JPH04320683A - 超高純度トロンビン調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【背景】タンパク質加水分解酵素であるトロンビンは止
血に不可欠である。それはフィブリン生成を介する血餅
形成における主剤である。トロンビンおよびその調製物
はその血餅形成助剤としての有効性の故に、外科手術の
際に出血を制御するのに有用である。乾燥トロンビンは
入手可能であるが、取り扱いおよび時間上の考慮から液
状調製物の方が一般に好ましい。

【０００２】今日に到るも、貯蔵安定性があり、しかも
外科手術中にいつでも使用できる高度に安定で澄明な液
状トロンビン調製物はない。これは、トロンビンが水ま
たは食塩水に溶解するとトロンビンタンパク質の変性お
よび自己溶解のためにその活性を速やかに失うためであ
る。

【０００３】

【本発明】本発明は、溶液状態の超高純度品位トロンビ
ンの調製方法の新たな改変に関する。この溶液は完全に
澄明でありかつ濁りがなく、そしてこれまでに報告され
ているどのトロンビン製品よりも高い血餅形成活性、少
い不活性タンパク質および高い比活性といった特徴を有
している。

【０００４】澄明なトロンビン溶液という目的を達成す
る本発明方法の新規性は、多くの段階を特定の順序で独
特に組み合わせたところにある。

【０００５】まず、通常のトロンビンは循環血液中では
プロトロンビンと呼ばれる不活性型として存在し、そし
てプロトロンビンをトロンビンに変えるにはトロンボプ
ラスチンと呼ばれる因子が必要である。本発明は、後述
の如く、トロンボプラスチン源として通常の牛肺抽出物
の使用は伴わず、単離され、高度に精製されたトロンボ
プラスチンを用いる。この方法は最終製品によくみられ
る不純物および濁りの源となり得る著しい量の混入タン
パク質を排除する。

【０００６】プロトロンビンからトロンビンへの転化混
合物を通常の遠心分離段階を経た後に陰イオン交換クロ
マトグラフィーカラムに通して得られる溶出物はなお濁
っている。この物質は次いで、本発明においては凍結さ
れ、次いで融解され、次いで遠心分離により大部分の濁
りを除去する。この濁りの除去により第二段階陽イオン
交換カラムクロマトグラフィー手順を通しての溶液フロ
ーが向上する。

【０００７】陽イオン交換体を通しての溶液の第二の通
過の段階における改良は、標準的な塩化ナトリウム溶液
ではなく塩勾配を用いて物質をこのカラムを通して通常
のフローにより頂部から底部へ溶出することより成る。

【０００８】これらの改変の結果、水の如く澄明で超高
純度のトロンビンが単離され、そしてその比活性は表１
に示されるように、市場で入手できるどの製品よりもは
るかに優れている。

【０００９】

【表１】

【００１０】従って本発明は最も広い観点において以下
に関するものである： Ｉ．４０００〜１１，０００単位／ｍｇタンパク質の比
活性を有する超高純度、澄明、無色トロンビン溶液。 ＩＩ．　プロトロンビンを精製トロンボプラスチンと反
応させそして生成トロンビンを遠心分離の後、その上清
を陰イオン交換アガロースカラムを通して溶出し；所望
の溶出液画分を凍結させ次いで約２５℃まで融解させ；
遠心分離しその上清を緩衝液中の塩勾配を用いて陽イオ
ン交換アガロースカラムを通して溶出させることにより
処理することによって調製される超高純度、澄明、無色
トロンビン溶液。 ＩＩＩ．　　プロトロンビンを精製トロンボプラスチン
と反応させ；その懸濁液を遠心分離し；その上清を緩衝
液を用いて陰イオン交換アガロースカラムを通して溶出
させ；所望の溶出液画分を凍結した後約２５℃まで融解
し；遠心分離しそしてその上清を緩衝液中の塩勾配を用
いて陽イオン交換アガロースカラムを通して溶出させる
ことより成る超高純度、澄明、無色トロンビン溶液の調
製方法。

【００１１】

【効果】本発明のトロンビン組成物および方法は、血餅
形成を助長する従来の調製物および方法に比しいくつか
の長所を有する。

【００１２】粉末状調製物と異なり、本発明の組成物は
使用に先立ち再構成する必要がない。すなわち、一以上
の成分または容器の測定、混合、滅菌などの考慮は重要
ではない。本発明の澄明調製物は、従来の液状調製物の
濁りの原因となる粒子が存在しないために最終的な使用
に先立ち調製することなく用いることができる。

【００１３】更に、本発明のトロンビン含有物質の安定
性は、製品のストックインベントリーおよび／またはロ
ーテーションの必要性が大方なくなる程のものである。 ４℃で約１週間しか安定でないトロンビンの大抵の食塩
水または水溶液とは異なり、本発明の調製物は、通常の
凍蔵温度（すなわち約４℃）および室温（すなわち約２
５℃）で６ケ月以上も安定であるように設計される。

【００１４】高濃度のグリセロール、スクロース、およ
びその他のポリオールが溶液中のタンパク質を安定化で
きることは知られている。トロンビンの場合には、６７
％のグリセロール濃度が１，０００μ／ｍｌトロンビン
溶液を大幅に安定化できることは知られている。しかし
ながら、高グリセロール濃度を用いることは、かかる調
製物が高粘度であるために、滅菌トロンビン溶液の大規
模製造には実用的でない。３０％以下のグリセロールを
含有してもよい本発明の組成物にはこれらの問題がない
。

【００１５】本発明のその他の効果および観点は以下の
本発明の説明を考慮することによって明らかとなろう。

【００１６】

【好ましい態様の詳細な説明】

肺組織からのトロンボプラスチンの単離牛／仔牛肺組織
にトリミングを施して脂肪組織を除去し、小片に切断し
、そして組織ホモジナイザーで０．５〜１．０％ポリソ
ルベート８０を含有する２５〜５０ｍＭホスフェート緩
衝液（ｐＨ６．２〜６．７、好ましくはｐＨ６．５）を
用いてホモジナイズする。その界面活性剤は酵素の抽出
を助長する。その他の非イオン性界面活性剤、例えばポ
リエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、例えばＴｗｅ
ｅｎＲ、ＩＣＩ；ポリオキシアルキリン脂肪酸エステル
、例えばＭＹＲＪＲ、ＩＣＩ；ポリオキシエチレン脂肪
エーテル、例えばＢｒｉｊＲ、ＩＣＩ；ポリオキシプロ
ピレン−ポリエチレンエーテル、例えばＰｌｕｒｏｎｉ
ｃＲ、ＢＡＳＦ；スクロースモノエステル；およびＴｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−１００などを用いることができる。その
ホモジネートを１２〜１４Ｋ　ＲＰＭで遠心分離しそし
てその上清を集める。その上清のｐＨを１０％酢酸液滴
を用いてｐＨ５．２〜５．７（好ましくはｐＨ５．５）
に調節しそして１２〜１４Ｋ　ＲＰＭで遠心分離する。 この段階からの上清を慣用の陽イオン交換架橋アガロー
スカラム、例えばＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲ（他の陽
イオン樹脂、例えばＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＲなども使
用できる）などにかけ、そして前述の如き２５〜５０ｍ
Ｍホスフェート緩衝液を用いて溶出する。溶出液は２８
０ｎＭでモニターする。溶出液中のトロンボプラスチン
の活性も、まずプロトロンビンをトロンビンに転化する
ことにより間接的にモニターされ、そして後者の活性を
次いでフィブロメーターを用いて血餅形成活性を測定す
ることにより測定する。

【００１７】カラムから溶出する初期画分がトロンボプ
ラスチンを含む第一ピークの部分を形成する。この精製
トロンボプラスチン溶液は、いかなる曇りや濁りのない
乳白光（ｏｐａｌｅｓｃｅｎｔ）を呈する。この画分は
、凍結／融解および遠心分離サイクルにより、プロトロ
ンビン転化活性をいささかも失うことなく更に澄明化す
ることができる。

【００１８】超高純度トロンビンの調製、単離および精
製トロンビン活性のアッセイ トロンビン血餅形成活性を改変ＮＩＨ法を用いて測定し
た。使用溶液は次のとおり：ａ）イミダゾール緩衝液、
ストック、（ＩＢＳ）、１．７２ｇのイミダゾールを９
０ｍｌの０．１Ｎ塩酸に溶解することにより作り、次い
で蒸留水で１００ｍｌとした（最終ｐＨは約７．２とす
べきである）。ｂ）ＰＥＧ／ＩＢＳ溶液、５８．８ｍｌ
のＩＢＳ、９．０ｇの塩化ナトリウムおよび５ｇのポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ、分子量８０００）を水で
１０００ｍｌに希釈することにより作った。正常ヒト血
漿をフィブリノーゲン源として用い、そして使用に先立
ち、０．１５４Ｍ塩化ナトリウムで希釈した（１：１）
。ＮＩＨトロンビンを標準として用い、そしてポリエチ
レングリコール（８０００）／イミダソール緩衝食塩水
（ＰＥＧ／ＩＢＳ）で希釈して５Ｕ／ｍｌとした。血餅
形成アッセイはフィブロメーターを用いて行った。希釈
血漿（２００μｌ）を３７℃で３分間インキュベートし
、次いで標準トロンビン（１００μｌ）を添加しそして
血餅形成時間（秒単位）を記録した（１４〜１５秒）。 トロンビン含有未知検体をＰＥＧ／ＩＢＳで希釈して標
準血餅形成時間値よりも約５秒だけ高いおよび低い血餅
形成時間値を与えるようにした。酵素活性は次のように
して算出した：

【００１９】

【数１】

【００２０】Ａ：未知トロンビン検体の高希釈係数Ｂ：
未知トロンビン検体の低希釈係数 Ｃ：標準トロンビンの平均血餅形成時間Ｄ：低希釈液の
未知検体の平均血餅形成時間Ｅ：高希釈液の未知検体の
平均血餅形成時間ｇ：試験混合物中の標準トロンビンの
単位数を試験混合物中の標準トロンビンの容量で除した
もの（０．５／０．１） 酵素活性は単位／ｍｌとして（８０００Ｕ／ｍｌまで）
、また単位／ｍｇタンパク質として（１０，０００Ｕ／
ｍｇタンパク質まで）表す。

【００２１】精製または部分精製牛血漿プロトロンビン
を、実施例Ｂの“超高純度トロンビンの単離”に記載さ
れる如く、１０〜２５℃の温度で１５〜４５分間、１０
〜４０ｍＭ塩化カルシウム溶液の存在下に精製トロンボ
プラスチンと反応させる。トロンボプラスチン活性量は
、ｐＨ６．５〜７．０でプロトロンビンのそれの２〜３
倍である。この反応により生成したトロンビンを更に次
のようにして精製する。生成タンパク質懸濁液を冷凍遠
心機（２°〜１０℃）で遠心分離して（１２Ｋ　ＲＰＭ
）不溶性不活性タンパク質を分離する。その上清を弱陰
イオン交換カラム（ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲ、
ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＲ、ＤＥ−５２Ｒ）にかけ
る。そのカラムを０．１Ｍ塩化ナトリウム含有２５〜５
０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ６．５）で溶出する（
２℃〜１０℃）。溶出液を２８０ｎＭでモニターする。 高ＵＶ吸収を示す画分について更にトロンビン血餅形成
活性を（フィブロメーターを用いて）チェックする。ト
ロンビンを含有するこれらのプールされた画分は濁って
おり、そしてその懸濁液を一夜凍結した後融解させ（＜
２５℃）そして遠心分離または濾過することによって澄
明化する。そのトロンビン含有プールを陽イオン交換カ
ラム（ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘＲ）にかけ、そして塩勾配（２５〜５０ｍＭホス
フェート緩衝液（ｐＨ６．５）中の０．１Ｍ〜１Ｍ塩化
ナトリウム）を用いて溶出する。

【００２２】その溶出液を２８０ｎＭでモニターし、そ
して（フィブロメーターにより測定されるところの）ト
ロンビン活性を含む画分をプールする（図１）。超高純
度トロンビンを含む画分は水の如く澄明であり、そして
約８０００Ｕ／ｍｌの活性を有し得る。超高純度トロン
ビンの純度は逆相ＨＰＬＣ、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動および等電フォーカシングにより測定する。

【００２３】トロンビン画分のタンパク質含量はＢｒａ
ｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，　Ｍ．，　Ａ
ｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７２：２４８，　１９
７６）およびＢｉｏＲａｄ（リッチモンド、カリホルニ
ア州）により製造されたタンパク質試薬を用いて測定し
た。調製物の比活性は、単位容量あたりの酵素単位を、
同じ単位容量あたりのタンパク質量で除することにより
算出した。

【００２４】本発明により製造されたトロンビンの例外
的に高い比活性は以下によるものである：１．採取した
ばかりのプロトロンビンの使用は高比活性のトロンビン
製品を与える。更に、不活性トロンビンは活性トロンビ
ンと同時に溶出し得、このために最終製品の比活性の低
下を招くことがある。それゆえ、すべての単離段階は約
２°〜７℃の温度で行う必要がある。更に溶液は冷蔵さ
れていてさえも使用前に長時間放置することはできなか
った。約−１０°〜−２０℃で凍結するだけで製品の保
護に十分であった。 ２．本発明に記載の高度精製トロンボプラスチンの使用
により、最終トロンビン調製物中の混入物の度合または
非特異的タンパク質の存在が低下し、従って比活性が増
大する。

【００２５】トロンビン調製物 本発明に従って製造された調製物は、液状媒質中に、超
高純度トロンビンおよび一以上の緩衝剤を含有しなけれ
ばならない。それらは、食塩水、およびタンパク質調製
物に慣用されるその他の物質を含んでいてよい。

【００２６】“調製物”という用語を用いているが、実
質的に可溶化された形態のトロンビンが一以上のグリコ
ールおよび緩衝剤と共存するあらゆるタイプの組成物を
意図していることに留意すべきである。

【００２７】液状組成物を作る場合には、使用する溶媒
（一種または複数種）または他の希釈剤（一種または複
数種）が、生産基準、例えばバッチごとのトロンビン濃
度の均一性に容易に合致し得るように、トロンビンに対
し適切な混和性を有していることが一般に好ましい。

【００２８】使用トロンビンは、本発明方法により得ら
れた超高純度トロンビンである。

【００２９】このトロンビン溶液は、所望により、次い
で安定化溶液を調製すべくアセテート緩衝剤またはホス
フェート緩衝液を含有するグリセロールおよび食塩水と
混合する。

【００３０】トロンビンは生理学的食塩水、すなわち、
水中に０．９％ＮａＣｌを含有する溶液、に可溶である
ことが知られている。しかしながら、その他の食塩水溶
液も本発明においては有用である。更に、かかる溶液中
のＮａＣｌの全部または一部を一以上の他の適当な塩で
置換することもできる。

【００３１】水は本発明の調製物の好ましい媒質である
。しかしながら、本発明の調製物のトロンビンの可溶性
および／または安定性に悪影響しない一以上の他の希釈
剤を用いることが望ましい。

【００３２】かかる希釈剤の一つはグリセロールである
。その他の有用なポリオールにはマンニトール、ソルビ
トール、スクロース、グルコース、などが包含される。 混合物を用いることもできる。グリセロールが極めて好
ましい。

【００３３】グリセロールまたは他の（一種または複数
種の）ポリオール成分は全組成物重量に対し、約１０〜
約４０重量％、好ましくは２０〜３０重量％の総濃度で
用いられることになる。

【００３４】特に断らない限り、記載されるすべての量
は全組成物重量に基づく重量パーセントである。

【００３５】適切な緩衝系はその水性溶液が最終トロン
ビン溶液のｐＨを約５．０〜約８．０（好ましいｐＨ域
は約５．５〜約６．５）に維持するものである。ホスフ
ェート緩衝剤を用いる場合には調製物の最終ｐＨを約６
．０〜約６．５とし、そしてアセテート緩衝剤を用いる
場合には最終ｐＨを約５．０とするのが特に好ましい。

【００３６】ｐＨ測定は、組合せ電極を用いた通常のｐ
Ｈメーターを用いて行われる。

【００３７】有用な緩衝系にはアセテート、ホスフェー
ト、スクシネート、バイカーボネート、イミダゾール、
ＴＲＩＳ、およびＮ．　Ｅ．　ＧｏｏｄおよびＳ．　Ｉ
ｚａｗａ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，
　２４，　Ｐａｒｔ　Ｂ，　５３（１９７２）；および
Ｗ．　Ｆ．　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，　Ｋ．　Ｉ．　Ｂｒａ
ｕｎｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，　Ｗ．　Ｒ．　Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇｅｒ，　Ｊ．　Ｒ．　Ｓｍｉｔｈ，　Ｊ．
　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，　Ｃ．　Ｃ．　Ｗａｓｍａｎｎ
，　Ｎ．　Ｐ．Ｊａｒｖｉｓ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｂｅｌｌ
，　およびＮ．　Ｅ．　Ｇｏｏｄ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ　１０４，　３００（１９８０）に記載され
ている双イオン性緩衝剤が包含される。これらの開示を
言及により本明細書の記載の一部に含める。

【００３８】本発明の緩衝系に用いるのに適した試薬に
はＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥ
ＰＥＳなどが包含される。カルシウムイオンが存在しな
い、またはＥＤＴＡが存在する場合にのみホスフェート
は使用すべきである。かかる試薬の混合物を用いること
ができる。混合緩衝剤を用いる場合、最終ｐＨは適切に
調節されるべきである。

【００３９】ホスフェートイオンおよびアセテートイオ
ンを含有する緩衝剤が好ましい。混合物を用いることも
できる。

【００４０】緩衝剤は緩衝溶液中に、水および／または
（一種または二種以上の）その他の適当な希釈液と共に
、約０．０１Ｍ〜約０．２Ｍ、好ましくは約０．０２５
Ｍ〜約０．１０Ｍの総濃度で存在することになる。

【００４１】様々な他の慣用の添加剤、例えば抗酸化剤
、着色剤、表面活性剤などを用いることもできる。任意
成分としてグルタチオンを用いてもよい。任意成分とし
てアミノ酸を用いてもよいが、それらの存在は、ポリオ
ールおよび緩衝剤成分の精製トロンビンに対する安定化
作用を妨害する程の量であってはならない。一般に、そ
れらは、存在するとしても０．５％以下の濃度でごく少
量で用いるのが好ましい。

【００４２】止　　　　血 現在単独で、あるいはトロンビン粉末または食塩水中の
トロンビンとの併用で用いられている止血物質、例えば
ＧＥＬＦＯＡＭＲ、ＳＵＲＧＩＣＥＬＲおよびＡＶＩＣ
ＥＬＲ、およびコラーゲンは、様々な方法を用いて、本
発明の安定化トロンビン組成物と共に有効に用いること
ができる。好ましくは、安定化溶液を止血剤上に吸収さ
せそしてそのパッドを凍結乾燥しそして滅菌的に包装す
る。

【００４３】特に、感染防止が重要な熱傷患者に用いる
ために、かかるパッドに抗微生物または抗生剤を取り込
むこともできる。

【００４４】本発明の凝血剤の調製に適した包帯の一つ
のタイプは米国特許第４，３６３，３１９号に記載され
ているところ、その開示を言及により本明細書の一部に
含める。

【００４５】以下は超高純度トロンビン溶液の調製を例
示したものである。

【００４６】

【実施例】Ａ．トロンボプラスチンの単離１００ｇの仔
牛肺を０．５％ポリソルベート８０を含む２００ｍｌの
２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中でホモ
ジナイズしそして２０分間、５℃、１２Ｋ　ＲＰＭで遠
心分離した。上清を集めそしてｐＨを１０％酢酸を用い
て５．７２に調節しそして冷蔵庫に１時間放置した。そ
の混合物を前述の如く２０分間遠心分離しそして上清を
集めた。１６０ｍｌの上清を２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．５）で飽和させたＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅＲカラム（３０×２０．５ｃｍ）にかけ、そして同
じ緩衝液を用いて溶出した。２３０滴の画分を集め（約
１３ｍｌ）そしてそれら画分の２８０ｎＭにおける光学
密度を測定した。

【００４７】

【表２】

【００４８】前記プールについて次のようにしてプロト
ロンビンをトロンビンに転化することによりトロンボプ
ラスチン活性をアッセイした： プロトロンビン　　　　　　　　　　　　１．０ｍｌ食
塩水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５
ｍｌプール画分　　　　　　　　　　　　　　　　０．
１ｍｌＣａＣｌ２（０．３Ｍ）　　１００μｌを混合し
、その混合物を２５℃で２５分間インキュベートし、５
℃、１３Ｋで１０分間遠心分離しそしてフィブロメータ
ーを用いてトロンビン血餅形成活性をアッセイした：

【００４９】

【表３】

【００５０】それら二つのプールは有意なトロンボプラ
スチン（プロトロンビン転化）活性を含んでいた。第一
プールを色が少ないためにプロトロンビンからトロンビ
ンへの転化に用いた。しかしながら第二プールも利用す
ることができた。

【００５１】Ｂ．超高純度トロンビンの単離転化混合物
の構成は次のとおりであった：プロトロンビン　　　　
　　　　　　　　　　　　　　９７ｍｌ食塩水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｍ
ｌＣａＣｌ２（０．３Ｍ）　　　　　　　　　　　　１
０ｍｌトロンボプラスチン（プール１）　　　　１５ｍ
ｌこれを２５℃で３０分間インキュベートしそして１３
Ｋ、５℃で２０分間遠心分離しそして上清を集めた。

【００５２】Ｃ．ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
クロマトグラフィー ０．０２％アジドナトリウム含有２５ｍＭ燐酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．５）でカラム（３０×２．５ｃｍ）
を平衡させた。アジドナトリウムを静菌剤として用いた
が、この剤は赤色ヘモグロビンの褐変を生じるのでトロ
ンボプラスチンの単離の際には使用できない。その他の
通常の静菌剤を代用できまたそれが好ましい。これらに
はフェノール類、置換フェノール、クロロブトベンジル
アルコール、ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニ
ウムクロライド、チメロサールおよび硝酸フェニル水銀
が包含される。

【００５３】１１５ｍｌの転化調製物をカラムにかけ、
そして０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液を
用いて溶出した。２３０滴の画分を集めそしてトロンビ
ン血餅活性をアッセイした。

【００５４】画分７〜４８は有意のトロンビン血餅形成
活性を示した。それらをプール（５１０ｍｌ）したとこ
ろ、その物質は濁った外観を呈した。プールされた物質
をプラスチック袋内に保ち、そして一夜凍結した。その
物質を融解し、１３Ｋで２０分間５℃で遠心分離しそし
て上清を集めた。

【００５５】Ｄ．ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロ
マトグラフィー ０．０２％アジドナトリウムおよび０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含有する２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６
．５）でカラム（３０×２．５ｃｍ）を平衡させた。

【００５６】ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム段階
からの先の上清４９３ｍｌをかけた。

【００５７】０．０２％アジドナトリウムおよび０．１
Ｍ塩化ナトリウムを含む２２５ｍｌの緩衝液、および０
．０２％アジドナトリウムおよび１．０Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む２２５ｍｌの緩衝液で構成される塩勾配を用い
てカラムを溶出した。画分を前述の如く集め、そしてフ
ィブロメーターを用いてトロンビン血餅形成活性をアッ
セイした。

【００５８】画分１５〜２１は有意な活性を含み、そし
てそれらをプールした（容量９０ｍｌ）。次にプールさ
れた物質のトロンビン活性をアッセイしたところ８２１
３Ｕ／ｍｌの血餅形成活性を示した。

【００５９】このプールされた画分について、更に、Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ法およびＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッ
セイキットを用いてタンパク質含量をアッセイした。こ
のプールされた物質は０．８２ｍｇ／ｍｌのタンパク質
を含有した。

【００６０】最終比活性＝８２１３／０．８２＝１００
１５Ｕ／ｍｇタンパク質。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例に示される如き０．１〜１．０Ｍ塩化ナ
トリウム溶液を用いたＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
溶出プロフィールとしてトロンビン精製を示すグラフで
ある。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　超高純度、澄明、無色トロンビン溶液
   。
2. 【請求項２】　　タンパク質１ｍｇあたり４０００〜１
   １，０００単位の比活性を有する超高純度、澄明、無色
   トロンビン溶液。
3. 【請求項３】　　改変ＮＩＨ法により測定した場合にタ
   ンパク質１ｍｇあたり４０００〜１１，０００単位の比
   活性を有する超高純度、澄明、無色トロンビン溶液。
4. 【請求項４】　　タンパク質１ｍｇあたり４０００〜１
   １，０００単位の比活性を有する請求項３記載のトロン
   ビン溶液。
5. 【請求項５】　　プロトロンビンを精製トロンボプラス
   チンと反応させ、そして生成トロンビンを遠心分離の後
   、その上清を陰イオン交換アガロースカラムを通して溶
   出し；所望の溶出液画分を凍結させ次いで約２５℃まで
   融解させ；遠心分離し、そしてその上清をホスフェート
   緩衝液中の０．１Ｍ〜１Ｍ塩化ナトリウム塩勾配を用い
   て陽イオン交換アガロースカラムを通して溶出させるこ
   とにより処理することによって調製された超高純度、澄
   明トロンビン溶液。
6. 【請求項６】　　改変ＮＩＨ法によって測定した場合に
   タンパク質１ｍｇあたり４０００〜１１，０００単位の
   比活性を有する請求項５記載のトロンビン溶液。
7. 【請求項７】　　タンパク質１ｍｇあたり４０００〜１
   １，０００単位の比活性を有する請求項６記載のトロン
   ビン溶液。
8. 【請求項８】（ａ）　　プロトロンビンを精製トロンボ
   プラスチンと反応させ；生成タンパク質懸濁液を遠心分
   離し； （ｂ）　　その上清を陰イオン交換アガロースカラムを
   通して溶出し；所望の溶出液画分を凍結させ、次いで約
   ２５℃まで融解させ； （ｃ）　　遠心分離し、そしてその上清をホスフェート
   緩衝液中の０．１Ｍ〜１Ｍ塩化ナトリウム塩勾配を用い
   て陽イオン交換アガロースカラムを通して溶出させるこ
   とにより成る超高純度、澄明トロンビン溶液の調製方法
   。
9. 【請求項９】　　精製トロンボプラスチンが（ａ）　　
   牛／仔牛肺組織を約０．５〜約１％の非イオン性界面活
   性剤を含有する２５ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ６．
   ５）と共にホモジナイズし；そしてその混合物を遠心分
   離し； （ｂ）　　その上清のｐＨを１０％酢酸で５．５に調節
   しそして遠心分離し； （ｃ）　　その上清を２５ｍＭホスフェート緩衝液を用
   いて陽イオン交換アガロースカラムを通して溶出させ；
   そして所望の画分を集めることにより調製される請求項
   ８記載の方法。
10. 【請求項１０】　　段階（ａ）が１０〜４０ｍＭ塩化カ
    ルシウム溶液中で約１０〜２５℃の温度で約１５〜４５
    分間行われる請求項８記載の方法。
11. 【請求項１１】　　段階（ｂ）の溶出が０．１Ｍ塩化ナ
    トリウム含有２５〜５０ｍＭホスフェート緩衝液を用い
    て行われる請求項８記載の方法。
12. 【請求項１２】　　段階（ｃ）の溶出が２５ｍＭホスフ
    ェート緩衝液中の０．１Ｍ〜１．０Ｍ塩化ナトリウムの
    塩勾配を用いて行われる請求項８記載の方法。
13. 【請求項１３】　　所望の画分を凍結させ、次いで約２
    ５°融解させ；遠心分離し、そしてその上清を集めるこ
    とにより更に澄明化する請求項９記載の方法。