JPH04297418A - 血小板凝集抑制剤および白血球活性化抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、各種成人病やアレルギ
ー性炎症疾患の治療および予防に有効な薬剤、特に血小
板凝集抑制剤および白血球活性化抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、食生活の変化により動物性脂肪、
塩分および砂糖の摂取量が著しく増え、それに伴う成人
病が増加している。特に、動脈硬化症、高脂血症、各種
血栓症、冠動脈性疾患、非インスリン依存型糖尿病およ
びその合併症、例えば血管炎、糖尿病性網膜症、糖尿病
性腎不全等に罹患する患者が増加している。これらの成
人病疾患では血液が凝固促進状態になっており、この状
態を改善する治療薬としてこれまでにいくつかの血小板
凝集抑制剤が開発されている。その代表的薬剤としては
、アスピリンやインドメサシンのような血小板シクロオ
キシゲナーゼ阻害剤〔Ｊ．Ｒ．　Ｖａｎｅ，　Ｎａｔｕ
ｒｅ，　２３１，　２３２　（１９７１）；　Ｈ．Ｈａ
ｍｂｅｒｇ　＆　Ｂ．Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｐｒｏｃ
．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７
２，２９４４（１９７５）］　、Ｕ−５１６０５　等の
血小板トロンボキサン合成酵素阻害剤〔Ｒ．Ｒ．Ｇｏｒ
ｍａｎ等，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃ
ｉ．　ＵＳＡ，　７４，４００７（１９７９）］　、お
よびジピリダモール等のサイクリックＡＭＰホスホジエ
ステラーゼ阻害剤〔Ｄ．Ｃ．Ｂ．Ｍｉｌｌｓ　＆　Ｊ．
Ｂ．Ｓｍｉｔｈ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，１２１，
１８５（１９７１）］　がある。これらはいずれも、強
力な血小板凝集因子であるトロンボキサンＡ２の産生を
抑制するための酵素阻害剤である。その他、甘草に含ま
れる新規物質（特開昭６４−５０８８５号公報）　およ
びイソリクイリチゲニン　（特開平１−１１７８２７号
公報）　からなる血小板凝集抑制剤も知られている。

【０００３】また、食生活および生活環境の変化、例え
ば高カロリー食、環境汚染、食品添加物の複合作用によ
って、それに伴うアレルギー性炎症疾患も著しく増加し
ている。アレルギー性炎症が関与する疾患としては、関
節リュウマチ、喘息、皮膚炎、胃腸障害、腎臓障害およ
び糖尿病時の合併症の血管内皮障害による血管炎等があ
る。これらのアレルギー性炎症疾患の状態を改善する治
療薬としては、これまでにステロイド剤、プロスタグラ
ンディン合成阻害剤、抗ヒスタミン剤、ヒスタミン遊離
抑制剤、ロイコトリエン産生阻害剤などが開発されてい
る。その代表的な薬剤として、プロスタグランディン合
成阻害剤　（インドメサシン、アスピリン）　が関節炎
の治療薬として用いられている〔Ｊ．Ｒ．Ｖａｎｅ，　
Ｎａｔｕｒｅ，　２３１，　２３２　（１９７１）；　
塩川優一，　治療学−特集　　炎症−，　８，　３８７
　（１９８２）　〕。抗ヒスタミン剤　（ジフェンヒド
ラミン、トリペレナミン、クロルフェニラミン、メクリ
ジン、プロメタジン）およびヒスタミン遊離抑制剤（イ
ンタール）、ならびにロイコトリエン産生阻害剤などは
、抗喘息薬、抗アレルギー剤として用いられている。

【０００４】また甘草に含まれるイソリクイリチゲニン
〔特公平１−５２３６３　号公報〕および甘草疎水性フ
ラボノイド製剤〔特開平２−２０４４１７号公報〕が抗
アレルギー剤として提案されている。また、同じく甘草
に含まれるアビオイソリクイリチン〔特開昭６０−１８
４０１７号公報〕またはアビオリクイリチン〔特開昭６
０−１８４０１６号公報〕からなる、補気薬としてのリ
ュウマチ、神経痛等の難治疾患の改善剤も知られている
。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】血小板凝集抑制剤に関
する上記従来の技術は、血小板内でのトロンボキサンＡ
２（血小板凝集因子）の生成に関与する酵素であるシク
ロオキシゲナーゼ、トロンボキサン合成酵素およびサイ
クリックＡＭＰホスホジエステラーゼに対する阻害剤で
ある血小板凝集抑制剤が開発の中心であった。また、上
記アレルギー性炎症疾患の治療薬として従来開発されて
きたのは、ステロイド剤、プロスタグランディン合成阻
害剤、抗ヒスタミン剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ロイコ
トリエン産生阻害剤を中心とした薬剤であった。また、
甘草に含まれる成分からなる上記薬剤、特に補気薬は、
その作用が不明瞭である。

【０００６】本発明は、脂肪、塩分および糖分の摂取過
多のような食生活の変化による成人病や、食生活および
生活環境の変化、例えば高カロリー食、環境汚染、食品
添加物の複合作用による、前述のようなアレルギーを伴
う免疫異常疾患の治療および予防に有用な薬剤、特に血
小板凝集抑制剤および白血球活性化抑制剤を提供するこ
とを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、甘草中に
含まれる多種類のフラボノイド成分のうち、リコカルコ
ンＡおよびリコカルコンＢが、トロンボキサンＡ２生成
酵素の阻害作用だけでなく、細胞内遊離Ｃａ濃度の上昇
を抑制する作用によっても高い血小板凝集抑制効果を有
することにより、血小板凝集抑制剤として有用であるこ
とを見出し、本発明を完成した。さらに、本発明者らは
、リコカルコンＡおよび／またはリコカルコンＢが優れ
た白血球活性化抑制作用を有することを見出し、上述し
たアレルギーを伴う免疫異常疾患や動脈硬化に白血球の
活性化が関与していることに着目した結果、これらの化
合物が、アレルギーを伴う免疫異常疾患や動脈硬化の予
防および治療に有用な白血球活性化抑制剤として機能す
ることを見出し、本発明を完成した。

【０００８】本発明の要旨は、リコカルコンＡおよび／
またはリコカルコンＢを有効成分とする血小板凝集抑制
剤、およびリコカルコンＡおよび／またはリコカルコン
Ｂを有効成分とする白血球活性化抑制剤にある。この白
血球活性化抑制剤は抗アレルギー性炎症剤として有用で
ある。

【０００９】ここで白血球活性化抑制剤とは、生体内で
産生されるアレルギーおよび炎症誘発物質による免疫異
常疾患、例えば、関節リュウマチ、喘息、皮膚炎、胃腸
障害、腎臓障害および糖尿病時の合併症の血管内皮障害
による血管炎、ならびに動脈硬化病巣において生じる白
血球活性化を抑制する作用を有する薬剤を意味する。ま
た、白血球活性化とは、アレルギーおよび炎症誘発物質
による多核白血球からのライソゾーム酵素遊離ロイコト
リエン類生成等により免疫異常疾患や動脈硬化等の症状
を誘発または悪化させることをいう。

【００１０】本発明で用いるリコカルコンＡおよびリコ
カルコンＢは甘草中に含有されるフラボノイドであり、
それぞれ甘草より抽出して得ることができる。例えば、
次のような抽出方法がある。まず、甘草を７０％アセト
ン水溶液で抽出し、これを減圧濃縮する。得られた濃縮
エキスを水に懸濁し、エーテル、酢酸エチルエステル、
ｎ−ブタノールで順次抽出し、エーテル、酢酸エチルエ
ステルおよびｎ−ブタノール可溶分画から粗フラボノイ
ド分画を得る。粗フラボノイド分画について、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーを用いてクロロホルム−メ
タノール混液　（９８：２　Ｖ／Ｖ）　で溶出するとリ
コカルコンＡおよびリコカルコンＢが得られる。リコカ
ルコンＡおよびリコカルコンＢはさらにシリカゲルカラ
ムクロマト法により別々の成分として得てもよいが、混
合物のままで使用してもよい。

【００１１】甘草中の他のフラボノイド成分については
、リコカルコンＡおよびリコカルコンＢを上記のように
して粗フラボノイド分画から溶出後、クロロホルム−メ
タノール混液　（４０：１　Ｖ／Ｖ）　で溶出するとイ
ソリクイリチゲニンおよびリクイリチゲニンを得ること
ができ、さらにクロロホルム−メタノール混液　（４：
１　Ｖ／Ｖ）で溶出するとイソリクイリチンおよびリク
イリチンを得ることができる。

【００１２】リコカルコンＡおよびリコカルコンＢの甘
草よりの抽出方法は上記方法に限定されるものではない
。また、本発明で使用する化合物は同定され構造が明ら
かになっているので、合成もしくは植物バイオ技術によ
って製造してもよい。各化合物の構造式は以下の通りで
ある。 リコカルコンＡ

【００１３】

【化１】

【００１４】リコカルコンＢ

【００１５】

【化２】

【００１６】

【作用】リコカルコンＡおよびリコカルコンＢは、強力
な血小板凝集因子であるトロンボキサンＡ２の代謝に関
与する血小板内の酵素を阻害することにより、トロンボ
キサンＡ２のアラキドン酸からの生成を抑制する。また
、炎症時に遊離、増加するトロンビンに対する抗血小板
凝集作用、および血小板遊離Ｃａ濃度の上昇阻止効果を
もつ。

【００１７】血小板凝集因子の生成を抑制し、トロンビ
ン刺激時の血小板凝集抑制と共に、細胞内の遊離Ｃａ濃
度の上昇を抑制するため、本発明化合物は非常に優れた
血小板遊離抑制作用を発揮し、血小板凝集抑制剤として
有効である。

【００１８】また、リコカルコンＡおよびリコカルコン
Ｂは、血小板内酵素である１２−リポキシゲナーゼに対
する抑制作用をもつ。この酵素により生成される１２−
　ヒドロパーオキシ−５，８，１０−１４−　エイコサ
テトラエン酸（１２−ＨＰＥＴＥ）および１２−　ヒド
ロキシ−５，８，１０，１４−　エイコサテトラエン酸
（１２−ＨＥＴＥ　）は白血球誘引、遊走作用［Ｒ．Ｍ
．Ｊ．Ｐａｌｍｅｒ　等，　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉ
ｎｅｓ，　２０，　４１１（１９８０）］　や、血管中
膜平滑筋細胞の遊走による血管壁の肥厚からの動脈硬化
の進展　（Ｊ．Ｎａｋａｎｏ等，　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌ
ｅｒｏｓｉｓ，　４３，１４３（１９８２）］　を起こ
すことが知られている。従って、本発明化合物は、酵素
生成物が示す白血球誘引、遊走や血管壁の肥厚を阻止す
ることができ、結果としてアレルギー性炎症の阻止や動
脈硬化の予防が期待される。

【００１９】さらに、リコカルコンＡおよびリコカルコ
ンＢは、アレルギーおよび炎症誘発生体物質である、血
小板活性化因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｃｔｉｖａｔｉ
ｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ，　ＰＡＦ）　、ロイコトリエンＢ
４　（白血球遊走作用、白血球凝集作用、肥満細胞から
のヒスタミン遊離作用などを有する）　および白血球活
性化合成ペプチド　（Ｎ−Ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔｈｙｏ
ｎｙｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，
　ｆＭＬＰ）による多核白血球からのライソゾーム酵素
の遊離抑制作用、ならびに白血球活性化カルシウムイオ
ノフォア（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ　Ａ２
３１８７，　Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ）　による多核白血
球からのライソゾーム酵素の遊離抑制作用を有する。ま
た、細胞外からのカルシウムイオンの流入抑制および細
胞内カルシウム貯蔵部位からの動員抑制作用による細胞
内遊離カルシウム濃度の上昇を抑制する効果をも有し、
優れた白血球活性化抑制作用をもつ。

【００２０】白血球活性化により白血球から放出される
ライソゾーム酵素は、生体の各組織の炎症および骨形成
蛋白の破壊を引き起こす因子である。従って、このライ
ソゾーム酵素によって関節リュウマチ、喘息、皮膚炎、
胃腸障害、腎臓障害および糖尿病合併症の血管内皮障害
による血管炎、動脈硬化などの症状が誘発もしくは悪化
する。従来の抗炎症剤および抗アレルギー剤は、白血球
の機能から追求しておらず、その作用機序は明らかでな
い。

【００２１】以上のように本発明化合物は、優れた血小
板凝集抑制作用を有するため血小板凝集抑制剤として血
栓性疾患、例えば動脈硬化症、糖尿病時の合併症　（血
管炎、腎不全、網膜症）　、高脂血症、各種血栓症、冠
動脈性疾患等の成人病の治療および予防に医薬品素材や
食品素材して使用できる。また、アレルギー時に産生、
増加することが知られている血小板活性化因子およびロ
イコトリエンＢ４に対して白血球活性化抑制作用を有す
るため、免疫異常およびアレルギー性炎症に伴う白血球
活性化を抑制する白血球活性化抑制剤として、免疫異常
疾患、例えば関節リュウマチ、喘息、皮膚炎、胃腸障害
、腎臓障害および糖尿病合併症時の血管内障害による血
管炎、動脈硬化の進展の予防および治療に医薬品として
使用が可能である。

【００２２】本発明のリコカルコンＡおよび／またはリ
コカルコンＢを医薬品として投与する場合は、疾病の種
類、症状の程度、患者の年齢、体重等により異なるが、
通常成人では１日に６０〜６００ｍｇ　程度を投与すれ
ばよい。 これは１日に１回ないしは数回に分けて投与することが
できる。投与方法としては、静脈内注射、皮下注射、筋
肉注射等による非経口投与または錠剤、カプセル剤、顆
粒剤、細粒剤、散剤等による経口投与、あるいは坐剤、
外用液剤、軟膏剤等による局所投与があり、特に限定さ
れない。

【００２３】本発明の化合物は、製剤化に慣用される添
加剤を使用し、投与方法に応じた種々の形態に製剤化し
て用いることができる。例えば、乳剤、水和剤、水溶液
、錠剤、カプセル剤、粉剤、粒剤、丸剤等の剤型が例示
できる。製剤化に用いる添加剤には、賦形剤、崩壊剤、
潤滑剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体等があ
る。これらはいずれも通常用いられている添加剤を使用
すればよい。以下に本発明の血小板凝集抑制剤および白
血球活性化抑制剤の作用を実験例により説明する。

【００２４】（実験例） １．甘草からのフラボノイド類の抽出、単離甘草１ｋｇ
を７０％アセトン水溶液（５リットル×３回）　で抽出
し、これを減圧濃縮した。得られた濃縮エキスを水１リ
ットルに懸濁し、エーテル、酢酸エチルエステル、ｎ−
ブタノールで順次抽出し、エーテル、酢酸エチルエステ
ルおよびｎ−ブタノール可溶分画から粗フラボノイド分
画を得た。この粗フラボノイド分画について、シリカゲ
ル　（メルク社製）　カラムクロマトグラフィーを用い
、クロロホルム−メタノール混液　（９８：２　Ｖ／Ｖ
）　で溶出するとリコカルコンＡおよびリコカルコンＢ
の混合物が得られ、さらにシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーを繰り返すことによってリコカルコンＡ１５ｇ
　およびリコカルコンＢ２．１５ｇ　が得られた。

【００２５】２．血小板凝集抑制作用 （１）　ヒト血小板の単離 ヒト血小板は１０日前からアスピリンおよびインドメサ
シン等の薬剤を服用していない正常人の肘静脈から採血
し、単離した。採血した血液に抗凝固剤として３．８　
％クエン酸ナトリウム溶液を１／１０量加え、よく混和
した。この血液を２２０　×ｇで１０分間室温で遠心分
離し、その上清　（多血小板血漿）　をさらに１，５０
０　×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して血小板を得た。 このように単離した血小板を２ｍＭのＥＤＴＡを含むヘ
ペス生食緩衝液　（２５ｍＭヘペス，１３５ｍＭ　Ｎａ
Ｃｌ，５ｍＭ　ＫＣｌ，５．５ｍＭ　グルコース，ｐＨ
　７．４）で２回洗浄し、血小板数が５×１０５　細胞
／μｌになるように懸濁した。

【００２６】（２）　ヒト血小板アラキドン酸代謝に及
ぼす甘草中の各フラボノイド化合物の影響 上記（２）　で調整したヒト血小板懸濁液（５×１０５
　細胞／μｌ）１３０　μｌ　に、上記（１）　で単離
した各フラボノイド成分（リコカルコンＡおよびリコカ
ルコンＢ）を加え、５分間３７℃でプレインキュベーシ
ョンした。次に、放射標識した［１−１４Ｃ］　アラキ
ドン酸　（比活性：５４．５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ＝２０１
６．５ＭＢｑ／ｍｍｏｌ，　ニューイングランドヌクリ
ア社製）５０μｌ（０．０５μＣｉ＝１．８５ＫＢｑ／
試験管）　を加えて、最終容量２００　μｌとして５分
間反応させた。反応溶液に０．５Ｎギ酸（２００μｌ）
を加え、反応を停止させた。次いで、８倍量の酢酸エチ
ルエステルを加え、アラキドン酸代謝物を抽出した。抽
出液を窒素気流中で乾固した。この乾固物に５０μｌ　
の酢酸エチルエステルを加えて溶解し、シリカゲルプラ
スチックシート　（メルク社製）　に定量的にスポット
し、展開した。展開溶媒は酢酸エチルエステル／２，２
，４−トリメチルペンタン／酢酸／蒸留水（１００：５
０：２０：１００　ｖ／ｖ　、上層）　を用いた。放射
活性代謝産物をオートラジオグラフィーで検出した。そ
の結果を図１に示す。

【００２７】さらに、各スポットを切り取り液体シンチ
レーションカウンターで各放射活性を測定して、リコカ
ルコンＡおよびリコカルコンＢのアラキドン酸代謝物に
対する影響をグラフにまとめた［　図２（ａ）　および
（ｂ）］。

【００２８】この実験系では主に３つのスポットが検出
できる。即ち、トロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）（トロ
ンボキサンＡ２の安定化合物）、１２−　ヒドロキシ−
５，８，１０−ヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）　、お
よび１２−　ヒドロキシ−５，８，１０，１４−　エイ
コサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）　である。トロン
ボキサンＢ２とＨＨＴ　はアラキドン酸よりシクロオキ
シゲナーゼを経て代謝されたものであり、１２−ＨＥＴ
Ｅ　は１２−リポキシゲナーゼを経て代謝されたもので
ある。図１および図２より、リコカルコンＡおよびリコ
カルコンＢははトロンボキサンＢ２、ＨＨＴ　、１２−
ＨＥＴＥ　の生成を抑制することが判明した。比較のた
めにイソリクイリチゲニンおよびリクイリチゲニンにつ
いて同様の実験を行った結果を図２（ｃ）　および（ｄ
）　に示す。この場合はトロンボキサンＢ２、ＨＨＴ　
の生成は抑制されるが、１２−ＨＥＴＥ　の生成はかえ
って増加する。

【００２９】図２のグラフより、各フラボノイド成分が
ＨＨＴ　およびトロボキサンＢ２産生を５０％阻害する
濃度を計算し、表１にまとめた。また、１２−ＨＥＴＥ
　産生に対する５０％阻害濃度も表１に示した。リコカ
ルコンＡは３．９７×１０−６Ｍで、リコカルコンＢは
２．３　×１０−５Ｍで、イソリクイリチゲニンは３．
７８×１０−６Ｍで、リクイリチゲニンは＞１０−３Ｍ
でトロンボキサンＢ２産生を５０％阻害する。このよう
にリコカルコンＡとリコカルコンＢは低濃度でトロンボ
キサンＢ２の生成を阻害する。一方、リコカルコンＡは
８．２３×１０−５Ｍで、リコカルコンＢは１．３４×
１０−５Ｍで１２−ＨＥＴＥ　産生を５０％阻害し、低
濃度での阻害が可能であるが、これに対しイソリクイリ
チゲニンおよびリクイリチゲニンは１０−４〜１０−３
Ｍで１２−ＨＥＴＥの生成を約２倍増加させた。

【００３０】

【表１】

【００３１】このように、リコカルコンＡおよびリコカ
ルコンＢはトロンボキサンＡ２の生成に関与する酵素を
阻害し、かつ１２−ＨＥＴＥ　の生成に関与する１２−
リポキシゲナーゼを阻害することは明らかである。

【００３２】（３）　トロンビンによるヒト血小板凝集
に対する甘草中の各フラボノイド成分の影響ヒト血小板
（２×１０８　細胞）　をキュベットに加え、３７℃、
１０００ｒｐｍｍで攪拌しながら各フラボノイド成分を
加え、１分間プレインキュベーションした後、０．１　
ユニット／ｍｌ　のトロンビンを加え、血小板凝集能を
血小板凝集計（ＮＢＳ　ＨＥＭＡ　　アグレゴメーター
、二光バイオサイエンス社製）　で５分間モニターした
。その結果は図３（ａ）　、（ｂ）　および（ｃ）　に
示すように、リコカルコンＡは２×１０−５〜２×１０
−４Ｍ濃度においてトロンヒンによる血小板凝集を有意
に抑制した。リコカルコンＢも２×１０−７〜２×１０
−４Ｍ濃度で血小板凝集を強く抑制した。これに対しイ
ソリクイリチゲニンはトロンビンによる血小板凝集を抑
制しない。

【００３３】（４）　ヒト血小板内遊離Ｃａ濃度に及ぼ
す甘草中のフラボノイド成分の影響 （４−１）　ヒト血小板への遊離Ｃａ測定試薬（Ｆｕｒ
ａ　２）の導入方法 ３μＭの１−［２−（５’−　アミノ−　カルボキシオ
キサゾール−２’−イル）−６−アミノベンゾフラン−
５−　オキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフ
ェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸のペ
ンタ−　アセトキシルメチルエステル（Ｆｕｒａ　２−
ＡＭ）　を多血小板血漿（ＰＲＰ）　に加え、３７℃で
３０分間インキュベーションした後、未反応のＦｕｒａ
　２−ＡＭ　をヘペス生食緩衝液（２５ｍＭ　ヘペス、
１３５ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ　、５．５　ｍ
Ｍグルコース、ｐＨ７．４）で２回洗浄する。次いで、
１ｍＭエチレングリコール−ビス　（β−アミノエチル
エーテル）　−Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）また
は１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むヘペス−生食緩衝液（同上
の成分）に懸濁した。

【００３４】（４−２）　トロンビン刺激時のヒト血小
板内遊離Ｃａ濃度に及ぼす甘草中の各フラボノイド成分
の影響上記の方法によって調整したＦｕｒａ　２で標識
したヒト血小板に各フラボノイド成分を加え、１分間プ
レインキュベーションした後、０．１　ユニット／ｍｌ
　のトロンビンを加え、細胞内遊離Ｃａ濃度測定装置（
ＪＡＣＯ　ＣＡＦ−１００　、Ｃａ２　＋　分析器）　
を用い、血小板内の遊離Ｃａ濃度を蛍光強度によりモニ
ターした。１ｍＭＣａＣｌ２　を含むヘペス生食緩衝液
（２５ｍＭ　ヘペス、１３５ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　
ＫＣｌ　、５．５　ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）と共
にトロンビンで刺激すると血小板内遊離Ｃａ濃度は上昇
する。この系に甘草中の各フラボノイド成分を作用させ
ると、図４（ａ）　および（ｂ）　に示すような結果が
得られた。即ち、リコカルコンＡおよびリコカルコンＢ
は２×１０−７Ｍ〜２×１０−４Ｍ濃度において、トロ
ンビン刺激下の血小板内遊離Ｃａ濃度の上昇を抑制した
。

【００３５】また、ヒト血小板を２ｍＭのＥＧＴＡを含
むヘペス生食緩衝液（同上の成分）に懸濁し、トロンビ
ンを作用させると、血小板内遊離Ｃａ濃度は上昇した。 この血小板内遊離Ｃａの上昇は細胞内のカルシウム貯蔵
部位からのＣａ２　＋　の動員によるものである。図５
（ａ）　および（ｂ）　からも明らかなように、この系
においてもリコカルコンＡおよびリコカルコンＢは、２
×１０−７Ｍ〜２×１０−４Ｍ濃度において、トロンビ
ン刺激下の血小板内遊離Ｃａ濃度の上昇を抑制した。

【００３６】３．白血球活性化抑制作用（１）　ヒト多
核白血球の単離 健康なヒトヘパリン加末梢静脈血３５ｍｌに６％デキス
トラン５ｍｌを加え混和して４５分静置後、上清分画を
とり、等量の０．９　％ＮａＣｌで希釈し、フィコール
／ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ／ｈｙｐａｑｕｅ）上に静
かに重層した。これを４℃において１５００ｒｐｍ　で
３０分間遠心し、その沈渣をとり、混在する赤血球を０
．３　％ＮａＣｌで溶血除去し、ダルベッコスのリン酸
−生食緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ　；　１
．０ｍＭ　ＣａＣｌ２，　２．６８ｍＭ　ＫＣｌ，１．
４７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，　０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，
　１３７ｍＭ　ＮａＣｌ，　８．０６ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ
４，　ｐＨ　７．４）に懸濁した。このように調整した
細胞は９７％以上の好中球、１％以下の血小板および好
酸球が存在し、好塩基球、リンパ球、単球の存在は認め
られなかった。細胞の生存率は９５％以上を示した。こ
のようにして調整した白血球を多核白血球とした。

【００３７】（２）　ヒト多核白血球からのライソゾー
ム酵素の遊離に及ぼす甘草中の各フラボノイド化合物の
影響ヒト多核白血球　（２．２　×１０６　細胞）　を
、前述の１において得た甘草中の各フラボノイド化合物
（リコカルコンＡおよびリコカルコンＢ）と共に３７℃
で５分間プレインキュベートし、次いでカルシウムイオ
ノフォアＡ２３１８７（２μＭ）を加え、さらに３７℃
で１０分間反応させた。一方、ロイコトリエンＢ４（Ｌ
ＴＢ４）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）　および白血球
活性化合成ペプチド（ｆＭＬＰ）による多核白血球から
のライソゾーム酵素の遊離は次に示すようにして行った
。ヒト多核白血球　（２．２　×１０６　細胞）　を３
７℃で５分間甘草中の各フラボノイド化合物（リコカル
コンＡおよびリコカルコンＢ）と共にプレインキュベー
トし、さらにサイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏ．Ｂ）（５μ
ｇ／ｍｌ　）を加え、３分間インキュベートした。次い
で、反応液に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）２．５　ｍ
ｇ／ｍｌを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳに溶解し
たＬＴＢ４　（１２５ｎｇ／ｍｌ）　、２００ｎＭ　Ｐ
ＡＦ　もしくは５０ｎＭ　　ｆＭＬＰを加え、３７℃で
５分間反応させた。各々の試験管を氷水中に置くことに
より反応を停止させ、４℃で１０分間遠心分離した。そ
の上清に放出したリゾチームおよびβ−グルクロニダー
ゼ活性の測定は、Ｔａｋａｍｏｒｉ　＆　Ｙａｍａｓｈ
ｉｔａ　［Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ：　２９，　３９５（１９８０）］およびＡｖｉｌ
ａ　＆　Ｃｏｎｖｉｔ　［Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．　Ａｃｔａ：　２９３，　３９７（１９７３）
］　の方法に準じて行った。また、細胞毒性の指標とな
る細胞内酵素、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
　の活性の測定もＢｅｒｇｍｅｙｅｒ　＆　Ｂｅｒｎｅ
ｔ　［Ｉｎ　Ｈ．Ｕ．　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ（ｅｄ．）
，　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｎａｌ
ｙｓｉｓ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ，　Ｉｎｃ．　　ニューヨーク　ｐｐ．５７４−
５７９，　１９７４］の方法によった。多核白血球内の
全酵素の活性は０．１　％トリトンＸ−１００　を作用
させ、上記の方法に従ってリゾチーム、β−グルクロニ
ダーゼおよびＬＤＨ　の全放出量を求めて行った。

【００３８】リコカルコンＡおよびリコカルコンＢのヒ
ト多核白血球からのライソゾーム酵素の遊離に対する影
響をグラフにまとめて示す（　図６および７）。図６に
示すように、リコカルコンＡは０．５　μＭ〜１００　
μＭ濃度において、カルシウムイオノフォアＡ２３１８
７、ＬＴＢ４、ＰＡＦ　およびｆＭＬＰによる多核白血
球からのライソゾーム酵素の遊離を抑制した。リコカル
コンＢもまた１０μＭ〜１０００μＭ濃度においてカル
シウムイオノフォアＡ２３１８７、ＬＴＢ４、ＰＡＦ　
およびｆＭＬＰによる多核白血球からのライソゾーム酵
素の遊離を抑制した　（図７）　。上記の実験条件では
リコカルコンＡおよびリコカルコンＢは細胞質内酵素Ｌ
ＤＨ　の遊離を引き起こさない。このことはリコカルコ
ンＡおよびリコカルコンＢが細胞障害を起こさないこと
を示している。

【００３９】（３）　ヒト多核白血球内の遊離カルシウ
ム濃度に及ぼす甘草中の各フラボノイド化合物の影響（
３−１）　ヒト多核白血球内への遊離カルシウム測定試
薬　（Ｆｕｒａ２）　の導入 ヒト多核白血球　（４．５　×１０７　細胞）　に２．
５　μＭの１−［２−（５’−　アミノ−　カルボキシ
オキサゾール−２’−イル）−６−アミノベンゾフラン
−５−　オキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチル
フェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−　四酢酸
のペンタ−アセトキシルメチルエステル（Ｆｕｒａ　２
−ＡＭ）を加え、３４．５℃で２０分間反応させた。反
応終了後、６５０　×ｇで遠心分離し、メジウム中の余
分なＦｕｒａ　２−ＡＭ　を除去し、ヘペス生食緩衝液
（２５ｍＭ　ヘペス、１３５ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　
ＫＣｌ　、５．５　ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）で２
回洗浄した。次いで、１ｍＭエチレングリコール−ビス
　（β−アミノエチルエーテル）　−Ｎ，Ｎ’−テトラ
酢酸（ＥＧＴＡ　、カルシウムキレート剤）　または１
ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むヘペス生食緩衝液（同上の成分
）に懸濁した。

【００４０】（３−２）　カルシウムイオノマイシン、
ＬＴＢ４、ＰＡＦ　およびｆＭＬＰ刺激時の多核白血球
内の遊離カルシウム濃度に及ぼす甘草中の各フラボノイ
ド成分の影響上記の方法によって調整したＦｕｒａ　２
で標識したヒト多核白血球中　（２．５　×１０６　細
胞）　懸濁液に各フラボノイド化合物　（リコカルコン
ＡおよびリコカルコンＢ）を加え、もしくは緩衝液のみ
で３７℃で１分間反応させた後、２μＭカルシウムイオ
ノマイシン、ＬＴＢ４（１２５ｎｇ／ｍｌ）、　２００
ｎＭ　ＰＡＦ　または５０ｎＭ　ｆＭＬＰ　を加え、細
胞内遊離カルシウム濃度測定装置（ＪＡＣＯ　ＣＡＦ−
１００　、Ｃａ２　＋　分析器）　を用い、白血球内の
遊離Ｃａ濃度を蛍光強度によりモニターすることにより
、リコカルコンＡおよびリコカルコンＢの白血球内遊離
カルシウム濃度に及ぼす影響を調べた。

【００４１】１ｍＭＣａＣｌ２　を含むヘペス生食緩衝
液（２５ｍＭ　ヘペス、１３５ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ
　ＫＣｌ　、５．５　ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）と
共に２μＭカルシウムイオノマイシン、ＬＴＢ４（１２
５ｎｇ／ｍｌ）、　２００ｎＭ　ＰＡＦ　または５０ｎ
Ｍ　ｆＭＬＰ　で刺激すると白血球内遊離カルシウム濃
度は上昇する。この系に甘草中の各フラボノイド成分を
作用させると、図８（ａ）および（ｂ）（代表例として
ＰＡＦ　刺激の場合。他も同様の傾向）　に示すような
結果が得られた。即ち、リコカルコンＡおよびリコカル
コンＢは１〜１００　μＭ濃度において、カルシウムイ
オノマイシン、ＬＴＢ４、ＰＡＦ　およびｆＭＬＰ刺激
下の白血球内遊離カルシウム濃度の上昇を抑制した。

【００４２】また、ヒト多核白血球を１ｍＭのＥＧＴＡ
を含むヘペス生食緩衝液（同上の成分）に懸濁し、カル
シウムイオノマイシンを作用させると、多核白血球内遊
離カルシウム濃度は上昇した。この多核白血球内遊離カ
ルシウム濃度の上昇は細胞内のカルシウム貯蔵部位から
のＣａ２　＋　の動員によるものである。図９（ａ）お
よび（ｂ）　からも明らかなように、この系においても
リコカルコンＡおよびリコカルコンＢは、１０〜１００
μＭ濃度において、カルシウムイオノマイシン刺激下の
多核白血球内遊離カルシウム濃度の上昇を抑制した。

【００４３】

【実施例】

　　用例１　　錠剤 　　　　　　　　　　■コーンスターチ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　６５ｇ　　　　　　　　　
　■結晶セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２０ｇ　　　　　　　　　　■カルボキシメチ
ル　　　　　　　　　　　　セルロースカルシウム　　
　　　　　　　　　　　　　３．５ｇ　　　　　　　　
　　■軽質無水ケイ酸　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．５ｇ　　　　　　　　　　■ステアリ
ン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　１ｇ　　　　
　　　　　　■本発明の化合物　（リコカルコンＡ）　
　　１０ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　計　　　　　　
　１００ｇ　　上記の処方に従って、■〜■を均一に混
合し、打錠機にて圧縮成型して一錠２００ｍｇ　の錠剤
を得た。この錠剤一錠には本発明化合物２０ｍｇが含有
され、成人で１日３〜３０錠を数回に分けて服用する。

【００４４】 　　用例２　　顆粒剤 　　　　　　　　　　■コーンスターチ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８４ｇ　　　　　　　　　
　■カルボキシメチル　　　　　　　　　　　　セルロ
ースカルシウム　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ　
　　　　　　　　　■軽質無水ケイ酸　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ　　　　　　　　
　　■ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　
　０．５ｇ　　　　　　　　　　■本発明の化合物　（
リコカルコンＢ）　　　１０ｇ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　計　　　　　　　１００ｇ　　上記の処方に従って
、■〜■を均一に混合し、圧縮成型機にて圧縮成型後、
破砕機により粉砕し、篩別して顆粒剤を得た。この顆粒
剤１ｇには本発明化合物１００ｍｇ　が含有され、成人
で１日１〜６ｇを数回に分けて服用する。

【００４５】 　　用例３　　カプセル剤 　　　　　　　　　　■コーンスターチ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　９４．５ｇ　　　　　　　
　　　■軽質無水ケイ酸　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．５ｇ　　　　　　　　　　■本発明
の化合物　（リコカルコンＡ）　　　　２．５ｇ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（
リコカルコンＢ）　　　　２．５ｇ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　計　　　　　　　１００ｇ　　上記の処方に従って
、■〜■を均一に混合し、２００ｍｇ　を２号カプセル
に充填した。このカプセル剤１カプセルには本発明化合
物１０ｍｇが含有され、成人で１日６〜６０カプセルを
数回に分けて服用する。

【００４６】 　　用例４　　注射剤 　　　　　　　　　　■注射用蒸留水　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　適量　　　　　　　　　
　■ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０ｍｇ　　　　　　　　　　■マクロ
ゴール４００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２５ｍｇ　　　　　　　　　　■塩化ナトリウム　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　９ｍｇ　　　　
　　　　　　■本発明の化合物　（リコカルコンＡ）　
　　１０ｍｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　全量　　　　　　
　　１ｍｌ 注射用蒸留水に■〜■を溶解させ、ｐＨ７．０　付近に
調製した後１ｍｌのアンプルに充填熔封し、１２１　℃
で１５分間加圧滅菌した。

【００４７】

【発明の効果】以上詳説したように、甘草中のフラボノ
イド成分のうち、リコカルコンＡおよびリコカルコンＢ
は、血小板凝集抑制作用を有するため、血液の凝固促進
状態を改善する血小板凝集抑制剤として、動脈硬化症、
糖尿病時の合併症、高脂血症、各種血栓症、冠動脈性疾
患等の血栓性疾患の成人病に対して有効に使用できる。 さらにリコカルコンＡおよびリコカルコンＢは、免疫異
常およびアレルギー性炎症に伴う白血球活性化を抑制す
る作用が非常に優れ、免疫異常疾患、例えば関節リュウ
マチ、喘息、皮膚炎、胃腸障害、腎臓障害および糖尿病
合併時の血管内皮障害による血管炎、ならびに動脈硬化
等に対して有用な白血球活性化抑制剤となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト血小板中のアラキドン酸代謝物のオートラ
ジオグラフィーの結果を示す図である。

【図２】図２（ａ）　、（ｂ）　、（ｃ）　および（ｄ
）　は甘草中のフラボノイド成分がアラキドン酸代謝物
に及ぼす影響を示すグラフである。

【図３】図３（ａ）　、（ｂ）　および（ｃ）　は甘草
中のフラボノイド成分が、トロンビン刺激時のヒト血小
板凝集能に対する影響を示すグラフである。

【図４】図４（ａ）　および（ｂ）　は甘草中のフラボ
ノイド成分が、トロンビン刺激時のヒト血小板内遊離Ｃ
ａ濃度に対する影響を示すグラフである。

【図５】図５（ａ）　および（ｂ）　は甘草中のフラボ
ノイド成分が、トロンビン刺激時のヒト血小板内遊離Ｃ
ａ濃度に対する影響を示すグラフである。

【図６】図６（ａ）　および（ｂ）　は、甘草中のリコ
カルコンＡがヒト多核白血球からのライソゾーム酵素の
遊離に及ぼす影響を示すグラフである。

【図７】図７（ａ）　および（ｂ）　は甘草中のリコカ
ルコンＢがヒト多核白血球からのライソゾーム酵素の遊
離に及ぼす影響を示すグラフである。

【図８】図８（ａ）　および（ｂ）　は甘草中のリコカ
ルコンＡおよびリコカルコンＢが、１ｍＭＣａ２　＋　
存在下で血小板活性化因子刺激時にヒト多核白血球内遊
離カルシウム濃度に及ぼす影響を示すグラフである。

【図９】図９（ａ）　および（ｂ）　は甘草中のリコカ
ルコンＡおよびリコカルコンＢが、１ｍＭＥＧＴＡの存
在下でカルシウムイオノマイシン刺激時にヒト多核白血
球内遊離カルシウム濃度に対する影響を示すグラフであ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　リコカルコンＡおよび／またはリコカ
   ルコンＢを有効成分とする血小板凝集抑制剤。
2. 【請求項２】　　リコカルコンＡおよび／またはリコカ
   ルコンＢを有効成分とする白血球活性化抑制剤。
3. 【請求項３】　　リコカルコンＡおよび／またはリコカ
   ルコンＢを有効成分とする抗アレルギー性炎症剤。