JPH04320700A - アポリポプロテインｅ遺伝子タイプの検査方法及びその検査に好適なプライマー及びプローブ - Google Patents
アポリポプロテインｅ遺伝子タイプの検査方法及びその検査に好適なプライマー及びプローブInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアポリポプロテインＥ（
以下、「アポＥ」ともいう）遺伝子タイプの検査方法及
びその検査に好適に用いられるプライマー及びプローブ
に関する。
以下、「アポＥ」ともいう）遺伝子タイプの検査方法及
びその検査に好適に用いられるプライマー及びプローブ
に関する。
【０００２】
【従来の技術】アポＥには等電点電気泳動で分けられる
３つの主要な同位体Ｅ２、Ｅ３及びＥ４と、これらより
頻度の少ないＥ５やＥ７等幾つもの同位体が見出されて
おり、このアポＥの多様性は脂質代謝異常症と関連して
いる。すなわちＥ３が野生型であり、これをコードする
遺伝子ε３の頻度は約７０％である。そして前記アポＥ
の多様性はアポＥ遺伝子の１カ所あるいは２カ所の変異
に起因しており、脂質代謝異常の確定診断のために、こ
の多様性を簡便で正確に検査する方法が望まれている。 アポＥフェノタイプを検査する従来法としてはＶＬＤＬ
、又は血清を等電点電気泳動後蛋白染色する方法（Ｚａ
ｎｎｉｓ，Ｖ．Ｉ．，ａｎｄ Ｂｒｅｓｌｏｗ，Ｊ．Ｌ
．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０，１０３３−１０
４１ １９８１ 年）や、試料をシアリダーゼ処理して
から等電点電気泳動し、アポＥに対するマウス抗体、続
いて抗マウス抗体−パーオキシダーゼ複合体を作用させ
た後、パーオキシダーゼ活性より検査する方法（ＭｃＤ
ｏｗｅｌｌ，Ｉ．Ｆ．Ｗ．，Ｗｉｓｄｏｍ，Ｇ．Ｂ．，
ａｎｄ Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｅ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．３５，２０７０−２０７３ １９８９年、（以下、
ＭｃＤｏｗｅｌｌらの方法ともいう））がある。一方、
アポＥ遺伝子タイプを検査する方法としてはアポＥ遺伝
子の一部をＳａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．らによって報告された
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９ 巻
４８７−４９１頁、１９８８年、特開昭６１−２７４６
９７ 号、以下、ＰＣＲ法ともいう）で増幅後、対立遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（
Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ Ｋ．Ｈ．，Ｎｅｗｈｏｕｓｅ，
Ｙ．Ｍ．ａｎｄ Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．， Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１
５７．１２１２−１２１７ １９８８年、（以下、Ｗｅ
ｉｓｇｒａｂｅｒらの方法ともいう）、Ｅｍｉ．Ｍ．，
Ｗｕ，Ｌ．Ｌ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｍｙ
ｅｒｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｈｅｇｅｌｅ，Ｒ．Ａ．，Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｌａｌ
ｏｕｅｌ，Ｊ．−Ｍ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．３，３７３
−３７９ １９８８年、（以下、Ｅｍｉ らの方法とも
いう））やＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Ｈ
ｈａＩで切断し、電気泳動のパターンより検査する方法
（Ｈｉｘｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｖｅｒｎｉｅｒ，
Ｄ．Ｔ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３１，５４５−
５４８ １９９０ 年、（以下、Ｈｉｘｓｏｎらの方法
ともいう））がある。これらのアポＥ遺伝子タイプ検査
法はε２型及びε４型を検査する方法であり、これらが
正常であればε３型としている。る。
３つの主要な同位体Ｅ２、Ｅ３及びＥ４と、これらより
頻度の少ないＥ５やＥ７等幾つもの同位体が見出されて
おり、このアポＥの多様性は脂質代謝異常症と関連して
いる。すなわちＥ３が野生型であり、これをコードする
遺伝子ε３の頻度は約７０％である。そして前記アポＥ
の多様性はアポＥ遺伝子の１カ所あるいは２カ所の変異
に起因しており、脂質代謝異常の確定診断のために、こ
の多様性を簡便で正確に検査する方法が望まれている。 アポＥフェノタイプを検査する従来法としてはＶＬＤＬ
、又は血清を等電点電気泳動後蛋白染色する方法（Ｚａ
ｎｎｉｓ，Ｖ．Ｉ．，ａｎｄ Ｂｒｅｓｌｏｗ，Ｊ．Ｌ
．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０，１０３３−１０
４１ １９８１ 年）や、試料をシアリダーゼ処理して
から等電点電気泳動し、アポＥに対するマウス抗体、続
いて抗マウス抗体−パーオキシダーゼ複合体を作用させ
た後、パーオキシダーゼ活性より検査する方法（ＭｃＤ
ｏｗｅｌｌ，Ｉ．Ｆ．Ｗ．，Ｗｉｓｄｏｍ，Ｇ．Ｂ．，
ａｎｄ Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｅ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．３５，２０７０−２０７３ １９８９年、（以下、
ＭｃＤｏｗｅｌｌらの方法ともいう））がある。一方、
アポＥ遺伝子タイプを検査する方法としてはアポＥ遺伝
子の一部をＳａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．らによって報告された
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９ 巻
４８７−４９１頁、１９８８年、特開昭６１−２７４６
９７ 号、以下、ＰＣＲ法ともいう）で増幅後、対立遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（
Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ Ｋ．Ｈ．，Ｎｅｗｈｏｕｓｅ，
Ｙ．Ｍ．ａｎｄ Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．， Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１
５７．１２１２−１２１７ １９８８年、（以下、Ｗｅ
ｉｓｇｒａｂｅｒらの方法ともいう）、Ｅｍｉ．Ｍ．，
Ｗｕ，Ｌ．Ｌ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｍｙ
ｅｒｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｈｅｇｅｌｅ，Ｒ．Ａ．，Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｌａｌ
ｏｕｅｌ，Ｊ．−Ｍ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．３，３７３
−３７９ １９８８年、（以下、Ｅｍｉ らの方法とも
いう））やＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Ｈ
ｈａＩで切断し、電気泳動のパターンより検査する方法
（Ｈｉｘｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｖｅｒｎｉｅｒ，
Ｄ．Ｔ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３１，５４５−
５４８ １９９０ 年、（以下、Ｈｉｘｓｏｎらの方法
ともいう））がある。これらのアポＥ遺伝子タイプ検査
法はε２型及びε４型を検査する方法であり、これらが
正常であればε３型としている。る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前記の試料を等電点電
気泳動してから蛋白染色するフェノタイプ検査法ではア
ポＥと同じ領域に泳動される蛋白により妨害を受け易い
。またアポＥに特異的な抗体を用いるイムノブロット法
と等電点電気泳動とを組み合わせたフェノタイプ検査法
の場合でも、電気泳動するまえに十分にシアリダーゼ処
理し脱シアル化しないと、ホモタイプであっても数本の
バンドが検出される。またヘテロタイプの場合ではアポ
Ｅ同位体は等量には存在しない（Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｇ
．，Ｐｒｕｉｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，
Ａ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５，６３−７２ １
９７９年）ことや、試料を長期凍結保存すると変性して
しまうこともあり、正確にフェノタイプ検査を行なうこ
とは困難である。一方、従来の遺伝子タイプ検査法は前
記のようにＰＣＲ法を応用しているが、図１に示すよう
にアポＥ遺伝子は４つのエクソン（エクソン１〜４）と
それに挟まれた３つのイントロンからなる非常にＧＣ含
量の多い遺伝子である（Ｐａｉｋ．Ｙ．−Ｋ．，Ｃｈａ
ｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｄａｖｉ
ｅｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．，ａｎｄ Ｔ
ａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，３４４５−３４４９ １９８
５ 年）ため、ＰＣＲ法による大きなＤＮＡ断片の増幅
が困難である。よって前記のアポＥ遺伝子型検査法はい
ずれもアポＥ遺伝子のエクソン４の一部分である短いＤ
ＮＡ断片のみを増幅してε２型及びε４型のみを検査す
る方法であり、これらが正常であればε３型としている
が、ε５型やε７型を検査することはできない。例えば
、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら及びＨｉｘｓｏｎらの方法で
は日本人の場合約１％存在すると考えられているε５型
やε７型の変異部は増幅されておらず従って検査できな
い。また、Ｅｍｉらの方法ではε５型の変異部が増幅さ
れておらず検査できないし、ε７型を検査しようとする
場合はシークエンスが必要であり面倒である。さらに、
プローブを使用するＷｅｉｓｇｒａｂｅｒらやＥｍｉ
らの方法では、使用する複数のプローブごとに各々その
ハイブリダイゼーションや洗浄温度が異なるので、一度
にアポＥ遺伝子タイプを検査するには各プローブに適す
る温度の複数の恒温装置を使用する必要があり繁雑であ
る。従って本発明の課題は前記従来法のフェノタイプ法
や遺伝子タイプ法より簡便で正確なアポＥ同位体検査方
法を提供することにあり、さらに本発明のもう一つの課
題は上記検査方法において好適に用いられるプライマー
及びプローブを提供することにある。
気泳動してから蛋白染色するフェノタイプ検査法ではア
ポＥと同じ領域に泳動される蛋白により妨害を受け易い
。またアポＥに特異的な抗体を用いるイムノブロット法
と等電点電気泳動とを組み合わせたフェノタイプ検査法
の場合でも、電気泳動するまえに十分にシアリダーゼ処
理し脱シアル化しないと、ホモタイプであっても数本の
バンドが検出される。またヘテロタイプの場合ではアポ
Ｅ同位体は等量には存在しない（Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｇ
．，Ｐｒｕｉｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，
Ａ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５，６３−７２ １
９７９年）ことや、試料を長期凍結保存すると変性して
しまうこともあり、正確にフェノタイプ検査を行なうこ
とは困難である。一方、従来の遺伝子タイプ検査法は前
記のようにＰＣＲ法を応用しているが、図１に示すよう
にアポＥ遺伝子は４つのエクソン（エクソン１〜４）と
それに挟まれた３つのイントロンからなる非常にＧＣ含
量の多い遺伝子である（Ｐａｉｋ．Ｙ．−Ｋ．，Ｃｈａ
ｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｄａｖｉ
ｅｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．，ａｎｄ Ｔ
ａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，３４４５−３４４９ １９８
５ 年）ため、ＰＣＲ法による大きなＤＮＡ断片の増幅
が困難である。よって前記のアポＥ遺伝子型検査法はい
ずれもアポＥ遺伝子のエクソン４の一部分である短いＤ
ＮＡ断片のみを増幅してε２型及びε４型のみを検査す
る方法であり、これらが正常であればε３型としている
が、ε５型やε７型を検査することはできない。例えば
、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら及びＨｉｘｓｏｎらの方法で
は日本人の場合約１％存在すると考えられているε５型
やε７型の変異部は増幅されておらず従って検査できな
い。また、Ｅｍｉらの方法ではε５型の変異部が増幅さ
れておらず検査できないし、ε７型を検査しようとする
場合はシークエンスが必要であり面倒である。さらに、
プローブを使用するＷｅｉｓｇｒａｂｅｒらやＥｍｉ
らの方法では、使用する複数のプローブごとに各々その
ハイブリダイゼーションや洗浄温度が異なるので、一度
にアポＥ遺伝子タイプを検査するには各プローブに適す
る温度の複数の恒温装置を使用する必要があり繁雑であ
る。従って本発明の課題は前記従来法のフェノタイプ法
や遺伝子タイプ法より簡便で正確なアポＥ同位体検査方
法を提供することにあり、さらに本発明のもう一つの課
題は上記検査方法において好適に用いられるプライマー
及びプローブを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の請求項１〜３に記載のアポリポプロテインＥ遺伝子タ
イプの検査方法は、請求項１については、アポリポプロ
テインＥ遺伝子に相補的なプライマーであって、プラス
鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマーを有する少
なくとも２種のプライマーの組合せを、検査すべきＤＮ
Ａ試料に用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより
、アポリポプロテインＥ遺伝子のε２，ε４，ε５及び
ε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅され
たＤＮＡ断片に、標識された対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、ε２型、ε４型、ε５型
及びε７型を検査することを、請求項２については、ア
ポリポプロテインＥ遺伝子に相補的なプライマーであっ
て、プラス鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマー
を有する少なくとも２種のプライマーの組合せを検査す
べきＤＮＡ試料に用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うこ
とにより、アポリポプロテインＥ遺伝子のε５変異部位
を含むＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片
に、標識された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いて、ε５型を検査することを、請求項３に
ついては、アポリポプロテインＥ遺伝子に相補的なプラ
イマーであって、プラス鎖用プライマー及びマイナス鎖
用プライマーを有する少なくとも２種のプライマーの組
合せを、検査すべきＤＮＡ試料に用いてポリメラーゼ連
鎖反応を行うことにより、アポリポプロテインＥ遺伝子
のε２，ε４及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅
させ、該増幅されたＤＮＡ断片に、標識された対立遺伝
子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ε２型
、ε４型及びε７型を検査することを各々特徴とする。
の請求項１〜３に記載のアポリポプロテインＥ遺伝子タ
イプの検査方法は、請求項１については、アポリポプロ
テインＥ遺伝子に相補的なプライマーであって、プラス
鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマーを有する少
なくとも２種のプライマーの組合せを、検査すべきＤＮ
Ａ試料に用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより
、アポリポプロテインＥ遺伝子のε２，ε４，ε５及び
ε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅され
たＤＮＡ断片に、標識された対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、ε２型、ε４型、ε５型
及びε７型を検査することを、請求項２については、ア
ポリポプロテインＥ遺伝子に相補的なプライマーであっ
て、プラス鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマー
を有する少なくとも２種のプライマーの組合せを検査す
べきＤＮＡ試料に用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うこ
とにより、アポリポプロテインＥ遺伝子のε５変異部位
を含むＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片
に、標識された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いて、ε５型を検査することを、請求項３に
ついては、アポリポプロテインＥ遺伝子に相補的なプラ
イマーであって、プラス鎖用プライマー及びマイナス鎖
用プライマーを有する少なくとも２種のプライマーの組
合せを、検査すべきＤＮＡ試料に用いてポリメラーゼ連
鎖反応を行うことにより、アポリポプロテインＥ遺伝子
のε２，ε４及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅
させ、該増幅されたＤＮＡ断片に、標識された対立遺伝
子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ε２型
、ε４型及びε７型を検査することを各々特徴とする。
【０００５】ここでアポリポプロテインＥ遺伝子に相補
的なプライマーであって、プラス鎖用プライマー及びマ
イナス鎖用プライマーを有する少なくとも２種のプライ
マーの組合せとは、アポリポプロテインＥ遺伝子のプラ
ス鎖又はマイナス鎖の各々の特定の一部分に相補的な２
種の一本鎖ＤＮＡの組合せであり、特定の一部分とは増
幅するＤＮＡ断片の両端よりも各々上流部分又は下流部
分である。すなわち、プラス鎖用プライマーは増幅する
ＤＮＡ断片の上流の方の一端よりもさらに上流部分であ
るアポＥ遺伝子のマイナス鎖と相補的であり、一方マイ
ナス鎖用プライマーは増幅するＤＮＡ断片の下流の方の
一端よりもさらに下流部分のアポＥ遺伝子のプラス鎖と
相補的である。
的なプライマーであって、プラス鎖用プライマー及びマ
イナス鎖用プライマーを有する少なくとも２種のプライ
マーの組合せとは、アポリポプロテインＥ遺伝子のプラ
ス鎖又はマイナス鎖の各々の特定の一部分に相補的な２
種の一本鎖ＤＮＡの組合せであり、特定の一部分とは増
幅するＤＮＡ断片の両端よりも各々上流部分又は下流部
分である。すなわち、プラス鎖用プライマーは増幅する
ＤＮＡ断片の上流の方の一端よりもさらに上流部分であ
るアポＥ遺伝子のマイナス鎖と相補的であり、一方マイ
ナス鎖用プライマーは増幅するＤＮＡ断片の下流の方の
一端よりもさらに下流部分のアポＥ遺伝子のプラス鎖と
相補的である。
【０００６】例えば請求項１のアポリポプロテインＥ遺
伝子タイプの検査方法においては、ε２、ε４、ε５及
びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する。そして図
１に示すようにこれらの変異部位中、ε５が一番上流に
、ε７が一番下流に位置しているので、請求項１のアポ
リポプロテインＥ遺伝子タイプの検査方法においては、
前記２種のプライマーの組合せの内、プラス鎖用プライ
マーはアポＥ遺伝子のε５変異部位よりも上流部分のマ
イナス鎖と相補的であり、マイナス鎖用プライマーは、
ε７変異部位よりも下流部分のプラス鎖と相補的である
。そして請求項２のアポリポプロテインＥ遺伝子タイプ
の検査方法においては、ε５変異部位を含むＤＮＡ断片
を増幅するので、プラス鎖用プライマーはアポＥ遺伝子
のε５変異部位より上流部分のマイナス鎖と、マイナス
鎖用プライマーはε５変異部位より下流部分のプラス鎖
と各々相補的である。また請求項３のアポリポプロテイ
ンＥ遺伝子タイプの検査方法においては、ε２、ε４及
びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する。そして図
１に示すようにこれらの変異部位中、ε４が一番上流に
、ε７が一番下流に位置しているので請求項３の検査方
法においては、プラス鎖用プライマーはアポＥ遺伝子の
ε４変異部位よりも上流部分のマイナス鎖と相補的であ
り、マイナス鎖用プライマーはε７変異部位よりも下流
部分のプラス鎖と各々相補的である。なお前記プラス鎖
用プライマーとマイナス鎖用プライマーとが相補性を有
する場合にはプライマーのダイマーができ、目的とする
アポＥ特異的ＤＮＡ断片の増幅効率が悪くなるので、プ
ラス鎖用プライマーとマイナス鎖用プライマーとが相補
性を有していないことが望ましい。
伝子タイプの検査方法においては、ε２、ε４、ε５及
びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する。そして図
１に示すようにこれらの変異部位中、ε５が一番上流に
、ε７が一番下流に位置しているので、請求項１のアポ
リポプロテインＥ遺伝子タイプの検査方法においては、
前記２種のプライマーの組合せの内、プラス鎖用プライ
マーはアポＥ遺伝子のε５変異部位よりも上流部分のマ
イナス鎖と相補的であり、マイナス鎖用プライマーは、
ε７変異部位よりも下流部分のプラス鎖と相補的である
。そして請求項２のアポリポプロテインＥ遺伝子タイプ
の検査方法においては、ε５変異部位を含むＤＮＡ断片
を増幅するので、プラス鎖用プライマーはアポＥ遺伝子
のε５変異部位より上流部分のマイナス鎖と、マイナス
鎖用プライマーはε５変異部位より下流部分のプラス鎖
と各々相補的である。また請求項３のアポリポプロテイ
ンＥ遺伝子タイプの検査方法においては、ε２、ε４及
びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する。そして図
１に示すようにこれらの変異部位中、ε４が一番上流に
、ε７が一番下流に位置しているので請求項３の検査方
法においては、プラス鎖用プライマーはアポＥ遺伝子の
ε４変異部位よりも上流部分のマイナス鎖と相補的であ
り、マイナス鎖用プライマーはε７変異部位よりも下流
部分のプラス鎖と各々相補的である。なお前記プラス鎖
用プライマーとマイナス鎖用プライマーとが相補性を有
する場合にはプライマーのダイマーができ、目的とする
アポＥ特異的ＤＮＡ断片の増幅効率が悪くなるので、プ
ラス鎖用プライマーとマイナス鎖用プライマーとが相補
性を有していないことが望ましい。
【０００７】また検査すべきＤＮＡ試料とは、検査対象
のヒト血液から通常の方法で調製されるアポＥ遺伝子を
含む試料である。
のヒト血液から通常の方法で調製されるアポＥ遺伝子を
含む試料である。
【０００８】請求項１〜３の発明によると、ＰＣＲ法を
利用しているので、少量のＤＮＡ試料から、２種のプラ
イマーによって挟まれた部分のＤＮＡ断片のみが迅速か
つ簡便に増幅される。なおこのＰＣＲ法において用いる
ＤＮＡポリメラーゼとしてＤＮＡの解裂温度において耐
熱性であるポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ等を用いると該酵素の補充がほとんど必要とさ
れないのでＰＣＲ法をより迅速かつ簡便な方法となし得
る。このようにＰＣＲ法によって大量に増幅された特定
のＤＮＡ断片は、２種のプライマーに挟まれた部分であ
るから、請求項１ではε２、ε４、ε５及びε７変異部
位を含むＤＮＡ断片、請求項２ではε５変異部位を含む
ＤＮＡ断片、請求項３ではε２、ε４及びε７変異部位
を含むＤＮＡ断片が各々増幅される。
利用しているので、少量のＤＮＡ試料から、２種のプラ
イマーによって挟まれた部分のＤＮＡ断片のみが迅速か
つ簡便に増幅される。なおこのＰＣＲ法において用いる
ＤＮＡポリメラーゼとしてＤＮＡの解裂温度において耐
熱性であるポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ等を用いると該酵素の補充がほとんど必要とさ
れないのでＰＣＲ法をより迅速かつ簡便な方法となし得
る。このようにＰＣＲ法によって大量に増幅された特定
のＤＮＡ断片は、２種のプライマーに挟まれた部分であ
るから、請求項１ではε２、ε４、ε５及びε７変異部
位を含むＤＮＡ断片、請求項２ではε５変異部位を含む
ＤＮＡ断片、請求項３ではε２、ε４及びε７変異部位
を含むＤＮＡ断片が各々増幅される。
【０００９】そして各型（ε２、ε４、ε５、ε７）を
検査するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブとしては、検査する各型のアポＥ遺伝子の野生型
遺伝子のプラス鎖又はマイナス鎖とミスマッチをきたす
変異型プローブ及びアポＥ遺伝子の変異型遺伝子のプラ
ス鎖又はマイナス鎖とミスマッチをきたす野生型プロー
ブの２種類を用いる。ここでミスマッチをきたす塩基が
プローブの略中央に位置するような１１〜１９塩基の長
さのものがプローブとしてより適している。これらのプ
ローブの標識には通常の種々の方法を用いることができ
る。しかし、本発明方法においては、該プローブと反応
させるＤＮＡ断片がＰＣＲ法により大量に増幅されてい
るので、ＲＩ（放射性同位体）標識を用いる必要は特に
なく、ジゴキシゲニンやビオチンなどで標識されたデオ
キシヌクレオチド、例えばジゴキシゲニン−１１−ｄＵ
ＴＰで標識してもよい。
検査するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブとしては、検査する各型のアポＥ遺伝子の野生型
遺伝子のプラス鎖又はマイナス鎖とミスマッチをきたす
変異型プローブ及びアポＥ遺伝子の変異型遺伝子のプラ
ス鎖又はマイナス鎖とミスマッチをきたす野生型プロー
ブの２種類を用いる。ここでミスマッチをきたす塩基が
プローブの略中央に位置するような１１〜１９塩基の長
さのものがプローブとしてより適している。これらのプ
ローブの標識には通常の種々の方法を用いることができ
る。しかし、本発明方法においては、該プローブと反応
させるＤＮＡ断片がＰＣＲ法により大量に増幅されてい
るので、ＲＩ（放射性同位体）標識を用いる必要は特に
なく、ジゴキシゲニンやビオチンなどで標識されたデオ
キシヌクレオチド、例えばジゴキシゲニン−１１−ｄＵ
ＴＰで標識してもよい。
【００１０】請求項１の発明においてはε２、ε４、ε
５及びε７型を検査するので、これらの各々の野生型プ
ローブ及び変異型プローブを用いる。請求項２の発明に
おいてはε５型を検査するので、ε５型の野生型プロー
ブ及び変異型プローブを用いる。請求項３の発明におい
てはε２、ε４及びε７型を検査するので、ε２、ε４
及びε７型の各々の野生型プローブ及び変異型プローブ
を用いる。
５及びε７型を検査するので、これらの各々の野生型プ
ローブ及び変異型プローブを用いる。請求項２の発明に
おいてはε５型を検査するので、ε５型の野生型プロー
ブ及び変異型プローブを用いる。請求項３の発明におい
てはε２、ε４及びε７型を検査するので、ε２、ε４
及びε７型の各々の野生型プローブ及び変異型プローブ
を用いる。
【００１１】例えば請求項１の発明ではε２、ε４、ε
５及びε７型を検査するので、ε２、ε４、ε５及びε
７型の各々の野生型遺伝子のプラス鎖又はマイナス鎖と
各々ミスマッチをきたす４種の変異型プローブと、ε２
、ε４、ε５及びε７型の各々の変異型遺伝子のプラス
鎖又はマイナス鎖と各々ミスマッチをきたす４種の野生
型プローブの少なくとも計８種類のプローブを用いて検
査を行う。
５及びε７型を検査するので、ε２、ε４、ε５及びε
７型の各々の野生型遺伝子のプラス鎖又はマイナス鎖と
各々ミスマッチをきたす４種の変異型プローブと、ε２
、ε４、ε５及びε７型の各々の変異型遺伝子のプラス
鎖又はマイナス鎖と各々ミスマッチをきたす４種の野生
型プローブの少なくとも計８種類のプローブを用いて検
査を行う。
【００１２】この８種類のプローブの各々と増幅したε
２、ε４、ε５及びε７型変異部位を含むＤＮＡ断片と
をハイブリダイゼーションすると、例えば全ての野生型
プローブとのみ反応し、いずれの変異型プローブとも反
応しない場合には、検査されたＤＮＡは両親由来の遺伝
子が共にε３型（野生型）であることがわかる。そして
、全ての野生型プローブ及び１種の変異型プローブ（例
えばε４型）と反応した場合には、検査されたＤＮＡは
両親由来の遺伝子のうち一方がε３型であり、もう一方
の親由来の遺伝子が反応した変異型プローブの型（ε４
型）であることがわかる。また、全ての野生型プローブ
及び２種の変異型プローブと反応した場合（例えばε２
型及びε４型と反応）には、検査されたＤＮＡは両親由
来の遺伝子のうち一方が反応した変異型の１種の型であ
り（ε２型）、もう一方の親由来の遺伝子が反応したも
う１種の型（ε４型）であることがわかる。その他に１
つの野生型プローブ以外の全ての野生型プローブとは反
応し、反応しなかった野生型プローブに対する変異型プ
ローブ（例えばε４型）とも反応する場合には検査され
たＤＮＡは両親由来の遺伝子が共に反応した変異型プロ
ーブの型（ε４型）であることがわかる。
２、ε４、ε５及びε７型変異部位を含むＤＮＡ断片と
をハイブリダイゼーションすると、例えば全ての野生型
プローブとのみ反応し、いずれの変異型プローブとも反
応しない場合には、検査されたＤＮＡは両親由来の遺伝
子が共にε３型（野生型）であることがわかる。そして
、全ての野生型プローブ及び１種の変異型プローブ（例
えばε４型）と反応した場合には、検査されたＤＮＡは
両親由来の遺伝子のうち一方がε３型であり、もう一方
の親由来の遺伝子が反応した変異型プローブの型（ε４
型）であることがわかる。また、全ての野生型プローブ
及び２種の変異型プローブと反応した場合（例えばε２
型及びε４型と反応）には、検査されたＤＮＡは両親由
来の遺伝子のうち一方が反応した変異型の１種の型であ
り（ε２型）、もう一方の親由来の遺伝子が反応したも
う１種の型（ε４型）であることがわかる。その他に１
つの野生型プローブ以外の全ての野生型プローブとは反
応し、反応しなかった野生型プローブに対する変異型プ
ローブ（例えばε４型）とも反応する場合には検査され
たＤＮＡは両親由来の遺伝子が共に反応した変異型プロ
ーブの型（ε４型）であることがわかる。
【００１３】請求項２のアポリポプロテインＥ遺伝子タ
イプの検査方法においては、ε５型の野生型プローブと
のみ反応した場合にはε５型ではないことがわかり、ε
５型の野生型及び変異型プローブの両者と反応した場合
には少なくとも両親由来の遺伝子のうちの一方がε５型
であることがわかる。ε５型の変異型プローブとのみ反
応した場合には両親由来の遺伝子が共にε５型であるこ
とがわかる。
イプの検査方法においては、ε５型の野生型プローブと
のみ反応した場合にはε５型ではないことがわかり、ε
５型の野生型及び変異型プローブの両者と反応した場合
には少なくとも両親由来の遺伝子のうちの一方がε５型
であることがわかる。ε５型の変異型プローブとのみ反
応した場合には両親由来の遺伝子が共にε５型であるこ
とがわかる。
【００１４】請求項３のアポリポプロテインＥ遺伝子タ
イプの検査方法においては、全ての野生型プローブと反
応し、いずれの変異型プローブとも反応しない場合には
、ε５型については検査されていないもののε５型は１
％とごく少ないため、一応ε３型と類推される。そして
これ以外の遺伝子タイプは請求項１の発明と同様に検査
される。
イプの検査方法においては、全ての野生型プローブと反
応し、いずれの変異型プローブとも反応しない場合には
、ε５型については検査されていないもののε５型は１
％とごく少ないため、一応ε３型と類推される。そして
これ以外の遺伝子タイプは請求項１の発明と同様に検査
される。
【００１５】前記プライマーとしては、例えば請求項４
の発明である、配列番号１，２，３又は４の塩基配列又
はこれらと同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子
に対して有する塩基配列であるプライマーがある。ここ
で同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して
有する塩基配列とは、アポリポプロテインＥ遺伝子との
相補性を妨げない限度で塩基の欠失、挿入あるいは置換
等による変異が生じている塩基配列を意味し、以下の本
明細書中、同意である。
の発明である、配列番号１，２，３又は４の塩基配列又
はこれらと同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子
に対して有する塩基配列であるプライマーがある。ここ
で同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して
有する塩基配列とは、アポリポプロテインＥ遺伝子との
相補性を妨げない限度で塩基の欠失、挿入あるいは置換
等による変異が生じている塩基配列を意味し、以下の本
明細書中、同意である。
【００１６】配列番号１〜４のプライマーが相補性を有
している部分のアポＥ遺伝子の塩基配列番号（前記文献
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８
２，３４４５−３４４９ １９８５年のＦｉｇ．３．参
照）（以下、これをヌクレオチド番号という。）は、配
列番号１のプライマーは５’−２８０２ 〜２８２３−
３’ 、配列番号２のプライマーは５’−３６１８ 〜
３６３９−３’ 、配列番号３のプライマーは３’−２
９５８ 〜２９７９−５’ 、配列番号４のプライマー
は３’−４２２０ 〜４２４１−５’ であり、配列番
号１および２のプライマーはプラス鎖用であり、配列番
号３及び４のプライマーはマイナス鎖用である。
している部分のアポＥ遺伝子の塩基配列番号（前記文献
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８
２，３４４５−３４４９ １９８５年のＦｉｇ．３．参
照）（以下、これをヌクレオチド番号という。）は、配
列番号１のプライマーは５’−２８０２ 〜２８２３−
３’ 、配列番号２のプライマーは５’−３６１８ 〜
３６３９−３’ 、配列番号３のプライマーは３’−２
９５８ 〜２９７９−５’ 、配列番号４のプライマー
は３’−４２２０ 〜４２４１−５’ であり、配列番
号１および２のプライマーはプラス鎖用であり、配列番
号３及び４のプライマーはマイナス鎖用である。
【００１７】請求項１〜３の発明において、請求項４の
プライマーの内の一部を使用するアポリポプロテインＥ
遺伝子タイプの検査方法は、各々請求項５〜７の発明で
あり、請求項５の発明は、請求項１に記載の方法におい
て、プラス鎖用プライマーが配列番号１の塩基配列であ
るか又は該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテイ
ンＥ遺伝子に対して有する塩基配列であり、かつマイナ
ス鎖用プライマーが配列番号４の塩基配列であるか又は
該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝
子に対して有する塩基配列であることを、請求項６の発
明は、請求項２に記載の方法において、プラス鎖用プラ
イマーが配列番号１の塩基配列であるか又は該塩基配列
と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して
有する塩基配列であり、かつマイナス鎖用プライマーが
配列番号３の塩基配列であるか又は該塩基配列と同等の
相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して有する塩
基配列であることを、請求項７の発明は、請求項３に記
載の方法において、プラス鎖用プライマーが配列番号２
の塩基配列であるか又は該塩基配列と同等の相補性をア
ポリポプロテインＥ遺伝子に対して有する塩基配列であ
り、かつマイナス鎖用プライマーが配列番号４の塩基配
列であるか又は該塩基配列と同等の相補性をアポリポプ
ロテインＥ遺伝子に対して有する塩基配列であることを
各々特徴とする。
プライマーの内の一部を使用するアポリポプロテインＥ
遺伝子タイプの検査方法は、各々請求項５〜７の発明で
あり、請求項５の発明は、請求項１に記載の方法におい
て、プラス鎖用プライマーが配列番号１の塩基配列であ
るか又は該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテイ
ンＥ遺伝子に対して有する塩基配列であり、かつマイナ
ス鎖用プライマーが配列番号４の塩基配列であるか又は
該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝
子に対して有する塩基配列であることを、請求項６の発
明は、請求項２に記載の方法において、プラス鎖用プラ
イマーが配列番号１の塩基配列であるか又は該塩基配列
と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して
有する塩基配列であり、かつマイナス鎖用プライマーが
配列番号３の塩基配列であるか又は該塩基配列と同等の
相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して有する塩
基配列であることを、請求項７の発明は、請求項３に記
載の方法において、プラス鎖用プライマーが配列番号２
の塩基配列であるか又は該塩基配列と同等の相補性をア
ポリポプロテインＥ遺伝子に対して有する塩基配列であ
り、かつマイナス鎖用プライマーが配列番号４の塩基配
列であるか又は該塩基配列と同等の相補性をアポリポプ
ロテインＥ遺伝子に対して有する塩基配列であることを
各々特徴とする。
【００１８】請求項５の発明においては図１に示される
ように配列番号１のプライマーと配列番号４のプライマ
ーに挟まれたＤＮＡ断片中にε２、ε４、ε５及びε７
変異部位が存在するので、ＰＣＲ法によりこれらの変異
部位を含むＤＮＡ断片が増幅される。同様に請求項６の
発明においては図１に示されるように配列番号１のプラ
イマーと配列番号３のプライマーに挟まれたＤＮＡ断片
中にε５変異部位が存在するので、ＰＣＲ法によりε５
変異部位を含むＤＮＡ断片が増幅され、請求項７の発明
においては図１に示されるように配列番号２のプライマ
ーと配列番号４のプライマーに挟まれたＤＮＡ断片中に
ε２、ε４及びε７変異部位が存在するので、ＰＣＲ法
によりこれらの変異部位を含むＤＮＡ断片が増幅される
。
ように配列番号１のプライマーと配列番号４のプライマ
ーに挟まれたＤＮＡ断片中にε２、ε４、ε５及びε７
変異部位が存在するので、ＰＣＲ法によりこれらの変異
部位を含むＤＮＡ断片が増幅される。同様に請求項６の
発明においては図１に示されるように配列番号１のプラ
イマーと配列番号３のプライマーに挟まれたＤＮＡ断片
中にε５変異部位が存在するので、ＰＣＲ法によりε５
変異部位を含むＤＮＡ断片が増幅され、請求項７の発明
においては図１に示されるように配列番号２のプライマ
ーと配列番号４のプライマーに挟まれたＤＮＡ断片中に
ε２、ε４及びε７変異部位が存在するので、ＰＣＲ法
によりこれらの変異部位を含むＤＮＡ断片が増幅される
。
【００１９】前記対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
プローブとしては、例えば請求項８の発明である、配列
番号５〜２０の塩基配列であるか又は該塩基配列と同等
の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して有する
塩基配列であるプローブがある。
プローブとしては、例えば請求項８の発明である、配列
番号５〜２０の塩基配列であるか又は該塩基配列と同等
の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対して有する
塩基配列であるプローブがある。
【００２０】ここで配列番号５〜１２のプローブはアポ
Ｅ遺伝子のプラス鎖と相補的なプローブであり、配列番
号１３〜２０のプローブはアポＥ遺伝子のマイナス鎖と
相補的なプローブである。ここで配列番号５、６、１３
及び１４のプローブの前記ヌクレオチド番号は３８７７
〜３８８９であり、ヌクレオチド番号３８８３の塩基が
ミスマッチをきたす塩基であり、該塩基が配列番号５で
はＧ、配列番号６ではＡ、配列番号１３ではＣ、配列番
号１４ではＴである。そして配列番号５及び１３はε２
野生型プローブであり、配列番号６及び１４はε２変異
型プローブである。ここでε２変異型のプローブとはア
ポＥ遺伝子ε２の野生型とミスマッチをきたすものであ
り、一方ε２野生型のプローブとはアポＥ遺伝子ε２の
変異型とミスマッチをきたすものであり、以下同様であ
る。
Ｅ遺伝子のプラス鎖と相補的なプローブであり、配列番
号１３〜２０のプローブはアポＥ遺伝子のマイナス鎖と
相補的なプローブである。ここで配列番号５、６、１３
及び１４のプローブの前記ヌクレオチド番号は３８７７
〜３８８９であり、ヌクレオチド番号３８８３の塩基が
ミスマッチをきたす塩基であり、該塩基が配列番号５で
はＧ、配列番号６ではＡ、配列番号１３ではＣ、配列番
号１４ではＴである。そして配列番号５及び１３はε２
野生型プローブであり、配列番号６及び１４はε２変異
型プローブである。ここでε２変異型のプローブとはア
ポＥ遺伝子ε２の野生型とミスマッチをきたすものであ
り、一方ε２野生型のプローブとはアポＥ遺伝子ε２の
変異型とミスマッチをきたすものであり、以下同様であ
る。
【００２１】また配列番号７、８、１５及び１６のプロ
ーブは前記ヌクレオチド番号が３７３９〜３７５１であ
り、ヌクレオチド番号３７４５の塩基がミスマッチをき
たす塩基であり、該塩基が配列番号７ではＡ、配列番号
８ではＧ、配列番号１５ではＴ、配列番号１６ではＣで
ある。そして配列番号７及び１５はε４野生型プローブ
であり、配列番号８及び１６はε４変異型プローブであ
る。
ーブは前記ヌクレオチド番号が３７３９〜３７５１であ
り、ヌクレオチド番号３７４５の塩基がミスマッチをき
たす塩基であり、該塩基が配列番号７ではＡ、配列番号
８ではＧ、配列番号１５ではＴ、配列番号１６ではＣで
ある。そして配列番号７及び１５はε４野生型プローブ
であり、配列番号８及び１６はε４変異型プローブであ
る。
【００２２】そして配列番号９、１０、１７及び１８の
プローブは前記ヌクレオチド番号が２８２９〜２８４３
であり、ヌクレオチド番号２８３６の塩基がミスマッチ
をきたす塩基であり、該塩基が配列番号９ではＣ、配列
番号１０ではＴ、配列番号１７ではＧ、配列番号１８で
はＡである。 そして配列番号９及び１７はε５野生型プローブであり
、配列番号１０及び１８はε５変異型プローブであり、
配列番号１１、１２、１９及び２０のプローブは前記ヌ
クレオチド番号が４１３６〜４１４９であり、ヌクレオ
チド番号４１４１及び４１４４の塩基がミスマッチをき
たす塩基であり、該塩基が配列番号１１ではＣ、配列番
号１２ではＴ、配列番号１９ではＧ、配列番号２０では
Ａである。 そして配列番号１１及び１９はε７野生型プローブであ
り、配列番号１２及び２０はε７変異型プローブである
。
プローブは前記ヌクレオチド番号が２８２９〜２８４３
であり、ヌクレオチド番号２８３６の塩基がミスマッチ
をきたす塩基であり、該塩基が配列番号９ではＣ、配列
番号１０ではＴ、配列番号１７ではＧ、配列番号１８で
はＡである。 そして配列番号９及び１７はε５野生型プローブであり
、配列番号１０及び１８はε５変異型プローブであり、
配列番号１１、１２、１９及び２０のプローブは前記ヌ
クレオチド番号が４１３６〜４１４９であり、ヌクレオ
チド番号４１４１及び４１４４の塩基がミスマッチをき
たす塩基であり、該塩基が配列番号１１ではＣ、配列番
号１２ではＴ、配列番号１９ではＧ、配列番号２０では
Ａである。 そして配列番号１１及び１９はε７野生型プローブであ
り、配列番号１２及び２０はε７変異型プローブである
。
【００２３】請求項８のプローブは１３〜１５塩基の長
さであるため、ハイブリダイゼーション及び洗浄を３７
℃で行なうことができる。
さであるため、ハイブリダイゼーション及び洗浄を３７
℃で行なうことができる。
【００２４】請求項１〜３又は５〜７の発明において、
請求項８のプローブ内の一部を使用するアポリポプロテ
インＥ遺伝子タイプの検査方法は、請求項９の発明であ
り、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが請
求項８に記載のプローブから選ばれたものであることを
特徴とする。
請求項８のプローブ内の一部を使用するアポリポプロテ
インＥ遺伝子タイプの検査方法は、請求項９の発明であ
り、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが請
求項８に記載のプローブから選ばれたものであることを
特徴とする。
【００２５】ここでε２、ε４、ε５及びε７型を検査
する請求項１及び５のアポリポプロテインＥ遺伝子タイ
プの検査方法においては、使用するプローブは請求項８
のプローブの内から選ばれたε２、ε４、ε５及びε７
型の野生型及び変異型プローブである。
する請求項１及び５のアポリポプロテインＥ遺伝子タイ
プの検査方法においては、使用するプローブは請求項８
のプローブの内から選ばれたε２、ε４、ε５及びε７
型の野生型及び変異型プローブである。
【００２６】そして請求項２及び６のアポリポプロテイ
ンＥ遺伝子タイプの検査方法においては、ε５型を検査
するので、使用するプローブは請求項８のプローブの内
から選ばれたε５型の野生型及び変異型プローブであり
、請求項３及び７のアポリポプロテインＥ遺伝子タイプ
の検査方法においてはε２、ε４及びε７型を検査する
ので、使用するプローブは請求項８のプローブの内から
選ばれたε２、ε４及びε７型の野生型及び変異型プロ
ーブである。
ンＥ遺伝子タイプの検査方法においては、ε５型を検査
するので、使用するプローブは請求項８のプローブの内
から選ばれたε５型の野生型及び変異型プローブであり
、請求項３及び７のアポリポプロテインＥ遺伝子タイプ
の検査方法においてはε２、ε４及びε７型を検査する
ので、使用するプローブは請求項８のプローブの内から
選ばれたε２、ε４及びε７型の野生型及び変異型プロ
ーブである。
【００２７】そして、使用するプローブはアポＥ遺伝子
のプラス鎖と相補的なもの、又はマイナス鎖と相補的な
もの、いずれでも良く、例えば請求項１及び５のアポリ
ポプロテインＥ遺伝子タイプの検査方法においては、配
列番号５〜１２のプローブを使用してもよいし、配列番
号１３〜２０のプローブを使用してもよく、配列番号５
、１４、７、１６、９、１８、１１及び２０を使用して
もよいし、配列番号５〜２０のプローブを各ハイブリダ
イゼーション溶液ごとに１種ずつ使用してもよい。
のプラス鎖と相補的なもの、又はマイナス鎖と相補的な
もの、いずれでも良く、例えば請求項１及び５のアポリ
ポプロテインＥ遺伝子タイプの検査方法においては、配
列番号５〜１２のプローブを使用してもよいし、配列番
号１３〜２０のプローブを使用してもよく、配列番号５
、１４、７、１６、９、１８、１１及び２０を使用して
もよいし、配列番号５〜２０のプローブを各ハイブリダ
イゼーション溶液ごとに１種ずつ使用してもよい。
【００２８】請求項１０のアポリポプロテインＥ遺伝子
タイプの検査方法は、請求項１〜３又は５〜７又は９の
内のいずれか１つに記載の方法において、ポリメラーゼ
連鎖反応が非対称ポリメラーゼ連鎖反応であり、該反応
においてより多く用いたプライマーがプラス鎖用プライ
マーである場合にはプラス鎖に相補的なプローブを用い
、一方、該反応においてより多く用いたプライマーがマ
イナス鎖用プライマーである場合にはマイナス鎖に相補
的なプローブを用いることにより、ハイブリダイゼーシ
ョンにおける変性及び中和工程を省略することを特徴と
する。
タイプの検査方法は、請求項１〜３又は５〜７又は９の
内のいずれか１つに記載の方法において、ポリメラーゼ
連鎖反応が非対称ポリメラーゼ連鎖反応であり、該反応
においてより多く用いたプライマーがプラス鎖用プライ
マーである場合にはプラス鎖に相補的なプローブを用い
、一方、該反応においてより多く用いたプライマーがマ
イナス鎖用プライマーである場合にはマイナス鎖に相補
的なプローブを用いることにより、ハイブリダイゼーシ
ョンにおける変性及び中和工程を省略することを特徴と
する。
【００２９】ここで非対称ポリメラーゼ連鎖反応（以下
ＡＰＣＲ法という）とはポリメラーゼ連鎖反応において
プラス鎖用又はマイナス鎖用プライマーのいずれか一方
のプライマーを他方のプライマーに対して５０〜２００
倍量使用する反応をいう（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ，Ｕ．
Ｂ．ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，７６５２−７
６５６，１９８８ 年）。このＡＰＣＲ法においては例
えばプラス鎖用プライマーをマイナス鎖用プライマーに
比べて大量に使用した場合にはプラス鎖がマイナス鎖に
比べて大量に合成されることになる。
ＡＰＣＲ法という）とはポリメラーゼ連鎖反応において
プラス鎖用又はマイナス鎖用プライマーのいずれか一方
のプライマーを他方のプライマーに対して５０〜２００
倍量使用する反応をいう（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ，Ｕ．
Ｂ．ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，７６５２−７
６５６，１９８８ 年）。このＡＰＣＲ法においては例
えばプラス鎖用プライマーをマイナス鎖用プライマーに
比べて大量に使用した場合にはプラス鎖がマイナス鎖に
比べて大量に合成されることになる。
【００３０】従ってこの増幅されたプラス鎖からなる一
本鎖ＤＮＡと相補的なプローブを使用することによりハ
イブリダイゼーションにおけるＤＮＡの変性工程及び中
和工程を省略した場合にもアポリポプロテインＥ遺伝子
タイプを検査することが可能である。同様にマイナス鎖
用プライマーを大量に使用した場合にはマイナス鎖から
なる一本鎖ＤＮＡと相補的なプローブを使用することに
よりハイブリダイゼーションにおけるＤＮＡの変性工程
及び中和工程を省略してアポＥ遺伝子タイプを検査する
ことができる。
本鎖ＤＮＡと相補的なプローブを使用することによりハ
イブリダイゼーションにおけるＤＮＡの変性工程及び中
和工程を省略した場合にもアポリポプロテインＥ遺伝子
タイプを検査することが可能である。同様にマイナス鎖
用プライマーを大量に使用した場合にはマイナス鎖から
なる一本鎖ＤＮＡと相補的なプローブを使用することに
よりハイブリダイゼーションにおけるＤＮＡの変性工程
及び中和工程を省略してアポＥ遺伝子タイプを検査する
ことができる。
【００３１】すなわち請求項１の発明においてプラス鎖
用プライマーを大量に使用した場合及び請求項５の発明
において配列番号１のプライマーを大量に使用した場合
には、プラス鎖と相補的なプローブを用い、請求項８の
プローブを使用する請求項９の発明では配列番号５〜１
２のプローブを用いる。
用プライマーを大量に使用した場合及び請求項５の発明
において配列番号１のプライマーを大量に使用した場合
には、プラス鎖と相補的なプローブを用い、請求項８の
プローブを使用する請求項９の発明では配列番号５〜１
２のプローブを用いる。
【００３２】一方、請求項１の発明においてマイナス鎖
用プライマーを大量に使用した場合及び請求項５の発明
において配列番号４のプライマーを大量に使用した場合
には、マイナス鎖と相補的なプローブを用い、請求項８
のプローブを使用する請求項９の発明では配列番号１３
〜２０のプローブを用いる。
用プライマーを大量に使用した場合及び請求項５の発明
において配列番号４のプライマーを大量に使用した場合
には、マイナス鎖と相補的なプローブを用い、請求項８
のプローブを使用する請求項９の発明では配列番号１３
〜２０のプローブを用いる。
【００３３】また、プローブをプラス鎖又はマイナス鎖
と相補的なもののいずれか一種に統一すると、プローブ
によっては安定性が高いＧ−Ｔミスマッチを識別しなけ
ればならない場合が生じる。そこでこのような場合には
Ｇ−Ｔミスマッチを識別しなければならないプローブが
野生型の場合には同じ遺伝子型の（例えばε２に対して
はε２の）変異型のプローブを、又はＧ−Ｔミスマッチ
を識別しなければならいプローブが変異型の場合には同
じ遺伝子型の野生型のプローブを、標識せずにハイブリ
ダイゼーションに共に使用して明白に識別できるように
すると良い。例えばε４型の変異型による配列番号８の
プローブを標識して用いる場合には標識していないε４
型の野生型である配列番号７のプローブを適量加えてハ
イブリダイゼーションを行なう。なお、プローブを一種
の鎖に統一しない場合にも、Ｇ−Ｔミスマッチを識別し
なければならないプローブについては前記と同様の操作
を行ない、より明白に識別できるようにすることができ
る。
と相補的なもののいずれか一種に統一すると、プローブ
によっては安定性が高いＧ−Ｔミスマッチを識別しなけ
ればならない場合が生じる。そこでこのような場合には
Ｇ−Ｔミスマッチを識別しなければならないプローブが
野生型の場合には同じ遺伝子型の（例えばε２に対して
はε２の）変異型のプローブを、又はＧ−Ｔミスマッチ
を識別しなければならいプローブが変異型の場合には同
じ遺伝子型の野生型のプローブを、標識せずにハイブリ
ダイゼーションに共に使用して明白に識別できるように
すると良い。例えばε４型の変異型による配列番号８の
プローブを標識して用いる場合には標識していないε４
型の野生型である配列番号７のプローブを適量加えてハ
イブリダイゼーションを行なう。なお、プローブを一種
の鎖に統一しない場合にも、Ｇ−Ｔミスマッチを識別し
なければならないプローブについては前記と同様の操作
を行ない、より明白に識別できるようにすることができ
る。
【００３４】
【実施例】次に本発明の具体的実施例に先立って本実施
例にて使用する請求項４に記載のプライマーの作成につ
いて説明する。
例にて使用する請求項４に記載のプライマーの作成につ
いて説明する。
【００３５】Ａ．請求項４に記載のプライマーの選定と
合成既知のアポＥ遺伝子の塩基配列（Ｐａｉｋ，Ｙ．−
Ｋ．，Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｃ．Ａ
．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．
ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，３４４５−３４４
９ １９８５年）より特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーを以下の方法で選定した。 （１） ε２，ε４、ε５及びε７変異部位を含む
ＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーの組合せの選定
プラス鎖用プライマーはε５変異部位より上流部分から
、マイナス鎖用プライマーはε７変異部位より下流部分
から各々特異的増幅を阻害するおそれのある繰返し配列
、類似配列、パリンドローム構造をコンピュータで検索
して除く方法により、プラス鎖用プライマーとしては配
列番号１のオリゴヌクレオチドを、マイナス鎖用プライ
マーとしては配列番号４のオリゴヌクレオチドをそれぞ
れ選定した。このプライマーの組合せをＡ−１とする。
合成既知のアポＥ遺伝子の塩基配列（Ｐａｉｋ，Ｙ．−
Ｋ．，Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｃ．Ａ
．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．
ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，３４４５−３４４
９ １９８５年）より特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーを以下の方法で選定した。 （１） ε２，ε４、ε５及びε７変異部位を含む
ＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーの組合せの選定
プラス鎖用プライマーはε５変異部位より上流部分から
、マイナス鎖用プライマーはε７変異部位より下流部分
から各々特異的増幅を阻害するおそれのある繰返し配列
、類似配列、パリンドローム構造をコンピュータで検索
して除く方法により、プラス鎖用プライマーとしては配
列番号１のオリゴヌクレオチドを、マイナス鎖用プライ
マーとしては配列番号４のオリゴヌクレオチドをそれぞ
れ選定した。このプライマーの組合せをＡ−１とする。
【００３６】（２） ε５変異部位を含むＤＮＡ断
片を増幅するためのプライマーの組合せの選定プラス鎖
用プライマーはε５変異部位より上流部分から、マイナ
ス鎖用プライマーはε５変異部位より下流部分から、各
々特異的増幅を阻害するおそれのある繰返し配列、類似
配列、パリンドローム構造をコンピュータで検索して除
く方法により、プラス鎖用プライマーとしては配列番号
１のオリゴヌクレオチドを、マイナス鎖用プライマーと
しては配列番号３のオリゴヌクレオチドをそれぞれ選定
した。このプライマーの組合せをＡ−２とする。
片を増幅するためのプライマーの組合せの選定プラス鎖
用プライマーはε５変異部位より上流部分から、マイナ
ス鎖用プライマーはε５変異部位より下流部分から、各
々特異的増幅を阻害するおそれのある繰返し配列、類似
配列、パリンドローム構造をコンピュータで検索して除
く方法により、プラス鎖用プライマーとしては配列番号
１のオリゴヌクレオチドを、マイナス鎖用プライマーと
しては配列番号３のオリゴヌクレオチドをそれぞれ選定
した。このプライマーの組合せをＡ−２とする。
【００３７】（３） ε２、ε４及びε７変異部位を含
むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーの組合せの選
定プラス鎖用プライマーはε４変異部位より上流部分か
ら、マイナス鎖用プライマーはε７変異部位より下流部
分から、各々特異的増幅を阻害するおそれのある繰返し
配列、類似配列、パリンドローム構造をコンピュータで
検索して除く方法により、プラス鎖用プライマーとして
は配列番号２のオリゴヌクレオチドを、マイナス鎖用プ
ライマーとしては配列番号４のオリゴヌクレオチドをそ
れぞれ選定した。このプライマーの組合せをＡ−３とす
る。以上の方法で選定した各プライマーをＤＮＡ合成機
（スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ 社製
Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌｕｓ）で合成
し、陰イオン交換体ＭｏｎｏＱ （スウェーデン国、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ 社製）を用いて液体クロマトグラフ
ィーＦＰＬＣ（スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社製）で精製した。
むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーの組合せの選
定プラス鎖用プライマーはε４変異部位より上流部分か
ら、マイナス鎖用プライマーはε７変異部位より下流部
分から、各々特異的増幅を阻害するおそれのある繰返し
配列、類似配列、パリンドローム構造をコンピュータで
検索して除く方法により、プラス鎖用プライマーとして
は配列番号２のオリゴヌクレオチドを、マイナス鎖用プ
ライマーとしては配列番号４のオリゴヌクレオチドをそ
れぞれ選定した。このプライマーの組合せをＡ−３とす
る。以上の方法で選定した各プライマーをＤＮＡ合成機
（スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ 社製
Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌｕｓ）で合成
し、陰イオン交換体ＭｏｎｏＱ （スウェーデン国、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ 社製）を用いて液体クロマトグラフ
ィーＦＰＬＣ（スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社製）で精製した。
【００３８】Ｂ．選定したプライマーがアポＥ遺伝子に
対して特異的であることを確認するための実験ヒトには
ハプロイド当り約３×１０９ 塩基対のＤＮＡが存在し
ているが塩基配列が解明されているのは一部だけである
。従って上記方法によって理論的に選定されたプライマ
ーが、いまだ解明されていない部分の塩基配列ともアニ
ーリングするものであれば、アポＥ遺伝子を含むＤＮＡ
断片以外の部分も増幅してしまうことになり、このよう
なプライマーは特異的とは言えない。そこで選定した各
々のオリゴヌクレオチドプライマーの組合せ（Ａ−１，
Ａ−２，Ａ−３）によってアポＥ遺伝子の特異的部分の
みが増幅されることを確認するために以下の実験を行っ
た。
対して特異的であることを確認するための実験ヒトには
ハプロイド当り約３×１０９ 塩基対のＤＮＡが存在し
ているが塩基配列が解明されているのは一部だけである
。従って上記方法によって理論的に選定されたプライマ
ーが、いまだ解明されていない部分の塩基配列ともアニ
ーリングするものであれば、アポＥ遺伝子を含むＤＮＡ
断片以外の部分も増幅してしまうことになり、このよう
なプライマーは特異的とは言えない。そこで選定した各
々のオリゴヌクレオチドプライマーの組合せ（Ａ−１，
Ａ−２，Ａ−３）によってアポＥ遺伝子の特異的部分の
みが増幅されることを確認するために以下の実験を行っ
た。
【００３９】（１） ＤＮＡ試料の調製前記ＭｃＤｏｗ
ｅｌｌらの方法により調べたアポＥフェノタイプが母親
及び父親由来の遺伝子が両方とも３型であるヒトの血液
を３０００ｒｐｍ で１５分間遠心分離して血清を除去
し、血球を得た。この血球約５００μｌに５００μｌの
緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５
ｍＭＭｇＣｌ２ 、０．３２Ｍ シュークロース、１
％トライトン Ｘ−１００）を加え、１３０００ｒｐ
ｍ で２０秒間遠心分離し、上清を除いた。沈殿に５０
０μｌの上記緩衝液、５９μｌの５％ＳＤＳ及び２５μ
ｌのプロティナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えて５５
℃で２時間加温した。 これにフェノール／クロロホルムを５００μｌ加え混和
後８０００ｒｐｍ で１５分間遠心分離し、得た上清に
再度フェノール／クロロホルムを５００μｌ加え同様の
操作をした。この上清にクロロホルム５００μｌを加え
転倒混和しフェノールを抽出した後８０００ｒｐｍ で
５分間遠心分離した。上清に５６μｌの３Ｍ ＮａＣ
ｌと１．１２ｍｌのの冷エタノールを加え、−７０℃に
２０分間静置後、８０００ｒｐｍ で１０分間遠心分離
し、沈殿を得た。 予め調製し、−２０℃に保存しておいた７０％エタノー
ルで沈殿を洗った後、減圧下で乾燥した。これに１００
μｌの緩衝液（１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
、０．１ｍＭＥＤＴＡ）を加えて溶解し、ＤＮＡ試料と
した。
ｅｌｌらの方法により調べたアポＥフェノタイプが母親
及び父親由来の遺伝子が両方とも３型であるヒトの血液
を３０００ｒｐｍ で１５分間遠心分離して血清を除去
し、血球を得た。この血球約５００μｌに５００μｌの
緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５
ｍＭＭｇＣｌ２ 、０．３２Ｍ シュークロース、１
％トライトン Ｘ−１００）を加え、１３０００ｒｐ
ｍ で２０秒間遠心分離し、上清を除いた。沈殿に５０
０μｌの上記緩衝液、５９μｌの５％ＳＤＳ及び２５μ
ｌのプロティナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えて５５
℃で２時間加温した。 これにフェノール／クロロホルムを５００μｌ加え混和
後８０００ｒｐｍ で１５分間遠心分離し、得た上清に
再度フェノール／クロロホルムを５００μｌ加え同様の
操作をした。この上清にクロロホルム５００μｌを加え
転倒混和しフェノールを抽出した後８０００ｒｐｍ で
５分間遠心分離した。上清に５６μｌの３Ｍ ＮａＣ
ｌと１．１２ｍｌのの冷エタノールを加え、−７０℃に
２０分間静置後、８０００ｒｐｍ で１０分間遠心分離
し、沈殿を得た。 予め調製し、−２０℃に保存しておいた７０％エタノー
ルで沈殿を洗った後、減圧下で乾燥した。これに１００
μｌの緩衝液（１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
、０．１ｍＭＥＤＴＡ）を加えて溶解し、ＤＮＡ試料と
した。
【００４０】（２） 選定したプライマーの組合せを用
いたＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅 ５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２ 、５％ＤＭＳ
Ｏ、０．００１％ゼラチン、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（
ｐＨ ８．３）、各２００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、各０．２μＭのプ
ラス鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマー、ＤＮ
Ａ試料（０．０１−１μｇ）及び１．２５ユニットのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼから成る反応液（５０μｌ）を
ミネラルオイルで覆いＤＮＡサーマル・サイクラー（Ｄ
ＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（米国、ＰＥＲ
ＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ社製）にセットした。 熱変性９６℃、３分間、アニーリング６２℃、１分間、
伸長反応を７０℃、４分間行った後、熱変性９６℃、３
０秒間、アニーリング６２℃、１分間、伸長反応を７０
℃、３分間を３９サイクル行った。その後７０℃で７分
間保温し、ＰＣＲ反応溶液を得た。なおここでプライマ
ーとしては前記「Ａ．請求項４に記載のプライマーの選
定と合成」にて合成した３種のプライマーの組合せ（Ａ
−１，Ａ−２，Ａ−３）を各々用い、３種のＰＣＲ反応
液を得た。
いたＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅 ５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２ 、５％ＤＭＳ
Ｏ、０．００１％ゼラチン、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（
ｐＨ ８．３）、各２００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、各０．２μＭのプ
ラス鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマー、ＤＮ
Ａ試料（０．０１−１μｇ）及び１．２５ユニットのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼから成る反応液（５０μｌ）を
ミネラルオイルで覆いＤＮＡサーマル・サイクラー（Ｄ
ＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（米国、ＰＥＲ
ＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ社製）にセットした。 熱変性９６℃、３分間、アニーリング６２℃、１分間、
伸長反応を７０℃、４分間行った後、熱変性９６℃、３
０秒間、アニーリング６２℃、１分間、伸長反応を７０
℃、３分間を３９サイクル行った。その後７０℃で７分
間保温し、ＰＣＲ反応溶液を得た。なおここでプライマ
ーとしては前記「Ａ．請求項４に記載のプライマーの選
定と合成」にて合成した３種のプライマーの組合せ（Ａ
−１，Ａ−２，Ａ−３）を各々用い、３種のＰＣＲ反応
液を得た。
【００４１】（３） 選定されたプライマーの組合せを
用いて増幅されたＤＮＡ断片がアポＥ遺伝子の特定のＤ
ＮＡ断片であることの確認 増幅反応後、前記ＰＣＲ反応溶液の一部をサイズマーカ
ーと共に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い臭
化エチジウムで染色した。その結果を図２に示す。すな
わち図２において、レーン１と５はサイズマーカーであ
り、レーン１はプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素Ｈｉ
ｎｆＩ で消化したＤＮＡ断片（それぞれ１６３２，５
１７，５０４，３９６，３４４，２９８，２２１，２２
０，１５４及び７５塩基対）で、レーン５はそれをさら
に制限酵素ＥｃｏＲＩ で消化した断片（それぞれ９９
８，６３４，５１７，５０４，３９６，３４４，２９８
，２２１，２２０，１５４ 及び７５塩基対）を電気泳
動した結果である。一方、レーン２〜レーン４はＰＣＲ
反応液を電気泳動した結果であり、レーン２はプライマ
ーの組合せとしてＡ−１を、レーン３はプライマーの組
合せとしてＡ−２を、レーン４はプライマーの組合せと
してＡ−３をそれぞれ用いた場合の結果である。
用いて増幅されたＤＮＡ断片がアポＥ遺伝子の特定のＤ
ＮＡ断片であることの確認 増幅反応後、前記ＰＣＲ反応溶液の一部をサイズマーカ
ーと共に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い臭
化エチジウムで染色した。その結果を図２に示す。すな
わち図２において、レーン１と５はサイズマーカーであ
り、レーン１はプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素Ｈｉ
ｎｆＩ で消化したＤＮＡ断片（それぞれ１６３２，５
１７，５０４，３９６，３４４，２９８，２２１，２２
０，１５４及び７５塩基対）で、レーン５はそれをさら
に制限酵素ＥｃｏＲＩ で消化した断片（それぞれ９９
８，６３４，５１７，５０４，３９６，３４４，２９８
，２２１，２２０，１５４ 及び７５塩基対）を電気泳
動した結果である。一方、レーン２〜レーン４はＰＣＲ
反応液を電気泳動した結果であり、レーン２はプライマ
ーの組合せとしてＡ−１を、レーン３はプライマーの組
合せとしてＡ−２を、レーン４はプライマーの組合せと
してＡ−３をそれぞれ用いた場合の結果である。
【００４２】ＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片は２つの
プライマーに挟まれた部分である。従ってε２、ε４、
ε５及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する場合
はプラス鎖用として５’−２８０２ 〜２８２３−３’
（配列番号１）及びマイナス鎖用として３’−４２２
０ 〜４２４１−５’ （配列番号４）のヌクレオチド
番号を有するプライマーを用いているので、増幅される
ＤＮＡ断片の大きさは１４４０ｂｐであると予想される
。実際に図２のレーン２に示されるように予想された大
きさに対応する位置にＤＮＡ断片が検出された。またε
５変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する場合は、プラス
鎖用として５’−２８０２ 〜２８２３−３’ （配列
番号１）及びマイナス鎖用として３’−２９５８ 〜２
９７９−５’ （配列番号３）のヌクレオチド番号を有
するプライマーを用いているので、増幅されるＤＮＡ断
片の大きさは１７８ｂｐであると予想される。実際に図
２のレーン３に示されるように予想された大きさに対応
する位置にＤＮＡ断片が検出された。そしてε２、ε４
及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する場合はプ
ラス鎖用として５’−３６１８ 〜３６３９−３’ （
配列番号２）及びマイナス鎖用として３’−４２２０
〜４２４１−５’ （配列番号４）のヌクレオチド番号
を有するプライマーを用いているので増幅されるＤＮＡ
断片の大きさは６２４ｂｐであると予想される。実際に
図２のレーン４に示されるように予想された大きさに対
応する位置にＤＮＡ断片が検出された。
プライマーに挟まれた部分である。従ってε２、ε４、
ε５及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する場合
はプラス鎖用として５’−２８０２ 〜２８２３−３’
（配列番号１）及びマイナス鎖用として３’−４２２
０ 〜４２４１−５’ （配列番号４）のヌクレオチド
番号を有するプライマーを用いているので、増幅される
ＤＮＡ断片の大きさは１４４０ｂｐであると予想される
。実際に図２のレーン２に示されるように予想された大
きさに対応する位置にＤＮＡ断片が検出された。またε
５変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する場合は、プラス
鎖用として５’−２８０２ 〜２８２３−３’ （配列
番号１）及びマイナス鎖用として３’−２９５８ 〜２
９７９−５’ （配列番号３）のヌクレオチド番号を有
するプライマーを用いているので、増幅されるＤＮＡ断
片の大きさは１７８ｂｐであると予想される。実際に図
２のレーン３に示されるように予想された大きさに対応
する位置にＤＮＡ断片が検出された。そしてε２、ε４
及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅する場合はプ
ラス鎖用として５’−３６１８ 〜３６３９−３’ （
配列番号２）及びマイナス鎖用として３’−４２２０
〜４２４１−５’ （配列番号４）のヌクレオチド番号
を有するプライマーを用いているので増幅されるＤＮＡ
断片の大きさは６２４ｂｐであると予想される。実際に
図２のレーン４に示されるように予想された大きさに対
応する位置にＤＮＡ断片が検出された。
【００４３】さらにこれらの増幅されたＤＮＡ断片がア
ポＥに特異的であることを確認するために、図２のレー
ン２のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ 、ＨｉｎｆＩ
あるいはＳａｕ３ＡＩで、レーン３のＤＮＡ断片をＨ
ａｅＩＩ で、レーン４のＤＮＡ断片をＰｓｔＩで各々
消化し、サイズマーカーと共に電気泳動を行い分析した
。その結果を図３に示す。すなわち図３において、レー
ン１はサイズマーカーであり、前記プラスミドｐＢＲ３
２２を制限酵素ＨｉｎｆＩ とＥｃｏＲＩ で消化した
断片を電気泳動した結果であり、レーン２は図２のレー
ン２のＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ で、レーン３はＨｉｎ
ｆＩ で、レーン４はＳａｕ３ＡＩでそれぞれ消化し、
電気泳動した結果であり、レーン５は図２のレーン３の
ＤＮＡ断片をＨａｅＩＩ で消化し電気泳動した結果で
あり、レーン６は図２のレーン４のＤＮＡ断片をＰｓｔ
Ｉで消化し電気泳動した結果である。
ポＥに特異的であることを確認するために、図２のレー
ン２のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ 、ＨｉｎｆＩ
あるいはＳａｕ３ＡＩで、レーン３のＤＮＡ断片をＨ
ａｅＩＩ で、レーン４のＤＮＡ断片をＰｓｔＩで各々
消化し、サイズマーカーと共に電気泳動を行い分析した
。その結果を図３に示す。すなわち図３において、レー
ン１はサイズマーカーであり、前記プラスミドｐＢＲ３
２２を制限酵素ＨｉｎｆＩ とＥｃｏＲＩ で消化した
断片を電気泳動した結果であり、レーン２は図２のレー
ン２のＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ で、レーン３はＨｉｎ
ｆＩ で、レーン４はＳａｕ３ＡＩでそれぞれ消化し、
電気泳動した結果であり、レーン５は図２のレーン３の
ＤＮＡ断片をＨａｅＩＩ で消化し電気泳動した結果で
あり、レーン６は図２のレーン４のＤＮＡ断片をＰｓｔ
Ｉで消化し電気泳動した結果である。
【００４４】アポＥ遺伝子の塩基配列よりε２、ε４、
ε５及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ
で消化した場合には１０７０ｂｐと３７０ｂｐの断片が
、ＨｉｎｆＩ では１０３０ｂｐ、３４８ｂｐと６２ｂ
ｐ、Ｓａｕ３ＡＩでは９０９ｂｐと５３１ｂｐの断片が
生じると予想される。また、ε５変異部位を含むＤＮＡ
断片をＨａｅＩＩ で消化した場合には１０３ｂｐと７
５ｂｐの断片が、そして、ε２、ε４及びε７変異部位
を含むＤＮＡ断片をＰｓｔＩで消化した場合には３６３
ｂｐ、１７４ｂｐと８７ｂｐの断片が生じると予想され
る。実際に、図３に示されるように予想された大きさに
対応する位置に各々のＤＮＡ断片が確認された。以上の
実験結果より前記Ａにおいて選定されたプライマーの組
合せ（Ａ−１，Ａ−２，Ａ−３）を用いるとアポＥ遺伝
子の一部が特異的に増幅され、すなわち、前記Ａにおい
て選定されたプライマーはアポＥ遺伝子に対して特異的
であるこど確認された。
ε５及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ
で消化した場合には１０７０ｂｐと３７０ｂｐの断片が
、ＨｉｎｆＩ では１０３０ｂｐ、３４８ｂｐと６２ｂ
ｐ、Ｓａｕ３ＡＩでは９０９ｂｐと５３１ｂｐの断片が
生じると予想される。また、ε５変異部位を含むＤＮＡ
断片をＨａｅＩＩ で消化した場合には１０３ｂｐと７
５ｂｐの断片が、そして、ε２、ε４及びε７変異部位
を含むＤＮＡ断片をＰｓｔＩで消化した場合には３６３
ｂｐ、１７４ｂｐと８７ｂｐの断片が生じると予想され
る。実際に、図３に示されるように予想された大きさに
対応する位置に各々のＤＮＡ断片が確認された。以上の
実験結果より前記Ａにおいて選定されたプライマーの組
合せ（Ａ−１，Ａ−２，Ａ−３）を用いるとアポＥ遺伝
子の一部が特異的に増幅され、すなわち、前記Ａにおい
て選定されたプライマーはアポＥ遺伝子に対して特異的
であるこど確認された。
【００４５】次に本実施例にて使用する請求項８に記載
のプローブの作製について説明する。 Ｃ 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの
作製 アポＥ遺伝子の塩基配列及び本発明で検査する変異及び
その位置が既知であることから、これらの知識に基づき
アポＥ遺伝子ε２、ε４、ε５又はε７の野生型又は変
異型遺伝子のプラス鎖又はマイナス鎖の各々とミスマッ
チをきたす塩基が、プローブの中央にくるようなオリゴ
ヌクレオチドを選定し、さらにハイブリダイゼーション
及び洗浄温度を３７℃で行うことのできる１３〜１５塩
基の長さである配列番号５〜２０のオリゴヌクレオチド
をプローブとして選定した。この配列番号５〜２０のプ
ローブを前記のプライマーの合成と同様に、前記ＤＮＡ
合成機を用いて合成し、ＭｏｎｏＱ を用いてＦＰＬＣ
で精製した。
のプローブの作製について説明する。 Ｃ 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの
作製 アポＥ遺伝子の塩基配列及び本発明で検査する変異及び
その位置が既知であることから、これらの知識に基づき
アポＥ遺伝子ε２、ε４、ε５又はε７の野生型又は変
異型遺伝子のプラス鎖又はマイナス鎖の各々とミスマッ
チをきたす塩基が、プローブの中央にくるようなオリゴ
ヌクレオチドを選定し、さらにハイブリダイゼーション
及び洗浄温度を３７℃で行うことのできる１３〜１５塩
基の長さである配列番号５〜２０のオリゴヌクレオチド
をプローブとして選定した。この配列番号５〜２０のプ
ローブを前記のプライマーの合成と同様に、前記ＤＮＡ
合成機を用いて合成し、ＭｏｎｏＱ を用いてＦＰＬＣ
で精製した。
【００４６】各プローブの標識は末端転移酵素を用いて
それの３´末端にジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを標
識した。具体的には２０μｌの１０Ｘ末端転移酵素緩衝
液（１．４ｍＭカコジレイトカリウム、１０ｍＭ塩化コ
バルト、１ｍＭジチオスレイトール、３００ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ ７．２））、６μｌの１ｍＭジゴキシ
ゲニン−１１−ｄＵＴＰ、１００μｌの２．５μＭオリ
ゴヌクレオチド及び６８μｌの蒸留水を加えて攪拌後、
末端転移酵素（２５Ｕ／μｌ）を６μｌ添加し、３７℃
で９０分反応させ、標識した。
それの３´末端にジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを標
識した。具体的には２０μｌの１０Ｘ末端転移酵素緩衝
液（１．４ｍＭカコジレイトカリウム、１０ｍＭ塩化コ
バルト、１ｍＭジチオスレイトール、３００ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ ７．２））、６μｌの１ｍＭジゴキシ
ゲニン−１１−ｄＵＴＰ、１００μｌの２．５μＭオリ
ゴヌクレオチド及び６８μｌの蒸留水を加えて攪拌後、
末端転移酵素（２５Ｕ／μｌ）を６μｌ添加し、３７℃
で９０分反応させ、標識した。
【００４７】次に本実施例にて使用する変異型コントロ
ールＤＮＡの調製について説明する。 Ｄ．変異型コントロールＤＮＡの調製 配列番号２１〜２８のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ
合成機で合成し、前記陰イオン交換体ＭｏｎｏＱ を用
いてＦＰＬＣで精製した。ここで配列番号２１及び２２
のオリゴヌクレオチドはε２変異型のコントロールＤＮ
Ａを調製するための各々プラス鎖とマイナス鎖である。 そして配列番号２１又は２２のヌクレオチド番号はそれ
ぞれ５’−３８５８−３８８７−３’ 又は３’−３８
７８−３９０７−５’ である。そしてヌクレオチド番
号３８８３においてＴに変異が形成されている。
ールＤＮＡの調製について説明する。 Ｄ．変異型コントロールＤＮＡの調製 配列番号２１〜２８のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ
合成機で合成し、前記陰イオン交換体ＭｏｎｏＱ を用
いてＦＰＬＣで精製した。ここで配列番号２１及び２２
のオリゴヌクレオチドはε２変異型のコントロールＤＮ
Ａを調製するための各々プラス鎖とマイナス鎖である。 そして配列番号２１又は２２のヌクレオチド番号はそれ
ぞれ５’−３８５８−３８８７−３’ 又は３’−３８
７８−３９０７−５’ である。そしてヌクレオチド番
号３８８３においてＴに変異が形成されている。
【００４８】次に配列番号２３及び２４のオリゴヌクレ
オチドはε４変異型のコントロールＤＮＡを調製するた
めの各々プラス鎖とマイナス鎖である。そして配列番号
２３又は２４のヌクレオチド番号はそれぞれ５’−３７
２１−３７５０−３’ 又は３’−３７４１−３７７０
−５’である。そしてヌクレオチド番号３７４５におい
てＣに変異が形成されている。また配列番号２５及び２
６のオリゴヌクレオチドはε５変異型のコントロールＤ
ＮＡを調製するための各々プラス鎖とマイナス鎖である
。そして配列番号２５又は２６のヌクレオチド番号はそ
れぞれ５’−２８１１−２８４０−３’ 又は３’−２
８３１−２８６０−５’である。そしてヌクレオチド番
号２８３６においてＡに変異が形成されている。そして
配列番号２７及び２８のオリゴヌクレオチドはε７変異
型のコントロールＤＮＡを調製するための各々プラス鎖
とマイナス鎖である。そして配列番号２７又は２８のヌ
クレオチド番号はそれぞれ５’−４１１８−４１４７−
３’ 又は３’−４１３８−４１６７−５’ である。 そして、ヌクレオチド番号４１４１及び４１４４におい
てＡに変異が形成されている。
オチドはε４変異型のコントロールＤＮＡを調製するた
めの各々プラス鎖とマイナス鎖である。そして配列番号
２３又は２４のヌクレオチド番号はそれぞれ５’−３７
２１−３７５０−３’ 又は３’−３７４１−３７７０
−５’である。そしてヌクレオチド番号３７４５におい
てＣに変異が形成されている。また配列番号２５及び２
６のオリゴヌクレオチドはε５変異型のコントロールＤ
ＮＡを調製するための各々プラス鎖とマイナス鎖である
。そして配列番号２５又は２６のヌクレオチド番号はそ
れぞれ５’−２８１１−２８４０−３’ 又は３’−２
８３１−２８６０−５’である。そしてヌクレオチド番
号２８３６においてＡに変異が形成されている。そして
配列番号２７及び２８のオリゴヌクレオチドはε７変異
型のコントロールＤＮＡを調製するための各々プラス鎖
とマイナス鎖である。そして配列番号２７又は２８のヌ
クレオチド番号はそれぞれ５’−４１１８−４１４７−
３’ 又は３’−４１３８−４１６７−５’ である。 そして、ヌクレオチド番号４１４１及び４１４４におい
てＡに変異が形成されている。
【００４９】各種変異型コントロールＤＮＡを調製する
ためのプラス鎖とマイナス鎖とをアニーリングした後、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを作用させて２本鎖の５０塩
基対ＤＮＡ断片とし、これを各変異型のコントロールＤ
ＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌの反応液組成は
、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２ 、５％ＤＭ
ＳＯ、０．００１％ゼラチン、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ ８．３）、各２００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、各０．２μＭの
オリゴヌクレオチド、及び１．２５ユニットのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼである。
ためのプラス鎖とマイナス鎖とをアニーリングした後、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを作用させて２本鎖の５０塩
基対ＤＮＡ断片とし、これを各変異型のコントロールＤ
ＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌの反応液組成は
、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２ 、５％ＤＭ
ＳＯ、０．００１％ゼラチン、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ ８．３）、各２００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、各０．２μＭの
オリゴヌクレオチド、及び１．２５ユニットのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼである。
【００５０】ここで前記各０．２μＭのオリゴヌクレオ
チドとしては、ε２変異型のコントロールＤＮＡを調製
する場合には配列番号２１及び２２のオリゴヌクレオチ
ドを各０．２μＭ使用し、ε４変異型のコントロールＤ
ＮＡを調製する場合には配列番号２３及び２４のオリゴ
ヌクレオチドを各々０．２μＭ使用し、ε５変異型のコ
ントロールＤＮＡを調製する場合には配列番号２５及び
２６のヌクレオチドを各０．２μＭ使用し、ε７変異型
のコントロールＤＮＡを調製する場合には配列番号２７
及び２８のヌクレオチドを各０．２μＭ使用した。
チドとしては、ε２変異型のコントロールＤＮＡを調製
する場合には配列番号２１及び２２のオリゴヌクレオチ
ドを各０．２μＭ使用し、ε４変異型のコントロールＤ
ＮＡを調製する場合には配列番号２３及び２４のオリゴ
ヌクレオチドを各々０．２μＭ使用し、ε５変異型のコ
ントロールＤＮＡを調製する場合には配列番号２５及び
２６のヌクレオチドを各０．２μＭ使用し、ε７変異型
のコントロールＤＮＡを調製する場合には配列番号２７
及び２８のヌクレオチドを各０．２μＭ使用した。
【００５１】前記組成の反応液をミネラルオイルで覆い
ＤＮＡサーマル・サイクラー（ＤＮＡｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ）（米国、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ Ｃ
ＥＴＵＳ社製）にセットした。熱変性９６℃、３分間、
アニーリング６２℃、１分間、伸長反応を７０℃、４分
間行った後熱、変性９６℃、３０秒間、アニーリング６
２℃、１分間、伸長反応を７０℃、３分間を３９サイク
ル行い、７０℃で７分間保温して各種変異型のコントロ
ールＤＮＡ溶液を調製した。
ＤＮＡサーマル・サイクラー（ＤＮＡｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ）（米国、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ Ｃ
ＥＴＵＳ社製）にセットした。熱変性９６℃、３分間、
アニーリング６２℃、１分間、伸長反応を７０℃、４分
間行った後熱、変性９６℃、３０秒間、アニーリング６
２℃、１分間、伸長反応を７０℃、３分間を３９サイク
ル行い、７０℃で７分間保温して各種変異型のコントロ
ールＤＮＡ溶液を調製した。
【００５２】次に前記のＡにおいて製造した請求項４の
プライマー及び前記のＣにおいて製造した請求項８のプ
ローブを用いて、アポＥ遺伝子タイプを検査する本発明
の具体的実施例について説明する。 実施例１ ε２、ε４、ε５及びε７型検査前記のＭ
ｃＤｏｗｅｌｌらの方法によりアポＥフェノタイプ検査
を行った９名のヒトの血球よりＢ（１） に記載の方法
で各ＤＮＡ試料を調製した。次にＡに記載の方法で選定
及び合成した配列番号１及び４のオリゴヌクレオチドを
各々プラス鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマー
（プライマーの組合せＡ−１）として用い、各ＤＮＡ試
料に対してＢ（２） に記載のごとくＰＣＲ法を行うこ
とにより各ＰＣＲ反応液を得た。これにより、各試料の
ε２、ε４、ε５及びε７変異部分を含むＤＮＡ断片が
増幅された。
プライマー及び前記のＣにおいて製造した請求項８のプ
ローブを用いて、アポＥ遺伝子タイプを検査する本発明
の具体的実施例について説明する。 実施例１ ε２、ε４、ε５及びε７型検査前記のＭ
ｃＤｏｗｅｌｌらの方法によりアポＥフェノタイプ検査
を行った９名のヒトの血球よりＢ（１） に記載の方法
で各ＤＮＡ試料を調製した。次にＡに記載の方法で選定
及び合成した配列番号１及び４のオリゴヌクレオチドを
各々プラス鎖用プライマー及びマイナス鎖用プライマー
（プライマーの組合せＡ−１）として用い、各ＤＮＡ試
料に対してＢ（２） に記載のごとくＰＣＲ法を行うこ
とにより各ＰＣＲ反応液を得た。これにより、各試料の
ε２、ε４、ε５及びε７変異部分を含むＤＮＡ断片が
増幅された。
【００５３】上記の如くにヒト９名の各ＤＮＡ試料から
得られた９種のＰＣＲ反応液およびＤに記載の方法で調
製した各変異型コントロールＤＮＡ溶液、各０．５μｌ
をそれぞれナイロンメンブレンにスポットした。風乾後
、変性溶液（０．５ＭＮａＯＨ、１ＭＮａＣｌ）に２分
、続いて中和溶液（１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５
）、１．５ＭＮａＣｌ）に２分間浸した。風乾後８０℃
で２時間焼き付けた。次にプレハイブリダイゼーション
を３７℃で１時間、ドイツ国、ベーリンガー−マンハイ
ム社製キット（ＤＮＡラベリング＆ディテクションキッ
ト、製品番号１０９３６５７ ）に従って行い、Ｃに記
載の方法で調製した標識された配列番号５〜１２のプロ
ーブの各々を単独に各ナイロンメンブレンに１．２５ｎ
Ｍ加え、３７℃で一夜ハイブリダイゼーションした。
得られた９種のＰＣＲ反応液およびＤに記載の方法で調
製した各変異型コントロールＤＮＡ溶液、各０．５μｌ
をそれぞれナイロンメンブレンにスポットした。風乾後
、変性溶液（０．５ＭＮａＯＨ、１ＭＮａＣｌ）に２分
、続いて中和溶液（１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５
）、１．５ＭＮａＣｌ）に２分間浸した。風乾後８０℃
で２時間焼き付けた。次にプレハイブリダイゼーション
を３７℃で１時間、ドイツ国、ベーリンガー−マンハイ
ム社製キット（ＤＮＡラベリング＆ディテクションキッ
ト、製品番号１０９３６５７ ）に従って行い、Ｃに記
載の方法で調製した標識された配列番号５〜１２のプロ
ーブの各々を単独に各ナイロンメンブレンに１．２５ｎ
Ｍ加え、３７℃で一夜ハイブリダイゼーションした。
【００５４】なお配列番号５、８、１０又は１２のプロ
ーブはＧ−Ｔミスマッチを識別するので、各々標識して
いない配列番号６、７、９又は１１のオリゴヌクレオチ
ドを、各々の標識した配列番号５、８、１０又は１２の
プローブに等量加えて、各々ハイブリダイゼーションを
行った。続いて３７℃において洗浄液（０．１〜６×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて１０分間で２回洗浄し
た。ここで１×ＳＳＣとは０．１５ＭＮａＣｌを含む０
．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ ７．０）で
ある。すべてのタイプの検査においてハイブリダイゼー
ション温度及び洗浄温度は３７℃で行った。そして上記
ベーリンガー−マンハイム社製キットを用いて非ＲＩ的
に検査した。その結果を図４に示す。
ーブはＧ−Ｔミスマッチを識別するので、各々標識して
いない配列番号６、７、９又は１１のオリゴヌクレオチ
ドを、各々の標識した配列番号５、８、１０又は１２の
プローブに等量加えて、各々ハイブリダイゼーションを
行った。続いて３７℃において洗浄液（０．１〜６×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて１０分間で２回洗浄し
た。ここで１×ＳＳＣとは０．１５ＭＮａＣｌを含む０
．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ ７．０）で
ある。すべてのタイプの検査においてハイブリダイゼー
ション温度及び洗浄温度は３７℃で行った。そして上記
ベーリンガー−マンハイム社製キットを用いて非ＲＩ的
に検査した。その結果を図４に示す。
【００５５】図４中、２Ｗ、２Ｍ、４Ｗ、４Ｍ、５Ｗ、
５Ｍ、７Ｗ及び７Ｍはプローブの種類を表す記号であり
、数字は変異型の種類を、Ｗは野生型をＭは変異型を各
々示している。すなわち、２Ｗ、２Ｍ、４Ｗ、４Ｍ、５
Ｗ、５Ｍ、７Ｗ又は７Ｍは各々配列番号５、６、７、８
、９、１０、１１又は１２のプローブを意味している。 またヒトＤＮＡ（ＮＯ． １〜９）の後の括弧書は９名
の各ヒトのアポＥフェノタイプを示しており、例えば３
／３とは両親由来遺伝子が共に３型であることを示し、
３／４とは片親由来遺伝子が３型でありもう一方の親由
来遺伝子が４型であることを示している。なお、図４中
の黒丸はプローブと反応したことを示している。
５Ｍ、７Ｗ及び７Ｍはプローブの種類を表す記号であり
、数字は変異型の種類を、Ｗは野生型をＭは変異型を各
々示している。すなわち、２Ｗ、２Ｍ、４Ｗ、４Ｍ、５
Ｗ、５Ｍ、７Ｗ又は７Ｍは各々配列番号５、６、７、８
、９、１０、１１又は１２のプローブを意味している。 またヒトＤＮＡ（ＮＯ． １〜９）の後の括弧書は９名
の各ヒトのアポＥフェノタイプを示しており、例えば３
／３とは両親由来遺伝子が共に３型であることを示し、
３／４とは片親由来遺伝子が３型でありもう一方の親由
来遺伝子が４型であることを示している。なお、図４中
の黒丸はプローブと反応したことを示している。
【００５６】図４に示されるように９名のヒトＤＮＡ試
料から本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ法により
増幅されたＤＮＡは、各々フェノタイプ検査の結果から
予想されるプローブとのみ反応した。例えばヒトＤＮＡ
（ＮＯ． １）においてはフェノタイプは３／４であり
、すなわち両親から由来した遺伝子のうち一方がε３型
（野生型）なので、この遺伝子が２Ｗ、４Ｗ、５Ｗ及び
７Ｗと反応し、もう一方の親由来の遺伝子がε４型なの
で、この遺伝子が２Ｗ、４Ｍ、５Ｗ及び７Ｗと反応する
ことが予想される。そして図４に示されるようにヒトＤ
ＮＡ（ＮＯ． １）については予想通りに２Ｗ、４Ｗ、
４Ｍ、５Ｗ及び７Ｗの５つのプローブと反応している。 また、ヒトＤＮＡ（ＮＯ． ２ 及び４ ）においては
フェノタイプは３／３であり、予想通りに２Ｍ、４Ｍ、
５Ｍ及び７Ｍの４つのプローブとは反応していない。
料から本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ法により
増幅されたＤＮＡは、各々フェノタイプ検査の結果から
予想されるプローブとのみ反応した。例えばヒトＤＮＡ
（ＮＯ． １）においてはフェノタイプは３／４であり
、すなわち両親から由来した遺伝子のうち一方がε３型
（野生型）なので、この遺伝子が２Ｗ、４Ｗ、５Ｗ及び
７Ｗと反応し、もう一方の親由来の遺伝子がε４型なの
で、この遺伝子が２Ｗ、４Ｍ、５Ｗ及び７Ｗと反応する
ことが予想される。そして図４に示されるようにヒトＤ
ＮＡ（ＮＯ． １）については予想通りに２Ｗ、４Ｗ、
４Ｍ、５Ｗ及び７Ｗの５つのプローブと反応している。 また、ヒトＤＮＡ（ＮＯ． ２ 及び４ ）においては
フェノタイプは３／３であり、予想通りに２Ｍ、４Ｍ、
５Ｍ及び７Ｍの４つのプローブとは反応していない。
【００５７】なお、ε２、ε４、ε５及びε７型を検査
するために、例えば配列番号１及び３のプライマーの組
合せとＤＮＡ試料を用いてε５変異部位を含むＤＮＡ断
片を増幅し、一方、例えば配列番号２及び４のプライマ
ーの組合せをＤＮＡ試料に用いてε２、ε４及びε７変
異部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、これらを混合し、ε
２、ε４、ε５及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片とし
たものに対して対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いてアポＥ遺伝子タイプを検査することもで
きる。
するために、例えば配列番号１及び３のプライマーの組
合せとＤＮＡ試料を用いてε５変異部位を含むＤＮＡ断
片を増幅し、一方、例えば配列番号２及び４のプライマ
ーの組合せをＤＮＡ試料に用いてε２、ε４及びε７変
異部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、これらを混合し、ε
２、ε４、ε５及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片とし
たものに対して対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いてアポＥ遺伝子タイプを検査することもで
きる。
【００５８】実施例２ 変性工程不要のε４型検査ａ
． プラス鎖用プライマーをマイナス鎖用プライマー
の５０倍量用いたＰＣＲ法（ＡＰＣＲ法）によるアポＥ
特異的ＤＮＡ断片の増幅 前記のＭｃＤｏｗｅｌｌらの方法により、アポＥフェノ
タイプ検査を行ったヒト（３名）の血球より、Ｂ（１）
に記載の方法で各ＤＮＡ試料を調製し、ＡＰＣＲ法を
用いて増幅した。５０μｌの反応液組成は、５０ｍＭＫ
Ｃｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２ 、５％ＤＭＳＯ、０．０
０１％ゼラチン、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８．
３）、各２００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、配列番号２であるプラス鎖用
プライマー（２５０ｎＭ）と配列番号４であるマイナス
鎖用プライマー（５ｎＭ）、ヒトＤＮＡ試料（０．０１
−１μｇ）及び１．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼである。この組成の反応液をミネラルオイルで覆
いＤＮＡサーマル・サイクラー（ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（米国、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ
ＣＥＴＵＳ社製）にセットした。熱変性９６℃、３分
間、アニーリング６２℃、１分間、伸長反応を７０℃、
４分間行った後、熱変性９６℃、３０秒間、アニーリン
グ６２℃、１分間、伸長反応を７０℃、３分間を３９サ
イクル行った。その後７０℃で７分間保温し、ＡＰＣＲ
反応液を得た。
． プラス鎖用プライマーをマイナス鎖用プライマー
の５０倍量用いたＰＣＲ法（ＡＰＣＲ法）によるアポＥ
特異的ＤＮＡ断片の増幅 前記のＭｃＤｏｗｅｌｌらの方法により、アポＥフェノ
タイプ検査を行ったヒト（３名）の血球より、Ｂ（１）
に記載の方法で各ＤＮＡ試料を調製し、ＡＰＣＲ法を
用いて増幅した。５０μｌの反応液組成は、５０ｍＭＫ
Ｃｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２ 、５％ＤＭＳＯ、０．０
０１％ゼラチン、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８．
３）、各２００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、配列番号２であるプラス鎖用
プライマー（２５０ｎＭ）と配列番号４であるマイナス
鎖用プライマー（５ｎＭ）、ヒトＤＮＡ試料（０．０１
−１μｇ）及び１．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼである。この組成の反応液をミネラルオイルで覆
いＤＮＡサーマル・サイクラー（ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（米国、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ
ＣＥＴＵＳ社製）にセットした。熱変性９６℃、３分
間、アニーリング６２℃、１分間、伸長反応を７０℃、
４分間行った後、熱変性９６℃、３０秒間、アニーリン
グ６２℃、１分間、伸長反応を７０℃、３分間を３９サ
イクル行った。その後７０℃で７分間保温し、ＡＰＣＲ
反応液を得た。
【００５９】ｂ． 変性及び中和工程不要のε４型検
査ａ．で得たＡＰＣＲ反応液をそのまま、又はこのＡＰ
ＣＲ反応液と変性溶液（０．５ＭＮａＯＨ、１ＭＮａＣ
ｌ）とを等量混合したもの（前者は変性工程なし、後者
は変性工程あり）の２種類を各０．５μｌをそれぞれナ
イロンメンブレンにスポットした。プラス鎖用とマイナ
ス鎖用の２種類のプライマーを等量ずつ用いる通常のＰ
ＣＲ法を行って得たＰＣＲ反応液についても同様の操作
を行い、変性工程あり及びなしのものの２種類を各０．
５μｌスポットした。またＤに記載の方法で調製したε
４型のコントロールＤＮＡ溶液（０．５μｌ）を前記変
性溶液と等量混合し、変性工程を行ったもの０．５μｌ
をスポットした。風乾後、中和溶液（１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、１．５ＭＮａＣｌ）に２分間浸し、風乾後８０℃で
２時間焼き付けた。次にプレハイブリダイゼーションを
３７℃で１時間、ドイツ国、ベーリンガー−マンハイム
社製キット（ＤＮＡラベリング＆ディクテクションキッ
ト、製品番号１０９３６５７ ）に従って行い、Ｃに記
載の方法で調製した配列番号７又は８の標識されたオリ
ゴヌクレオチドプローブを１．２５ｎＭ加え３７℃で一
夜ハイブリダイゼーションした。配列番号８のプローブ
はＧ−Ｔミスマッチを識別するので、標識していない配
列番号７のオリゴヌクレオチドを、標識された配列番号
８のプローブに等量加えて、ハイブリダイゼーションを
行った。続いて３７℃において洗浄液（５×ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳ）を用いて１０分間で２回洗浄した。そし
て上記ベーリンガー−マンハイム社製キットを用いて非
ＲＩ的に検査した。その結果を図５に示す。
査ａ．で得たＡＰＣＲ反応液をそのまま、又はこのＡＰ
ＣＲ反応液と変性溶液（０．５ＭＮａＯＨ、１ＭＮａＣ
ｌ）とを等量混合したもの（前者は変性工程なし、後者
は変性工程あり）の２種類を各０．５μｌをそれぞれナ
イロンメンブレンにスポットした。プラス鎖用とマイナ
ス鎖用の２種類のプライマーを等量ずつ用いる通常のＰ
ＣＲ法を行って得たＰＣＲ反応液についても同様の操作
を行い、変性工程あり及びなしのものの２種類を各０．
５μｌスポットした。またＤに記載の方法で調製したε
４型のコントロールＤＮＡ溶液（０．５μｌ）を前記変
性溶液と等量混合し、変性工程を行ったもの０．５μｌ
をスポットした。風乾後、中和溶液（１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、１．５ＭＮａＣｌ）に２分間浸し、風乾後８０℃で
２時間焼き付けた。次にプレハイブリダイゼーションを
３７℃で１時間、ドイツ国、ベーリンガー−マンハイム
社製キット（ＤＮＡラベリング＆ディクテクションキッ
ト、製品番号１０９３６５７ ）に従って行い、Ｃに記
載の方法で調製した配列番号７又は８の標識されたオリ
ゴヌクレオチドプローブを１．２５ｎＭ加え３７℃で一
夜ハイブリダイゼーションした。配列番号８のプローブ
はＧ−Ｔミスマッチを識別するので、標識していない配
列番号７のオリゴヌクレオチドを、標識された配列番号
８のプローブに等量加えて、ハイブリダイゼーションを
行った。続いて３７℃において洗浄液（５×ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳ）を用いて１０分間で２回洗浄した。そし
て上記ベーリンガー−マンハイム社製キットを用いて非
ＲＩ的に検査した。その結果を図５に示す。
【００６０】図５中、４Ｗ、４Ｍ及びヒトＤＮＡ後の括
弧書及び黒丸は図４にて説明したのと同様の意を示す。
弧書及び黒丸は図４にて説明したのと同様の意を示す。
【００６１】図５に示されるようにＡＰＣＲ法で増幅さ
れたＤＮＡについては変性工程を省いてもそのアポＥ遺
伝子タイプを検査することが可能であった。しかし通常
のＰＣＲ法で増幅したＤＮＡについては変性工程を行っ
た場合にのみアポＥ遺伝子タイプを検査することができ
た。
れたＤＮＡについては変性工程を省いてもそのアポＥ遺
伝子タイプを検査することが可能であった。しかし通常
のＰＣＲ法で増幅したＤＮＡについては変性工程を行っ
た場合にのみアポＥ遺伝子タイプを検査することができ
た。
【００６２】
【発明の効果】請求項１又は５の発明によるとアポリポ
プロテインＥ遺伝子のε２型、ε４型、ε５型及びε７
型を簡便かつ正確に検査することができる。請求項２又
は６の発明によるとアポリポプロテインＥ遺伝子のε５
型を簡便かつ正確に検査することができる。請求項３又
は７の発明によるとアポリポプロテインＥ遺伝子のε２
型、ε４型及びε７型を簡便かつ正確に検査することが
できる。請求項４のプライマー及び請求項８のプローブ
は本発明のアポリポプロテインＥ遺伝子の検査に好適に
用いられる。請求項９の発明によるとアポリポプロテイ
ンＥ遺伝子タイプの検査において全てのプローブのハイ
ブリダイゼーション及び洗浄を３７℃で行うことができ
る。従って３７℃の１つの恒温装置のみで一度にアポＥ
遺伝子タイプを検査することができ、便利である。請求
項１０の発明によるとＡＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅後
、該増幅されたＤＮＡのハイブリダイゼーションにおけ
る変性及び中和工程を省略した場合にもアポＥ遺伝子タ
イプを検査することができ、より簡便である。
プロテインＥ遺伝子のε２型、ε４型、ε５型及びε７
型を簡便かつ正確に検査することができる。請求項２又
は６の発明によるとアポリポプロテインＥ遺伝子のε５
型を簡便かつ正確に検査することができる。請求項３又
は７の発明によるとアポリポプロテインＥ遺伝子のε２
型、ε４型及びε７型を簡便かつ正確に検査することが
できる。請求項４のプライマー及び請求項８のプローブ
は本発明のアポリポプロテインＥ遺伝子の検査に好適に
用いられる。請求項９の発明によるとアポリポプロテイ
ンＥ遺伝子タイプの検査において全てのプローブのハイ
ブリダイゼーション及び洗浄を３７℃で行うことができ
る。従って３７℃の１つの恒温装置のみで一度にアポＥ
遺伝子タイプを検査することができ、便利である。請求
項１０の発明によるとＡＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅後
、該増幅されたＤＮＡのハイブリダイゼーションにおけ
る変性及び中和工程を省略した場合にもアポＥ遺伝子タ
イプを検査することができ、より簡便である。
配列番号：１
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＡＣＴＴＧＴＴＣ ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴ ＧＣ
２２配列番号：
２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧ ＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ ＣＧ
２２配列番号：
３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣ ＡＣＣＴＧＣＴＣＡＧ ＡＣ
２２配列番号：
４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＣＣＡＣＴＧＧＣ ＧＣＴＧＣＡＴＧＴＣ ＴＴ
２２配列番号：
５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＧＧＣＧＣＴＴ ＣＴＧ
１３配列番号：
６ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧ
１３配列番号：
７ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣ ＧＴＣ
１３配列番号：
８ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣ ＧＴＣ
１３配列番号：
９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧ
１５配列番号：
１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＴＧＣＴＴＣＡ ＣＣＴＴＧ
１５配列番号：
１１ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣ ＡＧＣＴ
１４配列番号：
１２ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣ ＡＧＣＴ
１４配列番号：
１３ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣ ＴＧＧ
１３配列番号：
１４ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣ ＴＧＧ
１３配列番号：
１５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＧ ＧＣＣ
１３配列番号：
１６ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧ ＧＣＣ
１３配列番号：
１７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ ＣＡＡＧＣ
１５配列番号：
１８ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧ ＣＡＡＧＣ
１５配列番号：
１９ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧ
１４配列番号：
２０ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡ ＧＣＡＧ
１４配列番号：
２１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＣＧＡＴＧＣＣ ＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣ ＡＧＡ
ＡＧＴＧＣＣＴ
３０配列番号：
２２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧ ＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡ ＧＧ
ＣＡＣＴＴＣＴ
３０配列番号：
２３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧ ＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡ ＣＧＴ
ＧＣＧＣＧＧＣ
３０配列番号：
２４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＣＧＧＴＡＣＴ ＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧ ＧＣＣ
ＧＣＧＣＡＣＧ
３０配列番号：
２５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡ ＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡ ＡＧＧ
ＴＧＡＡＧＣＡ
３０配列番号：
２６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴ ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴ ＴＧＣ
ＴＴＣＡＣＣＴ
３０配列番号：
２７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ ＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧ ＣＴＧ
ＡＡＧＡＡＧＣ
３０配列番号：
２８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＧＣＧＴＡＴＣＴ ＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧ ＣＴ
ＴＣＴＴＣＡＧ
３０
２２配列番号：
２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧ ＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ ＣＧ
２２配列番号：
３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣ ＡＣＣＴＧＣＴＣＡＧ ＡＣ
２２配列番号：
４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＣＣＡＣＴＧＧＣ ＧＣＴＧＣＡＴＧＴＣ ＴＴ
２２配列番号：
５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＧＧＣＧＣＴＴ ＣＴＧ
１３配列番号：
６ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧ
１３配列番号：
７ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣ ＧＴＣ
１３配列番号：
８ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣ ＧＴＣ
１３配列番号：
９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧ
１５配列番号：
１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＴＧＣＴＴＣＡ ＣＣＴＴＧ
１５配列番号：
１１ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣ ＡＧＣＴ
１４配列番号：
１２ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣ ＡＧＣＴ
１４配列番号：
１３ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣ ＴＧＧ
１３配列番号：
１４ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣ ＴＧＧ
１３配列番号：
１５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＧ ＧＣＣ
１３配列番号：
１６ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧ ＧＣＣ
１３配列番号：
１７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ ＣＡＡＧＣ
１５配列番号：
１８ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧ ＣＡＡＧＣ
１５配列番号：
１９ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧ
１４配列番号：
２０ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡ ＧＣＡＧ
１４配列番号：
２１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＣＧＡＴＧＣＣ ＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣ ＡＧＡ
ＡＧＴＧＣＣＴ
３０配列番号：
２２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧ ＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡ ＧＧ
ＣＡＣＴＴＣＴ
３０配列番号：
２３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧ ＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡ ＣＧＴ
ＧＣＧＣＧＧＣ
３０配列番号：
２４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＣＧＧＴＡＣＴ ＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧ ＧＣＣ
ＧＣＧＣＡＣＧ
３０配列番号：
２５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡ ＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡ ＡＧＧ
ＴＧＡＡＧＣＡ
３０配列番号：
２６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴ ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴ ＴＧＣ
ＴＴＣＡＣＣＴ
３０配列番号：
２７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ ＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧ ＣＴＧ
ＡＡＧＡＡＧＣ
３０配列番号：
２８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＧＣＧＴＡＴＣＴ ＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧ ＣＴ
ＴＣＴＴＣＡＧ
３０
【図１】アポＥ遺伝子とその各変異部分、配列番号１〜
４のプライマーの位置を示す概略図である。
４のプライマーの位置を示す概略図である。
【図２】アポＥ遺伝子のＤＮＡ断片の増幅反応液及びサ
イズマーカーのポリアクリルアミドゲール電気泳動臭化
エチジウム染色ゲルを示す。
イズマーカーのポリアクリルアミドゲール電気泳動臭化
エチジウム染色ゲルを示す。
【図３】アポＥ遺伝子のＤＮＡ断片を各種制限酵素で消
化した断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動臭化エチ
ジウム染色ゲルを示す。
化した断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動臭化エチ
ジウム染色ゲルを示す。
【図４】実施例１におけるアポＥ遺伝子タイプの検査結
果を示す。
果を示す。
【図５】実施例２におけるε４型検査の結果を示す。
１ 配列番号１のプライマー
２ 配列番号２のプライマー
３ 配列番号３のプライマー
４ 配列番号４のプライマー
Claims (10)
- 【請求項１】 アポリポプロテインＥ遺伝子に相補的
なプライマーであって、プラス鎖用プライマー及びマイ
ナス鎖用プライマーを有する少なくとも２種のプライマ
ーの組合せを、検査すべきＤＮＡ試料に用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行うことにより、アポリポプロテインＥ
遺伝子のε２，ε４，ε５及びε７変異部位を含むＤＮ
Ａ断片を増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片に、標識さ
れた対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用
いて、ε２型、ε４型、ε５型及びε７型を検査するこ
とを特徴とするアポリポプロテインＥ遺伝子タイプの検
査方法。 - 【請求項２】 アポリポプロテインＥ遺伝子に相補的
なプライマーであって、プラス鎖用プライマー及びマイ
ナス鎖用プライマーを有する少なくとも２種のプライマ
ーの組合せを、検査すべきＤＮＡ試料に用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行うことにより、アポリポプロテインＥ
遺伝子のε５変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅させ、該
増幅されたＤＮＡ断片に、標識された対立遺伝子特異的
オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ε５型を検査す
ることを特徴とするアポリポプロテインＥ遺伝子タイプ
の検査方法。 - 【請求項３】 アポリポプロテインＥ遺伝子に相補的
なプライマーであって、プラス鎖用プライマー及びマイ
ナス鎖用プライマーを有する少なくとも２種のプライマ
ーの組合せを、検査すべきＤＮＡ試料に用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行うことにより、アポリポプロテインＥ
遺伝子のε２，ε４及びε７変異部位を含むＤＮＡ断片
を増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片に、標識された対
立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて、
ε２型、ε４型及びε７型を検査することを特徴とする
アポリポプロテインＥ遺伝子タイプの検査方法。 - 【請求項４】 配列番号１，２，３又は４の塩基配列
又はこれらと同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝
子に対して有する塩基配列であるプライマー。 - 【請求項５】 請求項１に記載の方法において、プラ
ス鎖用プライマーが配列番号１の塩基配列であるか又は
該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝
子に対して有する塩基配列であり、かつマイナス鎖用プ
ライマーが配列番号４の塩基配列であるか又は該塩基配
列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対し
て有する塩基配列であるアポリポプロテインＥ遺伝子タ
イプの検査方法。 - 【請求項６】 請求項２に記載の方法において、プラ
ス鎖用プライマーが配列番号１の塩基配列であるか又は
該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝
子に対して有する塩基配列であり、かつマイナス鎖用プ
ライマーが配列番号３の塩基配列であるか又は該塩基配
列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対し
て有する塩基配列であるアポリポプロテインＥ遺伝子タ
イプの検査方法。 - 【請求項７】 請求項３に記載の方法において、プラ
ス鎖用プライマーが配列番号２の塩基配列であるか又は
該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝
子に対して有する塩基配列であり、かつマイナス鎖用プ
イラマーが配列番号４の塩基配列であるか又は該塩基配
列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ遺伝子に対し
て有する塩基配列であるアポリポプロテインＥ遺伝子タ
イプの検査方法。 - 【請求項８】 配列番号５〜２０の塩基配列であるか
又は該塩基配列と同等の相補性をアポリポプロテインＥ
遺伝子に対して有する塩基配列であるプローブ。 - 【請求項９】 請求項１〜３又は５〜７の内のいずれ
か１つに記載の方法において、対立遺伝子特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブが請求項８に記載のプローブから
選ばれたものであるアポリポプロテインＥ遺伝子タイプ
の検査方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜３又は５〜７又は９のい
ずれか１つに記載の方法において、ポリメラーゼ連鎖反
応が非対称ポリメラーゼ連鎖反応であり、該反応におい
てより多く用いたプライマーがプラス鎖用プライマーで
ある場合にはプラス鎖に相補的なプローブを用い、一方
、該反応においてより多く用いたプライマーがマイナス
鎖用プライマーである場合にはマイナス鎖に相補的なプ
ローブを用いることにより、ハイブリダイゼーションに
おける変性及び中和工程を省略することを特徴とするア
ポリポプロテインＥ遺伝子タイプの検査方法。
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|---|---|---|---|
| JP11243591A JP3514779B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | アポリポプロテインｅ遺伝子タイプの検査方法及びその検査に好適なプライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11243591A JP3514779B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | アポリポプロテインｅ遺伝子タイプの検査方法及びその検査に好適なプライマー及びプローブ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH04320700A true JPH04320700A (ja) | 1992-11-11 |
| JP3514779B2 JP3514779B2 (ja) | 2004-03-31 |
Family
ID=14586564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11243591A Expired - Fee Related JP3514779B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | アポリポプロテインｅ遺伝子タイプの検査方法及びその検査に好適なプライマー及びプローブ |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP3514779B2 (ja) |
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-
1991
- 1991-04-17 JP JP11243591A patent/JP3514779B2/ja not_active Expired - Fee Related
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