＳｏ−１を供試し
た。発病抑制効果の検定は前記した方法に従って行った
。すなわち、水保存してある各菌株をＹＰＤＡ平板培地
に広げて単一コロニー分離を行い、これを２００ｍｌの
ＹＰＤ液体培地の入った坂口フラスコに接種し、３０℃
で４８時間振とう培養を行い、遠心（８，０００×ｇ、
２０分間）によって得られた菌体を滅菌蒸留水に約１０
１０ｃｆｕ／ｍｌになるように懸濁し、これを１０倍段
階希釈することにより約１０１０、１０８　、１０６　
ｃｆｕ／ｍｌの細菌懸濁液を作成した。この各濃度の非
病原性菌株Ｎ７５０３の懸濁液にメチルセルロースを１
．５％になるように加え、これに３％次亜塩素酸ナトリ
ウム（アンチホルミン）で表面殺菌を行ったイネ種子を
浸漬し、３０℃で２４時間静置後、滅菌したくみあい培
土８０ｇの入った容器に６０粒ずつ播種し、２０ｇのく
みあい培土で覆土した後、各濃度の病原性菌株Ｓｏ−１
の細菌懸濁液を１０ｍｌずつ灌注接種を行い、３０℃で
４８時間接種箱に置き、２８℃で１日１２時間照明に調
節した植物育成チャンバー内に入れ、１５日目に発病度
の検定を行った。

【００１８】この結果を表３に示した。表３から明らか
なように、非病原性菌株の濃度が１０１０ｃｆｕ／ｍｌ
の細菌懸濁液でイネ種子を処理した場合、土壌中の病原
性菌株の菌濃度が１０１０ｃｆｕ／ｇと高濃度であって
も高い発病抑制効果が示された。しかし、非病原性菌株
の菌濃度が１０８　ｃｆｕ／ｍｌ以下になり、さらに、
病原性菌株の菌濃度が１０６　ｃｆｕ／ｇと低くなると
発病抑制効果は得られず、効果を得るためには高濃度（
１０１０ｃｆｕ／ｍｌ）の非病原性菌株の懸濁液で処理
する必要があることが明らかとなった。

【００１９】

【表３】

【００２０】さらに、本発明では、本発明のシュードモ
ナス　　グルメＮ７５０３がイネ科作物の病害防除に使
用できることを立証するため、次の試験を行った。

【試験１】　　非病原性Ｎ７５０３菌株の各種病原性菌
株に対する発病抑制効果 非病原性菌株Ｎ７５０３の持つ発病抑制効果が、さらに
多くの他の病原性菌株に対しても同様に高い発病抑制効
果を示すか否かについて検討を行った。

【００２１】すなわち、九州大学植物病理学教室保存の
イネもみ枯細菌病菌の菌株の内、強い病原性を示すＫｕ
８１０６、Ｋｕ８１２１、ＩＩＩ　、８００１、８０１
７、Ｉ、Ｋｕ８１０５の計５菌株を供試し、Ｎ７５０３
菌株の発病抑制効果を検討した。発病抑制試験は前記の
方法によって行った。この結果は表４に示したように非
病原性菌株Ｎ７５０３は供試した全ての病原性菌株に対
して強い発病抑制効果を持つ菌株である事が明らかとな
った。

【００２２】

【表４】

【００２３】

【試験例２】　　カスガマイシン・キャプタン水和剤と
の発病抑制効果の比較本発明のＮ７５０３菌株のイネ幼
苗腐敗症の防除効果と、従来イネ幼苗腐敗症の防除に有
効なイネ育苗箱施用剤として報告されているカスガマイ
シン・キャプタン水和剤の防除効果とを比較した。

【００２４】すなわち、病原性菌株Ｓｏ−１と非病原性
菌株Ｎ７５０３との組み合わせで、イネ品種としてはあ
そみのりを用いて実験を行った。発病抑制試験は前記方
法によった。カスガマイシン・キャプタン水和剤は、１
容器当たり２００倍希釈液（原体換算でカスガマイシン
１．２ｇ＋キャプタン１．２ｍｇ）１０ｍｌを、播種後
覆土前に滅菌土壌に灌注することにより処理した。

【００２５】この結果を表５に示す。Ｎ７５０３でイネ
種子を前処理することにより得られる発病抑制効果は、
カスガマイシン・キャプタン水和剤を土壌１当たり０．
４ｍｇで施用した場合に得られる発病抑制効果とほぼ同
程度のものであった。しかし、カスガマイシン・キャプ
タン水和剤で処理した区では、Ｎ７５０３の前処理また
は１．５％メチルセルロースのみで処理した区と比べて
、イネ幼苗の苗丈が低いなど、若干の成育抑制が見られ
る場合があった。非病原性菌株で前処理したものは、防
除薬剤とほぼ同程度の効果が得られ、その生育は無処理
区との間に殆ど差は認められなかった。

【００２６】

【表５】

【００２７】

【試験３】　　発病抑制効果の品種間差異本発明の非病
原注菌株が、イネ品質あそみのりがイネ幼苗腐敗症の発
病を顕著に抑制することが明らかとなったので、この効
果が他のイネの品種においても認められるかどうか検討
した。

【００２８】すなわち、イネ品種として、あそみのり、
太刀風、黄玉、中国４５号、クジュウ、愛知旭、農林２
９号、ＩＲ６４、イナバワセの計９品種を供試した。細
菌は非病原性菌株としてＮ７５０３、ＹＮ７８１０及び
８０５を、また病原性菌株としてＳｏ−１、Ｋｙｕ８２
−３４−２及び２を用いた。非病原性菌株による種子処
理、病原性菌株の接種及び効果の検定は前記した発病抑
制試験に示した方法で行った。

【００２９】この結果を表６及び表７に示す。実験結果
から非病原性菌株による発病抑制効果には品種間差異が
存在することが明らかとなった。非病原性菌株８０５と
病原性菌株Ｋｙｕ８２−３４−２の組み合わせにおいて
は、太刀風、黄玉、中国４５号及びクジュウで発病抑制
効果が認められたが、他の品種（あそみのり、愛知旭、
農林２９号、ＩＲ６４、イナバワセ）においては全く発
病は抑制されなかった。非病原性菌株８０５と病原性菌
株２の組み合わせでは、愛知旭、中国４５号で発病抑制
効果は認められず、農林２９号において若干の発病抑制
が認められ、他の６品種（あそみのり、太刀風、黄玉、
クジュウ、ＩＲ６４、イナバワセ）においては高い発病
抑制効果を示した。また、非病原性菌株ＹＮ７８１０と
病原性菌株Ｓｏ−１の組み合わせでは、太刀風、クジュ
ウ、イナバワセにおいては全く発病抑制効果は得られず
、他の品種（あそみのり、黄玉、中国４５号、愛知旭、
農林２９号、ＩＲ６４）では高い発病抑制効果が得られ
た。非病原性菌株Ｎ７５０３と病原性菌株Ｓｏ−１の組
み合わせでは、全ての品種において発病を抑制すること
が明らかとなった。以上のことから発病抑制効果発現に
は非病原性菌株、病原性菌株及びイネ品種の３者の間の
特異的な関係が関与することが判明した。

【００３０】

【表６】

【表７】

【００３１】

【試験４】　　イネ幼苗腐敗症発病抑制機作の検討１．
さらに、本発明では、非病原性イネもみ枯細菌病菌によ
るイネ幼苗腐敗症発病抑制機作を知るために、まず、非
病原性菌株の病原性菌株に対する抗菌活性を検討した。 すなわち、非病原性菌株Ｎ７５０３、Ｎ７５０、８０５
、ＹＮ７８１０、ＹＮ７８２５及び病原性菌株Ｋｕ８１
１１、２、Ｓｏ−１、Ｋｙｕ８２−３４−２を供試した
。抗菌物質の産生性及び活性の検定にはＹＰＤＡ平板培
地を用い、プレートクロロホルム法及びＵＶ照射の２通
りの方法で行った。ＵＶ照射は、培養後コロニーの形成
が認められたシャーレの上蓋を外し、１５Ｗの殺菌ラン
プ（東芝ＧＬ−１５）で高さ３０ｃｍから３時間行った
。その後、３０℃で２４時間静置し、指示菌である病原
性菌株を重層し、３０℃で培養後コロニーの周囲に形成
される阻止帯の有無により抗菌物質産生性を検討した。

【００３２】この結果、供試した非病原性菌株Ｎ７５０
３及びＮ７５０において抗菌活性が認められた。これら
の菌株が形成した阻止帯の巾は数ｍｍ程度の小さなもの
であった。しかし、非病原性菌株が病原性菌株に対して
培地上で示す抗菌活性と発病抑制効果との間には直接的
な関連性は認められなかった。

【００３３】２．次にイネもみ枯細菌病菌以外の既知植
物病原細菌及び腐生菌についてイネ幼苗腐敗症の発病抑
制効果を検討した。九州大学植物病理学教室において保
存してある植物病原細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　　Ｋｕ７４１１、Ｅｒｗｉ
ｎｉａ　　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　　ｓｕｂｓｐ．ｃａ
ｒｏｔｏｖｏｒａ　　Ｎ７１２９、Ｃｌａｖｉｂａｃｔ
ｅｒ　　ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ　　ｐｖ．ｍｉｃｈ
ｉｇａｎｅｎｓｅＮ６６０１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ　　ＡＴＣＣ　　６６３３、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　　ｓｙｒｉｎｇａｅ　　ｐｖ．ｓｙｒｉ
ｎｇａｅ　　Ｉ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ　　ｐ−１５を供試した。これら
の細菌はそれぞれＰＳＡ斜面培地上に３０℃で４８時間
培養後、２００ｍｌのＹＰＤ液体培地の入った坂口フラ
スコに移植し、３０℃で４８時間培養し、遠心（８，０
００×ｇ、２０分）によって菌体を集め、これを約１０
１０ｃｆｕ／ｍｌになるように滅菌水に懸濁し、前処理
に用い、前記した発病抑制試験を行った。

【００３４】この結果、イネ幼苗腐敗症の発病抑制効果
は、非病原性イネもみ枯細菌病菌のみによって示された
。供試したその他全ての細菌では発病抑制効果が全く認
められないことが明らかとなった。

【００３５】３．また、非病原性菌株の培養濾液でイネ
種子を処理した場合の発病抑制効果について検討した。 すなわち、非病原性菌株Ｎ７５０３をＹＰＤ液体培地（
２００ｍｌ）に接種し、３０℃で４日間振とう培養後、
遠心（８，０００×ｇ、２０分）し、上清を孔径０．２
μｍのメンブランフィルターを通し完全に除菌すること
により非病原性菌株培養濾液を得た。この培養濾液に表
面殺菌したイネ種子を２４時間浸漬し、これを病原性菌
株Ｓｏ−１が土壌１ｇ当たり２．６×１０７　ｃｆｕに
なるように接種した汚染土壌に播種し、１５日目に発病
度を調査した。

【００３６】その結果、培養濾液の原液を用いた場合も
、１／１００希釈した場合も殆ど差のない発病度を示し
、培養濾液による発病抑制効果は全く認められなかった
。

【００３７】４．さらに、非病原性イネもみ枯細菌病菌
によるイネ幼苗腐敗症の発病抑制効果が死菌によっても
認められるか否かについて検討した。供試菌株として非
病原性菌株Ｎ７５０３、及び病原性菌株Ｓｏ−１を用い
た。ＰＳＡ斜面培地上に３０℃で４８時間培養した非病
原性菌株Ｎ７５０３を約１０１０ｃｆｕ／ｍｌになるよ
うに滅菌蒸留水に懸濁した後、次に示す３通りの方法に
よって死菌の作成を行った。■１００℃で１０分間の熱
処理、■滅菌シャーレに細菌懸濁液を２〜３ｍｌずつ入
れ、１５Ｗの殺菌ランプ（東芝ＧＬ−１５）で３０ｃｍ
の高さから４時間照射、■細菌懸濁液約１０ｍｌを５０
ｍｌのビーカーに取り、これをクロロホルム約２００ｍ
ｌの入った２，０００ｍｌのビーカーに入れアルミニウ
ム箔で密封し、スターラーで撹拌しながら４時間の蒸気
処理を行った。発病抑制試験は前記した方法によって行
なった。

【００３８】これらは、いずれの場合においても発病抑
制効果が全く認められなかった。このことから非病原性
菌株による発病抑制効果は生菌によってのみ示される事
が明らかとなった。

【００３９】５．さらに、種子処理法及び接種法の違い
が発病抑制効果に及ぼす影響について検討した。すなわ
ち、高い発病抑制効果の認められる非病原性菌株Ｎ７５
０３と病原性菌株Ｓｏ−１の組み合わせを用いて行った
。非病原性菌株と病原性菌株の混合液（濃度Ｎ７５０３
：６．３×１０９　ｃｆｕ／ｍｌ、Ｓｏ−１：２．３×
１０７　ｃｆｕ／ｍｌ）及び非病原性菌株、病原性菌株
の単独液にメチルセルロースを１．５％になるように加
え、これらの液に表面殺菌したイネ種子を浸漬し、３０
℃で２４時間保った。処理した種子を、１００℃のくみ
あい培土の入った容器に６０粒ずつ播種し、３２℃で湿
度１００％の接種箱に４８時間保った後、２８℃、１日
１２時間照射の植物育成チャンバー内に置き、播種後１
５日目に発病度の検定を行った。また、濃度６．３×１
０９　ｃｆｕ／ｍｌの非病原性菌株懸濁液及び濃度２．
７×１０７　ｃｆｕ／ｍｌの病原性菌株懸濁液を１容器
（１００ｇのくみあい培土）当り１０ｍｌずつ混合し、
この土壌に表面殺菌した種子を播種した後、上記と同様
に播種１５日目に発病度の調査を行った。さらに、病原
性菌株接種後に非病原性菌株で処理した場合の発病抑制
効果の検定を以下の方法で行った。表面殺菌を行ったイ
ネ種子を病原性菌株Ｓｏ−１の細菌懸濁液（濃度：２．
３×１０８　ｃｆｕ／ｍｌ）で種々の時間（１０分、２
４、４８、７２、９６、１０２時間）浸漬接種後、１０
０ｇのくみあい培土の入った容器に６０粒ずつ播種し、
非病原性菌株Ｎ７５０３の細菌懸濁液（濃度：約１０９
−１０ｃｆｕ／ｍｌ）を１０ｍｌずつ灌注し、３２℃で
湿度１００％に保った接種箱に４８時間入れ、その後２
８℃で１日１２時間照明の植物育成チャンバー内に置き
、育苗した。発病後の検定は播種後１５日目に行った。

【００４０】実験の結果を表８及び表９に示す。表８に
示したように、病原性菌株を単独でイネ種子にコーティ
ングした区では全ての固体が完全に腐敗・枯死したのに
対し、非病原性菌株と病原性菌株の混合液でイネ種子を
コーティングした場合、発病度０．７を示し、高い発病
抑制効果が認められた。また、濃度２．３×１０６　ｃ
ｆｕ／ｇの病原性菌株で汚染した土壌に播種した場合に
は３．６の発病度を示したのに対して、この土壌に非病
原性菌株が６．３×１０８　ｃｆｕ／ｇの濃度で存在し
た場合には発病度が０．６と顕著な抑制効果を示した。 また、表９から明らかなように、先に病原性菌株Ｓｏ−
１をイネ種子に浸漬接種し、非病原性菌株Ｎ７５０３が
土壌１ｇ当たり約１０９ｃｆｕの菌量で存在している土
壌に播種した場合にも発病は顕著に抑制された。さらに
、イネ種子を病原性菌株の細菌懸濁液に１２０時間浸漬
接種した場合でも非病原性菌株を添加した土壌に播種す
れば発病が抑制されることが明らかとなった。この結果
から発病を防止するには、イネ種子を本発明の非病原性
菌株で被覆するかあるいはイネ種子を播種する土壌に本
発明の非病原性菌株を添加するとその効果を充分に達成
することができる。

【００４１】

【表８】

【表９】

【００４２】６．またさらに、非病原性菌株によるイネ
幼苗腐敗症の発病抑制効果の機作を明らかにする目的で
、イネ発芽液中及び栄養分の極端に限られている滅菌水
中における非病原性菌株と病原性菌株との競合関係につ
いて検討を行った。非病原性菌株としてＮ７５０３、病
原性菌株としてストレプトマイシン耐性のＳｏ−１−Ｓ
Ｒを用いた。イネ発芽液は次のようにして調整した。 即ち、３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）で
９０分間表面殺菌した種子を滅菌水で充分に洗浄後、滅
菌水５０ｍｌの入った１００ｍｌの三角コルベンに１０
粒ずつ入れ、３０℃で１日１２時間照明の植物育成チャ
ンバー内に７日間置き、その後滅菌ピンセットでイネ植
物体を除去、メンブランフィルター（孔径０．２μｍ）
を通すことにより完全に除菌した液をイネ発芽液とした
。この発芽液を１００ｍｌの三角コルベンに２８ｍｌず
つ入れ、これに供試菌を所定の濃度（Ｎ７５０３：１×
１０ｃｆｕ／ｍｌ、Ｓｏ−１−ＳＲ：３×１０ｃｆｕ／
ｍｌ）になるように接種した後、３０℃で静置培養し、
経時的にＹＰＤＡ及びストレプトマイシン５００ｐｐｍ
含有ＹＰＤＡ培地を使用する希釈平板法により細菌の定
量を行った。イネ発芽液の代わりに滅菌蒸留水を用いた
ものを対照とした。

【００４３】病原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲをイネ発芽液中
に３×１０ｃｆｕ／ｍｌになるように単独接種して培養
した場合、その菌数は培養２日目に１×１０７　ｃｆｕ
／ｍｌに達し、その後若干の減少が見られたが、培養１
５日目まで約１０６　ｃｆｕ／ｍｌのほぼ一定の菌量で
生存した。非病原性菌株Ｎ７５０３と混合培養した場合
、病原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲの増殖は著しく抑制され、
培養２日目に単独培養の菌数に比べて約１／１００、培
養５日目には約１／１０となり、その後１５日目まで約
１／１０の濃度で推移した。非病原性菌株Ｎ７５０３の
増殖は病原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲとの混合培養によって
も減少せず、単独培養の場合とほぼ同様の増殖パターン
を示した。また、滅菌蒸留水中においてもイネ発芽液中
の増殖パターンと同様の傾向が認められた。すなわち、
混合培養において病原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲの増殖は抑
制され、培養２日目から１５日目まで単独培養の場合と
比べて約１／１０の菌量で推移した。

【００４４】７．またさらに非病原性菌株でイネ種子を
処理することにより病原性菌株によるイネ幼苗腐敗症の
感染及び発病が抑えられる。この場合、イネもみにおい
て病原性菌株及び非病原性菌株がどのように消長するか
について検討を行なった。菌株は発病抑制効果の認めら
れる組み合わせとして非病原性菌株Ｎ７５０３と病原性
菌株２−ＳＲ及び効果の認められない組み合わせとして
非病原性菌株ＹＮ７８１０と病原性菌株２−ＳＲを供試
した。イネ品種あそみのりの種子から外穎と内穎を取り
除き、３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）で
９０分間表面殺菌し、滅菌蒸留水で充分に洗浄した。こ
の種子を０．５％の素寒天２０ｍｌの入った１００ｍｌ
の三角コルベンに１０粒ずつ播種し、非病原性菌株（濃
度：約１０１０ｃｆｕ／ｍｌ）及び病原性菌株（濃度：
約１０８　ｃｆｕ／ｍｌ）の混合液を２ｍｌ及び各細菌
液を２倍に希釈した単独液を２ｍｌがつ接種した。その
後２５℃で３４，０００〜４０，０００ｌｕｘ照明の条
件下で育苗し、２日間隔で各菌の定量をＹＰＤＡ平板培
地及びストレプトマイシン１００ｐｐｍ含有ＹＰＤＡ平
板培地を用いて行った。

【００４５】この結果、病原性菌株２−ＳＲを単独で接
種した区においては、時間の経過とともに増殖し、接種
後１０日目には１種子当たり約１０７　ｃｆｕの菌量に
達した。しかし、発病抑制効果を示す非病原性菌株Ｎ７
５０３との混合培養においては、病原性菌株２−ＳＲは
接種後１０日目においても１種子当たり１×１０５　ｃ
ｆｕ／ｍｌの値にとどまり、接種時の菌量とほぼ同じ値
であった。また、発病抑制効果を示さない非病原性菌株
ＹＮ７８１０との混合培養では、病原性菌株２−ＳＲは
単独培養の場合と同様に増殖していき、接種後１０日目
には１種子当たり１×１０７　ｃｆｕの菌量に達した。 両非病原性菌株は単独、混合の両培養において１０日目
まで１種子当たり約１０７　ｃｆｕの菌量で一定してい
た。このように、発病抑制効果の認められる菌株の組み
合わせでは病原性菌株の増殖が非病原性菌株との混合培
養によって抑えられる傾向が認められた。

【００４６】８．さらに、イネもみ枯細菌病菌は培地中
で毒素を産生することが報告されている。しかし、培地
中では病原性の有無にかかわらず毒性物質を産生するこ
とが明らかとなった。一方、非病原性菌株は土壌中では
イネに対する生育抑制を示さないことから、このイネ及
び土壌が関与した条件下で病原性菌株が産生する毒素を
非病原性菌株が中和あるいは解毒することにより発病が
抑制される可能性も十分に考えられる。このことを明ら
かにする目的で以下の実験を行った。

【００４７】非病原性菌株による毒素の解毒は次の方法
により検討した。すなわち、くみあい培土５００ｇに対
して蒸留水１，０００ｍｌを加え、時々撹拌しながら２
４時間静置し、吸引濾過によりくみあい培土の水抽出液
を得た。これを１００ｍｌの三角コルベンに１８ｍｌず
つ分注し加圧滅菌した。これに３％次亜塩素ナトリウム
（アンチホルミン）で表面殺菌した無菌のイネ種子を２
０粒ずつ加え、病原性菌株２（菌濃度：約１０９　ｃｆ
ｕ／ｍｌ）の細菌懸濁液を２ｍｌずつ接種し、２５℃で
３４，０００〜４０，０００ｌｕｘ照明下で１０日間育
苗した。その後イネ種子を取り除き、１０，０００×ｇ
、２０分間の遠心を行い、得られた上清を０．２μｍの
メンブランフィルターで処理し、完全に除菌した病原性
菌株２の培養濾液を得た。この培養濾液を２ｍｌずつ滅
菌試験管に入れ、これにＹＰＤＡ斜面培地で３０℃、４
８時間培養した非病原性菌株Ｎ７５０３を約１０９　ｃ
ｆｕ／ｍｌになるように接種し、２５℃で培養した。培
養１０日目に、１０，０００×ｇ、２０分間の遠心によ
り培養濾液からの菌体を除き、０．２μｍのメンブラン
フィルターを通すことにより完全に除菌し、得られた濾
液を２ｍｌずつ滅菌試験管に分注、これに表面殺菌した
イネ種子を２粒ずつ入り、２５℃、３４，０００〜４０
，０００ｌｕｘの条件下で育苗し、１０日目に幼苗長及
び細長を測定し、解毒の有無を調べた。

【００４８】この結果、病原性菌株２の培養濾液では幼
苗長６．８ｍｍ、根長１．０ｍｍと強い生育阻害が認め
られたのに対して、これに非病原性菌株Ｎ７５０３を接
種し１０日間培養した濾液では幼苗長９１．６ｍｍ、根
長８３．０ｍｍと、対照区とほぼ同様の生育を示し、毒
素の活性が著しく低下している事が明かとなった。

【００４９】次に本発明の実施例を示す。

【実施例１】シュードモナス　　グルメＮ７５０３菌株
を約１０１０ｃｆｕ／ｍｌの菌体濃度になるように滅菌
蒸留水に懸濁し、これにメチルセルロースを１．５％に
なるように加えた。この懸濁液１００ｍｌに、イネ種子
あそみのり６０粒を３０℃で２４時間浸漬した。この種
子を１２０℃で３０分間滅菌したくみあい培土（三井東
圧社製）約８０ｇの入った容器に播種し、２０ｇ覆土し
た後、病原性菌株の懸濁液（約１０８　ｃｆｕ／ｍｌ）
を１０ｍｌ灌注した。１５日経過したが発病は観察され
なかった。一方、Ｎ７５０３菌株を接種しなかった種子
について、同様の試験を行った結果、これらは全て発病
した。

【００５０】

【実施例２】１２０℃で３０分間滅菌した土壌に、シュ
ードモナス　　グルメＮ７５０３菌株を６．３×１０８
　ｃｆｕ／ｇ−土壌及び病原性シュードモナス　　グル
メを２．３×１０６　ｃｆｕ／ｇ−土壌になるように散
布、混合した。この土壌にあそみのり種子を播種した。 種子は、その後、発芽し、生育したが発病は観察されな
かった。一方Ｎ７５０３を混合せず、病原性菌のみを混
入した区では、全て発病した。

【００５１】

【実施例３】イネ品種あそみのりを播種し、その２６日
目に、ワグネルポットに５株づつ移植して生育させ、移
植後８５日目の開花期に、シュードモナス　　グルメＮ
７５０３菌株の懸濁液（菌体濃度２．５×１０１０ｃｆ
ｕ／ｍｌ）及び病原性菌株の懸濁液（Ｓｏ−１菌体濃度
：２．５×１０８　ｃｆｕ／ｍｌ、Ｋｕ８１１１菌体濃
度：１．７×１０８　ｃｆｕ／ｍｌ）の混合液（１：１
）、または前記Ｎ７５０３菌株の懸濁液２倍希釈液或い
は前記病原性菌株の懸濁液２倍希釈液を、それぞれ１ポ
ット当たり５０ｍｌづつ噴霧接種した。接種後、３日間
ビニールで被覆し、２０日目に穂の発病の有無を調査し
、罹病株率及び１穂平均罹病度を算出した。この結果を
表１０に示した。

【００５２】

【表１０】 　　　　　　　　　　　　接種菌株　　　　　　　　　
　　　罹病株率（％）　　　　１穂平均罹病度　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｎ７５０３　の２倍希釈液　
　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０　　　　　　　　Ｎ７５０３：Ｓｏ−１混
合液　　　　　　　　　　４０．０　　　　　　　　　
　　　　　　　５　　　　　　　　Ｎ７５０３：Ｋｕ８
１１１混合液　　　　　　　　３５．０　　　　　　　
　　　　　　　１５　　　　　　　　Ｓｏ−１の２倍希
釈液　　　　　　　　　　９０．０　　　　　　　　　
　　　　　２０　　　　　　　　Ｋｕ８１１１の２倍希
釈液　　　　　　　　９０．０　　　　　　　　　　　
　　　３８　　　　　　　　ブランク　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードモナス　　グルメで惹起されるコメ種
子疾病の指標０〜５Ｎは壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）をＣ
は褪緑（ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ）を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　イネ科作物の病害防除に有効な病原性
   のない新規シュードモナス　　グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
   ｏｎａｓ　　ｇｌｕｍａｅ）Ｎ７５０３（微工研菌寄第
   １２１０５）。
2. 【請求項２】　　病原性のない新規シュードモナス　　
   グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｇｌｕｍａｅ）Ｎ
   ７５０３（微工研菌寄第１２１０５）をイネ種子に接種
   することを特徴とするイネ科作物の病害防除方法。
3. 【請求項３】　　病原性のない新規シュードモナス　　
   グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｇｌｕｍａｅ）Ｎ
   ７５０３（微工研菌寄第１２１０５）を土壌に散布する
   ことを特徴とするイネ科作物の病害防除方法。
4. 【請求項４】　　イネ科作物の病害防除がイネ幼苗腐敗
   症及びイネもみ枯細菌病の防除である請求項（２）〜（
   ３）のいずれかに記載の方法