JPH04298501A

JPH04298501A - ヘパリノイド活性を有する多糖類組成物或いは多糖類、それらの製造方法及びそれらを有効成分とする抗血液凝固剤

Info

Publication number: JPH04298501A
Application number: JP2241004A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Maeda; 前田　昌徹; Tsutomu Uehara; 上原　勉; Hisao Takeshita; 尚男竹下
Original assignee: Nisshinbo Industries Inc; Nisshin Spinning Co Ltd
Current assignee: Nisshinbo Holdings Inc
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1990-09-11
Publication date: 1992-10-22
Anticipated expiration: 2015-03-21
Also published as: DE69115181D1; EP0475383A2; EP0475383A3; US5268366A; DE69115181T2; EP0475383B1; JP3023485B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ミル目ミル科の緑藻類より得られるヘパリノ
イド活性を有する多糖類組成物或いは多糖類、それらの
製造方法及びそれらを有効成分とする抗血液凝固剤に関
するものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとしている問題点〕

ヘパリノイド活性を示す物質は、血液の凝固を阻止した
り、血液中の脂血を清浄化したりする作用を示すため、
各種の疾患の治療に使用されており、このようなヘパリ
ノイド活性を示すものとしては、従来より、ヘパリン、
デキストラン硫酸ナトリウム塩等の硫酸化多糖が知られ
ている。

しかしながら、上記多糖類中、ヘパリンには、高等動物
の内臓等から抽出し精製する必要があるため、このよう
な製造方法自体や、得られたヘパリンの活性が不均一と
なつてしまう点等に難点があり、又、デキストラン硫酸
ナトリウム塩には、やはり製造方法や、得られたヘパリ
ンの活性が弱い点等に難点があり、従って、上記多糖類
以外で、有効なヘパリノイド活性を示す物質の開発提供
が望まれていた。

一方、褐藻から得られ、主としてＬ−フコースからなる
硫酸多糖であるフコイダン硫酸が、ヘパリノイド活性を
示すことはよく知られており、この観点からの研究によ
り見い出された、ヒトエグサ属の緑藻類から得られ強い
ヘパリノイド活性を示す多糖であるラムナン硫酸につい
ては、すでに特許出願がなされている（特公昭６３−２
３５３０１号公報参照）。

本発明は、日本が四方を海で囲まれ、緑藻等の藻類に恵
まれていることから、この緑藻類から得られ、強いヘパ
リノイド活性を示す、上記ヒトエグサ属の緑藻類から得
られるラムナン硫酸以外の多糖類組成物或いは多糖類を
提供し、併せて上記緑藻類の有効利用を図ることを目的
としてなされた。

又、本発明は、上記ヘパリンやデキストラン硫酸ナトリ
ウム塩の製造方法が有していたような問題点を伴わない
製造方法と、得られたヘパリノイド活性を有する多糖類
の有用な用途を提供することを目的としてなされた。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために本発明が採用した多糖類組成
物の構成は、ミル目ミル科の緑藻類から得られることを
特徴とするものであり、又、本発明が採用した多糖類の
構成は、次の理化学的性質を具えることを特徴とするも
のである。

（イ）色と形状：無色〜かすかに淡黄色の粉末（ロ）溶解性：水、ジメチルスルホキシドに易溶０〜６Ｎの塩酸、硫酸または硝酸に可溶０〜２０％のエチルアルコールに可溶０〜３Ｎの水酸化ナトリウム溶液に可溶ベンゼン、シクロヘキサンに不溶（ハ）糖組成：Ｌ−アラビノフラノースを主成分とする
ホモ多糖（ニ）硫酸エステル含量：多糖乾燥重量あたり１０〜２
５％（ホ）赤外線吸収スペクトル：第１図に示す通りである
。

（ヘ）１Ｈ核磁気共鳴吸収スペクトル（４００ＭＨｚ）
：第２図に示す通りである。

（ト）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１．５〜＋１５．０
である。

又、同様に本発明が採用した多糖類組成物の製造方法の
構成は、ミル目ミル科の緑藻類を水で抽出することを特
徴とするものであり、本発明が採用した多糖類組成物の
製造方法の構成は、ミル目ミル科の緑藻類を水で抽出し
た後、希塩化カリウムを用いた分別沈殿により精製する
ことを特徴とするものである。

更に、本発明が採用した抗血液凝固剤の構成は、上記ヘ
パリノイド活性を有する多糖類組成物又は多糖類を有効
成分として含有することを特徴とするものである。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明のヘパリノイド活性を有する多糖類の製造に使用
する緑藻類は、ミル目ミル科のものであり、とりわけヒ
ラミル（Ｃｏｄｉｕｍ．ｌａｔｕｍ）が好ましい。この
ヒラミル等のミル目ミル科の緑藻類としては、採集した
後に乾燥しておいたものを材料とすることが簡便である
。

尚、ヒラミル（Ｃｏｄｉｕｍ．ｌａｔｕｍ）は、前記ラ
ムナン硫酸抽出の原料となったヒトエグサ（Ｍｏｍｏｓ
ｔｒｏｍａ．ｎｉｔｉｄｕｍ）とは、分類的に異なった
位置にある。

このヒラミル等のミル目ミル科の緑藻類から本発明のヘ
パリノイド活性を有する多糖類組成物或いは多糖類を製
造するには、まず、好ましくは乾燥しておいたヒラミル
等を、例えば水に適宜時間浸漬して膨潤させた後、ブレ
ンダー等によつて細断し、布で■過する等して水抽出液
とする。そして、この水抽出液を流水に対して透析後、
凍結乾燥して本発明多糖類組成物である水抽出粗多糖を
得るのである。

又、前記抽出残渣に水を加えて加熱した後、布で■過し
て熱水抽出液とし、得られた熱水抽出液を透析後、凍結
乾燥して本発明多糖類組成物である熱水抽出粗多糖を得
てもよい。

尚、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（例えばＷｈａｔｍａ
ｎ　ＤＥ５２、ＯＨ型）により、溶出溶媒として水や塩
化ナトリウム水溶液を使用して、本発明多糖類組成物を
精製することもできる。

この場合、塩化ナトリウム水溶液の濃度は例えば０．５
〜３．０Ｍであり、このような範囲内で、段階的あるい
は濃度勾配的に濃度を変化させて溶出する。

上記のようにして得られた本発明多糖類組成物のヘパリ
ノイド活性は、精製の程度等により多少変動するが、標
準ヘパリンの抗血液凝固活性を１とした場合の比活性で
概ね１．１〜６．０の範囲内である。

尚、上記ヘパリノイド活性は次のような手順で測定され
る。

即ち、ヘパリンコファクターとして、牛胎児血清の生理
食塩水溶液に、ウシトロンビンの生理食塩水溶液を加え
、バルビタール緩衝液（ｐＨ７．０）と共に混和後、温
度平衡に至らしめ、この混液に対しフィブリノーゲンの
生理食塩水溶液を加え、この直後からフィブリンの形成
に至るまでの時間をＴ１とする。

これとは別に、ヘパリノイド活性を有する物質を加えた
バルビタール緩衝液（ｐＨ７．０）を、上記成分と共に
加えた系において、フィブリンの形成に至るまでの時間
をＴ２とし、これらの時間差（Ｔ２−Ｔ１）を血液凝固
阻止活性の指標（以下、ＡＴＡ値［Ａｎｔｉ　Ｔｈｒｏ
ｍｂｉｎＡｃｔｉｖｉｔｙ］という）とするのである。

一方、上記のようにして得られた抽出多糖を精製すれば
、本発明の多糖類とすることができる。この精製には、
例えば、上記本発明多糖類組成物を製造する場合と同様
に、ＤＥＡＥ−セルロースカラムによるイオン交換クロ
マトグラフィーにより行なってもよいが、希塩化カリウ
ムによる分別沈殿による精製が、簡便であり、且つ、得
られる多糖の活性の点から好ましい。この分別沈殿によ
る場合の希塩化カリウムの濃度としては、例えば０．２
Ｍ程度という数値を挙げることができる。

尚、希塩化カリウムによる分別沈殿による精製の後、更
にＤＥＡＥ−セルロースカラムによるイオン交換クロマ
トグラフィーにより本発明多糖類を精製するようにして
もよい。

而して、本発明のヘパリノイド活性を有する多糖類は、
次のような理化学的性質を具えることを特徴とするもの
である。

（イ）色と形状：無白〜かすかに淡黄色の粉末（ロ）溶解性：水、ジメチルスルホキシドに易溶０〜６Ｎの塩酸、硫酸または硝酸に可溶０〜２０％のエ
チルアルコールに可溶０〜３Ｎの水酸化ナトリウム溶液に可溶ベンゼン、シク
ロヘキサンに不溶（ハ）糖組成Ｌ−アラビノフラノースを主成分するホモ多糖この性質は、本発明多糖の加水分解物の核磁気共鳴吸収
スペクトル、赤外線吸収スペクトル及び加水分解物のジ
フェニルヒドラジン誘導体の融点から決定した。

（ニ）硫酸エステル含量多糖乾燥重量あたり１０〜２５％この性質は、赤外線吸収スペクトルにより、あらかじめ
求めておいたコンドロイチン硫酸Ａによる検量線に基づ
き、１２４０ｃｍ−１付近の吸収の面積を測定すること
、及び、ロジゾン酸試薬による比色定量法を併用するこ
とにより決定した。

（ホ）赤外線吸収スペクトル第１図に示す通りである。

（ヘ）１Ｈ核磁気共鳴吸収スペクトル（４００ＭＨｚ）第２図に示す通りである。

（ト）比旋光度［α］Ｄ２５＝＋１．５〜＋１５．０である。

又、本発明多糖類を脱硫酸後、ゲル■過法で分子量を測
定してみると、１５０，０００〜３００，０００の範囲
であることが判明した。

更に、本発明多糖類のヘパリノイド活性は、標準ヘパリ
ンの抗血液凝固活性を１とした場合の比活性で概ね６．
０〜１０．０である。

一方、本発明が採用した抗血液凝固剤は、上記本発明の
多糖類組成物或いは多糖類を有効成分として含有するこ
とを特徴とするものであり、従来より使用されているヘ
パリン製剤と同様、散剤または軟膏等の適宜の剤形に製
剤し、投与することができる。

〔実施例〕

以下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。

１　ヒラミルよりの粗多糖の抽出ヒラミルは、伊豆半島の白浜海岸において採集し、海水
中で十分に洗浄して不純物を除き、室内で風乾したもの
を材料とした。

風乾媒体に対して約５倍量の蒸留水に、およそ１時間浸
漬後、ブレンダーによつて細断し、室温で２時間放置し
、布で■過して水抽出液とした。この水抽出液を流水に
対して３日間透析後、凍結乾燥して、本発明多糖類組成
物である水抽出多糖を得た。

又、前記抽出残渣に同量の蒸留水を加えて、１００℃で
１時間加熱した後、布で■過して熱水抽出液とし、得ら
れた熱水抽出液を３日間透析後、凍結乾燥して、本発明
多糖類組成物である熱水抽出多糖を得た。

２　血液凝固阻止活性の測定ヘパリンコファクターを加えたｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で
の抗トロンビン活性として測定した。

まず、ヘパリンコフアクターとして、牛胎児血清（和光
純薬製）の１％生理食塩水溶液１ｍｌに、ウシトロンビ
ン（オリエンタル酵母製）の生理食塩水溶液１ｍｌを加
え、２０ｍＭバルビタール緩衝液（和光純薬製、ｐＨ７
．０）２ｍｌと共に混和後、３７℃の水浴に９０分間浸
漬して、温度平衡に至らしめた。

この混液０．３ｍｌに対し、フィブリノーゲン（日本ケ
ミカルリサーチ製）の１％生理食塩水溶液１ｍｌを加え
、この直後から、フィブリンの形成に至るまでの時間を
Ｔ１とした。

これとは別に、ヘパリンまたはヘパリノイド活性を有す
る物質を加えた２０ｍＭバルビタール緩衝液（和光純薬
製、ｐＨ７．０）２ｍｌを加えた系において、フィブリ
ンの形成に至るまでの時間をＴ２とし、これらの時間差
（Ｔ２−Ｔ１）を求め、血液凝固阻止活性の指標である
ＡＴＡ値とした。尚、ヘパリンは日本薬局方標準検定に
用いられる標品を使用し、フィブリンの形成に至るまで
の時間は、５回以上の測定から平均値を求めた。又、Ａ
ＴＡ値は３μｇ／ｍｌの測定資料により測定した。

上記の方法により、１で得た水抽出多糖及び熱水抽出多
糖の血液凝固阻止活性を測定したところ、熱水抽出多糖
よりも水抽出多糖につき高い活性がみられ、そのＡＴＡ
値は、ヘパリンを１とした場合に２．２であった。

３−１　水抽出多糖の分画及び精製（１）ＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィー
により行なった。

まず、水抽出多糖１ｇを約５００ｍｌの水に溶解し、不
溶性残渣を遠心分離によつて除去した上清をカラムに付
し、蒸留水による溶出でゲルに未吸着の成分を除去後、
塩化ナトリウム水溶液により、その濃度を０．５Ｍ、１
．０Ｍ、２．０Ｍ及び３．０Ｍと段階的に変化させて溶
出を行なった。

この操作により得られた分画につき、上記２に記載した
方法により血液凝固阻止活性を測定したところ、塩化ナ
トリウム濃度が０．５Ｍの分画が最も活性が強かった（
ヘパリンを１とした場合のＡＴＡ値で２．２）ので、こ
の分画を再度イオン交換クロマトグラフィーに付し、塩
化ナトリウム水溶液により、その濃度を段階的に変化さ
せて溶出を行なったところ、第３図に示すような溶出プ
ロフィールを得た。

そして、各分画につき、２に記載した方法により血液凝
固阻止活性を測定したところ、第４図中でＥとした分画
が最も活性が強かった。尚、この分画Ｅに含まれる本発
明多糖の活性は、標準ヘパリンを１とした場合のＡＴＡ
値で５．６であった。

３−２　構成単糖の分析上記各段階で得られた多糖を、２Ｎ硫酸により加水分解
をした後、ガスクロマトグラフィーで分析することによ
り、それらの構成単糖が、いずれも、Ｌ−アラビノフラ
ノースとＤ−ガラクトースであることが、標準品との比
較により確認された。尚、各段階で得られた多糖におい
ては、精製が進むにつれ、Ｄ−ガラクトースが減少しＬ
−アラビノフラノースの量比が増加することが確認され
た。

４−１　水抽出多糖の分画及び精製（２）希塩化カリウ
ムによる分別沈殿法により行なった。これは、水抽出多
糖に希塩化カリウムを加え、遠心分離して得た沈殿分画
には血液凝固阻止活性の向上が認められたが、上清部分
には全く血液凝固阻止活性が認められなかったことに基
づく。

この分別沈殿において、希塩化カリウムの濃度を種々変
化させて、沈殿分画の血液凝固阻止活性との関係を検討
したところ、最終濃度で０．２Ｍから３．０Ｍ希塩化カ
リウム溶液となるまで加えた際の沈殿分画に高い活性が
みられ、特に最終濃度で０．２Ｍ希塩化カリウム溶液と
なるように加えた際の沈殿分画の活性が最も高かった（
これをＫ分画とする）。

尚、この沈殿分画に含まれる本発明多糖の活性は、希塩
化カリウム溶液の最終濃度により変動するが、標準ヘパ
リンを１とした場合のＡＴＡ値で６．５乃至８．３であ
った。

以下、この分画を本発明多糖を含むＫ分画とする。

４−２　Ｋ分画の化学的分析１）セルロース・アセテート膜電気泳動陽極側に単一な
ピークを示し、精製が行なわれていることを示している。

即ち、このＫ分画に含まれる多糖が本発明多糖である。

２）赤外線吸収スペクトル第１図のように、硫酸エステルの特徴であるＳ＝Ｏ伸縮振動の吸収を１２４０ｃｍ−１に示す
スペクトルを与え、このスペクトルから、硫酸基含有量
を約２０％と定量した。

このことから、本発明多糖はアラビナン硫酸であるといえる。

３）核磁気共鳴吸収第２図のようなスペクトルを与えた。

スペクトル上、アノメリックプロトンのシグナルが５．５ｐｐｍ付近にみられ、このことから
、この多糖はα−Ｌ−配置と思われる。

４）比旋光度［α］Ｄ２５＝＋２．４であった。

５）加水分解物のガスクロマトグラフィー加水分解物を
トリフロルアセチルアルジトール誘導体に導き、２％フッ素化シリコンを充填し
たカラム（φ２ｍｍ×１００ｃｍ）を使用したガスクロ
マトグラフィーで分析したところ（カラム温度：１０５
℃、キャリア：窒素ガス、流速：６０ｍｌ／分）、保持
時間５．７分において単一のピークを示した。

４−３　構成単糖の分析上記加水分解物の１、１−ジフェニルヒドラゾン誘導体
を合成し、その融点を測定したところ、１８３〜１８５
℃であり、一方、Ｌ−アラビノフラノースの１、１−ジ
フェニルヒドラゾン誘導体の融点は１８３〜１８５℃、
Ｄ−アラビノースの誘導体の融点は１８９〜１９３℃で
あり、更に、加水分解物の誘導体とＬ−アラビノフラノ
ースの誘導体の混融試験における融点は１８３〜１８５
℃であり、加水分解物の誘導体とＤ−アラビノースの誘
導体の混融試験においては融点降下が観察されたので、
Ｋ分画の構成単糖をＬ−アラビノフラノースと決定した
。

又、加水分解物の核磁気共鳴吸収スペクトルは、Ｌ−ア
ラビノフラノースの標準品のスペクトルと一致した。

４−４　Ｋ分画のメチル化４−１で得られたＫ分画に含まれる多糖を、脱硫酸後、
完全メチル化し、得られた部分メチル化アルジトールア
セテートをガスクロマトグラフィーで分析することによ
り、上記多糖の大部分は、フラノース環であり、α−Ｌ
−１，５結合からなる直鎖多糖であるものと考えられた
。

４−５　分子量の測定脱硫酸後、ゲル■過法（充填材：トヨパールＨＷ−６５
｛商品名｝、移動相：水、分子量マーカー：プルラン｛
商品名｝）で測定した分子量は、概ね２７０，０００で
あった。

４−６　Ｋ分画の精製４−１で得られたＫ分画を、ＤＥＡＥ・トヨパール（東
洋曹達製）イオン交換クロマトグラフィーに付し、塩化
ナトリウム水溶液により、その濃度を段階的に変化させ
て溶出を行なったところ、第４図に示すような溶出プロ
フィールを得た。

そして、各分画につき、２に記載した方法により血液凝
固阻止活性を測定したところ、第４図中でＩＩとした分
画が最も活性が強かった。

尚、この分画ＩＩに含まれる多糖の活性は、標準ヘパリ
ンを１とした場合のＡＴＡ値で約９．５であった。

〔発明の効果〕

上述のように、本発明によれば、ミル目ミル科の緑藻類
、例えばヒラミル（Ｃｏｄｉｕｍ．ｌａｔｕｍ）から得
られ、強いヘパリノイド活性を示す、上記ヒトエグサ属
の緑藻類から得られるラムナン硫酸以外の多糖類組成物
或いは多糖類を提供することができ、併せて上記緑藻類
の有効利用を図ることができる。

又、本発明の製造方法は、前記ヘパリンやデキストラン
硫酸ナトリウム塩の製造方法が有していたような、不均
一な硫酸化による製品のバラツキという問題点を伴わな
ず、簡便且つ経済的であり、得られた本発明ヘパリノイ
ド活性を有する多糖類は、抗血液凝固剤という有用な用
途を有するものである。

特許出願人　日清紡績株式会社代理人　弁理士　小林雅人　他１名

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ミル目ミル科の緑藻類から得られることを
特徴とするヘパリノイド活性を有する多糖類組成物。
【請求項２】ミル目ミル科の緑藻類はヒラミル（Ｃｏｄ
ｉｕｍ．ｌａｔｕｍ）であることを特徴とする請求項１
に記載のヘパリノイド活性を有する多糖類組成物。
【請求項３】水により抽出されることを特徴とする請求
項１又は２に記載のヘパリノイド活性を有する多糖類組
成物。
【請求項４】ヘパリノイド活性が、標準ヘパリンの抗血
液凝固活性を１とした場合の比活性で１．１〜６．０で
あることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載
のヘパリノイド活性を有する多糖類組成物。
【請求項５】主成分が、次の理化学的性質を具える多糖
類であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに
記載のヘパリノイド活性を有する多糖類組成物。（イ）色と形状：無色〜かすかに淡黄色の粉末（ロ）溶解性：水、ジメチルスルホキシドに易溶０〜６Ｎの塩酸、硫酸または硝酸に可溶０〜２０％のエチルアルコールに可溶０〜３Ｎの水酸化ナトリウム溶液に可溶ベンゼン、シクロヘキサンに不溶（ハ）糖組成：Ｌ−アラビノフラノースを主成分とする
ホモ多糖（ニ）硫酸エステル含量：多糖乾燥重量あたり１０〜２
５％（ホ）赤外線吸収スペクトル：第１図に示す通りである
。（ヘ）１Ｈ核磁気共鳴吸収スペクトル（４００ＭＨｚ）
：第２図に示す通りである。（ト）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１．５〜＋１５．０
である。
【請求項６】ミル目ミル科の緑藻類を水で抽出すること
を特徴とするヘパリノイド活性を有する多糖類組成物の
製造方法。
【請求項７】ミル目ミル科の緑藻類はヒラミル（Ｃｏｄ
ｉｕｍ．ｌａｔｕｍ）であることを特徴とする請求項６
に記載のヘパリノイド活性を有する多糖類組成物の製造
方法。
【請求項８】次の理化学的性質を具えることを特徴とす
るヘパリノイド活性を有する多糖類。（イ）色と形状：無色〜かすかに淡黄色の粉末（ロ）溶解性：水、ジメチルスルホキシドに易溶０〜６Ｎの塩酸、硫酸または硝酸に可溶０〜２０％のエチルアルコールに可溶０〜３Ｎの水酸化ナトリウム溶液に可溶ベンゼン、シクロヘキサンに不溶（ハ）糖組成：Ｌ−アラビノフラノースを主成分とする
ホモ多糖（ニ）硫酸エステル含量：多糖乾燥重量あたり１０〜２
５％（ホ）赤外線吸収スペクトル：第１図に示す通りである
。（ヘ）１Ｈ核磁気共鳴吸収スペクトル（４００ＭＨｚ）
：第２図に示す通りである。（ト）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１．５〜＋１５．０
である。
【請求項９】ヘパリノイド活性が、標準ヘパリンの抗血
液凝固活性を１とした場合の比活性で６．０〜１０．０
であることを特徴とする請求項８に記載のヘパリノイド
活性を有する多糖類。
【請求項１０】脱硫酸後、ゲル■過法で測定した分子量
が１５０，０００〜３００，０００の範囲であることを
特徴とする請求項８又は９に記載のヘパリノイド活性を
有する多糖類。
【請求項１１】ミル目ミル科の緑藻類を水で抽出した後
、希塩化カリウムを用いた分別沈殿により精製すること
を特徴とするヘパリノイド活性を有する多糖類の製造方
法。
【請求項１２】ミル目ミル科の緑藻類はヒラミル（Ｃｏ
ｄｉｕｍ・ｌａｔｕｍ）であることを特徴とする請求項
１１に記載のヘパリノイド活性を有する多糖類の製造方
法。
【請求項１３】請求項１乃至５のいずれかに記載された
多糖類組成物を、希塩化カリウムを用いた分別沈殿によ
り精製することを特徴とするヘパリノイド活性を有する
多糖類の製造方法。
【請求項１４】請求項１乃至５のいずれかに記載された
多糖類組成物を有効成分とすることを特徴とする抗血液
凝固剤。
【請求項１５】請求項８乃至１０のいずれかに記載され
た多糖類を有効成分とすることを特徴とする抗血液凝固
剤。