JPH04330293A - 非特異的スター活性を減少させる方法 - Google Patents
非特異的スター活性を減少させる方法Info
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- JPH04330293A JPH04330293A JP3056718A JP5671891A JPH04330293A JP H04330293 A JPH04330293 A JP H04330293A JP 3056718 A JP3056718 A JP 3056718A JP 5671891 A JP5671891 A JP 5671891A JP H04330293 A JPH04330293 A JP H04330293A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非特異的スター活性を
、デオキシリボ核酸の特異的分解の際に適当な緩衝液中
で制限エンドヌクレアーゼを用いてのインキュベーショ
ンにより減少させる方法に関する。
、デオキシリボ核酸の特異的分解の際に適当な緩衝液中
で制限エンドヌクレアーゼを用いてのインキュベーショ
ンにより減少させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】此処２０年来、制限酵素は、デオキシリ
ボ核酸の分解に使用されている。この場合、所謂タイプ
ＩＩの制限エンドヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡの特異
的配列を認識し、かつＤＮＡをこの認識配列内で分解す
る。しかし、多数の制限エンドヌクレアーゼの場合、一
定のインキュベーション条件下で特異性は減少されてお
り、この特異性は、所謂“スター活性”を示す。この場
合、配列（以下、スター配列と呼ぶ）は、分解され、こ
の配列は認識配列に類似しているが、しかし認識配列と
同一のものではない（Ｂ． Ｐｏｌｉｓｋｙ， Ｐ．
Ｇｒｅｅｎｅ， Ｄ．Ｅ． Ｇａｒｆｉｎ， Ｂ．Ｊ．
ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｈ．Ｍ． Ｇｏｏｄｍａｎ ＆
Ｈ．Ｗ． Ｂｏｙｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２２（１９７５），３
３１０）。このようなスター活性は、多数の酵素、例え
ばＥｃｏＲＩ（ＥｃｏＲＩ＊）に対して確認されている
。スター活性は酵素に固有の性質であるので、このスタ
ー活性は、酵素調製物の後精製によって阻止されなくと
もよい。スター活性は、一般に高いエンドヌクレアーゼ
濃度、長いインキュベーション時間、低いイオン強度、
高いｐＨ値、低い温度および有機溶剤、例えば二重鎖Ｄ
ＮＡ構造を脱安定化するＤＭＳＯまたはグリセリンを使
用する場合に殊に観察される。
ボ核酸の分解に使用されている。この場合、所謂タイプ
ＩＩの制限エンドヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡの特異
的配列を認識し、かつＤＮＡをこの認識配列内で分解す
る。しかし、多数の制限エンドヌクレアーゼの場合、一
定のインキュベーション条件下で特異性は減少されてお
り、この特異性は、所謂“スター活性”を示す。この場
合、配列（以下、スター配列と呼ぶ）は、分解され、こ
の配列は認識配列に類似しているが、しかし認識配列と
同一のものではない（Ｂ． Ｐｏｌｉｓｋｙ， Ｐ．
Ｇｒｅｅｎｅ， Ｄ．Ｅ． Ｇａｒｆｉｎ， Ｂ．Ｊ．
ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｈ．Ｍ． Ｇｏｏｄｍａｎ ＆
Ｈ．Ｗ． Ｂｏｙｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２２（１９７５），３
３１０）。このようなスター活性は、多数の酵素、例え
ばＥｃｏＲＩ（ＥｃｏＲＩ＊）に対して確認されている
。スター活性は酵素に固有の性質であるので、このスタ
ー活性は、酵素調製物の後精製によって阻止されなくと
もよい。スター活性は、一般に高いエンドヌクレアーゼ
濃度、長いインキュベーション時間、低いイオン強度、
高いｐＨ値、低い温度および有機溶剤、例えば二重鎖Ｄ
ＮＡ構造を脱安定化するＤＭＳＯまたはグリセリンを使
用する場合に殊に観察される。
【０００３】実際に、イオン強度を高めることによって
スター活性を抑制することは、試みられたが、しかしこ
のことは、しばしば酵素活性の損失と関連している。
スター活性を抑制することは、試みられたが、しかしこ
のことは、しばしば酵素活性の損失と関連している。
【０００４】スター活性を抑制するもう１つの方法は、
インキュベーション配合物へのスペルミジンの添加であ
る（Ａ． Ｐｉｎｇｏｕｄ（１９８５）Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７，１０５〜１０９）。しかし
、この場合には、特異的活性も減少される。２、３の酵
素の場合には、この条件下であってもなおスター活性は
観察される。
インキュベーション配合物へのスペルミジンの添加であ
る（Ａ． Ｐｉｎｇｏｕｄ（１９８５）Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７，１０５〜１０９）。しかし
、この場合には、特異的活性も減少される。２、３の酵
素の場合には、この条件下であってもなおスター活性は
観察される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、特異的酵素活性の減少なしに制限エンドヌクレアー
ゼの非特異的スター活性を十分に減少させかつ普遍的に
常用のインキュベーション条件下で使用可能であること
を可能にする１つの方法を提供することである。
は、特異的酵素活性の減少なしに制限エンドヌクレアー
ゼの非特異的スター活性を十分に減少させかつ普遍的に
常用のインキュベーション条件下で使用可能であること
を可能にする１つの方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の対象は
、非特異的スター活性を、デオキシリボ核酸の特異的分
解の際に適当な緩衝液中で制限エンドヌクレアーゼを用
いてのインキュベーションにより減少させる方法であり
、この方法は、インキュベーション配合物に抗生物質を
添加し、この場合この抗生物質は、酵素のスター配列に
接触または隣接して結合するが、しかし制限エンドヌク
レアーゼの特異的認識配列内ではＤＮＡに結合していな
いことによって特徴付けられる。
、非特異的スター活性を、デオキシリボ核酸の特異的分
解の際に適当な緩衝液中で制限エンドヌクレアーゼを用
いてのインキュベーションにより減少させる方法であり
、この方法は、インキュベーション配合物に抗生物質を
添加し、この場合この抗生物質は、酵素のスター配列に
接触または隣接して結合するが、しかし制限エンドヌク
レアーゼの特異的認識配列内ではＤＮＡに結合していな
いことによって特徴付けられる。
【０００７】本発明による方法は、それぞれ使用される
制限酵素に対して標準条件下で、すなわち特に７．５〜
８．０のｐＨ範囲内でトリス−アセテートまたはトリス
−ＨＣｌの場合には、１０〜５０ミリモル／ｌの濃度で
、酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムの場合には
、５〜１０ミリモル／ｌの濃度で、酢酸カリウムの場合
には、６６ミリモル／ｌの濃度で、または塩化ナトリウ
ムの場合には、０〜１００ミリモル／ｌの濃度で実施さ
れる。還元剤としては、ＤＴＥ（１，４−ジチオエリト
リット１ミリモル／ｌ）、ＤＴＴ（１，４−ジチオトレ
イト０．５ミリモル／ｌ）または２−メルカプトエタノ
ール（１ミリモル／ｌ）を使用することができる。特に
好ましい条件は、ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のパンフレット“Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ”（１９８８），第１７６／１７７頁
および類似の形でＭａｎｉａｔｉｓ他、（１９８２）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ならびに Ｏ’
Ｆａｒｒｅｌｌ他（１９８０）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．１７９．４２１に記載されている。これらの文
献には、数多くの制限酵素に関してそれぞれ特に好適な
緩衝組成物が記載されている。
制限酵素に対して標準条件下で、すなわち特に７．５〜
８．０のｐＨ範囲内でトリス−アセテートまたはトリス
−ＨＣｌの場合には、１０〜５０ミリモル／ｌの濃度で
、酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムの場合には
、５〜１０ミリモル／ｌの濃度で、酢酸カリウムの場合
には、６６ミリモル／ｌの濃度で、または塩化ナトリウ
ムの場合には、０〜１００ミリモル／ｌの濃度で実施さ
れる。還元剤としては、ＤＴＥ（１，４−ジチオエリト
リット１ミリモル／ｌ）、ＤＴＴ（１，４−ジチオトレ
イト０．５ミリモル／ｌ）または２−メルカプトエタノ
ール（１ミリモル／ｌ）を使用することができる。特に
好ましい条件は、ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のパンフレット“Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ”（１９８８），第１７６／１７７頁
および類似の形でＭａｎｉａｔｉｓ他、（１９８２）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ならびに Ｏ’
Ｆａｒｒｅｌｌ他（１９８０）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．１７９．４２１に記載されている。これらの文
献には、数多くの制限酵素に関してそれぞれ特に好適な
緩衝組成物が記載されている。
【０００８】スター活性は、余り完全には除去されない
場合には、ＤＮＡ結合抗生物質の添加によって明らかに
減少される。このことは、ＤＮＡ上の制限酵素のスター
配列に接触または隣接して抗生物質を結合し、ひいては
分解前に配列を保護することによって行なわれる。しか
し、制限酵素の特異的認識配列を抗生物質によって結合
させないことも本発明による方法にとって本質的なこと
である。それというのも、それによって特異的活性は、
同様に強力に損なわれるからである。
場合には、ＤＮＡ結合抗生物質の添加によって明らかに
減少される。このことは、ＤＮＡ上の制限酵素のスター
配列に接触または隣接して抗生物質を結合し、ひいては
分解前に配列を保護することによって行なわれる。しか
し、制限酵素の特異的認識配列を抗生物質によって結合
させないことも本発明による方法にとって本質的なこと
である。それというのも、それによって特異的活性は、
同様に強力に損なわれるからである。
【０００９】それぞれの制限酵素に対してスター活性を
減少させるが、しかし酵素の特異的活性を損なわない適
当な抗生物質を見い出すために、本発明によれば、２種
類の配向試験を実施することができる。第１に、使用さ
れる抗生物質は、制限エンドヌクレアーゼの特異的認識
配列に結合しないことが保証されていなければならない
。このためには、特に所謂“フットプリントアッセイ”
（Ｒ．Ｊ． ＷｈｉｔｅおよびＤ．Ｒ． Ｐｈｉｌｌｉ
ｐｓ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８、６２
５９〜６２６９；Ｗ．Ｓ． ＤｙｎａｎおよびＲ． Ｔ
ｊｉａｎ（１９８３），Ｃｅｌｌ３５，７９〜８７）が
実施される。この方法によれば、ＤＮＡ結合抗生物質は
、少なくとも１回制限エンドヌクレアーゼの特異的認識
配列を含有するＤＮＡ断片に結合され、次にＤＮＡは、
ＤＮＡ断片１個当たり最大で１個の切片が生じるように
デオキシリボヌクレアーゼを用いて分解される。分解生
成物を変性ポリアクリルアミドゲル中で分離する場合に
は、階段状のパターンが生じ、このパターン中には、空
隙が存在し、この空隙により結合蛋白質は、ＤＮＡを分
解前にデオキシリボヌクレアーゼによって保護した。そ
れと共に同じゲル上には、マクサム−ギルバートによる
塩基配列の種々の配合物が塗布され、それによって正確
に認識配列の位置および認識配列の抗生物質の場合によ
る結合を確定することを可能にする。
減少させるが、しかし酵素の特異的活性を損なわない適
当な抗生物質を見い出すために、本発明によれば、２種
類の配向試験を実施することができる。第１に、使用さ
れる抗生物質は、制限エンドヌクレアーゼの特異的認識
配列に結合しないことが保証されていなければならない
。このためには、特に所謂“フットプリントアッセイ”
（Ｒ．Ｊ． ＷｈｉｔｅおよびＤ．Ｒ． Ｐｈｉｌｌｉ
ｐｓ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８、６２
５９〜６２６９；Ｗ．Ｓ． ＤｙｎａｎおよびＲ． Ｔ
ｊｉａｎ（１９８３），Ｃｅｌｌ３５，７９〜８７）が
実施される。この方法によれば、ＤＮＡ結合抗生物質は
、少なくとも１回制限エンドヌクレアーゼの特異的認識
配列を含有するＤＮＡ断片に結合され、次にＤＮＡは、
ＤＮＡ断片１個当たり最大で１個の切片が生じるように
デオキシリボヌクレアーゼを用いて分解される。分解生
成物を変性ポリアクリルアミドゲル中で分離する場合に
は、階段状のパターンが生じ、このパターン中には、空
隙が存在し、この空隙により結合蛋白質は、ＤＮＡを分
解前にデオキシリボヌクレアーゼによって保護した。そ
れと共に同じゲル上には、マクサム−ギルバートによる
塩基配列の種々の配合物が塗布され、それによって正確
に認識配列の位置および認識配列の抗生物質の場合によ
る結合を確定することを可能にする。
【００１０】更に、配向試験として、なお使用される抗
生物質が実際に制限エンドヌクレアーゼのスター活性を
減少させるか否かを試験しなければならない。このこと
は、同時に分解すべきＤＮＡが配合物中でそれぞれ抗生
物質と一緒にもしくは抗生物質なしにインキュベートさ
れることによって行なわれる。アガロースゲル中で生成
された断片を分離した後、抗生物質の添加後にスター活
性に基づくと思われるバンドがゲル中で減少されている
か除去されているか否かを確認することができる。
生物質が実際に制限エンドヌクレアーゼのスター活性を
減少させるか否かを試験しなければならない。このこと
は、同時に分解すべきＤＮＡが配合物中でそれぞれ抗生
物質と一緒にもしくは抗生物質なしにインキュベートさ
れることによって行なわれる。アガロースゲル中で生成
された断片を分離した後、抗生物質の添加後にスター活
性に基づくと思われるバンドがゲル中で減少されている
か除去されているか否かを確認することができる。
【００１１】しかし、また本発明による方法の場合には
、好ましい結合配列が既に公知であるような抗生物質に
基づく方法も存在する。この種の抗生物質は、本発明に
よる方法の場合には有利に使用される。次の第１表は、
好ましい抗生物質、その結合配列、ならびにこの抗生物
質が詳細に記載されている文献名の一覧を示す。抗生物
質が適当であるか否か、スター活性を減少させることが
できるか否かまたは／および特異的活性が制限エンドヌ
クレアーゼの特異的認識配列への抗生物質の結合によっ
て損なわれることを予想することができるか否かを前記
抗生物質の公知の結合配列によって簡単に確認すること
ができる。
、好ましい結合配列が既に公知であるような抗生物質に
基づく方法も存在する。この種の抗生物質は、本発明に
よる方法の場合には有利に使用される。次の第１表は、
好ましい抗生物質、その結合配列、ならびにこの抗生物
質が詳細に記載されている文献名の一覧を示す。抗生物
質が適当であるか否か、スター活性を減少させることが
できるか否かまたは／および特異的活性が制限エンドヌ
クレアーゼの特異的認識配列への抗生物質の結合によっ
て損なわれることを予想することができるか否かを前記
抗生物質の公知の結合配列によって簡単に確認すること
ができる。
【００１２】
第１表抗生物質
有利な結合配列
文献アクチノマイシンＤ
ＧＣ
１、２ディスタマイシン
ＡＴＴまたはＡＡＴＴ
１、３エキノマイシン
ＣＧ
１、４ミトラマイシン
ＧＣ
１ネトロプシン
Ａ／Ｔ Ａ／Ｔ Ａ／Ｔ ５、
６１．Ｒ．Ｊ． Ｗｈｉｔｅ ＆ Ｄ．Ｒ Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（１９８９
）、６２５９〜６２６９。
第１表抗生物質
有利な結合配列
文献アクチノマイシンＤ
ＧＣ
１、２ディスタマイシン
ＡＴＴまたはＡＡＴＴ
１、３エキノマイシン
ＣＧ
１、４ミトラマイシン
ＧＣ
１ネトロプシン
Ａ／Ｔ Ａ／Ｔ Ａ／Ｔ ５、
６１．Ｒ．Ｊ． Ｗｈｉｔｅ ＆ Ｄ．Ｒ Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（１９８９
）、６２５９〜６２６９。
【００１３】２．Ｖ．Ｌ． Ａｉｖａｓａｓｈｖｉｌｌ
ｉ ＆ Ｒ．Ｓ． Ｂｅａｂｅａｌａｓｈｖｉｌｌｉ，
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１６０（１９８３），１２〜１
２８。
ｉ ＆ Ｒ．Ｓ． Ｂｅａｂｅａｌａｓｈｖｉｌｌｉ，
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１６０（１９８３），１２〜１
２８。
【００１４】３．Ｍ．Ｌ． Ｋｏｐｋａ， Ｃ． Ｙｏ
ｏｎ， Ｄ． Ｇｏｏｇｓｅｌｌ， Ｏ． Ｐｊｕｒａ
＆ Ｒ．Ｅ． Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳ８２（１９８５
），１３７６〜１３８０。
ｏｎ， Ｄ． Ｇｏｏｇｓｅｌｌ， Ｏ． Ｐｊｕｒａ
＆ Ｒ．Ｅ． Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳ８２（１９８５
），１３７６〜１３８０。
【００１５】４．Ｃ．Ｍ．Ｌ． Ｌｏｗ， Ｈ．Ｒ．
Ｄｒｅｗ， Ｍ．Ｊ．Ｗａｒｉｎｇ， Ｎｕｃｌ． Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１９８４），４８６５〜４８
７９。
Ｄｒｅｗ， Ｍ．Ｊ．Ｗａｒｉｎｇ， Ｎｕｃｌ． Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１９８４），４８６５〜４８
７９。
【００１６】５．Ｈ．Ｍ． Ｂｅｒｍａｎ， Ｓ． Ｎ
ｅｉｄｌｅ， Ｃ． Ｚｉｍｍｅｒ ＆ Ｈ． Ｔｈｒ
ｕｍ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
５６１ １２４〜１３１。
ｅｉｄｌｅ， Ｃ． Ｚｉｍｍｅｒ ＆ Ｈ． Ｔｈｒ
ｕｍ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
５６１ １２４〜１３１。
【００１７】６．Ａ．Ｄ．Ｂ． Ｍａｌｃｏｌｍ ＆
Ｊ．Ｒ． Ｍｏｆｆａｔ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６５５（１９８１），１２８〜
１３５。
Ｊ．Ｒ． Ｍｏｆｆａｔ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６５５（１９８１），１２８〜
１３５。
【００１８】一定の制限酵素がスター活性を有するか否
かは、酵素の一定の数の認識配列を有する、公知のＤＮ
Ａ配列の分解によって簡単に測定することができる。こ
の公知のＤＮＡ配列の分解が行なわれた後に酵素によっ
て予想されないバンドがゲル中に生じた場合には、スタ
ー活性から出発することができる。次の第２表中には、
スター活性を多少とも強い程度に有することが知られて
いる若干の酵素に関して、酵素の認識配列、ならびにス
ター活性の減少に使用可能な１つまたはそれ以上の抗生
物質、および同様に抗生物質の有利な結合配列が記載さ
れている。
かは、酵素の一定の数の認識配列を有する、公知のＤＮ
Ａ配列の分解によって簡単に測定することができる。こ
の公知のＤＮＡ配列の分解が行なわれた後に酵素によっ
て予想されないバンドがゲル中に生じた場合には、スタ
ー活性から出発することができる。次の第２表中には、
スター活性を多少とも強い程度に有することが知られて
いる若干の酵素に関して、酵素の認識配列、ならびにス
ター活性の減少に使用可能な１つまたはそれ以上の抗生
物質、および同様に抗生物質の有利な結合配列が記載さ
れている。
【００１９】
【表１】
【００２０】制限エンドヌクレアーゼと、抗生物質との
記載した組合せ物は、本発明による方法の場合には有利
な実施態様である。しかし、上記の配向試験によって確
認された限りでは、酵素と、抗生物質との別の組合せ物
も本発明による方法の場合には使用することができ、実
際にスター活性は減少されるが、しかし、制限エンドヌ
クレアーゼの特異的活性は、余り変化されない。
記載した組合せ物は、本発明による方法の場合には有利
な実施態様である。しかし、上記の配向試験によって確
認された限りでは、酵素と、抗生物質との別の組合せ物
も本発明による方法の場合には使用することができ、実
際にスター活性は減少されるが、しかし、制限エンドヌ
クレアーゼの特異的活性は、余り変化されない。
【００２１】本発明による方法の場合には、抗生物質は
、有利にインキュベーション配合物の場合に５〜２００
マイクロモル／ｌの量で使用される。
、有利にインキュベーション配合物の場合に５〜２００
マイクロモル／ｌの量で使用される。
【００２２】本発明による方法は、酵素の非特異的スタ
ー活性を酵素のスター配列への抗生物質の結合によって
ＤＮＡ上で減少させることにより、簡単な方法で、デオ
キシリボ核酸の分解の際にタイプＩＩの制限エンドヌク
レアーゼによって分解の特異性を向上させることを可能
にする。この場合、適当な抗生物質は、酵素と、抗生物
質との例示的に記載された有利な組合せ物から認めるこ
とができるか、または簡単な予備試験によって定めるこ
とができる。従って、簡単で安価な方法で、極めて特異
的なＤＮＡ分解を実施することが可能であり、このこと
は、今日の遺伝子技術方法にとって極めて望ましいこと
であるが、しかしこれまで全酵素を用いて達成すること
ができた訳ではない。
ー活性を酵素のスター配列への抗生物質の結合によって
ＤＮＡ上で減少させることにより、簡単な方法で、デオ
キシリボ核酸の分解の際にタイプＩＩの制限エンドヌク
レアーゼによって分解の特異性を向上させることを可能
にする。この場合、適当な抗生物質は、酵素と、抗生物
質との例示的に記載された有利な組合せ物から認めるこ
とができるか、または簡単な予備試験によって定めるこ
とができる。従って、簡単で安価な方法で、極めて特異
的なＤＮＡ分解を実施することが可能であり、このこと
は、今日の遺伝子技術方法にとって極めて望ましいこと
であるが、しかしこれまで全酵素を用いて達成すること
ができた訳ではない。
【００２３】
【実施例】次の実施例により、本発明をさらに詳説する
。
。
【００２４】例１
ＳｇｒＡＩに関する活性の測定およびスター活性の検出
ａ）活性 酵素単位の定義：ＳｇｒＡＩ １Ｕは、λ−ＤＮＡ
１μｇを３７℃で１時間で最終的容量５０μｌに分解
する。
ａ）活性 酵素単位の定義：ＳｇｒＡＩ １Ｕは、λ−ＤＮＡ
１μｇを３７℃で１時間で最終的容量５０μｌに分解
する。
【００２５】活性を測定するために、酵素の増大量（種
々の希釈）をλ−ＤＮＡ１μｇでインキュベートする。 λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃で１時間で完全に分解す
る酵素量は、１Ｕに相当する。
々の希釈）をλ−ＤＮＡ１μｇでインキュベートする。 λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃で１時間で完全に分解す
る酵素量は、１Ｕに相当する。
【００２６】ｂ）活性試験
インキュベーション緩衝液５μｌ（トリス−アセテート
３３０ミリモル／ｌ、ｐＨ７．９／３７℃、酢酸マグネ
シウム１００ミリモル／ｌ、酢酸カリウム６６０ミリモ
ル／ｌ、ＤＴＴ５ミリモル／ｌ）の混合物に、水３９μ
ｌ（反応混合物にネトロプシンを添加した場合）および
λ−ＤＮＡ５μｌ（光学密度：４ＯＤ／ｍｌ）ならびに
ＳｇｒＡＩ １μｌ（０．２Ｕ／μｌ〜１５Ｕ／μｌ
）を添加する。この溶液を３７℃で１時間インキュベー
トし、氷上で冷却し、かつこれに尿素７モル／ｌ、サッ
カロース２０（ｗ／ｖ）％、ＥＤＴＡ５０ミリモル／ｌ
およびブロムフェノールブルー０．０１（ｗ／ｖ）％か
らなる停止試薬１０μｌを添加する。引続き、０．８％
のアガロースゲル中で１００ボルトで２〜３時間電気泳
動処理することによって分離を実施した。得られたバン
ドをＤＮＡ長さ標準（Ｌａｅｎｇｅｎｓｔａｎｄａｒｄ
）との比較により同定する。
３３０ミリモル／ｌ、ｐＨ７．９／３７℃、酢酸マグネ
シウム１００ミリモル／ｌ、酢酸カリウム６６０ミリモ
ル／ｌ、ＤＴＴ５ミリモル／ｌ）の混合物に、水３９μ
ｌ（反応混合物にネトロプシンを添加した場合）および
λ−ＤＮＡ５μｌ（光学密度：４ＯＤ／ｍｌ）ならびに
ＳｇｒＡＩ １μｌ（０．２Ｕ／μｌ〜１５Ｕ／μｌ
）を添加する。この溶液を３７℃で１時間インキュベー
トし、氷上で冷却し、かつこれに尿素７モル／ｌ、サッ
カロース２０（ｗ／ｖ）％、ＥＤＴＡ５０ミリモル／ｌ
およびブロムフェノールブルー０．０１（ｗ／ｖ）％か
らなる停止試薬１０μｌを添加する。引続き、０．８％
のアガロースゲル中で１００ボルトで２〜３時間電気泳
動処理することによって分離を実施した。得られたバン
ドをＤＮＡ長さ標準（Ｌａｅｎｇｅｎｓｔａｎｄａｒｄ
）との比較により同定する。
【００２７】ｃ）スター活性の検出
スター活性は、特異的分解によって生じた完全な消化（
Ｖｅｒｄａｕ）のバンドパターンに対して付加的に生じ
るバンドの生成によって特徴付けられる。
Ｖｅｒｄａｕ）のバンドパターンに対して付加的に生じ
るバンドの生成によって特徴付けられる。
【００２８】インキュベーション混合物の製造および分
解生成物の分析は、活性試験と同様に行なわれる。しか
し、インキュベーション時間は１６時間である。
解生成物の分析は、活性試験と同様に行なわれる。しか
し、インキュベーション時間は１６時間である。
【００２９】例２
活性の測定およびＥｃｏＲＩに対するスター活性の検出
ａ）活性 酵素単位の定義 ＥｃｏＲＩ １Ｕは、λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃
で１時間で最終的容量２５μｌに分解する。
ａ）活性 酵素単位の定義 ＥｃｏＲＩ １Ｕは、λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃
で１時間で最終的容量２５μｌに分解する。
【００３０】活性を測定するために、増大する量の酵素
（種々の希釈）をλ−ＤＮＡ １μｇと一緒にインキ
ュベートする。λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃で１時間
で完全に分解する酵素量は、１Ｕに相当する。
（種々の希釈）をλ−ＤＮＡ １μｇと一緒にインキ
ュベートする。λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃で１時間
で完全に分解する酵素量は、１Ｕに相当する。
【００３１】ｂ）活性試験
インキュベーション緩衝液２．５μｌ（トリス−ＨＣｌ
５００ミリモル／ｌ、ｐＨ７．５／３７℃、ＮａＣ
ｌ １モル／ｌ、塩化マグネシウム１００ミリモル／
ｌ、ＤＴＥ１０ミリモル／ｌ）の混合物に、水１６．５
μｌ（抗生物質の存在下に活性を測定した場合には、１
４μｌでなければならない）およびλ−ＤＮＡ５μｌ（
光学密度：４ ＯＤ／μｌ）ならびにＥｃｏＲＩ溶液
１〜２μｌ（０．３〜４０Ｕ／μｌ）を添加する。 この溶液を３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷
却し、かつこれに尿素７モル／ｌ、サッカロース２０（
ｗ／ｖ）％、ＥＤＴＡ６０ミリモル／ｌおよびブロムフ
ェノールブルー０．０１（ｗ／ｖ）％からなる停止試薬
１０μｌを添加する。引続き、０．８％のアガロースゲ
ル中で１００ボルトで２〜３時間電気泳動処理すること
によって分離を実施した。得られたバンドをＤＮＡ長さ
標準（Ｌａｅｎｇｅｎｓｔａｎｄａｒｄ）との比較によ
り同定する。
５００ミリモル／ｌ、ｐＨ７．５／３７℃、ＮａＣ
ｌ １モル／ｌ、塩化マグネシウム１００ミリモル／
ｌ、ＤＴＥ１０ミリモル／ｌ）の混合物に、水１６．５
μｌ（抗生物質の存在下に活性を測定した場合には、１
４μｌでなければならない）およびλ−ＤＮＡ５μｌ（
光学密度：４ ＯＤ／μｌ）ならびにＥｃｏＲＩ溶液
１〜２μｌ（０．３〜４０Ｕ／μｌ）を添加する。 この溶液を３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷
却し、かつこれに尿素７モル／ｌ、サッカロース２０（
ｗ／ｖ）％、ＥＤＴＡ６０ミリモル／ｌおよびブロムフ
ェノールブルー０．０１（ｗ／ｖ）％からなる停止試薬
１０μｌを添加する。引続き、０．８％のアガロースゲ
ル中で１００ボルトで２〜３時間電気泳動処理すること
によって分離を実施した。得られたバンドをＤＮＡ長さ
標準（Ｌａｅｎｇｅｎｓｔａｎｄａｒｄ）との比較によ
り同定する。
【００３２】ｃ）スター活性の検出
スター活性は、特異的分解によって生じた完全な消化（
Ｖｅｒｄａｕ）のバンドパターンに対して付加的に生じ
るバンドの生成によって特徴付けられる。
Ｖｅｒｄａｕ）のバンドパターンに対して付加的に生じ
るバンドの生成によって特徴付けられる。
【００３３】この反応混合物を活性の測定に対する記載
と同様の方法により得る。しかし、インキュベーション
時間は１６時間である。分解生成物の分離は、活性測定
の記載と同様に行なわれる。
と同様の方法により得る。しかし、インキュベーション
時間は１６時間である。分解生成物の分離は、活性測定
の記載と同様に行なわれる。
【００３４】例３
ネトロプシンがＳｇｒＡｌの認識配列の外で結合するこ
との検出 “フットプリント”法（Ｒ．Ｊ． Ｗｈｉｔｅおよび
Ｄ．Ｒ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ２８，６２５９〜６２６９；Ｗ．Ｓ． Ｄ
ｙｎａｎおよび Ｒ． Ｔｊｉａｎ（１９８３）Ｃｅｌ
ｌ３５，７９〜８７）を用いて、ネトロプシンがＳｇｒ
Ａｌの認識配列の外で結合しているか否かを検査した。 この方法によれば、ＤＮＡ結合ファクターはＤＮＡ断片
に結合され、次いでこのＤＮＡ結合ファクターは、断片
１個当たり最大１個の切片が生じるようにデオキシリボ
ヌクレアーゼにより消化される。分解生成物を変性ポリ
アクリルアミドゲル中で分離した場合には、はしご状の
パターンが生じる。このはしご状のパターンには、結合
蛋白質がデオキシリボヌクレアーゼによる分解前にＤＮ
Ａを保護するような間隙が存在する。ＳｇｒＡＩに対す
る分解位置を有する長い断片の１９１対塩基をＢａｍＨ
ＩおよびＳｐｈＩを用いてプラスミドｐＢＲ３２２から
切断し、かつＢａｍＨＩ分解位置で３２燐を用いて標識
化した。この断片５ｆｍｏｌをネトロプシン１０マイク
ロモル／ｌおよび２０マイクロモル／ｌと一緒にインキ
ュベートし、かつＤＮＡｓｅＩを用いて分解した。分解
生成物をポリアクリルアミドゲル中で分離した後、数多
くの保護された領域を検出した。しかし、ＳｇｒＡＩの
対する認識配列は、ネトロプシンによって保護されては
いなかった。 例４ 認識配列に結合している抗生物質がスター活性に影響を
及ぼさないかまたはスター活性の外で特異的活性をも減
少させることの例活性の測定は、ＳｇｒＡＩに関しては
例１の記載と同様に行なわれ、かつＥｃｏＲＩに関して
は例２の記載と同様に行なわれる。
との検出 “フットプリント”法（Ｒ．Ｊ． Ｗｈｉｔｅおよび
Ｄ．Ｒ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ２８，６２５９〜６２６９；Ｗ．Ｓ． Ｄ
ｙｎａｎおよび Ｒ． Ｔｊｉａｎ（１９８３）Ｃｅｌ
ｌ３５，７９〜８７）を用いて、ネトロプシンがＳｇｒ
Ａｌの認識配列の外で結合しているか否かを検査した。 この方法によれば、ＤＮＡ結合ファクターはＤＮＡ断片
に結合され、次いでこのＤＮＡ結合ファクターは、断片
１個当たり最大１個の切片が生じるようにデオキシリボ
ヌクレアーゼにより消化される。分解生成物を変性ポリ
アクリルアミドゲル中で分離した場合には、はしご状の
パターンが生じる。このはしご状のパターンには、結合
蛋白質がデオキシリボヌクレアーゼによる分解前にＤＮ
Ａを保護するような間隙が存在する。ＳｇｒＡＩに対す
る分解位置を有する長い断片の１９１対塩基をＢａｍＨ
ＩおよびＳｐｈＩを用いてプラスミドｐＢＲ３２２から
切断し、かつＢａｍＨＩ分解位置で３２燐を用いて標識
化した。この断片５ｆｍｏｌをネトロプシン１０マイク
ロモル／ｌおよび２０マイクロモル／ｌと一緒にインキ
ュベートし、かつＤＮＡｓｅＩを用いて分解した。分解
生成物をポリアクリルアミドゲル中で分離した後、数多
くの保護された領域を検出した。しかし、ＳｇｒＡＩの
対する認識配列は、ネトロプシンによって保護されては
いなかった。 例４ 認識配列に結合している抗生物質がスター活性に影響を
及ぼさないかまたはスター活性の外で特異的活性をも減
少させることの例活性の測定は、ＳｇｒＡＩに関しては
例１の記載と同様に行なわれ、かつＥｃｏＲＩに関して
は例２の記載と同様に行なわれる。
【００３５】認識配列中でアクチノマイシンＤに対する
結合位置を有するＳｇｒＡＩの特異的活性をアクチノマ
イシンＤに（＞６マイクロモル／ｌ）によって阻止する
。
結合位置を有するＳｇｒＡＩの特異的活性をアクチノマ
イシンＤに（＞６マイクロモル／ｌ）によって阻止する
。
【００３６】認識配列中でネトロプシンに対する結合位
置を有するＥｃｏＲＩの特異的活性をネトロプシン（２
００マイクロモル／ｌ）によって阻止する。
置を有するＥｃｏＲＩの特異的活性をネトロプシン（２
００マイクロモル／ｌ）によって阻止する。
【００３７】認識配列中で同様にネトロプシンに対する
結合位置を有するＳｃａＩの特異的活性およびスター活
性をネトロプシン（＜１５０マイクロモル／ｌ）によっ
て阻止する。
結合位置を有するＳｃａＩの特異的活性およびスター活
性をネトロプシン（＜１５０マイクロモル／ｌ）によっ
て阻止する。
【００３８】ＳｃａＩの活性測定
酵素単位の定義：ＳｃａＩ １Ｕは、λ−ＤＮＡ
１μｇを３７℃で１時間で分解する。
１μｇを３７℃で１時間で分解する。
【００３９】インキュベーション緩衝液２５μｌ（トリ
ス−ＨＣｌ ５００ミリモル／ｌ、ｐＨ７．５／３７
℃、ＭｇＣｌ２ １００ミリモル／ｌ、ＮａＣｌ
１モル／ｌ、ＤＴＥ １０ミリモル／ｌ）の混合物に
、水１７．５μｌおよびλ−ＤＮＡ５μｌ（光学密度：
４ ＯＤ／μｌ）ならびにＳｃａＩ溶液 １μｌ（
１Ｕ／μｌ〜５Ｕ／μｌ）を添加する。この溶液を３７
℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、かつこれ
に尿素７モル／ｌ、サッカロース２０（ｗ／ｖ）％、Ｅ
ＤＴＡ６０ミリモル／ｌおよびブロムフェノールブルー
０．０１（ｗ／ｖ）％からなる停止試薬５μｌを添加す
る。引続き、１％のアガロースゲル中で１００ボルトで
２〜３時間電気泳動処理することによって分離を実施し
た。得られたバンドをＤＮＡ長さ標準（Ｌａｅｎｇｅｎ
ｓｔａｎｄａｒｄ）との比較により同定する。
ス−ＨＣｌ ５００ミリモル／ｌ、ｐＨ７．５／３７
℃、ＭｇＣｌ２ １００ミリモル／ｌ、ＮａＣｌ
１モル／ｌ、ＤＴＥ １０ミリモル／ｌ）の混合物に
、水１７．５μｌおよびλ−ＤＮＡ５μｌ（光学密度：
４ ＯＤ／μｌ）ならびにＳｃａＩ溶液 １μｌ（
１Ｕ／μｌ〜５Ｕ／μｌ）を添加する。この溶液を３７
℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、かつこれ
に尿素７モル／ｌ、サッカロース２０（ｗ／ｖ）％、Ｅ
ＤＴＡ６０ミリモル／ｌおよびブロムフェノールブルー
０．０１（ｗ／ｖ）％からなる停止試薬５μｌを添加す
る。引続き、１％のアガロースゲル中で１００ボルトで
２〜３時間電気泳動処理することによって分離を実施し
た。得られたバンドをＤＮＡ長さ標準（Ｌａｅｎｇｅｎ
ｓｔａｎｄａｒｄ）との比較により同定する。
【００４０】例５
認識配列への抗生物質の結合または認識配列外での抗生
物質の結合の検出 このような方法は、例３に記載されているフットプリン
ト法である。
物質の結合の検出 このような方法は、例３に記載されているフットプリン
ト法である。
【００４１】ＤＮＡ結合抗生物質をＤＮＡ断片に対して
５〜２０マイクロモル／ｌの濃度で結合する。このＤＮ
Ａ断片は、検査すべきＲＥ認識配列を有する。このＤＮ
Ａ断片を２つの鎖の１つに３２燐を用いて末端標識化す
る。それぞれ標識化された断片５〜１０ｆｍｏｌを５０
μｌの反応容量中で抗生物質５〜２０マイクロモル／ｌ
と一緒に０℃で１５分間インキュベートする。その上、
この反応バッチを室温で１分間インキュベートし、Ｍｇ
Ｃｌ２（１０ミリモル／ｌ）およびＣａＣｌ２（５ミリ
モル／ｌ）からなる溶液５０μｌを添加し、かつ再び室
温で１分間インキュベートする。デオキシリボヌクレー
ゼ２μｌ（０．１２５ｎｇ／ｍｌ）を添加し、かつ室温
で１分間インキュベートする。この反応を停止溶液９０
μｌ（ＥＤＴＡ２０ミリモル／ｌ、ＳＤＳ１％、ＮａＣ
ｌ ０．２ミリモル／ｌ、酵素ＲＮＡ２５０μｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ８．０）の添加によって中断する。この反応混
合物をフェノール化し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ
、かつ尿素８モル／ｌを含有する６％のポリアクリルア
ミドゲル上で分離する。ＤＮＡの検出は、オートラジオ
グラフィーによって行なわれる。抗生物質の結合によっ
て保護された領域は、制限されたデオキシリボヌクレア
ーゼの消化によって生じた断片はしご状体中の間隙を示
す。ＤＮＡ断片の配列に対する結合位置の相互配置は、
マクサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５、４９７〜５５９）
により得られた平行に支持された配列はしご状体によっ
て行なわれる。
５〜２０マイクロモル／ｌの濃度で結合する。このＤＮ
Ａ断片は、検査すべきＲＥ認識配列を有する。このＤＮ
Ａ断片を２つの鎖の１つに３２燐を用いて末端標識化す
る。それぞれ標識化された断片５〜１０ｆｍｏｌを５０
μｌの反応容量中で抗生物質５〜２０マイクロモル／ｌ
と一緒に０℃で１５分間インキュベートする。その上、
この反応バッチを室温で１分間インキュベートし、Ｍｇ
Ｃｌ２（１０ミリモル／ｌ）およびＣａＣｌ２（５ミリ
モル／ｌ）からなる溶液５０μｌを添加し、かつ再び室
温で１分間インキュベートする。デオキシリボヌクレー
ゼ２μｌ（０．１２５ｎｇ／ｍｌ）を添加し、かつ室温
で１分間インキュベートする。この反応を停止溶液９０
μｌ（ＥＤＴＡ２０ミリモル／ｌ、ＳＤＳ１％、ＮａＣ
ｌ ０．２ミリモル／ｌ、酵素ＲＮＡ２５０μｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ８．０）の添加によって中断する。この反応混
合物をフェノール化し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ
、かつ尿素８モル／ｌを含有する６％のポリアクリルア
ミドゲル上で分離する。ＤＮＡの検出は、オートラジオ
グラフィーによって行なわれる。抗生物質の結合によっ
て保護された領域は、制限されたデオキシリボヌクレア
ーゼの消化によって生じた断片はしご状体中の間隙を示
す。ＤＮＡ断片の配列に対する結合位置の相互配置は、
マクサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５、４９７〜５５９）
により得られた平行に支持された配列はしご状体によっ
て行なわれる。
【００４２】例６
ネトロプシンによるＳｇｒＡＩのスター活性の還元ネト
ロプシンの存在下でのＳｇｒＡＩの活性およびスター活
性の測定は、例１の記載と同様にして行なわれる。 インキュベーション混合物にネトロプシン（ネトロプシ
ン４ミリモル／ｌ、トリス−ＨＣｌ １０ミリモル／
ｌ、ＥＤＴＡ１ミリモル／ｌ、ｐＨ８．０）からなる溶
液１．２５〜５μｌを添加する。スター活性は、付加的
に特異的活性によって製造されて生じるＤＮＡ断片の生
起を示す。
ロプシンの存在下でのＳｇｒＡＩの活性およびスター活
性の測定は、例１の記載と同様にして行なわれる。 インキュベーション混合物にネトロプシン（ネトロプシ
ン４ミリモル／ｌ、トリス−ＨＣｌ １０ミリモル／
ｌ、ＥＤＴＡ１ミリモル／ｌ、ｐＨ８．０）からなる溶
液１．２５〜５μｌを添加する。スター活性は、付加的
に特異的活性によって製造されて生じるＤＮＡ断片の生
起を示す。
【００４３】消化の条件
λ−ＤＮＡ １μｇ、ネトロプシン０．１〜０．４ミ
リモル／ｌ、ＳｇｒＡＩ１〜２０Ｕ、トリス−アセテー
ト３３ミリモル、Ｍｇ−アセテート１０ミリモル、Ｋ−
アセテート６６ミリモル／ｌ、ＤＴＴ０．５ミリモル／
ｌ、３７℃でｐＨ７．９。反応混合物の容量５０μｌ。 ３７℃で１６時間のインキュベーション。
リモル／ｌ、ＳｇｒＡＩ１〜２０Ｕ、トリス−アセテー
ト３３ミリモル、Ｍｇ−アセテート１０ミリモル、Ｋ−
アセテート６６ミリモル／ｌ、ＤＴＴ０．５ミリモル／
ｌ、３７℃でｐＨ７．９。反応混合物の容量５０μｌ。 ３７℃で１６時間のインキュベーション。
【００４４】λ−ＤＮＡをＳｇｒＡＩを用いて認識配列
ＣＡ／ＧＣＣＧＧＣ／ＴＧについて分解することによっ
て、 １６６７６ １４８５０ ７０６６ ４１９８ ２７７５ １６１６および １３２１の対塩基を有する７つの断片が生じる。
ＣＡ／ＧＣＣＧＧＣ／ＴＧについて分解することによっ
て、 １６６７６ １４８５０ ７０６６ ４１９８ ２７７５ １６１６および １３２１の対塩基を有する７つの断片が生じる。
【００４５】これを、電気泳動法によって分離し、かつ
エチジウムブロミドを用いて着色することによってＵＶ
光中で目で見ることができるようにする。
エチジウムブロミドを用いて着色することによってＵＶ
光中で目で見ることができるようにする。
【００４６】増大する量のＳｇｒＡＩをそれぞれλ−Ｄ
ＮＡ１μｇと一緒に３７℃で１時間インキュベートする
。
ＮＡ１μｇと一緒に３７℃で１時間インキュベートする
。
【００４７】ネトロプシンが不在である場合には、１〜
５Ｕの酵素量の際に完全な消化に対して特性を示すパタ
ーン（７個のバンド）を示すことができる。７Ｕを用い
た場合には、１６１６ｂｐを有する断片は、部分的に減
成されている。１０Ｕを用いた場合には、付加的に弱い
強度のバンドが生じ、約１３０００ｂｐおよび約１０５
００ｂｐを有する断片は、相互配置されていてもよい。 ＳｇｒＡＩ１２Ｕを用いた場合には、約１３０００ｂｐ
および１０５００ｂｐを有する断片は、明らかに目で見
ることができ、対塩基約３８００、３７００および２０
００を有する他の断片が生成され、１６１６ｂｐを有す
る断片は完全に消失している。ＳｇｒＡＩ １６Ｕを
用いた場合には、他の付加的な断片が形成され、特異的
な消化によって生成された断片は、より強く減成されて
いる。
５Ｕの酵素量の際に完全な消化に対して特性を示すパタ
ーン（７個のバンド）を示すことができる。７Ｕを用い
た場合には、１６１６ｂｐを有する断片は、部分的に減
成されている。１０Ｕを用いた場合には、付加的に弱い
強度のバンドが生じ、約１３０００ｂｐおよび約１０５
００ｂｐを有する断片は、相互配置されていてもよい。 ＳｇｒＡＩ１２Ｕを用いた場合には、約１３０００ｂｐ
および１０５００ｂｐを有する断片は、明らかに目で見
ることができ、対塩基約３８００、３７００および２０
００を有する他の断片が生成され、１６１６ｂｐを有す
る断片は完全に消失している。ＳｇｒＡＩ １６Ｕを
用いた場合には、他の付加的な断片が形成され、特異的
な消化によって生成された断片は、より強く減成されて
いる。
【００４８】ネトロプシン０．２ミリモル／ｌを添加し
た場合には、ＳｇｒＡＩは１６Ｕまでスター活性によっ
て発生したバンドを観察することができず、１６１６ｂ
ｐ断片は、ＳｇｒＡＩ １２Ｕから容易に減成されて
いる。また、ネトロプシン０．４ミリモル／ｌを用いた
場合には、１６Ｕまで付加的に、スター活性によって生
成されていてもよい断片を目で見ることができず、１６
１６ｂｐを有する断片は、僅かにのみ減成されている。
た場合には、ＳｇｒＡＩは１６Ｕまでスター活性によっ
て発生したバンドを観察することができず、１６１６ｂ
ｐ断片は、ＳｇｒＡＩ １２Ｕから容易に減成されて
いる。また、ネトロプシン０．４ミリモル／ｌを用いた
場合には、１６Ｕまで付加的に、スター活性によって生
成されていてもよい断片を目で見ることができず、１６
１６ｂｐを有する断片は、僅かにのみ減成されている。
【００４９】スター活性は、ネトロプシンによって２〜
３倍減少可能である。
３倍減少可能である。
【００５０】例７
アクチノマイシンＤによるＥｃｏＲＩのスター活性の減
少：アクチノマイシンＤの存在下でのＥｃｏＲＩの活性
およびスター活性の測定は、例２に記載の方法と同様に
行なわれる。しかし、インキュベーションバッチには、
ＴＥ中のアクチノマイシンＤからの溶液１．２５〜２．
５μｌ（アクチノマイシンＤ２００マイクロモル／ｌ、
トリス−ＨＣｌ １０ミリモル／ｌ、ＥＤＴＡ１ミリ
モル／ｌ、ｐＨ８．０）が添加される。
少：アクチノマイシンＤの存在下でのＥｃｏＲＩの活性
およびスター活性の測定は、例２に記載の方法と同様に
行なわれる。しかし、インキュベーションバッチには、
ＴＥ中のアクチノマイシンＤからの溶液１．２５〜２．
５μｌ（アクチノマイシンＤ２００マイクロモル／ｌ、
トリス−ＨＣｌ １０ミリモル／ｌ、ＥＤＴＡ１ミリ
モル／ｌ、ｐＨ８．０）が添加される。
【００５１】ＥｃｏＲＩの完全な認識配列についてのλ
−ＤＮＡの特異的な分解により、 ２１２２６ ７４２１ ５８０４ ５６４３ ４８７８および ３５３０の対塩基を有する断片が生じる。
−ＤＮＡの特異的な分解により、 ２１２２６ ７４２１ ５８０４ ５６４３ ４８７８および ３５３０の対塩基を有する断片が生じる。
【００５２】消化の条件
λ−ＤＮＡ １μｇ、アクチノマイシンＤ１０〜２０
マイクロモル／ｌ、ＥｃｏＲＩ １〜６０Ｕ、トリス
−ＨＣｌ ５０ミリモル、ＭｇＣｌ２１０ミリモル、
ＮａＣｌ １００ミリモル／ｌ、ＤＴＥ １ミリモ
ル／ｌ、３７℃でｐＨ７．５。反応混合物の容量２５μ
ｌ。３７℃で１６時間のインキュベーション。
マイクロモル／ｌ、ＥｃｏＲＩ １〜６０Ｕ、トリス
−ＨＣｌ ５０ミリモル、ＭｇＣｌ２１０ミリモル、
ＮａＣｌ １００ミリモル／ｌ、ＤＴＥ １ミリモ
ル／ｌ、３７℃でｐＨ７．５。反応混合物の容量２５μ
ｌ。３７℃で１６時間のインキュベーション。
【００５３】λ−ＤＮＡ１μｇを増大する量のＥｃｏＲ
Ｉと一緒に１６時間インキュベートした場合には、次の
観察が行なわれる：ＥｃｏＲＩ １〜１０Ｕにより、
λ−ＤＮＡの完全な消化パターンが生じる。ＥｃｏＲＩ
２０Ｕを用いた場合には、約１１５００、８８００、４
５００、２８００および２０００の大きさの対塩基の断
片を相互配置することができる付加的なバンドが生じる
。 特異的な分解によって生成された断片は、例えば相対的
強度から判断することができるように部分的に減成され
ている。ＥｃｏＲＩ３０Ｕを用いた場合には、特異的な
分解によって特性を示す断片がさらに減成され、非特異
的分解によって生成された断片は数が多くなり、かつ大
量に存在する。
Ｉと一緒に１６時間インキュベートした場合には、次の
観察が行なわれる：ＥｃｏＲＩ １〜１０Ｕにより、
λ−ＤＮＡの完全な消化パターンが生じる。ＥｃｏＲＩ
２０Ｕを用いた場合には、約１１５００、８８００、４
５００、２８００および２０００の大きさの対塩基の断
片を相互配置することができる付加的なバンドが生じる
。 特異的な分解によって生成された断片は、例えば相対的
強度から判断することができるように部分的に減成され
ている。ＥｃｏＲＩ３０Ｕを用いた場合には、特異的な
分解によって特性を示す断片がさらに減成され、非特異
的分解によって生成された断片は数が多くなり、かつ大
量に存在する。
【００５４】しかし、反応混合物にアクチノマイシンＤ
（１０マイクロモル／ｌ）を添加した場合には、Ｅｃｏ
ＲＩ １０Ｕ、２０Ｕおよび３０Ｕによって生じる分
解パターンが同定され、分解は、ＥｃｏＲＩの特異的な
認識配列についてのみ生じる。ＥｃｏＲＩ４０Ｕを用い
た場合に初めて付加的なバンドが生じる。スター活性は
、３倍だけ減少される。
（１０マイクロモル／ｌ）を添加した場合には、Ｅｃｏ
ＲＩ １０Ｕ、２０Ｕおよび３０Ｕによって生じる分
解パターンが同定され、分解は、ＥｃｏＲＩの特異的な
認識配列についてのみ生じる。ＥｃｏＲＩ４０Ｕを用い
た場合に初めて付加的なバンドが生じる。スター活性は
、３倍だけ減少される。
Claims (3)
- 【請求項１】 非特異的スター活性をデオキシリボ核
酸の特異的分解の際に適当な緩衝液中で制限エンドヌク
レアーゼを用いてのインキュベーションにより減少させ
る方法において、インキュベーション配合物に抗生物質
を添加し、この場合この抗生物質は、酵素のスター配列
に接触または隣接して結合するが、しかし制限エンドヌ
クレアーゼの特異的認識配列内ではＤＮＡに結合してい
ないことを特徴とする、非特異的スター活性を減少させ
る方法。 - 【請求項２】 抗生物質が制限エンドヌクレアーゼの
特異的認識配列に結合しているか否かを試験するために
、所謂“フットプリントアッセイ”を実施し、スター配
列への抗生物質の結合を、インキュベーション配合物中
で抗生物質を一緒におよび抗生物質なしにエンドヌクレ
アーゼを用いてＤＮＡ分解するための比較試験によって
確認する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 使用される制限エンドヌクレアーゼに
依存して、アクチノマイシンＤ、ディスタマイシン、エ
キノマイシン、ミトラマイシンまたはネトロプシンを抗
生物質として使用する、請求項１または２に記載の方法
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4009663A DE4009663A1 (de) | 1990-03-26 | 1990-03-26 | Verfahren zur verminderung von sternaktivitaeten |
| DE4009663.7 | 1990-03-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330293A true JPH04330293A (ja) | 1992-11-18 |
Family
ID=6403078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3056718A Pending JPH04330293A (ja) | 1990-03-26 | 1991-03-20 | 非特異的スター活性を減少させる方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5204238A (ja) |
| EP (1) | EP0449178A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04330293A (ja) |
| DE (1) | DE4009663A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE493493T1 (de) * | 2005-08-31 | 2011-01-15 | New England Biolabs Inc | Kpni-restriktionsendonukleasen mit reduzierter star-aktivität |
| CN101802183B (zh) * | 2007-07-12 | 2016-02-24 | 新英格兰生物实验室公司 | 高保真度限制性内切核酸酶 |
| US10947518B1 (en) * | 2019-10-18 | 2021-03-16 | Abclonal Science, Inc. | Using proteases to control restriction enzyme activity |
-
1990
- 1990-03-26 DE DE4009663A patent/DE4009663A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-03-14 US US07/669,562 patent/US5204238A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-20 JP JP3056718A patent/JPH04330293A/ja active Pending
- 1991-03-25 EP EP19910104674 patent/EP0449178A3/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0449178A2 (de) | 1991-10-02 |
| DE4009663A1 (de) | 1991-10-02 |
| US5204238A (en) | 1993-04-20 |
| EP0449178A3 (en) | 1992-07-15 |
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