JPH04330281A - Ｄｎａの塩基配列検出方法 - Google Patents
Ｄｎａの塩基配列検出方法Info
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- JPH04330281A JPH04330281A JP3098920A JP9892091A JPH04330281A JP H04330281 A JPH04330281 A JP H04330281A JP 3098920 A JP3098920 A JP 3098920A JP 9892091 A JP9892091 A JP 9892091A JP H04330281 A JPH04330281 A JP H04330281A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子生物分野、医療分
野、法医学分野、農林水産業、製薬業などに於いて有用
な、ＤＮＡの塩基配列の検出方法に関する。
野、法医学分野、農林水産業、製薬業などに於いて有用
な、ＤＮＡの塩基配列の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年バイオテクノロジーとして、生物の
遺伝子を操作して、より優れた有用な特性を有する生物
体を産出させたり、有用な物質をより効率良く産出させ
る生物体にするなどの研究が盛んに行われている。これ
らのバイオテクノロジー分野においては、遺伝子の特性
を左右するＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の塩基配列を知
ることが重要であり、従来、いくつかのＤＮＡの塩基配
列の検出方法が提案されている。
遺伝子を操作して、より優れた有用な特性を有する生物
体を産出させたり、有用な物質をより効率良く産出させ
る生物体にするなどの研究が盛んに行われている。これ
らのバイオテクノロジー分野においては、遺伝子の特性
を左右するＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の塩基配列を知
ることが重要であり、従来、いくつかのＤＮＡの塩基配
列の検出方法が提案されている。
【０００３】図２から図４にそって、近年よく使われて
いるＤＮＡの塩基配列検出方法を説明する。図２は一本
鎖ＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡを構成する
４種類のヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡを合成す
る様子を示した概念図である。図２の（ａ）に示した如
く、調べたいＤＮＡ分子をアルカリ処理して一本鎖ＤＮ
Ａ９にする。次に、図２の（ｂ）に示した如く、この一
本鎖ＤＮＡ９に、放射性３２Ｐを含むプライマー１０を
付ける。この溶液にＤＮＡの構成分子である４種類のデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸１１（この分子の一般
名称をヌクレオチドといい、塩基としてアデニンを含む
もの（Ａ）、チミンを含むもの（Ｔ）、シトシンを含む
もの（Ｃ）、グアニンを含むもの（Ｇ）がある）とＤＮ
Ａポリメラーゼを存在させておくと、図２の（ｃ）に示
した如く、一本鎖ＤＮＡ９上に相補的な塩基対（チミン
にはアデニンが、グアニンにはシトシンがそれぞれ特異
的に水素結合する）ができ、二本鎖のＤＮＡ１２ができ
あがる。
いるＤＮＡの塩基配列検出方法を説明する。図２は一本
鎖ＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡを構成する
４種類のヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡを合成す
る様子を示した概念図である。図２の（ａ）に示した如
く、調べたいＤＮＡ分子をアルカリ処理して一本鎖ＤＮ
Ａ９にする。次に、図２の（ｂ）に示した如く、この一
本鎖ＤＮＡ９に、放射性３２Ｐを含むプライマー１０を
付ける。この溶液にＤＮＡの構成分子である４種類のデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸１１（この分子の一般
名称をヌクレオチドといい、塩基としてアデニンを含む
もの（Ａ）、チミンを含むもの（Ｔ）、シトシンを含む
もの（Ｃ）、グアニンを含むもの（Ｇ）がある）とＤＮ
Ａポリメラーゼを存在させておくと、図２の（ｃ）に示
した如く、一本鎖ＤＮＡ９上に相補的な塩基対（チミン
にはアデニンが、グアニンにはシトシンがそれぞれ特異
的に水素結合する）ができ、二本鎖のＤＮＡ１２ができ
あがる。
【０００４】ところで、ヌクレオチドの構成分子である
デオキシリボースの３′位の水酸基を水素で置換したジ
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が少量存在する場合
を考えてみる。このような修飾ヌクレオチドがＤＮＡに
取り込まれると次のヌクレオチドの付加ができなくなり
、反応はここで止まる。従って、図３に示すように塩基
としてアデニンを持つ修飾ヌクレオチド１３を少量混ぜ
て一定時間反応させると、このアデニンを持つ修飾ヌク
レオチド１３は、ランダム重合体を合成する場合のモノ
マーの如く連鎖中にランダムに取り込まれるため、末端
の塩基がアデニンの長さの異なる種々の二本鎖ＤＮＡが
できる。図３はこの様子をモデル的に示した末端がアデ
ニンの種々の長さのＤＮＡの作成方法を示したモデル図
である。
デオキシリボースの３′位の水酸基を水素で置換したジ
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が少量存在する場合
を考えてみる。このような修飾ヌクレオチドがＤＮＡに
取り込まれると次のヌクレオチドの付加ができなくなり
、反応はここで止まる。従って、図３に示すように塩基
としてアデニンを持つ修飾ヌクレオチド１３を少量混ぜ
て一定時間反応させると、このアデニンを持つ修飾ヌク
レオチド１３は、ランダム重合体を合成する場合のモノ
マーの如く連鎖中にランダムに取り込まれるため、末端
の塩基がアデニンの長さの異なる種々の二本鎖ＤＮＡが
できる。図３はこの様子をモデル的に示した末端がアデ
ニンの種々の長さのＤＮＡの作成方法を示したモデル図
である。
【０００５】尚、図３中１４、１５、１６、１７はそれ
ぞれ一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌク
レオチドを示し、図２と同一のものについては符号を図
２と同一にしたので説明を省略する。図３中（ａ）は反
応前の各成分を示し、（ｂ）は反応して得られた末端の
塩基がアデニンの種々の二本鎖ＤＮＡのうちの１つをモ
デル的に示しており、（ｃ）は末端の塩基がアデニンの
長さの異なる種々の二本鎖ＤＮＡを３種類モデル的に示
したものである。
ぞれ一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌク
レオチドを示し、図２と同一のものについては符号を図
２と同一にしたので説明を省略する。図３中（ａ）は反
応前の各成分を示し、（ｂ）は反応して得られた末端の
塩基がアデニンの種々の二本鎖ＤＮＡのうちの１つをモ
デル的に示しており、（ｃ）は末端の塩基がアデニンの
長さの異なる種々の二本鎖ＤＮＡを３種類モデル的に示
したものである。
【０００６】同じように、他の３種類の塩基についても
同じ操作を繰り返して、それぞれアデニン、シトシン、
チミン、グアニンが末端のいろいろな長さのＤＮＡがで
きあがる。図４に示すようにこのようにしてできた４種
類のＤＮＡ溶液１８、１９、２０、２１の溶液を４つの
レーンで電気泳動することによって、図４のようなパタ
ーン２２がオートラジオグラフィーで観測できるので、
元のＤＮＡの塩基配列を検出することができる。尚、図
４中矢印２３は電気泳動の電界の向きを示す。
同じ操作を繰り返して、それぞれアデニン、シトシン、
チミン、グアニンが末端のいろいろな長さのＤＮＡがで
きあがる。図４に示すようにこのようにしてできた４種
類のＤＮＡ溶液１８、１９、２０、２１の溶液を４つの
レーンで電気泳動することによって、図４のようなパタ
ーン２２がオートラジオグラフィーで観測できるので、
元のＤＮＡの塩基配列を検出することができる。尚、図
４中矢印２３は電気泳動の電界の向きを示す。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述した従来のＤＮＡ
の塩基配列の検出方法は広く使われており、一日で数千
の塩基配列を読み取る事ができる。しかし、以下に述べ
るような問題点を含んでいる。 （１）大量のＤＮＡが必要である。 （２）放射性の３２Ｐを用いるため、特殊な施設が必要
であり、また、被爆の危険性もある。 （３）３２Ｐの半減期は１４日と短く、常時試薬を調製
しなくてはならない。 （４）操作が何段階にも分かれているので、めんどうで
根気のいる仕事である。
の塩基配列の検出方法は広く使われており、一日で数千
の塩基配列を読み取る事ができる。しかし、以下に述べ
るような問題点を含んでいる。 （１）大量のＤＮＡが必要である。 （２）放射性の３２Ｐを用いるため、特殊な施設が必要
であり、また、被爆の危険性もある。 （３）３２Ｐの半減期は１４日と短く、常時試薬を調製
しなくてはならない。 （４）操作が何段階にも分かれているので、めんどうで
根気のいる仕事である。
【０００８】そこで、安全に、簡単に、迅速に、しかも
少量のＤＮＡでも塩基配列を検出できる方法を提供する
ことは産業上重要な課題である。本発明は安全に、簡単
に、迅速に、しかも少量のＤＮＡでもその塩基配列を検
出できる方法を提供することを目的とするものである。
少量のＤＮＡでも塩基配列を検出できる方法を提供する
ことは産業上重要な課題である。本発明は安全に、簡単
に、迅速に、しかも少量のＤＮＡでもその塩基配列を検
出できる方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法はＤＮＡを構成する
４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用を及ぼす
４種類の分子のいずれか１種類が固定された３種類また
は４種類の探針を用意し、これらの探針を原子間力顕微
鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれぞれの探
針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近させて、
力を測定しながら原子レベルの精度で走査することから
なる。
本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法はＤＮＡを構成する
４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用を及ぼす
４種類の分子のいずれか１種類が固定された３種類また
は４種類の探針を用意し、これらの探針を原子間力顕微
鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれぞれの探
針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近させて、
力を測定しながら原子レベルの精度で走査することから
なる。
【００１０】また、前記構成において、特異的に相互作
用を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含
む分子である事が好ましい。また、前記構成において、
特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡ（リ
ボ核酸）を構成する塩基を含む分子である事が好ましい
。本発明方法によれば、ＤＮＡを構成する４種類の塩基
を、化学的な相互作用によってそれぞれ直接識別する事
ができ、それにより、従来の問題を解決しようとするも
のである。以下に詳細を示す。
用を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含
む分子である事が好ましい。また、前記構成において、
特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡ（リ
ボ核酸）を構成する塩基を含む分子である事が好ましい
。本発明方法によれば、ＤＮＡを構成する４種類の塩基
を、化学的な相互作用によってそれぞれ直接識別する事
ができ、それにより、従来の問題を解決しようとするも
のである。以下に詳細を示す。
【００１１】図１は本発明の検出方法の原理を示す模式
図である。図１に示すように、ＤＮＡを構成する４種類
の塩基のうち、塩基アデニン８を含む分子２を原子間力
顕微鏡（ＡＦＭ）の探針１に固定して、この探針１を基
板４の上に固定された一本鎖ＤＮＡ３上に接近させ、そ
の時の相互作用の結果生じる力を測定しながら原子レベ
ルの精度で走査する。尚、本発明は原子間力顕微鏡の探
針が、ＤＮＡを構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特
異的に相互作用を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類
が固定された３種類または４種類の探針を用いる点で特
異性があるが、他の点においては通常の原子間力顕微鏡
とその構造、動作原理などは基本的に同一であり、また
、原子間力顕微鏡はすでに知られているので、その構造
などの詳細な説明は省略する。
図である。図１に示すように、ＤＮＡを構成する４種類
の塩基のうち、塩基アデニン８を含む分子２を原子間力
顕微鏡（ＡＦＭ）の探針１に固定して、この探針１を基
板４の上に固定された一本鎖ＤＮＡ３上に接近させ、そ
の時の相互作用の結果生じる力を測定しながら原子レベ
ルの精度で走査する。尚、本発明は原子間力顕微鏡の探
針が、ＤＮＡを構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特
異的に相互作用を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類
が固定された３種類または４種類の探針を用いる点で特
異性があるが、他の点においては通常の原子間力顕微鏡
とその構造、動作原理などは基本的に同一であり、また
、原子間力顕微鏡はすでに知られているので、その構造
などの詳細な説明は省略する。
【００１２】探針１に固定された分子２中のアデニン８
がチミン６上に来た時、他の塩基アデニン８、グアニン
７、シトシン５の場合にはみられない、水素結合による
強い力が働く。この力の働く場所を調べることによって
、ＤＮＡ３中のチミン６の位置が分かる。図中（ａ）の
探針１の位置はＤＮＡ３中のグアニン７上に探針１に固
定されたアデニン８が位置している場合で、この場合は
水素結合による強い力が働いていない位置を示している
。図中（ｂ）の探針１の位置はＤＮＡ３中のチミン６上
に探針１に固定されたアデニン８が位置している場合で
、この場合は水素結合による強い力が働く位置に探針１
があることを示している。
がチミン６上に来た時、他の塩基アデニン８、グアニン
７、シトシン５の場合にはみられない、水素結合による
強い力が働く。この力の働く場所を調べることによって
、ＤＮＡ３中のチミン６の位置が分かる。図中（ａ）の
探針１の位置はＤＮＡ３中のグアニン７上に探針１に固
定されたアデニン８が位置している場合で、この場合は
水素結合による強い力が働いていない位置を示している
。図中（ｂ）の探針１の位置はＤＮＡ３中のチミン６上
に探針１に固定されたアデニン８が位置している場合で
、この場合は水素結合による強い力が働く位置に探針１
があることを示している。
【００１３】そして、チミンを含む分子、シトシンを含
む分子、グアニンを含む分子がそれぞれ固定された３種
類の探針を用いて、これらの操作を繰り返すことによっ
て、一本鎖ＤＮＡ３中のアデニン、グアニン、シトシン
の位置がそれぞれ分かる。以上のことから、一本鎖ＤＮ
Ａの塩基配列が検出できる。なお、一本鎖ＤＮＡの塩基
配列が分かるということは、アデニンはチミンと、また
、グアニンはシトシンとしか特異的に結合しないので、
元の２本鎖ＤＮＡの塩基配列が分かるということになる
。
む分子、グアニンを含む分子がそれぞれ固定された３種
類の探針を用いて、これらの操作を繰り返すことによっ
て、一本鎖ＤＮＡ３中のアデニン、グアニン、シトシン
の位置がそれぞれ分かる。以上のことから、一本鎖ＤＮ
Ａの塩基配列が検出できる。なお、一本鎖ＤＮＡの塩基
配列が分かるということは、アデニンはチミンと、また
、グアニンはシトシンとしか特異的に結合しないので、
元の２本鎖ＤＮＡの塩基配列が分かるということになる
。
【００１４】ところで、ＤＮＡはチミン、アデニン、シ
トシン、グアニンの４種類の塩基を含むので、原理的に
は、３種類の塩基の位置が検出できればＤＮＡの塩基配
列は分かる。従って、上記では４種類の探針を用いてい
るが、チミン、アデニン、シトシン、グアニンを含む分
子のそれぞれいずれか１種類が固定された４種類の探針
のうちのいずれか３種類の探針を用いてもＤＮＡの塩基
配列は検出される。
トシン、グアニンの４種類の塩基を含むので、原理的に
は、３種類の塩基の位置が検出できればＤＮＡの塩基配
列は分かる。従って、上記では４種類の探針を用いてい
るが、チミン、アデニン、シトシン、グアニンを含む分
子のそれぞれいずれか１種類が固定された４種類の探針
のうちのいずれか３種類の探針を用いてもＤＮＡの塩基
配列は検出される。
【００１５】また、探針に固定するのはチミン、アデニ
ン、シトシン、グアニンを含む分子に限る必要はなく、
ＤＮＡを構成する塩基と特異的に相互作用を及ぼすもの
であれば何でも良い。特異的相互作用としては例えば、
水素結合やイオン間力などの原子間力などが挙げられる
がこれのみに限定されるものではない。たとえば、ＲＮ
Ａを構成する塩基を含む分子、叉はこれらの誘導物質な
ど様々な分子を用いることができる。ＲＮＡの場合、Ｒ
ＮＡを構成する４種類の塩基はウラシル、アデニン、シ
トシン、グアニンであり、ウラシルはＤＮＡを構成する
塩基のうちアデニンと特異的に結合し、他の塩基につい
ては前述のＤＮＡの場合と同様な特異的結合をする。
ン、シトシン、グアニンを含む分子に限る必要はなく、
ＤＮＡを構成する塩基と特異的に相互作用を及ぼすもの
であれば何でも良い。特異的相互作用としては例えば、
水素結合やイオン間力などの原子間力などが挙げられる
がこれのみに限定されるものではない。たとえば、ＲＮ
Ａを構成する塩基を含む分子、叉はこれらの誘導物質な
ど様々な分子を用いることができる。ＲＮＡの場合、Ｒ
ＮＡを構成する４種類の塩基はウラシル、アデニン、シ
トシン、グアニンであり、ウラシルはＤＮＡを構成する
塩基のうちアデニンと特異的に結合し、他の塩基につい
ては前述のＤＮＡの場合と同様な特異的結合をする。
【００１６】本発明においては、ＤＮＡの塩基を含む位
置を上述のように分子１つ１つの単位で検出していくの
で、原子間力顕微鏡の探針を検出対象となる一本鎖ＤＮ
Ａ試料の固定された基板上に原子レベルの精度で走査す
る。原子間力顕微鏡はこの様な操作が出来るようになっ
ているが、例えば本発明方法においては、長さ約１μｍ
、根元部の幅約４μｍ程度の先細りの探針などを用いて
１μｍ角の領域を０．０１〜０．１オングストローム程
度の精度で３次元のＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸方向に動かして走
査し原子間力などの相互作用を記録する。
置を上述のように分子１つ１つの単位で検出していくの
で、原子間力顕微鏡の探針を検出対象となる一本鎖ＤＮ
Ａ試料の固定された基板上に原子レベルの精度で走査す
る。原子間力顕微鏡はこの様な操作が出来るようになっ
ているが、例えば本発明方法においては、長さ約１μｍ
、根元部の幅約４μｍ程度の先細りの探針などを用いて
１μｍ角の領域を０．０１〜０．１オングストローム程
度の精度で３次元のＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸方向に動かして走
査し原子間力などの相互作用を記録する。
【００１７】この様な精度で走査するには、通常原子間
力顕微鏡においては、試料を載せる台がピエゾ素子など
の電圧をかけることによりその長さが伸縮する圧電素子
などで構成されており、この圧電素子を３次元方向にコ
ントロールして動かすことで走査を行っているのが通常
である。そして原子間力の測定は、センサーで原子間力
をキャッチして、原子間力が常に一定になるように例え
ば強く原子間力が作用する位置では原子間力が当初の一
定値になるように試料と探針の位置を遠ざけるなど、試
料と探針の距離を近づけたり、離したりして原子間力が
常に一定値になるようにし、この動きを電気信号にして
記録することにより検知するシステムとなっている。
力顕微鏡においては、試料を載せる台がピエゾ素子など
の電圧をかけることによりその長さが伸縮する圧電素子
などで構成されており、この圧電素子を３次元方向にコ
ントロールして動かすことで走査を行っているのが通常
である。そして原子間力の測定は、センサーで原子間力
をキャッチして、原子間力が常に一定になるように例え
ば強く原子間力が作用する位置では原子間力が当初の一
定値になるように試料と探針の位置を遠ざけるなど、試
料と探針の距離を近づけたり、離したりして原子間力が
常に一定値になるようにし、この動きを電気信号にして
記録することにより検知するシステムとなっている。
【００１８】なお、以下に、一本鎖ＤＮＡ分子の基板上
への固定方法と、ＤＮＡを構成する４種類の塩基とそれ
ぞれ特異的に相互作用を及ぼす分子のＡＦＭの探針への
固定方法の例を説明する。
への固定方法と、ＤＮＡを構成する４種類の塩基とそれ
ぞれ特異的に相互作用を及ぼす分子のＡＦＭの探針への
固定方法の例を説明する。
【００１９】１：一本鎖ＤＮＡの基板上への固定方法１
−１：物理吸着法 一本鎖ＤＮＡ溶液（１０〜５０μｇ／ｍｌ）をよく洗浄
された平面度の高いグラファイト、ガラス基板、金でコ
ーテイングされたガラス基板もしくは雲母上に滴下する
か、もしくはこれらの基板をこのＤＮＡ溶液中に浸して
、一本鎖ＤＮＡをこれらの基板に固定する。その後、こ
れらの基板を純水でよく洗浄して測定用の基板とする。
−１：物理吸着法 一本鎖ＤＮＡ溶液（１０〜５０μｇ／ｍｌ）をよく洗浄
された平面度の高いグラファイト、ガラス基板、金でコ
ーテイングされたガラス基板もしくは雲母上に滴下する
か、もしくはこれらの基板をこのＤＮＡ溶液中に浸して
、一本鎖ＤＮＡをこれらの基板に固定する。その後、こ
れらの基板を純水でよく洗浄して測定用の基板とする。
【００２０】１−２：化学結合法
基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
【００２１】まず、塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに
約１０μｇの一本鎖ＤＮＡを加える。次に、この溶液に
基板を入れ、室温付近で数時間反応させ、一本鎖ＤＮＡ
をこれらの基板に固定する。その後、これらの基板を蒸
留水でよくすすぎ、再びきれいな蒸留水に浸し洗浄して
測定用の基板とする。
約１０μｇの一本鎖ＤＮＡを加える。次に、この溶液に
基板を入れ、室温付近で数時間反応させ、一本鎖ＤＮＡ
をこれらの基板に固定する。その後、これらの基板を蒸
留水でよくすすぎ、再びきれいな蒸留水に浸し洗浄して
測定用の基板とする。
【００２２】１−３：化学結合法
基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
【００２３】まず、末端がトルエンカルボン酸でエステ
ル化されたシランカップリング剤［ＣＨ３ −Ｃ６ Ｈ
４ −ＯＯＣ−（ＣＨ２ ）ｎ−ＳｉＣｌ３ ］を有機
溶剤（ヘキサデカン８０％、クロロホルム１２％、四塩
化炭素８％）に重量にして１％溶解して反応溶液とし、
この反応溶液に基板を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反
応を行わせる。
ル化されたシランカップリング剤［ＣＨ３ −Ｃ６ Ｈ
４ −ＯＯＣ−（ＣＨ２ ）ｎ−ＳｉＣｌ３ ］を有機
溶剤（ヘキサデカン８０％、クロロホルム１２％、四塩
化炭素８％）に重量にして１％溶解して反応溶液とし、
この反応溶液に基板を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反
応を行わせる。
【００２４】次にこの基板を２つの糟のクロロホルム溶
液に１５分ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反
応においては、シランカップリング剤の化学式のｎの値
は０〜２５で可能であるが、１０〜２０の場合がＤＮＡ
等を構成する塩基の反応性などが立体障害などにより影
響を受けるのを防止できるので好ましい。ひき続いて、
この基板を数％のリチウムアルミニウムハイドライド（
ＬｉＡｌＨ４ ）を含むエーテル溶液中で室温下で２０
分反応さる。
液に１５分ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反
応においては、シランカップリング剤の化学式のｎの値
は０〜２５で可能であるが、１０〜２０の場合がＤＮＡ
等を構成する塩基の反応性などが立体障害などにより影
響を受けるのを防止できるので好ましい。ひき続いて、
この基板を数％のリチウムアルミニウムハイドライド（
ＬｉＡｌＨ４ ）を含むエーテル溶液中で室温下で２０
分反応さる。
【００２５】最後に、この基板を、約１０μｇの一本鎖
ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに入れ
、室温付近で数時間反応させた後、蒸留水でよく洗浄し
、一本鎖ＤＮＡを固定する。
ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに入れ
、室温付近で数時間反応させた後、蒸留水でよく洗浄し
、一本鎖ＤＮＡを固定する。
【００２６】１−４：化学結合法
基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
【００２７】まず、末端がビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ２
）のトリクロロシランカップリング剤（ＣＨ２ ＝ＣＨ
−（ＣＨ２ ）ｎ−ＳｉＣｌ３ ）を有機溶剤（ヘキサ
デカン８０％、クロロホルム１２％、四塩化炭素８％）
に重量にして１％溶解して反応溶液とし、この反応溶液
に基板を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反応を行わせる
。次にこの基板を２つの糟のクロロホルム溶液に１５分
ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反応において
は、シランカップリング剤の化学式のｎの値は０〜２５
で可能であるが、前述の場合と同様に１０〜２０の場合
が好都合である。
）のトリクロロシランカップリング剤（ＣＨ２ ＝ＣＨ
−（ＣＨ２ ）ｎ−ＳｉＣｌ３ ）を有機溶剤（ヘキサ
デカン８０％、クロロホルム１２％、四塩化炭素８％）
に重量にして１％溶解して反応溶液とし、この反応溶液
に基板を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反応を行わせる
。次にこの基板を２つの糟のクロロホルム溶液に１５分
ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反応において
は、シランカップリング剤の化学式のｎの値は０〜２５
で可能であるが、前述の場合と同様に１０〜２０の場合
が好都合である。
【００２８】次に、この基板をジボランの溶解したテト
ラヒドロフラン溶液（１Ｍ）にアルゴン雰囲気中室温で
１分間反応させた後、過酸化水素と水酸化ナトリウムの
混合溶液（過酸化水素３０％、水酸化ナトリウム０．１
Ｍ）中で１分間反応させる。最後に、この基板を、約１
０μｇの一本鎖ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）
５０ｍｌに入れ、室温付近で数時間反応させた後、蒸留
水でよく洗浄し、一本鎖ＤＮＡを固定する。
ラヒドロフラン溶液（１Ｍ）にアルゴン雰囲気中室温で
１分間反応させた後、過酸化水素と水酸化ナトリウムの
混合溶液（過酸化水素３０％、水酸化ナトリウム０．１
Ｍ）中で１分間反応させる。最後に、この基板を、約１
０μｇの一本鎖ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）
５０ｍｌに入れ、室温付近で数時間反応させた後、蒸留
水でよく洗浄し、一本鎖ＤＮＡを固定する。
【００２９】２：ＡＦＭの探針への分子の固定法２−１
：ＡＦＭの探針上への、ＤＮＡを構成する４種類の塩基
の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
：ＡＦＭの探針上への、ＤＮＡを構成する４種類の塩基
の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
【００３０】ＤＮＡを構成する塩基を含む分子としては
、ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。 １−２〜１−４のいずれかと同じ方法でヌクレオチドを
探針に固定する事ができる。但し、基板の代わりに上述
のＡＦＭの探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにヌクレオチ
ドをそれぞれ用いる。
、ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。 １−２〜１−４のいずれかと同じ方法でヌクレオチドを
探針に固定する事ができる。但し、基板の代わりに上述
のＡＦＭの探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにヌクレオチ
ドをそれぞれ用いる。
【００３１】２−２：ＡＦＭの探針上への、ＲＮＡを構
成する４種類の塩基の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
成する４種類の塩基の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
【００３２】ＲＮＡを構成する塩基を含む分子としては
、ＲＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。 １−２〜１−４と同じ方法でヌクレオチドを探針に固定
する事ができる。但し、基板の代わりに上述のＡＦＭの
探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにＲＮＡを構成するヌク
レオチドをそれぞれ用いる。
、ＲＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。 １−２〜１−４と同じ方法でヌクレオチドを探針に固定
する事ができる。但し、基板の代わりに上述のＡＦＭの
探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにＲＮＡを構成するヌク
レオチドをそれぞれ用いる。
【００３３】
【作用】本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法はＤＮＡを
構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類が固定された３
種類または４種類の探針を用意し、これらの探針を原子
間力顕微鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれ
ぞれの探針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近
させて、力を測定しながら原子レベルの精度で走査する
ので、放射性元素を用いる必要がないため安全で、工程
が簡単で、迅速に、しかもまた、原理的には、一個のＤ
ＮＡがあれば測定できるので従来法に比べてＤＮＡの量
は格段に少ない量のＤＮＡでもその塩基配列を検出でき
る方法を提供出来る。さらに、３種類、ないしは４種類
の微小探針を用いて同様の操作でルーチンワーク的にＤ
ＮＡの塩基配列を検出できるので、従来法より手間はか
からず、簡単、迅速にＤＮＡの塩基配列を決定できる。
構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類が固定された３
種類または４種類の探針を用意し、これらの探針を原子
間力顕微鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれ
ぞれの探針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近
させて、力を測定しながら原子レベルの精度で走査する
ので、放射性元素を用いる必要がないため安全で、工程
が簡単で、迅速に、しかもまた、原理的には、一個のＤ
ＮＡがあれば測定できるので従来法に比べてＤＮＡの量
は格段に少ない量のＤＮＡでもその塩基配列を検出でき
る方法を提供出来る。さらに、３種類、ないしは４種類
の微小探針を用いて同様の操作でルーチンワーク的にＤ
ＮＡの塩基配列を検出できるので、従来法より手間はか
からず、簡単、迅速にＤＮＡの塩基配列を決定できる。
【００３４】また、本発明において、特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出
来、また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤ
ＮＡの塩基配列を決定できる。また、本発明において、
特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構
成する塩基を含む分子である好ましい態様にすることに
より、基板への試料の固定と、探針への分子の固定がほ
ぼ同様の操作で出来、また、相互作用も予め分っている
のでより容易にＤＮＡの塩基配列を決定できる。
を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出
来、また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤ
ＮＡの塩基配列を決定できる。また、本発明において、
特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構
成する塩基を含む分子である好ましい態様にすることに
より、基板への試料の固定と、探針への分子の固定がほ
ぼ同様の操作で出来、また、相互作用も予め分っている
のでより容易にＤＮＡの塩基配列を決定できる。
【００３５】
実施例１
３０塩基対分だけ切断し取り出された大腸菌ＤＮＡの塩
基配列を本発明の方法で検出した。以下に詳細を示す。 まず、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡを２０μ／ｍｇ
以下の濃度となるように１５ｍＭの塩化ナトリウムと１
．５ｍＭのクエン酸ナトリウムの混合溶液に溶かした。 そして、この溶液を沸騰した湯浴に１０分間つけた後、
氷水で急冷して、大腸菌ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにした。
基配列を本発明の方法で検出した。以下に詳細を示す。 まず、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡを２０μ／ｍｇ
以下の濃度となるように１５ｍＭの塩化ナトリウムと１
．５ｍＭのクエン酸ナトリウムの混合溶液に溶かした。 そして、この溶液を沸騰した湯浴に１０分間つけた後、
氷水で急冷して、大腸菌ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにした。
【００３６】この一本鎖ＤＮＡを、前述の１−１の方法
を用いて、グラファイト基板上に分散して固定した。ま
た、前述の２−１の方法（この中でも特に、１−３の方
法を応用）を用いて、ＤＮＡを構成するヌクレオチドを
ＡＦＭの探針に固定した。まず、アデニンを含むヌクレ
オチドが固定された探針を一本鎖ＤＮＡの固定された基
板表面に接近させ、探針と基板表面間に働く力が一定に
なるように、探針と基板表面の間の距離を調製しながら
、原子レベルの精度（０．１オングストロームの精度）
でこの探針を走査した。ここで、探針の走査範囲は１０
０×１００ｎｍ２ とし、この時探針の軌跡が描く曲線
群の形状を調べた。
を用いて、グラファイト基板上に分散して固定した。ま
た、前述の２−１の方法（この中でも特に、１−３の方
法を応用）を用いて、ＤＮＡを構成するヌクレオチドを
ＡＦＭの探針に固定した。まず、アデニンを含むヌクレ
オチドが固定された探針を一本鎖ＤＮＡの固定された基
板表面に接近させ、探針と基板表面間に働く力が一定に
なるように、探針と基板表面の間の距離を調製しながら
、原子レベルの精度（０．１オングストロームの精度）
でこの探針を走査した。ここで、探針の走査範囲は１０
０×１００ｎｍ２ とし、この時探針の軌跡が描く曲線
群の形状を調べた。
【００３７】基板表面の様々な場所における曲線群の形
状を調べたところ、数箇所において、平面の上に半径が
数ナノメーターの棒状の物がのっているような形状が観
測された。しかも、この棒は７ヶ所に突起を持っていた
。これらは、以下のように解釈された。まず、上に示し
た基板表面の観察方法は、基本的には、従来のＡＦＭに
よる固体表面の形状の観察方法と同じである。従って、
探針の軌跡の描く曲線群の形状は、基板表面の形状を表
すので、棒状の物は一本鎖ＤＮＡを示していると解釈さ
れた。
状を調べたところ、数箇所において、平面の上に半径が
数ナノメーターの棒状の物がのっているような形状が観
測された。しかも、この棒は７ヶ所に突起を持っていた
。これらは、以下のように解釈された。まず、上に示し
た基板表面の観察方法は、基本的には、従来のＡＦＭに
よる固体表面の形状の観察方法と同じである。従って、
探針の軌跡の描く曲線群の形状は、基板表面の形状を表
すので、棒状の物は一本鎖ＤＮＡを示していると解釈さ
れた。
【００３８】しかし、チミンが存在する部分のＤＮＡの
見かけの形状は、従来のＡＦＭで示される形状と少し様
子が違ってくる。すなわち、探針に固定されたアデニン
とＤＮＡ中のチミン間には水素結合による力が働き、こ
の力は、この探針と他の塩基や基板表面間に働く力より
も充分大きく、そのため、探針は、ＤＮＡ中のチミン上
にきたとき、原子間力を一定にするためにＤＮＡから大
きく離れようとする。従って、従来のＡＦＭでは見られ
ない突起がＤＮＡを表す曲線群上に観測される。そこで
、この突起の位置にチミンがあると判断された。以上の
ことより、ＤＮＡ上にある７箇所のチミンの位置が判っ
た。
見かけの形状は、従来のＡＦＭで示される形状と少し様
子が違ってくる。すなわち、探針に固定されたアデニン
とＤＮＡ中のチミン間には水素結合による力が働き、こ
の力は、この探針と他の塩基や基板表面間に働く力より
も充分大きく、そのため、探針は、ＤＮＡ中のチミン上
にきたとき、原子間力を一定にするためにＤＮＡから大
きく離れようとする。従って、従来のＡＦＭでは見られ
ない突起がＤＮＡを表す曲線群上に観測される。そこで
、この突起の位置にチミンがあると判断された。以上の
ことより、ＤＮＡ上にある７箇所のチミンの位置が判っ
た。
【００３９】次に、チミン、グアニン、シトシンのいず
れかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定された３種類の
探針を用いて、同様な操作をして、ＤＮＡ上のアデニン
、シトシン、グアニンの位置がそれぞれ調べられた。 以上の４種類の探針を用いて調べたＤＮＡ中の塩基の位
置から、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が
検出された。
れかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定された３種類の
探針を用いて、同様な操作をして、ＤＮＡ上のアデニン
、シトシン、グアニンの位置がそれぞれ調べられた。 以上の４種類の探針を用いて調べたＤＮＡ中の塩基の位
置から、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が
検出された。
【００４０】なお、チミン、グアニン、シトシンのいず
れかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定された３種類の
探針だけを用いても、ＤＮＡの塩基配列の検出をするこ
とができた。すなわち、これらの３種類の探針をそれぞ
れ用いて一本鎖ＤＮＡを調べたところ、ＤＮＡを示す曲
線群上に多数の突起が観測され、これによって、アデニ
ン、シトシン、グアニンのＤＮＡ上の位置が分かった。 ところで、上記のどの探針を用いた場合にも、突起の現
れない場所がＤＮＡを示す曲線群上にあった。そこで、
この場所にチミンが存在すると判断された。しかも、こ
の場所の広さから、ここに存在しているチミンの数が分
かった。以上のことから、３０塩基対からなる大腸菌Ｄ
ＮＡの塩基配列か検出できた。
れかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定された３種類の
探針だけを用いても、ＤＮＡの塩基配列の検出をするこ
とができた。すなわち、これらの３種類の探針をそれぞ
れ用いて一本鎖ＤＮＡを調べたところ、ＤＮＡを示す曲
線群上に多数の突起が観測され、これによって、アデニ
ン、シトシン、グアニンのＤＮＡ上の位置が分かった。 ところで、上記のどの探針を用いた場合にも、突起の現
れない場所がＤＮＡを示す曲線群上にあった。そこで、
この場所にチミンが存在すると判断された。しかも、こ
の場所の広さから、ここに存在しているチミンの数が分
かった。以上のことから、３０塩基対からなる大腸菌Ｄ
ＮＡの塩基配列か検出できた。
【００４１】実施例２
前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
へ固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によって、３
０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出できた
。
へ固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によって、３
０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出できた
。
【００４２】実施例３
前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
に固定し、また、前述の２−１の方法（この中でも特に
、１−２の方法を応用）を用いて、ＤＮＡを構成するヌ
クレオチドをＡＦＭの探針に固定した。
に固定し、また、前述の２−１の方法（この中でも特に
、１−２の方法を応用）を用いて、ＤＮＡを構成するヌ
クレオチドをＡＦＭの探針に固定した。
【００４３】それ以外は実施例１と同じ方法によって、
３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出でき
た。
３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出でき
た。
【００４４】実施例４
前述の２−２の方法（この中でも特に、１−３の方法を
応用）を用いてＲＮＡを構成するヌクレオチドをＡＦＭ
の探針に固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によっ
て、３０塩基対からなる大腸菌のＤＮＡの塩基配列が検
出できた。
応用）を用いてＲＮＡを構成するヌクレオチドをＡＦＭ
の探針に固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によっ
て、３０塩基対からなる大腸菌のＤＮＡの塩基配列が検
出できた。
【００４５】実施例５
前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
へ固定し、また、前述の２−２の方法（この中でも特に
、１−３の方法を応用）を用いてＲＮＡを構成するヌク
レオチドをＡＦＭの探針に固定した。それ以外は実施例
１と同じ方法によって、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮ
Ａの塩基配列が検出できた。
へ固定し、また、前述の２−２の方法（この中でも特に
、１−３の方法を応用）を用いてＲＮＡを構成するヌク
レオチドをＡＦＭの探針に固定した。それ以外は実施例
１と同じ方法によって、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮ
Ａの塩基配列が検出できた。
【００４６】実施例６
前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
に固定し、また、前述の２−２の方法（この中でも特に
、１−２の方法を応用）を用いて、ＲＮＡを構成するヌ
クレオチドをＡＦＭの探針に固定した。
に固定し、また、前述の２−２の方法（この中でも特に
、１−２の方法を応用）を用いて、ＲＮＡを構成するヌ
クレオチドをＡＦＭの探針に固定した。
【００４７】それ以外は実施例１と同じ方法によって、
３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出でき
た。ＤＮＡの塩基配列を迅速に決めることは、分子生物
分野、医療分野、法医学分野、農林水産業、製薬業の分
野でたいへん重要である。特に、遺伝病の治療や、ＤＮ
Ａ操作による植物等の品種改良、有用物質の生物による
生産を行う場合、ＤＮＡの塩基配列を読みとることは、
これらを実施するための基礎技術として今後ますます重
要になってくると考えられる。本発明は、今までの方法
に比べて簡便で少量のＤＮＡしか必要としないので、こ
れらの分野に有効に適用できる。
３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出でき
た。ＤＮＡの塩基配列を迅速に決めることは、分子生物
分野、医療分野、法医学分野、農林水産業、製薬業の分
野でたいへん重要である。特に、遺伝病の治療や、ＤＮ
Ａ操作による植物等の品種改良、有用物質の生物による
生産を行う場合、ＤＮＡの塩基配列を読みとることは、
これらを実施するための基礎技術として今後ますます重
要になってくると考えられる。本発明は、今までの方法
に比べて簡便で少量のＤＮＡしか必要としないので、こ
れらの分野に有効に適用できる。
【００４８】さらに、現在、人のＤＮＡ配列をすべて決
めてしまおうとする“人ゲノム解析計画”が計画されて
いる。この場合読みとるべきヒトＤＮＡの塩基対の数は
２８億と非常に多く、迅速にしかも正確に塩基配列を読
みとる手段の開発が強く望まれている。本発明は、この
ゲノム解析の有力な手段としても期待できる。なお、実
施例においては、ＤＮＡもしくはＲＮＡを構成する４種
類のヌクレヲチドをＡＦＭの探針に固定したが、これら
の分子に限る必要はなく、前述した如くＤＮＡ上の塩基
と特異的に相互作用を及ぼすものであればなんでも良い
ことは言うまでもない。
めてしまおうとする“人ゲノム解析計画”が計画されて
いる。この場合読みとるべきヒトＤＮＡの塩基対の数は
２８億と非常に多く、迅速にしかも正確に塩基配列を読
みとる手段の開発が強く望まれている。本発明は、この
ゲノム解析の有力な手段としても期待できる。なお、実
施例においては、ＤＮＡもしくはＲＮＡを構成する４種
類のヌクレヲチドをＡＦＭの探針に固定したが、これら
の分子に限る必要はなく、前述した如くＤＮＡ上の塩基
と特異的に相互作用を及ぼすものであればなんでも良い
ことは言うまでもない。
【００４９】
【発明の効果】本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法は安
全で、工程が簡単で、迅速に、しかもまた、少ない量の
ＤＮＡでもその塩基配列を検出できる方法を提供出来る
。また、本発明において、特異的に相互作用を及ぼす４
種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む分子である
好ましい態様にすることにより、基板への試料の固定と
、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出来、また、
相互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡの塩基
配列を検出できる。
全で、工程が簡単で、迅速に、しかもまた、少ない量の
ＤＮＡでもその塩基配列を検出できる方法を提供出来る
。また、本発明において、特異的に相互作用を及ぼす４
種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む分子である
好ましい態様にすることにより、基板への試料の固定と
、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出来、また、
相互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡの塩基
配列を検出できる。
【００５０】また、本発明において、特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定が同様の操作で出来、
また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡ
の塩基配列を決定できる。
を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定が同様の操作で出来、
また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡ
の塩基配列を決定できる。
【図１】本発明によって一本鎖ＤＮＡの塩基配列を検出
する原理を示した模式図。
する原理を示した模式図。
【図２】一本鎖ＤＮＡから、２本鎖ＤＮＡを合成する様
子を示した概念図である。
子を示した概念図である。
【図３】末端がアデニンの種々の長さのＤＮＡの作成方
法を示したモデル図である。
法を示したモデル図である。
【図４】オートラジオグラフィーによって観測された４
種類のＤＮＡの混合溶液の電気泳動パターンを示す図で
ある。
種類のＤＮＡの混合溶液の電気泳動パターンを示す図で
ある。
１ ＡＦＭの探針
２ ＤＮＡを構成する塩基を含む分子３
一本鎖ＤＮＡ ４ 基板 ５ シトシン ６ チミン ７ グアニン ８ アデニン ９ 塩基配列を調べようとする一本鎖ＤＮＡ１０
プライマー １１ ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチド１２
二本鎖ＤＮＡ １３ アデニンを塩基とするジデオキシヌクレオシド
三リン酸 １４ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド １５ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド １６ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド。 １７ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド。 １８ 末端がアデニンである種々の長さのＤＮＡ１９
末端がチミンである種々の長さのＤＮＡ２０ 末
端がシトシンである種々の長さのＤＮＡ２１ 末端が
グアニンである種々の長さのＤＮＡ２２ オートラジ
オグラフィーで観測した４種類の混合溶液１８、１９、
２０、２１の電気泳動パターン２３ 電気泳動の電界
の向き
一本鎖ＤＮＡ ４ 基板 ５ シトシン ６ チミン ７ グアニン ８ アデニン ９ 塩基配列を調べようとする一本鎖ＤＮＡ１０
プライマー １１ ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチド１２
二本鎖ＤＮＡ １３ アデニンを塩基とするジデオキシヌクレオシド
三リン酸 １４ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド １５ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド １６ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド。 １７ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合した
ヌクレオチド。 １８ 末端がアデニンである種々の長さのＤＮＡ１９
末端がチミンである種々の長さのＤＮＡ２０ 末
端がシトシンである種々の長さのＤＮＡ２１ 末端が
グアニンである種々の長さのＤＮＡ２２ オートラジ
オグラフィーで観測した４種類の混合溶液１８、１９、
２０、２１の電気泳動パターン２３ 電気泳動の電界
の向き
Claims (3)
- 【請求項１】 ＤＮＡを構成する４種類の塩基に対し
それぞれ特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子のいず
れか１種類が固定された３種類または４種類の探針を用
意し、これらの探針を原子間力顕微鏡の探針とし、前記
原子間力顕微鏡によりそれぞれの探針を基板上に固定さ
れた一本鎖ＤＮＡ上に接近させて、力を測定しながら原
子レベルの精度で走査することからなるＤＮＡの塩基配
列検出方法。 - 【請求項２】 特異的に相互作用を及ぼす４種類の分
子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む分子である請求項１
記載のＤＮＡの塩基配列検出方法。 - 【請求項３】 特異的に相互作用を及ぼす４種類の分
子が、ＲＮＡを構成する塩基を含む分子である請求項１
記載のＤＮＡの塩基配列検出方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3098920A JP2561396B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | Ｄｎａの塩基配列検出方法 |
| EP92107342A EP0511662B1 (en) | 1991-04-30 | 1992-04-29 | Scanning probe microscope, molecular processing method using the scanning probe microscope and DNA base arrangement detecting method |
| DE69212062T DE69212062T2 (de) | 1991-04-30 | 1992-04-29 | Raster-Abtastmikroskop, molekulares Verarbeitungsverfahren unter Verwendung des Mikroskops und Verfahren zum Wahrnehmen der DNA-Basen-Anordnung |
| US07/875,694 US5363697A (en) | 1991-04-30 | 1992-04-29 | Scanning probe microscope, molecular processing method using the scanning probe microscope and DNA base arrangement detecting method |
| US08/340,866 US5730940A (en) | 1991-04-30 | 1994-11-15 | Scanning probe microscope and molecular processing method using the scanning probe microscope |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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