JPH04330234A - キュウリモザイクウィルス抵抗性トマト及びその作出方法 - Google Patents
キュウリモザイクウィルス抵抗性トマト及びその作出方法Info
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- JPH04330234A JPH04330234A JP3081544A JP8154491A JPH04330234A JP H04330234 A JPH04330234 A JP H04330234A JP 3081544 A JP3081544 A JP 3081544A JP 8154491 A JP8154491 A JP 8154491A JP H04330234 A JPH04330234 A JP H04330234A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、キュウリモザイクウイ
ルスの感染に対して抵抗性を示すトマト及びその作出方
法に関する。
ルスの感染に対して抵抗性を示すトマト及びその作出方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キュウリモザイクウイルスは広範囲な植
物に感染する重要病原ウイルスである。特に、トマトに
おける被害は大きく、抵抗性品種の開発が望まれている
。しかしながら、トマト栽培種あるいはその関連野生種
に抵抗性母体が存在していないために、キュウリモザイ
クウイルス防除の主眼はもっぱら栽培法及び農薬を用い
た間接的な手段に頼っているのが現状である。
物に感染する重要病原ウイルスである。特に、トマトに
おける被害は大きく、抵抗性品種の開発が望まれている
。しかしながら、トマト栽培種あるいはその関連野生種
に抵抗性母体が存在していないために、キュウリモザイ
クウイルス防除の主眼はもっぱら栽培法及び農薬を用い
た間接的な手段に頼っているのが現状である。
【０００３】近年、遺伝子組換えの手法の発展により、
ウイルスの外被タンパクやサテライトＲＮＡの遺伝子を
導入する形質転換による全く新しいタイプのウイルス抵
抗性の獲得が可能となった。従来より弱毒病原性のウイ
ルスを予め植物に接種しておくと、後に同種ウイルスの
強毒系に感染しても強毒ウイルスの感染から免れる干渉
作用は知られていた。この作用は先のウイルスが後のウ
イルスの遺伝子を保護している外被タンパクの脱外被を
妨げるためと考えられている。そこでウイルス外被タン
パクの遺伝子を取り出し形質転換法を利用して植物に導
入し、ウイルスの外被タンパクを産生する植物を作製し
ておくと、その植物は干渉作用に似たウイルス抵抗性を
示すようになることが知られている。例えば、タバコモ
ザイクウイルス（パウエルら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２
：７３８−７４３、１９８６）、アルファルファモザイ
クウイルス（チューマーら、ＥＭＢＯ Ｊ ６：１１８
１−１１８８、 １９８７及びロッシュら、ＥＭＢＯ
Ｊ ６：１８４５−１８５１、 １９８７） 、ポテト
ウイルスＸ（ヘメンウエイら、ＥＭＢＯ Ｊ ７：１２
７３−１２８０、 １９８８） 、ポテトウイルスＹ（
ローソンら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１２
７−１３４、１９９０） 及びキュウリモザイクウイル
ス（クゾーら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５
４９−５５８、 １９８８） に関して病徴軽減効果が
得られたと報告されている。
ウイルスの外被タンパクやサテライトＲＮＡの遺伝子を
導入する形質転換による全く新しいタイプのウイルス抵
抗性の獲得が可能となった。従来より弱毒病原性のウイ
ルスを予め植物に接種しておくと、後に同種ウイルスの
強毒系に感染しても強毒ウイルスの感染から免れる干渉
作用は知られていた。この作用は先のウイルスが後のウ
イルスの遺伝子を保護している外被タンパクの脱外被を
妨げるためと考えられている。そこでウイルス外被タン
パクの遺伝子を取り出し形質転換法を利用して植物に導
入し、ウイルスの外被タンパクを産生する植物を作製し
ておくと、その植物は干渉作用に似たウイルス抵抗性を
示すようになることが知られている。例えば、タバコモ
ザイクウイルス（パウエルら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２
：７３８−７４３、１９８６）、アルファルファモザイ
クウイルス（チューマーら、ＥＭＢＯ Ｊ ６：１１８
１−１１８８、 １９８７及びロッシュら、ＥＭＢＯ
Ｊ ６：１８４５−１８５１、 １９８７） 、ポテト
ウイルスＸ（ヘメンウエイら、ＥＭＢＯ Ｊ ７：１２
７３−１２８０、 １９８８） 、ポテトウイルスＹ（
ローソンら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１２
７−１３４、１９９０） 及びキュウリモザイクウイル
ス（クゾーら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５
４９−５５８、 １９８８） に関して病徴軽減効果が
得られたと報告されている。
【０００４】キュウリモザイクウイルスはＲＮＡウイル
スである。このウイルス粒子には通常４種類のＲＮＡ（
ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３、ＲＮＡ４）が含まれて
おり、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２はＲＮＡウイルスの複製に
関する遺伝子を持っている。ＲＮＡ３の５’側の遺伝子
はウイルスの細胞間移動に関与していると考えられてい
る。また、ＲＮＡ４はＲＮＡ３の３’側の遺伝子と同一
のものでありウイルスの外被タンパクの遺伝子を持って
いる。ところが、キュウリモザイクウイルスの分離株の
中にはサテライトＲＮＡと呼ばれる余分なＲＮＡを含ん
でいるものがある。このサテライトＲＮＡは３３０〜３
９０ｂｐから成る低分子ＲＮＡであり、ＲＮＡ自身は増
殖能を持たず、その複製を親ウイルスに依存している。 このサテライトＲＮＡの重要な特質は、罹病植物の病徴
を変化させることにある。つまり、キュウリモザイクウ
イルスとサテライトＲＮＡが同時に宿主植物の細胞にお
いて増殖した場合、一般にウイルスの増殖及び集積が抑
制されウイルス感染植物の病徴がサテライトＲＮＡを持
たないものと比べ軽減する場合が多い。そこでこのサテ
ライトＲＮＡを適当な形質転換法を利用して植物に導入
し、植物で発現させることによりキュウリモザイクウイ
ルスの増殖並びに病徴の進展を抑制しようとする試みが
なされ、タバコにおいては病徴軽減効果があったことが
報告されている（ハリソンら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：
７９９−８０２、 １９８７、アグリカルチュラル、ジ
ェネテックス、カンパニー、リミテッドＪＰ−ＰＡＴ
６４−２７４７４） 。また、トマトにおいてもキュウ
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡ導入が試みられ
、サテライトＲＮＡを導入したトマトも作出されたが、
通常のものより病徴が増幅され、実用的な抵抗性は得る
に至らなかった（マクガービーら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １７０：５４８
−５５５、 １９９０ 、トウシュら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． Ｐａｒｉｓｔ３１１、 Ｓｅｒｉｅ
ＩＩＩ：３７７−３８４、 １９９０） 。
スである。このウイルス粒子には通常４種類のＲＮＡ（
ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３、ＲＮＡ４）が含まれて
おり、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２はＲＮＡウイルスの複製に
関する遺伝子を持っている。ＲＮＡ３の５’側の遺伝子
はウイルスの細胞間移動に関与していると考えられてい
る。また、ＲＮＡ４はＲＮＡ３の３’側の遺伝子と同一
のものでありウイルスの外被タンパクの遺伝子を持って
いる。ところが、キュウリモザイクウイルスの分離株の
中にはサテライトＲＮＡと呼ばれる余分なＲＮＡを含ん
でいるものがある。このサテライトＲＮＡは３３０〜３
９０ｂｐから成る低分子ＲＮＡであり、ＲＮＡ自身は増
殖能を持たず、その複製を親ウイルスに依存している。 このサテライトＲＮＡの重要な特質は、罹病植物の病徴
を変化させることにある。つまり、キュウリモザイクウ
イルスとサテライトＲＮＡが同時に宿主植物の細胞にお
いて増殖した場合、一般にウイルスの増殖及び集積が抑
制されウイルス感染植物の病徴がサテライトＲＮＡを持
たないものと比べ軽減する場合が多い。そこでこのサテ
ライトＲＮＡを適当な形質転換法を利用して植物に導入
し、植物で発現させることによりキュウリモザイクウイ
ルスの増殖並びに病徴の進展を抑制しようとする試みが
なされ、タバコにおいては病徴軽減効果があったことが
報告されている（ハリソンら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：
７９９−８０２、 １９８７、アグリカルチュラル、ジ
ェネテックス、カンパニー、リミテッドＪＰ−ＰＡＴ
６４−２７４７４） 。また、トマトにおいてもキュウ
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡ導入が試みられ
、サテライトＲＮＡを導入したトマトも作出されたが、
通常のものより病徴が増幅され、実用的な抵抗性は得る
に至らなかった（マクガービーら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １７０：５４８
−５５５、 １９９０ 、トウシュら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． Ｐａｒｉｓｔ３１１、 Ｓｅｒｉｅ
ＩＩＩ：３７７−３８４、 １９９０） 。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述したようにキュウ
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡをトマトに導入
して実用的に十分なレベルの抵抗性を示すトマトを作出
することには成功していない。本発明は、キュウリモザ
イクウイルス抵抗性に優れたトマト栽培種を提供するこ
とを目的とする。
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡをトマトに導入
して実用的に十分なレベルの抵抗性を示すトマトを作出
することには成功していない。本発明は、キュウリモザ
イクウイルス抵抗性に優れたトマト栽培種を提供するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、キュウ
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡについて鋭意研
究した結果、トマトに対して黄変、病徴激化等の悪影響
がなく、極めて病徴抑制効果の高いキュウリモザイクウ
イルスのサテライトＲＮＡを単離することに成功し、こ
のサテライトＲＮＡをトマトに導入することによりキュ
ウリモザイクウイルスに対して抵抗性の高いトマトを作
出できることを見出し、この発明を完成した。すなわち
、本発明は、キュウリモザイクウイルスのサテライトＲ
ＮＡのｃＤＮＡをを含むキュウリモザイクウイルス抵抗
性トマトを提供する。
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡについて鋭意研
究した結果、トマトに対して黄変、病徴激化等の悪影響
がなく、極めて病徴抑制効果の高いキュウリモザイクウ
イルスのサテライトＲＮＡを単離することに成功し、こ
のサテライトＲＮＡをトマトに導入することによりキュ
ウリモザイクウイルスに対して抵抗性の高いトマトを作
出できることを見出し、この発明を完成した。すなわち
、本発明は、キュウリモザイクウイルスのサテライトＲ
ＮＡのｃＤＮＡをを含むキュウリモザイクウイルス抵抗
性トマトを提供する。
【０００７】本発明において、トマトに導入するキュウ
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡはトマト対して
病徴抑制効果が高く悪影響の少ないものを利用する必要
がある。本発明者らは軽微な病徴を示すキュウリモザイ
クウイルス罹病植物を採取し、これら植物体から４系統
のキュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡを単離
した。これらサテライトＲＮＡはそれぞれＳ１９−ｓａ
ｔＲＮＡ、 Ｔ４３−ｓａｔＲＮＡ、 Ｔ６２−ｓａｔ
ＲＮＡ、 Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡと命名された。これら
のキュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡをトマ
トに接種したところ、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡは病徴軽減
効果に特に優れていることが判明した（マスタら、Ａｎ
ｎ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ． Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ
５６：２０７−２１２、 １９９０）。なお、Ｔ７３−
ｓａｔＲＮＡの塩基配列は図２に示されており、上記４
系統のサテライトＲＮＡの塩基配列も上記マスタらの文
献に記載されている。 もっとも、本発明において用
いられるキュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡ
はこれらに限られるものではない。すなわち、タバコ等
のキュウリモザイクウイルスに感染して病徴を示す植物
にキュウリモザイクウイルスを感染させ、病徴が軽減さ
れたものからサテライトＲＮＡを常法により抽出し、こ
れをトマトに感染させ、キュウリモザイクウイルスに対
して優れた抵抗性を与えるものを選択することにより、
本発明に用いるのに適当なサテライトＲＮＡを得ること
が可能である。
リモザイクウイルスのサテライトＲＮＡはトマト対して
病徴抑制効果が高く悪影響の少ないものを利用する必要
がある。本発明者らは軽微な病徴を示すキュウリモザイ
クウイルス罹病植物を採取し、これら植物体から４系統
のキュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡを単離
した。これらサテライトＲＮＡはそれぞれＳ１９−ｓａ
ｔＲＮＡ、 Ｔ４３−ｓａｔＲＮＡ、 Ｔ６２−ｓａｔ
ＲＮＡ、 Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡと命名された。これら
のキュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡをトマ
トに接種したところ、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡは病徴軽減
効果に特に優れていることが判明した（マスタら、Ａｎ
ｎ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ． Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ
５６：２０７−２１２、 １９９０）。なお、Ｔ７３−
ｓａｔＲＮＡの塩基配列は図２に示されており、上記４
系統のサテライトＲＮＡの塩基配列も上記マスタらの文
献に記載されている。 もっとも、本発明において用
いられるキュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡ
はこれらに限られるものではない。すなわち、タバコ等
のキュウリモザイクウイルスに感染して病徴を示す植物
にキュウリモザイクウイルスを感染させ、病徴が軽減さ
れたものからサテライトＲＮＡを常法により抽出し、こ
れをトマトに感染させ、キュウリモザイクウイルスに対
して優れた抵抗性を与えるものを選択することにより、
本発明に用いるのに適当なサテライトＲＮＡを得ること
が可能である。
【０００８】次に、本発明のキュウリモザイクウイルス
抵抗性トマトを作出する工程を説明する。本発明におい
て、サテライトＲＮＡを植物に導入し発現させるために
は、ＤＮＡである必要がある。そのため単離したサテラ
イトＲＮＡはその全長を含むｃＤＮＡを合成プライマー
及び逆転写酵素を用いて常法によりクローニングを行な
うことができる。
抵抗性トマトを作出する工程を説明する。本発明におい
て、サテライトＲＮＡを植物に導入し発現させるために
は、ＤＮＡである必要がある。そのため単離したサテラ
イトＲＮＡはその全長を含むｃＤＮＡを合成プライマー
及び逆転写酵素を用いて常法によりクローニングを行な
うことができる。
【０００９】上記のようにして得られたサテライトＲＮ
ＡのｃＤＮＡは形質転換法を用いてトマトに導入するこ
とができる。従来、トマトの形質転換は効率が低く、ま
た、品種によっては形質転換が著しく困難であった。本
願発明者は、極めて効率が高く、また、トマトに害を与
えない新規なトマト形質転換方法を開発し、特許出願し
た（特願平２−４１１６８１号）。キュウリモザイクウ
イルスは、この方法によりトマトに導入することができ
る。
ＡのｃＤＮＡは形質転換法を用いてトマトに導入するこ
とができる。従来、トマトの形質転換は効率が低く、ま
た、品種によっては形質転換が著しく困難であった。本
願発明者は、極めて効率が高く、また、トマトに害を与
えない新規なトマト形質転換方法を開発し、特許出願し
た（特願平２−４１１６８１号）。キュウリモザイクウ
イルスは、この方法によりトマトに導入することができ
る。
【００１０】この方法では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ のＴｉプラスミドｐＴｉ
Ｂｏ５４２のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ領域を含む
プラスミド及びキュウリモザイクウイルスのサテライト
ＲＮＡのｃＤＮＡを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ でトマトを形質転換する
。ここで、ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由来の
ＤＮＡは、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＧ及びｖｉｒＣ遺伝子を含
むものであることが好ましい。このようなプラスミドの
好ましい具体例として、後述の実施例において詳述する
プラスミドｐＴＯＫ１６２ を挙げることができる。キ
ュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡは、上記プ
ラスミドのＴ領域中に挿入する。この挿入は、制限酵素
を用いた常法により行うことも可能であるが、プラスミ
ドｐＴＯＫ１６２ のように、大型で多数の制限酵素部
位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所
望のＤＮＡをＴ領域内に導入することが必ずしも容易で
はないことがある。このような場合には、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 細胞内のｉ
ｎ ｖｉｖｏ 系での相同組換え（ヘレラ−エステレラ
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：９８７−９９５、１９８３年、
ホーチら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２３：４９６−４９８
、 １９８４年）を利用することにより、目的のＤＮＡ
をｐＴＯＫ１６２ に導入することが可能になる。すな
わち、例えば、先ず、ｐＴＯＫ１６２ をＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に導入して
おいて、この菌にさらにキュウリモザイクウイルスのサ
テライトＲＮＡのｃＤＮＡを導入したｐＢＲ３２２と呼
ばれるプラスミド（類似のプラスミドを含む）を導入す
る。ｐＴＯＫ１６２ のＤＮＡにはｐＢＲ３２２と相同
な部分があるので、ｐＢＲ３２２誘導体は相同配列を介
した組み替えによりｐＴＯＫ１６２ に組み込まれるこ
とになる。ｐＢＲ３２２はｐＴＯＫ１６２ と異なりＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
中では複製できないので、このような組み込まれた状態
（ｐＴＯＫ１６２：：ｐＢＲ３２２ と言う）でなけれ
ばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ 中で生存することができない。そして、ｐＴＯＫ１
６２ とｐＢＲ３２２誘導体のそれぞれに特異的な特性
（薬剤耐性等）に基づいて選抜すれば、ｐＴＯＫ１６２
：：ｐＢＲ３２２ 誘導体を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を得ることができ
る。次いで、このプラスミドを導入したＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ とトマトの子
葉断片を液体倍地中で共存培養することによりｃＤＮＡ
をトマトに導入することができる。子葉断片は洗浄後、
例えばプラスミドが薬剤耐性を有する場合、抗生物質を
含むトマト茎葉分化培地に着床させ、抗生物質に対して
耐性を示す茎葉を発根培地に着床させ、形質転換体を得
ることができる。 出現した形質転換体については、形態及び形質調査、サ
テライトＲＮＡのｃＤＮＡの導入及びｍＲＮＡ転写の確
認及びキュウリモザイクウイルスの接種を行うことによ
りキュウリモザイクウイルス抵抗性トマトを得ることが
できる。
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ のＴｉプラスミドｐＴｉ
Ｂｏ５４２のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ領域を含む
プラスミド及びキュウリモザイクウイルスのサテライト
ＲＮＡのｃＤＮＡを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ でトマトを形質転換する
。ここで、ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由来の
ＤＮＡは、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＧ及びｖｉｒＣ遺伝子を含
むものであることが好ましい。このようなプラスミドの
好ましい具体例として、後述の実施例において詳述する
プラスミドｐＴＯＫ１６２ を挙げることができる。キ
ュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡは、上記プ
ラスミドのＴ領域中に挿入する。この挿入は、制限酵素
を用いた常法により行うことも可能であるが、プラスミ
ドｐＴＯＫ１６２ のように、大型で多数の制限酵素部
位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所
望のＤＮＡをＴ領域内に導入することが必ずしも容易で
はないことがある。このような場合には、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 細胞内のｉ
ｎ ｖｉｖｏ 系での相同組換え（ヘレラ−エステレラ
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：９８７−９９５、１９８３年、
ホーチら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２３：４９６−４９８
、 １９８４年）を利用することにより、目的のＤＮＡ
をｐＴＯＫ１６２ に導入することが可能になる。すな
わち、例えば、先ず、ｐＴＯＫ１６２ をＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に導入して
おいて、この菌にさらにキュウリモザイクウイルスのサ
テライトＲＮＡのｃＤＮＡを導入したｐＢＲ３２２と呼
ばれるプラスミド（類似のプラスミドを含む）を導入す
る。ｐＴＯＫ１６２ のＤＮＡにはｐＢＲ３２２と相同
な部分があるので、ｐＢＲ３２２誘導体は相同配列を介
した組み替えによりｐＴＯＫ１６２ に組み込まれるこ
とになる。ｐＢＲ３２２はｐＴＯＫ１６２ と異なりＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
中では複製できないので、このような組み込まれた状態
（ｐＴＯＫ１６２：：ｐＢＲ３２２ と言う）でなけれ
ばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ 中で生存することができない。そして、ｐＴＯＫ１
６２ とｐＢＲ３２２誘導体のそれぞれに特異的な特性
（薬剤耐性等）に基づいて選抜すれば、ｐＴＯＫ１６２
：：ｐＢＲ３２２ 誘導体を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を得ることができ
る。次いで、このプラスミドを導入したＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ とトマトの子
葉断片を液体倍地中で共存培養することによりｃＤＮＡ
をトマトに導入することができる。子葉断片は洗浄後、
例えばプラスミドが薬剤耐性を有する場合、抗生物質を
含むトマト茎葉分化培地に着床させ、抗生物質に対して
耐性を示す茎葉を発根培地に着床させ、形質転換体を得
ることができる。 出現した形質転換体については、形態及び形質調査、サ
テライトＲＮＡのｃＤＮＡの導入及びｍＲＮＡ転写の確
認及びキュウリモザイクウイルスの接種を行うことによ
りキュウリモザイクウイルス抵抗性トマトを得ることが
できる。
【００１１】
【発明の効果】本発明により、キュウリモザイクウイル
スの感染による生育遅延、果実収量の低下等の被害を伴
わない事実上十分キュウリモザイクウイルスに対して抵
抗性のあるトマト及びその作出方法が提供された。本発
明のトマトは、キュウリモザイクウイルス通常系（Ｏ系
統）の感染によっても殆どが病徴を示さない抵抗性トマ
トである。
スの感染による生育遅延、果実収量の低下等の被害を伴
わない事実上十分キュウリモザイクウイルスに対して抵
抗性のあるトマト及びその作出方法が提供された。本発
明のトマトは、キュウリモザイクウイルス通常系（Ｏ系
統）の感染によっても殆どが病徴を示さない抵抗性トマ
トである。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を実施例により、さらに具体的
に説明するが、本発明の実施例はこれに限定されるもの
ではない。なお、以下の実施例において、特に断りがな
い限り、ティー・マニアティス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ（１９８２））記載の方法により行った。 （１） Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡの単離及びｃＤＮＡのク
ローニング栃木県下のタバコ産地を中心に種々のキュウ
リモザイクウイルスの採取を行い、４系統のキュウリモ
ザイクウイルスのサテライトＲＮＡを単離した。これら
のサテライトＲＮＡの４系統は、それぞれＳ１９−ｓａ
ｔＲＮＡ、 Ｔ４３−ｓａｔＲＮＡ、Ｔ６２−ｓａｔＲ
ＮＡ、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡと命名した。これらのキュ
ウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡをトマトに接
種したところＴ７３−ｓａｔＲＮＡはトマトの病徴軽減
に特に優れていることが判明した（マスタら、上掲）。 次いで、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡの全長を含むｃＤＮＡを
合成プライマーと逆転写酵素を用いてクローニングを行
った。この操作は具体的には次のように行った。Ｔ７３
−ｓａｔＲＮＡの３’末端領域と相同な合成プローブを
プライマーとし、第一鎖のｃＤＮＡ合成を行い、ＲＮＡ
−ＤＮＡ雑種分子を得た。この雑種分子をＲＮａｓｅＨ
で処理した後、ＤＮＡの３’末端と相同な合成プローブ
をプライマーとして第２鎖のＤＮＡを得た。このように
して得られた全長ｃＤＮＡを、プラスミドｐＵＣ１１９
（ 宝酒造株式会社製）のＳｍａＩ部位に導入し、ｐＵ
Ｃ１１９−７３ｓａｔを得た。
に説明するが、本発明の実施例はこれに限定されるもの
ではない。なお、以下の実施例において、特に断りがな
い限り、ティー・マニアティス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ（１９８２））記載の方法により行った。 （１） Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡの単離及びｃＤＮＡのク
ローニング栃木県下のタバコ産地を中心に種々のキュウ
リモザイクウイルスの採取を行い、４系統のキュウリモ
ザイクウイルスのサテライトＲＮＡを単離した。これら
のサテライトＲＮＡの４系統は、それぞれＳ１９−ｓａ
ｔＲＮＡ、 Ｔ４３−ｓａｔＲＮＡ、Ｔ６２−ｓａｔＲ
ＮＡ、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡと命名した。これらのキュ
ウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡをトマトに接
種したところＴ７３−ｓａｔＲＮＡはトマトの病徴軽減
に特に優れていることが判明した（マスタら、上掲）。 次いで、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡの全長を含むｃＤＮＡを
合成プライマーと逆転写酵素を用いてクローニングを行
った。この操作は具体的には次のように行った。Ｔ７３
−ｓａｔＲＮＡの３’末端領域と相同な合成プローブを
プライマーとし、第一鎖のｃＤＮＡ合成を行い、ＲＮＡ
−ＤＮＡ雑種分子を得た。この雑種分子をＲＮａｓｅＨ
で処理した後、ＤＮＡの３’末端と相同な合成プローブ
をプライマーとして第２鎖のＤＮＡを得た。このように
して得られた全長ｃＤＮＡを、プラスミドｐＵＣ１１９
（ 宝酒造株式会社製）のＳｍａＩ部位に導入し、ｐＵ
Ｃ１１９−７３ｓａｔを得た。
【００１３】（２） プラスミドｐＴＯＫ１６２ への
サテライトＲＮＡの導入 （１） で得られたｃＤＮＡを植物発現用ベクターｐＬ
ＧＶ２３８２に常法により組み込み、ｐＬＧＶ２３８２
−７３ｓａｔを得た。このベクターを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ 及びＰｖｕＩＩ で切断し、Ｎｏｓ プロモー
タ、Ｔ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤＮＡ及びＮｏｓ ター
ミネーターを含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断
片を大腸菌ＤＮＡポリメレースＩクレノー断片により平
滑末端とした。次に、トランスポゾンＴｎ７ の制限酵
素ＣｌａＩ断片２．５ｋｂ 由来のスペクチノマイシン
耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２を制限酵素ＣｌａＩで切
断した後、大腸菌ＤＮＡポリメレースＩクレノー断片に
より平滑末端とし、先のＤＮＡ断片とＴ４ライゲースに
より連結を行ないＴ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤＮＡ，ス
ペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｐＹＳ１３４を得た
。このようにして得られたｐＹＳ１３４をカナマイシン
及びテトラサイクリン耐性を持つプラスミドｐＴＯＫ１
６２ （コマリ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ
９：３０３−３０６、 １９９０）を有するＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の菌種
ＬＢＡ４４０４ （ホックマンら、Ｎａｔｕｒｅ ３０
３：１７９−１８０、 １９８３） に三系交配法（デ
ィッタら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７７：７３４７−７３５１１９８０） により導
入した。次に、カナマイシン、スペクチノマイシン双方
に耐性を示すコロニーを選抜した。得られた耐性コロニ
ーは２種のプラスミドｐＹＳ１３４、 ｐＴＯＫ１６２
の中の相同領域を介した組み換えによって出現したも
のである。 以上の結果、プラスミドｐＴＯＫ１６２ にＴ７３−ｓ
ａｔＲＮＡ遺伝子を組み込んだプラスミドを構築し、こ
れをｐＹＳ１４３と命名した。図１にプラスミドｐＹＳ
１４３の構築の図を示す。
サテライトＲＮＡの導入 （１） で得られたｃＤＮＡを植物発現用ベクターｐＬ
ＧＶ２３８２に常法により組み込み、ｐＬＧＶ２３８２
−７３ｓａｔを得た。このベクターを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ 及びＰｖｕＩＩ で切断し、Ｎｏｓ プロモー
タ、Ｔ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤＮＡ及びＮｏｓ ター
ミネーターを含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断
片を大腸菌ＤＮＡポリメレースＩクレノー断片により平
滑末端とした。次に、トランスポゾンＴｎ７ の制限酵
素ＣｌａＩ断片２．５ｋｂ 由来のスペクチノマイシン
耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２を制限酵素ＣｌａＩで切
断した後、大腸菌ＤＮＡポリメレースＩクレノー断片に
より平滑末端とし、先のＤＮＡ断片とＴ４ライゲースに
より連結を行ないＴ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤＮＡ，ス
ペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｐＹＳ１３４を得た
。このようにして得られたｐＹＳ１３４をカナマイシン
及びテトラサイクリン耐性を持つプラスミドｐＴＯＫ１
６２ （コマリ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ
９：３０３−３０６、 １９９０）を有するＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の菌種
ＬＢＡ４４０４ （ホックマンら、Ｎａｔｕｒｅ ３０
３：１７９−１８０、 １９８３） に三系交配法（デ
ィッタら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７７：７３４７−７３５１１９８０） により導
入した。次に、カナマイシン、スペクチノマイシン双方
に耐性を示すコロニーを選抜した。得られた耐性コロニ
ーは２種のプラスミドｐＹＳ１３４、 ｐＴＯＫ１６２
の中の相同領域を介した組み換えによって出現したも
のである。 以上の結果、プラスミドｐＴＯＫ１６２ にＴ７３−ｓ
ａｔＲＮＡ遺伝子を組み込んだプラスミドを構築し、こ
れをｐＹＳ１４３と命名した。図１にプラスミドｐＹＳ
１４３の構築の図を示す。
【００１４】（３） トマトの形質転換（２） で得ら
れたＬＢＡ４４０４（ｐＹＳ１４３） を用いてトマト
の形質転換を行なった。形質転換は、トマト品種桃太郎
（タキイ種苗株式会社）及びＪＴＭ−７（日本たばこ株
式会社、植物開発研究所で育成したもの）を使用した。 これらの種子をエチルアルコール及び次亜鉛素酸ナトリ
ウムにより滅菌した後、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ（１９６５）の無機塩類、３０ｇ／ｌ のシ
ュクロース及び寒天（０．９％） を含む培地に播種し
た。播種１０日後、無菌的に発芽させたトマトの子葉を
０．７ ×０．７ ｃｍの大きさに切断した。この子葉
の断片１ｇ とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ 約１０８ 細胞とをＬｉｎｓｍａｉｅ
ｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ の無機塩類と３０ｇ ／ｌ
のグルコースより成る液体培地中で４０時間共存培養し
た。 そして、子葉断片を滅菌水で洗浄し、細菌を洗い落とし
た後、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ の無
機塩類、インドール酢酸０．３ｍｇ／ｌ 、イソペンテ
ニルアデニン１０ ｍｇ／ｌ 、カナマイシン１００ｍ
ｇ／ｌ 、セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌ 、グルコー
ス３０ｇ／ｌ を含む寒天（０．９％） 培地に着床し
た。培養２０日後、着床した子葉断片よりカナマイシン
耐性カルスが出現した。これらのカルスを上記培地上で
さらに１５日間培養を行なった結果、カナマイシン耐性
を示す茎葉が出現した。これらの茎葉を切断し、Ｌｉｎ
ｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ の無機塩類、３０
ｇ／ｌ のシュクロース及びセフォタキシム２５０ｍｇ
／ｌ を含む寒天（０．９％） 培地に着床した。培養
３０日後、発根した植物体を閉鎖型室温内で栽培した。 その結果、ＪＴＭ−７について再分化植物４個体（Ｓａ
ｔ−７１、Ｓａｔ−７２、Ｓａｔ−７３、Ｓａｔ−７４
）が得られ、桃太郎については再分化植物３個体（Ｓａ
ｔｍ−１１、 Ｓａｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−１３）が
得られた。
れたＬＢＡ４４０４（ｐＹＳ１４３） を用いてトマト
の形質転換を行なった。形質転換は、トマト品種桃太郎
（タキイ種苗株式会社）及びＪＴＭ−７（日本たばこ株
式会社、植物開発研究所で育成したもの）を使用した。 これらの種子をエチルアルコール及び次亜鉛素酸ナトリ
ウムにより滅菌した後、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ（１９６５）の無機塩類、３０ｇ／ｌ のシ
ュクロース及び寒天（０．９％） を含む培地に播種し
た。播種１０日後、無菌的に発芽させたトマトの子葉を
０．７ ×０．７ ｃｍの大きさに切断した。この子葉
の断片１ｇ とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ 約１０８ 細胞とをＬｉｎｓｍａｉｅ
ｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ の無機塩類と３０ｇ ／ｌ
のグルコースより成る液体培地中で４０時間共存培養し
た。 そして、子葉断片を滅菌水で洗浄し、細菌を洗い落とし
た後、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ の無
機塩類、インドール酢酸０．３ｍｇ／ｌ 、イソペンテ
ニルアデニン１０ ｍｇ／ｌ 、カナマイシン１００ｍ
ｇ／ｌ 、セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌ 、グルコー
ス３０ｇ／ｌ を含む寒天（０．９％） 培地に着床し
た。培養２０日後、着床した子葉断片よりカナマイシン
耐性カルスが出現した。これらのカルスを上記培地上で
さらに１５日間培養を行なった結果、カナマイシン耐性
を示す茎葉が出現した。これらの茎葉を切断し、Ｌｉｎ
ｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ の無機塩類、３０
ｇ／ｌ のシュクロース及びセフォタキシム２５０ｍｇ
／ｌ を含む寒天（０．９％） 培地に着床した。培養
３０日後、発根した植物体を閉鎖型室温内で栽培した。 その結果、ＪＴＭ−７について再分化植物４個体（Ｓａ
ｔ−７１、Ｓａｔ−７２、Ｓａｔ−７３、Ｓａｔ−７４
）が得られ、桃太郎については再分化植物３個体（Ｓａ
ｔｍ−１１、 Ｓａｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−１３）が
得られた。
【００１５】（４） 再分化植物の形態（３） で得ら
れた再分化植物とその親品種ＪＴＭ−７又は桃太郎との
比較調査を行なった。その結果、これらの形質転換体の
形態及び生育特性は親品種と変わらず、稔性も正常であ
り、果実の形成も親品種と同様正常であった。
れた再分化植物とその親品種ＪＴＭ−７又は桃太郎との
比較調査を行なった。その結果、これらの形質転換体の
形態及び生育特性は親品種と変わらず、稔性も正常であ
り、果実の形成も親品種と同様正常であった。
【００１６】（５） サザン分析によるＴ７３−ｓａｔ
ＲＮＡ遺伝子の導入の確認 再分化植物体のうち、Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２、
Ｓａｔｍ−１１、 Ｓａｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−１
３ についてサザン分析によるＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺
伝子の導入の確認を行なった。まず、これら５個体の葉
からコマリらの方法（コマリら、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ
Ｇｅｎｅｔ ７７：５４７−５５２、 １９８９）に
従い、全ＤＮＡの抽出を行なった。得られた全ＤＮＡを
制限酵素Ｂａｍ Ｈ１で切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片の分離を行なった。次に、これらの
ＤＮＡ断片をナイロン膜、ジーン スクリーン プ
ラス（ジュポン社製）に移行させ、プラスミドｐＵＣ１
１９−７３ｓａｔのＨｉｎｄ ＩＩＩ、 ＥｃｏＲＩ
断片０．４ｋｂ をランダム・プライム法（ベーリンガ
ー、マンハイム社製）により３２Ｐ標識したプローブを
用いてサザン分析を行なった。その結果を図３に示す。 サザン分析の結果、Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２にお
いて５．８ｋｂ のバンドが検出され、これは導入され
たＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子を含むＢａｍ Ｈ１断片
の大きさとほぼ一致した。また対照として用いたＪＴＭ
−７にはにこのようなバンドは検出されなかった。この
結果から、これら２個体にＴ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤ
ＮＡが組み込まれていることが明らかになった。一方、
桃太郎の形質転換体３個体についても同様に分析を行な
った結果、Ｔ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤＮＡの導入が確
認された。
ＲＮＡ遺伝子の導入の確認 再分化植物体のうち、Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２、
Ｓａｔｍ−１１、 Ｓａｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−１
３ についてサザン分析によるＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺
伝子の導入の確認を行なった。まず、これら５個体の葉
からコマリらの方法（コマリら、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ
Ｇｅｎｅｔ ７７：５４７−５５２、 １９８９）に
従い、全ＤＮＡの抽出を行なった。得られた全ＤＮＡを
制限酵素Ｂａｍ Ｈ１で切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片の分離を行なった。次に、これらの
ＤＮＡ断片をナイロン膜、ジーン スクリーン プ
ラス（ジュポン社製）に移行させ、プラスミドｐＵＣ１
１９−７３ｓａｔのＨｉｎｄ ＩＩＩ、 ＥｃｏＲＩ
断片０．４ｋｂ をランダム・プライム法（ベーリンガ
ー、マンハイム社製）により３２Ｐ標識したプローブを
用いてサザン分析を行なった。その結果を図３に示す。 サザン分析の結果、Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２にお
いて５．８ｋｂ のバンドが検出され、これは導入され
たＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子を含むＢａｍ Ｈ１断片
の大きさとほぼ一致した。また対照として用いたＪＴＭ
−７にはにこのようなバンドは検出されなかった。この
結果から、これら２個体にＴ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤ
ＮＡが組み込まれていることが明らかになった。一方、
桃太郎の形質転換体３個体についても同様に分析を行な
った結果、Ｔ７３−ＳａｔＲＮＡのｃＤＮＡの導入が確
認された。
【００１７】（６） ノーザン分析によるＴ７３−ｓａ
ｔＲＮＡ遺伝子の転写の確認 再分化植物体Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２についてノ
ーザン分析によるＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子のｍＲＮ
Ａ転写の確認を行なった。 先ず、これら２個体の葉より全ＲＮＡを抽出し、トーマ
スの方法（トーマス、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５２０１−５２０５（１９８０
））に従いグリオキサルとジメチルスルホキサイドでＲ
ＮＡを変性させた後、アガロースゲル電気泳動により分
離した。次に、これらＲＮＡをナイロン膜、ジーンスク
リーンプラス（ジュポン社製）に移行させ、サザン分析
と同様の０．４ｋｂ のＤＮＡ断片をプローブに用いて
ノーザン分析を行なった。その結果を図４に示す。ノー
ザン分析の結果、Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２におい
て１．３ｋｂのｍＲＮＡの転写が認められた。これは予
測されるＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子から転写されるｍ
ＲＮＡの大きさと一致するものである。また、対照とし
て用いたＪＴＭ−７にはこのようなｍＲＮＡの転写は認
められなかった。この結果はこれら２個体においてＴ７
３−ＳａｔＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡが転写されているこ
とを示している。再分化植物体Ｓａｔｍ−１１、 Ｓａ
ｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−１３ についても同様に分析
した結果、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡの転
写が確認された。
ｔＲＮＡ遺伝子の転写の確認 再分化植物体Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２についてノ
ーザン分析によるＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子のｍＲＮ
Ａ転写の確認を行なった。 先ず、これら２個体の葉より全ＲＮＡを抽出し、トーマ
スの方法（トーマス、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５２０１−５２０５（１９８０
））に従いグリオキサルとジメチルスルホキサイドでＲ
ＮＡを変性させた後、アガロースゲル電気泳動により分
離した。次に、これらＲＮＡをナイロン膜、ジーンスク
リーンプラス（ジュポン社製）に移行させ、サザン分析
と同様の０．４ｋｂ のＤＮＡ断片をプローブに用いて
ノーザン分析を行なった。その結果を図４に示す。ノー
ザン分析の結果、Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２におい
て１．３ｋｂのｍＲＮＡの転写が認められた。これは予
測されるＴ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子から転写されるｍ
ＲＮＡの大きさと一致するものである。また、対照とし
て用いたＪＴＭ−７にはこのようなｍＲＮＡの転写は認
められなかった。この結果はこれら２個体においてＴ７
３−ＳａｔＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡが転写されているこ
とを示している。再分化植物体Ｓａｔｍ−１１、 Ｓａ
ｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−１３ についても同様に分析
した結果、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡの転
写が確認された。
【００１８】（７） キュウリモザイクウイルスの人工
接種による病徴の発現 Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡのｃＤＮＡの導入及びｍＲＮＡの
転写が認められた形質転換体Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−
７２についてキュウリモザイクウイルス普通系（Ｏ系統
）の接種を行なった。対照として親品種であるＪＴＭ−
７を用いた。その結果、キュウリモザイクウイルスＯ系
統を接種したＳａｔ−７１、Ｓａｔ−７２ は僅かなが
らモザイク様の病徴を示したが、形態及び生育状態は、
キュウリモザイクウイルスＯ系統の接種を行なっていな
い対照のＪＴＭ−７と何ら変わりはなかった。また、対
照のＪＴＭ−７と同様に正常に果実の形成が認められた
。一方、キュウリモザイクウイルスＯ系統の接種を行な
ったＪＴＭ−７は生育も極度に遅れ、果実も形成されな
かった。以上の結果より、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡの発現
が確認された個体は普通系キュウリモザイクウイルスが
感染しても病徴発現が極めて軽微であることが明らかに
なった。次に、キュウリモザイクウイルスＯ系統の接種
を行なったＳａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２より抽出した
ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析した。その
結果を図５に示す。キュウリモザイクウイルスＯ系統の
ＲＮＡのほか、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡが増殖しているこ
とが確認された。一方、対照として用いたキュウリモザ
イクウイルスＯ系統の接種を行なったＪＴＭ−７におい
てはＴ７３−ｓａｔＲＮＡは認められなかった。この結
果から、ここで認められたＴ７３−ｓａｔＲＮＡの増殖
が病徴軽減効果をもたらしていると考えられる。形質転
換体Ｓａｔｍ−１１、 Ｓａｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−
１３ についても同様にキュウリモザイクウイルスＯ系
統の接種を行なったところ病徴は殆ど現われず、これら
の形質転換体でＴ７３−ｓａｔＲＮＡの増殖が認められ
た。以上の結果から、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡのｃＤＮＡ
を導入したトマトは、キュウリモザイクウイルスに感染
しても極めて軽微な病徴を示すのみで、事実上抵抗性を
持つことが明らかとなった。従って、本発明により現在
まで得ることのできなかったキュウリモザイクウイルス
抵抗性トマトを作出することが可能となった。
接種による病徴の発現 Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡのｃＤＮＡの導入及びｍＲＮＡの
転写が認められた形質転換体Ｓａｔ−７１、 Ｓａｔ−
７２についてキュウリモザイクウイルス普通系（Ｏ系統
）の接種を行なった。対照として親品種であるＪＴＭ−
７を用いた。その結果、キュウリモザイクウイルスＯ系
統を接種したＳａｔ−７１、Ｓａｔ−７２ は僅かなが
らモザイク様の病徴を示したが、形態及び生育状態は、
キュウリモザイクウイルスＯ系統の接種を行なっていな
い対照のＪＴＭ−７と何ら変わりはなかった。また、対
照のＪＴＭ−７と同様に正常に果実の形成が認められた
。一方、キュウリモザイクウイルスＯ系統の接種を行な
ったＪＴＭ−７は生育も極度に遅れ、果実も形成されな
かった。以上の結果より、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡの発現
が確認された個体は普通系キュウリモザイクウイルスが
感染しても病徴発現が極めて軽微であることが明らかに
なった。次に、キュウリモザイクウイルスＯ系統の接種
を行なったＳａｔ−７１、 Ｓａｔ−７２より抽出した
ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析した。その
結果を図５に示す。キュウリモザイクウイルスＯ系統の
ＲＮＡのほか、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡが増殖しているこ
とが確認された。一方、対照として用いたキュウリモザ
イクウイルスＯ系統の接種を行なったＪＴＭ−７におい
てはＴ７３−ｓａｔＲＮＡは認められなかった。この結
果から、ここで認められたＴ７３−ｓａｔＲＮＡの増殖
が病徴軽減効果をもたらしていると考えられる。形質転
換体Ｓａｔｍ−１１、 Ｓａｔｍ−１２、 Ｓａｔｍ−
１３ についても同様にキュウリモザイクウイルスＯ系
統の接種を行なったところ病徴は殆ど現われず、これら
の形質転換体でＴ７３−ｓａｔＲＮＡの増殖が認められ
た。以上の結果から、Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡのｃＤＮＡ
を導入したトマトは、キュウリモザイクウイルスに感染
しても極めて軽微な病徴を示すのみで、事実上抵抗性を
持つことが明らかとなった。従って、本発明により現在
まで得ることのできなかったキュウリモザイクウイルス
抵抗性トマトを作出することが可能となった。
【図１】プラスミドｐＹＳ１４３の構築を示す図。
【図２】Ｔ７３−ｓａｔＲＮＡの全塩基配列を示す図。
【図３】形質転換体Ｓａｔ−７１、Ｓａｔ−７２ を用
いたサザン分析の結果を示す図。
いたサザン分析の結果を示す図。
【図４】形質転換体Ｓａｔ−７１、Ｓａｔ−７２ を用
いたノーザン分析の結果を示す図。
いたノーザン分析の結果を示す図。
【図５】ＣＭＶ接種形質転換体Ｓａｔ−７１のＲＮＡの
アガロースゲル電気泳動の結果を示す図。
アガロースゲル電気泳動の結果を示す図。
Claims (5)
- 【請求項１】 キュウリモザイクウイルスのサテライ
トＲＮＡのｃＤＮＡをを含むキュウリモザイクウイルス
抵抗性トマト。 - 【請求項２】 前記ｃＤＮＡがキュウリモザイクウイ
ルスのＴ７３−ｓａｔＲＮＡのｃＤＮＡである請求項１
記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性トマト。 - 【請求項３】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ のＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ領域を含むプラスミド
及びキュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡのｃ
ＤＮＡを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ でトマトを形質転換することから成
るトマトの形質転換方法。 - 【請求項４】 前記ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス
領域由来のＤＮＡは、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＧ及びｖｉｒＣ
遺伝子を含む請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域由来のＤＮＡを含有するプラスミド
はプラスミドｐＴＯＫ１６２ である請求項３記載の方
法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3081544A JPH04330234A (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | キュウリモザイクウィルス抵抗性トマト及びその作出方法 |
| EP19920104774 EP0504869A3 (en) | 1991-03-20 | 1992-03-19 | Tomato resistant to cucumber mosaic virus and method for transforming tomato |
Applications Claiming Priority (1)
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