JPH04335154A - 薬物スクリ−ニング方法 - Google Patents
薬物スクリ−ニング方法Info
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- JPH04335154A JPH04335154A JP13214191A JP13214191A JPH04335154A JP H04335154 A JPH04335154 A JP H04335154A JP 13214191 A JP13214191 A JP 13214191A JP 13214191 A JP13214191 A JP 13214191A JP H04335154 A JPH04335154 A JP H04335154A
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は固相上に配置した細胞の
セロトニン取り込み反応（いわゆるアップテイク反応）
を利用するドラッグ・スクリーニング法に関し、より詳
しくは、固相上に配置した特定のセロトニン取り込み能
力を有する細胞のセロトニン等のリガンド取り込み反応
を利用するドラッグ・スクリーニング法に関する。
セロトニン取り込み反応（いわゆるアップテイク反応）
を利用するドラッグ・スクリーニング法に関し、より詳
しくは、固相上に配置した特定のセロトニン取り込み能
力を有する細胞のセロトニン等のリガンド取り込み反応
を利用するドラッグ・スクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、神経伝達物質の一種であるセロト
ニンに関連したドラッグスクリーニング方法としては、
例えばセロトニンリセプターを利用した測定法が知られ
ている。このリセプター法においては、ラット等の動物
脳のホモジネート等を薬剤等の被検試料、および放射性
同位元素で標識した標識セロトニンとインキュベートし
、リセプターと結合した標識セロトニン（Ｂ）と非結合
の遊離標識セロトニン（Ｆ）のいわゆるＢ／Ｆ分離を行
った後、結合標識セロトニン量を測定するのが一般的で
あった。また、取り込み反応を行う場合にも、動物脳の
ホモジネートを同様に用いるのが一般的であった。
ニンに関連したドラッグスクリーニング方法としては、
例えばセロトニンリセプターを利用した測定法が知られ
ている。このリセプター法においては、ラット等の動物
脳のホモジネート等を薬剤等の被検試料、および放射性
同位元素で標識した標識セロトニンとインキュベートし
、リセプターと結合した標識セロトニン（Ｂ）と非結合
の遊離標識セロトニン（Ｆ）のいわゆるＢ／Ｆ分離を行
った後、結合標識セロトニン量を測定するのが一般的で
あった。また、取り込み反応を行う場合にも、動物脳の
ホモジネートを同様に用いるのが一般的であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな動物脳ホモジネートを用いた方法においては多くの
神経伝達物質の受容体・取り込み系が存在し、結果の解
釈が困難であったり、あるいは非特異反応が生じ易いと
いう欠点があった。
うな動物脳ホモジネートを用いた方法においては多くの
神経伝達物質の受容体・取り込み系が存在し、結果の解
釈が困難であったり、あるいは非特異反応が生じ易いと
いう欠点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、特定のセロトニン取り込み能力を有する細胞を用
いたアップテイク（ｕｐｔａｋｅ）反応を積極的に利用
することにより、（特にｕｐｔａｋｅ阻害を第一選択と
する）簡便で非特異反応がより抑制されたドラッグスク
リーニングが可能なことを見出し本発明を完成した。
結果、特定のセロトニン取り込み能力を有する細胞を用
いたアップテイク（ｕｐｔａｋｅ）反応を積極的に利用
することにより、（特にｕｐｔａｋｅ阻害を第一選択と
する）簡便で非特異反応がより抑制されたドラッグスク
リーニングが可能なことを見出し本発明を完成した。
【０００５】本発明のセロトニン取り込み反応の測定法
はこのような知見に基づくものであり、より詳しくは、
固相上に配置したセロトニン取り込み能力を有する細胞
を、セロトニン取り込み系における標識リガンドおよび
被検薬物と接触させ、上記細胞中に取り込まれた標識リ
ガンドを測定することを特徴とするものである。
はこのような知見に基づくものであり、より詳しくは、
固相上に配置したセロトニン取り込み能力を有する細胞
を、セロトニン取り込み系における標識リガンドおよび
被検薬物と接触させ、上記細胞中に取り込まれた標識リ
ガンドを測定することを特徴とするものである。
【０００６】以下、本発明を更に詳細に説明する。
（細 胞）本発明の測定方法で用いられる細胞は、以
下に定義するセロトニン取り込み能力が、後述するイン
キュベーション温度（例えば３７゜Ｃ）において０．０
１ｐ ｍｏｌ ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ 以上
、更には０．２ ｐ ｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／
ｍｉｎ 以上であることが好ましく、セロトニン取り込
み阻害剤（例えば、イミプラミン）により、阻害剤非存
在下でのセロトニン取り込み量に対して、２０％以上、
更には７０％以上の阻害を受けるものであることが好ま
しい。
下に定義するセロトニン取り込み能力が、後述するイン
キュベーション温度（例えば３７゜Ｃ）において０．０
１ｐ ｍｏｌ ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ 以上
、更には０．２ ｐ ｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／
ｍｉｎ 以上であることが好ましく、セロトニン取り込
み阻害剤（例えば、イミプラミン）により、阻害剤非存
在下でのセロトニン取り込み量に対して、２０％以上、
更には７０％以上の阻害を受けるものであることが好ま
しい。
【０００７】本発明においては、上記「セロトニン取り
込み能力」は、以下の方法で好適に測定できる。 （１） 試料細胞を必要に応じてポリリシン（Ｐｏｌｙ
−ｌｙｓｉｎ）、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）等で
処理した培養容器（９６穴のマイクロプレート等に１０
４ 〜１０６ 個／ｍｌの濃度で播種し、３７℃のイン
キュベータ中で２〜３日間程度培養する。 （２） 培養後、等張緩衝液、ＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎｇｅ
ｒ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ （１２８ｍＭ ＮａＣｌ−５
．２ｍＭ ＫＣｌ−２．１ｍＭ ＭｇＳＯ４ −５
ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ −１０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐ
Ｈ７．４−０．５ｍＭ ａｓｃｏｒｂａｔｅ −０．
５ｍＭ ｐａｒｇｙｌｉｎｅ ）で２回細胞の洗浄操
作を行い、更に、０．１μＭ ３Ｈ標識セロトニン（ま
たはパロキセチン等）５０μｌを各ウェル毎に加え、３
７℃で４０分間反応させる。 （３） 反応終了後、上記と同様な洗浄操作を３回行い
、続いて１％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）１
５０μｌを添加し、細胞を可溶化する。 （４） 細胞に取り込まれたセロトニン量は、可溶化し
た細胞をシンチレーションカクテル（例えば、エコシン
ト、ナショナル ダイアグノスティック社等）に分散
して液体シンチレーションカウンター（例えば、ＬＳＣ
−７００、アロカ等）を用いて測定する。 （５） 可溶化した細胞の蛋白量を、例えばＢＣＡ蛋白
質定量法（Ｓｍｉｔｈ．Ｐ．Ｋ． ｅｔａｌ．，Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５０，７６−８５（１９８５
） ）を用いて測定する。 （６） 上記で測定したセロトニン量 （ｐ ｍｏｌ）
、および可溶化細胞の蛋白質量（ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ）
から計算により、セロトニン取り込み量（ｐ ｍｏｌ／
ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ／ｍｉｎ）を求める。
込み能力」は、以下の方法で好適に測定できる。 （１） 試料細胞を必要に応じてポリリシン（Ｐｏｌｙ
−ｌｙｓｉｎ）、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）等で
処理した培養容器（９６穴のマイクロプレート等に１０
４ 〜１０６ 個／ｍｌの濃度で播種し、３７℃のイン
キュベータ中で２〜３日間程度培養する。 （２） 培養後、等張緩衝液、ＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎｇｅ
ｒ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ （１２８ｍＭ ＮａＣｌ−５
．２ｍＭ ＫＣｌ−２．１ｍＭ ＭｇＳＯ４ −５
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５ｍＭ ｐａｒｇｙｌｉｎｅ ）で２回細胞の洗浄操
作を行い、更に、０．１μＭ ３Ｈ標識セロトニン（ま
たはパロキセチン等）５０μｌを各ウェル毎に加え、３
７℃で４０分間反応させる。 （３） 反応終了後、上記と同様な洗浄操作を３回行い
、続いて１％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）１
５０μｌを添加し、細胞を可溶化する。 （４） 細胞に取り込まれたセロトニン量は、可溶化し
た細胞をシンチレーションカクテル（例えば、エコシン
ト、ナショナル ダイアグノスティック社等）に分散
して液体シンチレーションカウンター（例えば、ＬＳＣ
−７００、アロカ等）を用いて測定する。 （５） 可溶化した細胞の蛋白量を、例えばＢＣＡ蛋白
質定量法（Ｓｍｉｔｈ．Ｐ．Ｋ． ｅｔａｌ．，Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５０，７６−８５（１９８５
） ）を用いて測定する。 （６） 上記で測定したセロトニン量 （ｐ ｍｏｌ）
、および可溶化細胞の蛋白質量（ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ）
から計算により、セロトニン取り込み量（ｐ ｍｏｌ／
ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ／ｍｉｎ）を求める。
【０００８】なお、上記した測定条件は細胞の「セロト
ニン取り込み能力」を評価するためにのみ用いられるも
のであり、本発明の薬物スクリーニング法自体における
測定条件を何等限定するものではない。
ニン取り込み能力」を評価するためにのみ用いられるも
のであり、本発明の薬物スクリーニング法自体における
測定条件を何等限定するものではない。
【０００９】本発明においては、上述したようなセロト
ニン取り込み能力を有する細胞を特に制限なく用いるこ
とが可能であるが、ラット副腎褐色腫細胞、例えばＡＴ
ＣＣ（アメリカン タイプ カルチャー コレク
ション Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） 寄託番号第ＣＲＬ１７２
１号のＰＣ１２ ｃｅｌｌ が好ましく用いられる。 このＰＣ１２細胞は、例えば、大日本製薬株式会社等を
通じて容易に入手することができる。上記細胞は、必要
に応じて、マイクロプレート等の固相とともに用いるが
、該細胞を固相上に播種した後、必要に応じて培養して
用いてもよい。
ニン取り込み能力を有する細胞を特に制限なく用いるこ
とが可能であるが、ラット副腎褐色腫細胞、例えばＡＴ
ＣＣ（アメリカン タイプ カルチャー コレク
ション Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） 寄託番号第ＣＲＬ１７２
１号のＰＣ１２ ｃｅｌｌ が好ましく用いられる。 このＰＣ１２細胞は、例えば、大日本製薬株式会社等を
通じて容易に入手することができる。上記細胞は、必要
に応じて、マイクロプレート等の固相とともに用いるが
、該細胞を固相上に播種した後、必要に応じて培養して
用いてもよい。
【００１０】上記固相としては、例えば複数のウェル（
ｗｅｌｌ）を有するプラスチック製のマイクロプレート
（９６−ウェル−マイクロプレート等）が、小量の細胞
を用いた簡便迅速なスクリーニングを可能とする点から
好ましく用いられる。細胞を固相上に安定に配置する点
からは、上記固相をあらかじめポリリジン又はコラーゲ
ン等（特にポリリジン）で前処理した後に用いることが
好ましい。固相をポリリジン等で処理する場合、例えば
、濃度０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ（より好
ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌ）程度のポリリジン
の水溶液に、上記固相を１分以上、より好ましくは２０
〜１２０分程度浸した後、必要に応じて乾燥し、２回程
度の蒸留水による洗浄を施した後、使用すればよい。上
記したセロトニン取り込み能力を有する細胞は、例えば
上記固相上に１０４〜１０６ 個／ｍｌ程度、より好ま
しくは２×１０５ 個／ｍｌ程度の濃度で接種し、３７
℃で数時間ないし数週間、通常は数日程度（２〜３日間
）培養した後に用いればよい。
ｗｅｌｌ）を有するプラスチック製のマイクロプレート
（９６−ウェル−マイクロプレート等）が、小量の細胞
を用いた簡便迅速なスクリーニングを可能とする点から
好ましく用いられる。細胞を固相上に安定に配置する点
からは、上記固相をあらかじめポリリジン又はコラーゲ
ン等（特にポリリジン）で前処理した後に用いることが
好ましい。固相をポリリジン等で処理する場合、例えば
、濃度０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ（より好
ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌ）程度のポリリジン
の水溶液に、上記固相を１分以上、より好ましくは２０
〜１２０分程度浸した後、必要に応じて乾燥し、２回程
度の蒸留水による洗浄を施した後、使用すればよい。上
記したセロトニン取り込み能力を有する細胞は、例えば
上記固相上に１０４〜１０６ 個／ｍｌ程度、より好ま
しくは２×１０５ 個／ｍｌ程度の濃度で接種し、３７
℃で数時間ないし数週間、通常は数日程度（２〜３日間
）培養した後に用いればよい。
【００１１】細胞を固相上に配置する場合、セロトニン
取り込み反応に供する際に、該細胞が固相上で均一な状
態となっていることが、再現性が良好なスクリーニング
を行う上で好ましい。このような好適な状態を得るため
に、最初の接種濃度および培養時間が重要である。より
具体的には、例えば、大きさが８５×１２７×１４ｍｍ
程度の９６ウェル−マイクロプレート（例えば、コーニ
ング社製 ２５８６０ プレート等）を用いる場合に
は、（好ましくはポリリジンでコートした後）細胞を１
ウェル当り１０３ 〜２×１０５個／ウェル程度（特に
好ましくは１０４ 〜１０５個／ウェル程度）接種し、
３７℃のインキュベータ中で２４〜７２時間程度（特に
４０〜５２時間程度）培養することが、測定感度と再現
性（ないし均一性）のバランスの点で好ましい。
取り込み反応に供する際に、該細胞が固相上で均一な状
態となっていることが、再現性が良好なスクリーニング
を行う上で好ましい。このような好適な状態を得るため
に、最初の接種濃度および培養時間が重要である。より
具体的には、例えば、大きさが８５×１２７×１４ｍｍ
程度の９６ウェル−マイクロプレート（例えば、コーニ
ング社製 ２５８６０ プレート等）を用いる場合に
は、（好ましくはポリリジンでコートした後）細胞を１
ウェル当り１０３ 〜２×１０５個／ウェル程度（特に
好ましくは１０４ 〜１０５個／ウェル程度）接種し、
３７℃のインキュベータ中で２４〜７２時間程度（特に
４０〜５２時間程度）培養することが、測定感度と再現
性（ないし均一性）のバランスの点で好ましい。
【００１２】（標識リガンド）本発明においては、標識
すべきリガンドとして、セロトニン自体の他にパロキセ
チン等のセロトニン取り込み系におけるリガンドが利用
可能である。セロトニン等のリガンドを標識する物質と
しては、後述するような測定方法により該標識リガンド
の細胞内への取り込み量を測定可能な物質であれば、特
に制限なく用いることが可能である。
すべきリガンドとして、セロトニン自体の他にパロキセ
チン等のセロトニン取り込み系におけるリガンドが利用
可能である。セロトニン等のリガンドを標識する物質と
しては、後述するような測定方法により該標識リガンド
の細胞内への取り込み量を測定可能な物質であれば、特
に制限なく用いることが可能である。
【００１３】このような標識物質として、より具体的に
は ３Ｈ、１４Ｃ等の放射性同位元素、酵素、発光物質
等が用いられる、細胞内へのリガンド取り込み量を簡便
且つ正確に測定可能な点からは、放射性同位元素（特に
トリチウム）を用いることが好ましい。セロトニン等の
リガンド取り込み量の測定法としては、公知の手段が特
に制限なく用いられる。より具体的には、標識物質とし
て放射性同位元素を用いた場合には、液体シンチレーシ
ョンカウンターやγカウンター等が用いられる。酵素を
標識物質として用いた場合には、例えば、該酵素と反応
する基質を加えて所定の反応を行わせた後、分光光度計
による測定を行えばよい。また、標識物質として発光物
質を用いた場合にはフォトンカウンター等による測定を
行えばよい。
は ３Ｈ、１４Ｃ等の放射性同位元素、酵素、発光物質
等が用いられる、細胞内へのリガンド取り込み量を簡便
且つ正確に測定可能な点からは、放射性同位元素（特に
トリチウム）を用いることが好ましい。セロトニン等の
リガンド取り込み量の測定法としては、公知の手段が特
に制限なく用いられる。より具体的には、標識物質とし
て放射性同位元素を用いた場合には、液体シンチレーシ
ョンカウンターやγカウンター等が用いられる。酵素を
標識物質として用いた場合には、例えば、該酵素と反応
する基質を加えて所定の反応を行わせた後、分光光度計
による測定を行えばよい。また、標識物質として発光物
質を用いた場合にはフォトンカウンター等による測定を
行えばよい。
【００１４】（被検試料）本発明の方法によりドラッグ
スクリーニングを行う場合には、被検試料として、セロ
トニン等のリガンド取り込みに与える効果を見ようとす
る薬剤が用いられる。該薬剤の使用量は特に限定されな
いが、例えば最終濃度０．０００１〜１０００μＭ程度
、更には０．０１〜１００μＭ程度となるように該薬剤
を用いればよい。この場合、上記標識セロトニン等のリ
ガンドは、例えばマイクロプレートの一穴当たり、濃度
０．１μＭ程度の溶液として２０〜３００μｌ（更には
５０〜２００μｌ）程度を用いることが好ましい。
スクリーニングを行う場合には、被検試料として、セロ
トニン等のリガンド取り込みに与える効果を見ようとす
る薬剤が用いられる。該薬剤の使用量は特に限定されな
いが、例えば最終濃度０．０００１〜１０００μＭ程度
、更には０．０１〜１００μＭ程度となるように該薬剤
を用いればよい。この場合、上記標識セロトニン等のリ
ガンドは、例えばマイクロプレートの一穴当たり、濃度
０．１μＭ程度の溶液として２０〜３００μｌ（更には
５０〜２００μｌ）程度を用いることが好ましい。
【００１５】（インキュベーション）本発明においては
、上記したセロトニン取り込み能力を有する細胞を標識
セロトニン等の標識リガンド、および被検試料と接触さ
せて所定の反応を生じさせる（いわゆるインキュベーシ
ョン）が、このインキュベーションに先立って、等張緩
衝液（例えばＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｂｕｆｆ
ｅｒ ）等で細胞の洗浄を１回以上（好ましくは１〜２
回）行うことは再現性の点から好ましい。標識リガンド
および被検試料は、必要に応じてＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎｇ
ｅｒ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｔ等の緩衝液で濃度０．０１〜
０．５μＭ程度、および０．０１〜１０μＭ程度に希釈
して用いることが好ましい。インキュベーションの温度
としては、０℃以上が好ましく、更には４〜３７℃（特
に３７℃程度）が好ましい。インキュベーションの時間
としては、５分以上、更には１０〜６０分程度が、作業
の効率性、再現性の点をも考慮した場合に好ましい。反
応終了後、細胞に取り込みされていない標識リガンドを
除くため、必要に応じて、上記と同様に緩衝液で複数回
（好ましくは２〜３回）洗浄操作を行った後、上記細胞
中に取り込みされたリガンド量を測定する。
、上記したセロトニン取り込み能力を有する細胞を標識
セロトニン等の標識リガンド、および被検試料と接触さ
せて所定の反応を生じさせる（いわゆるインキュベーシ
ョン）が、このインキュベーションに先立って、等張緩
衝液（例えばＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｂｕｆｆ
ｅｒ ）等で細胞の洗浄を１回以上（好ましくは１〜２
回）行うことは再現性の点から好ましい。標識リガンド
および被検試料は、必要に応じてＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎｇ
ｅｒ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｔ等の緩衝液で濃度０．０１〜
０．５μＭ程度、および０．０１〜１０μＭ程度に希釈
して用いることが好ましい。インキュベーションの温度
としては、０℃以上が好ましく、更には４〜３７℃（特
に３７℃程度）が好ましい。インキュベーションの時間
としては、５分以上、更には１０〜６０分程度が、作業
の効率性、再現性の点をも考慮した場合に好ましい。反
応終了後、細胞に取り込みされていない標識リガンドを
除くため、必要に応じて、上記と同様に緩衝液で複数回
（好ましくは２〜３回）洗浄操作を行った後、上記細胞
中に取り込みされたリガンド量を測定する。
【００１６】（取り込みリガンド量の測定）本発明にお
いては、細胞内に取り込みされた標識セロトニン等の標
識リガンド量の測定方法は特に制限されないが、例えば
、上記細胞を可溶化した後に、該細胞に取り込まれてい
た標識リガンド量と、可溶化した細胞の蛋白質量とを測
定して、リガンドの取り込み量（ｐ ｍｏｌ／ｍｇ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を計算することが、良好な再現
性を得る上で好ましい。ブランク（薬剤を用いない系）
のリガンド取り込み量との比較により、被検試料のリガ
ンド取り込みに対する効果の判定が可能となる。
いては、細胞内に取り込みされた標識セロトニン等の標
識リガンド量の測定方法は特に制限されないが、例えば
、上記細胞を可溶化した後に、該細胞に取り込まれてい
た標識リガンド量と、可溶化した細胞の蛋白質量とを測
定して、リガンドの取り込み量（ｐ ｍｏｌ／ｍｇ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を計算することが、良好な再現
性を得る上で好ましい。ブランク（薬剤を用いない系）
のリガンド取り込み量との比較により、被検試料のリガ
ンド取り込みに対する効果の判定が可能となる。
【００１７】上述したように細胞内に取り込まれた標識
リガンド量を測定するためには、公知の方法を用いるこ
とができる。例えば、０．１〜１％程度の濃度のＳＤＳ
溶液で細胞を可溶化する方法が好ましく用いられる標識
物質として放射性同位元素を用いた場合には、可溶化し
た細胞に取り込まれたリガンド量は、例えば、該可溶化
細胞をシンチレーションカクテルに分散して液体シンチ
レーションカウンター等で測定することができる。また
、可溶化した細胞の蛋白量は前記ＢＣＡ法等の公知の方
法を用いて測定すればよい。
リガンド量を測定するためには、公知の方法を用いるこ
とができる。例えば、０．１〜１％程度の濃度のＳＤＳ
溶液で細胞を可溶化する方法が好ましく用いられる標識
物質として放射性同位元素を用いた場合には、可溶化し
た細胞に取り込まれたリガンド量は、例えば、該可溶化
細胞をシンチレーションカクテルに分散して液体シンチ
レーションカウンター等で測定することができる。また
、可溶化した細胞の蛋白量は前記ＢＣＡ法等の公知の方
法を用いて測定すればよい。
【００１８】（Ｎａ依存性）本発明において、特にセロ
トニンの取り込みをスクリーニングの対象とする場合に
は、本取り込みがＮａ＋ 、Ｃｌ− の要求性が高いた
め、生理的な条件（例えば濃度１２８ｍＭ程度）のＮａ
Ｃｌを測定系に添加することが好ましい。また、この条
件では一般にレセプターに対する結合が弱くなるので、
取り込みに対する選択性が更に高まるという効果もある
。以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
トニンの取り込みをスクリーニングの対象とする場合に
は、本取り込みがＮａ＋ 、Ｃｌ− の要求性が高いた
め、生理的な条件（例えば濃度１２８ｍＭ程度）のＮａ
Ｃｌを測定系に添加することが好ましい。また、この条
件では一般にレセプターに対する結合が弱くなるので、
取り込みに対する選択性が更に高まるという効果もある
。以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００１９】
【実施例】副腎褐色腫細胞ＰＣ１２ｈ（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ． ＣＲＬ１７２１）を、あらかじめＰｏｌｙ−ｌ
ｙｓｉｎで処理した９６−ウェル マイクロプレート
（培養容器）に，１０５ 個／ｍｌの濃度で播種し、２
日間程度培養した。上記培養後、 ＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎ
ｇｅｒ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ（１２８ｍＭ ＮａＣｌ−
５．２ｍＭＫＣｌ−２．１ｍＭ ＭｇＳＯ４−５ｍＭ
ｇｌｕｃｏｓｅ −１０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７
．４−０．５ｍＭ ａｓｃｏｒｂａｔｅ −０．５ｍ
Ｍ ｐａｒｇｙｌｉｎｅ ）で２回細胞の洗浄操作を
行った後に、各ウェル中の上記細胞に２５μｌの０．２
μＭトリチウム標識セロトニン及び２５μｌの被検試料
（濃度０．００２〜２００μＭ）を加え、３７℃で４０
分間反応させた。
ｏ． ＣＲＬ１７２１）を、あらかじめＰｏｌｙ−ｌ
ｙｓｉｎで処理した９６−ウェル マイクロプレート
（培養容器）に，１０５ 個／ｍｌの濃度で播種し、２
日間程度培養した。上記培養後、 ＨＥＰＥＳ−Ｒｉｎ
ｇｅｒ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ（１２８ｍＭ ＮａＣｌ−
５．２ｍＭＫＣｌ−２．１ｍＭ ＭｇＳＯ４−５ｍＭ
ｇｌｕｃｏｓｅ −１０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７
．４−０．５ｍＭ ａｓｃｏｒｂａｔｅ −０．５ｍ
Ｍ ｐａｒｇｙｌｉｎｅ ）で２回細胞の洗浄操作を
行った後に、各ウェル中の上記細胞に２５μｌの０．２
μＭトリチウム標識セロトニン及び２５μｌの被検試料
（濃度０．００２〜２００μＭ）を加え、３７℃で４０
分間反応させた。
【００２０】反応終了後、上記と同様な洗浄操作を３回
行い、続いて１％ ＳＤＳを１５０μｌ各ウェルに添
加し、細胞を可溶化した。可溶化した細胞に取り込まれ
たセロトニン量は、上記可溶化細胞をシンチレーション
カクテル（エコシント、ナショナル ダイアグノステ
ィック社）に分散して、液体シンチレーションカウンタ
ー（ＬＳＣ−７００、アロカ）で測定した。一方、可溶
化した細胞の蛋白量は、ＢＣＡ蛋白定量法を用いて測定
した。上記測定に基づき、標識セロトニンの取り込み量
を５０％阻害する被検試料の濃度を、ＩＣ５０値として
求めた。測定結果を下記表１及び図１に示す。図１にお
いて、縦軸は、被検試料非存在下のセロトニン取り込み
活性を１００％とする相対値を示し、横軸は薬物濃度の
対数値を示す。
行い、続いて１％ ＳＤＳを１５０μｌ各ウェルに添
加し、細胞を可溶化した。可溶化した細胞に取り込まれ
たセロトニン量は、上記可溶化細胞をシンチレーション
カクテル（エコシント、ナショナル ダイアグノステ
ィック社）に分散して、液体シンチレーションカウンタ
ー（ＬＳＣ−７００、アロカ）で測定した。一方、可溶
化した細胞の蛋白量は、ＢＣＡ蛋白定量法を用いて測定
した。上記測定に基づき、標識セロトニンの取り込み量
を５０％阻害する被検試料の濃度を、ＩＣ５０値として
求めた。測定結果を下記表１及び図１に示す。図１にお
いて、縦軸は、被検試料非存在下のセロトニン取り込み
活性を１００％とする相対値を示し、横軸は薬物濃度の
対数値を示す。
【表１】
【００２１】
【発明の効果】上述したように本発明によれば、固相上
に配置した特定の細胞を用いるセロトニン等のリガンド
取り込み反応を利用するドラッグ・スクリーニング方法
が提供される。本発明のドラッグ・スクリーニング方法
によれば、以下のように優れた効果が得られる。 （１） 従来の測定系においては、一般に動物の脳を用
いていたのに対し、本発明においては特異的な取り込み
能力を有する培養細胞を用いるため、均一な測定用材料
の大量調製が容易であり、しかも個体差の問題がなく再
現性が高い。 （２） 測定法が簡便である。 （３） 動物脳を用いた従来法において生じていたとこ
ろの、動物組織使用に伴う手技の煩雑さや、材料の不均
一性等に起因する非特異反応が抑制される。 （４） 細胞を用いることにより、実験動物を殺さずに
済む。
に配置した特定の細胞を用いるセロトニン等のリガンド
取り込み反応を利用するドラッグ・スクリーニング方法
が提供される。本発明のドラッグ・スクリーニング方法
によれば、以下のように優れた効果が得られる。 （１） 従来の測定系においては、一般に動物の脳を用
いていたのに対し、本発明においては特異的な取り込み
能力を有する培養細胞を用いるため、均一な測定用材料
の大量調製が容易であり、しかも個体差の問題がなく再
現性が高い。 （２） 測定法が簡便である。 （３） 動物脳を用いた従来法において生じていたとこ
ろの、動物組織使用に伴う手技の煩雑さや、材料の不均
一性等に起因する非特異反応が抑制される。 （４） 細胞を用いることにより、実験動物を殺さずに
済む。
【図１】被検試料たる各種薬物のセロトニン阻害作用を
示すグラフである。この図１においては、被検試料のＩ
Ｃ５０値を求めるために、縦軸は被検試料非存在下のセ
ロトニン取り込み活性を１００％とする相対値を示し、
横軸は薬物濃度の対数値を示している。
示すグラフである。この図１においては、被検試料のＩ
Ｃ５０値を求めるために、縦軸は被検試料非存在下のセ
ロトニン取り込み活性を１００％とする相対値を示し、
横軸は薬物濃度の対数値を示している。
Claims (1)
- 【請求項１】 固相上に配置したセロトニン取り込み
能力を有する細胞を、セロトニン取り込み系における標
識リガンドおよび被検薬物と接触させ、上記細胞中に取
り込まれた標識リガンドを測定することを特徴とする薬
物スクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13214191A JPH04335154A (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | 薬物スクリ−ニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13214191A JPH04335154A (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | 薬物スクリ−ニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04335154A true JPH04335154A (ja) | 1992-11-24 |
Family
ID=15074324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13214191A Pending JPH04335154A (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | 薬物スクリ−ニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04335154A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994026413A1 (en) * | 1993-05-17 | 1994-11-24 | Amersham International Plc | Devices and methods for the measurement of cellular biochemical processes |
| DE102016117040A1 (de) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Fanuc Corporation | Laserbearbeitungssystem mit einer funktion zur reinigung eines laserstrahlwegs |
| DE102016117039A1 (de) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Fanuc Corporation | Laserbearbeitungssystem zum überwachen von verunreinigungsgas in einem laserstrahlengang |
-
1991
- 1991-05-09 JP JP13214191A patent/JPH04335154A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994026413A1 (en) * | 1993-05-17 | 1994-11-24 | Amersham International Plc | Devices and methods for the measurement of cellular biochemical processes |
| DE102016117040A1 (de) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Fanuc Corporation | Laserbearbeitungssystem mit einer funktion zur reinigung eines laserstrahlwegs |
| DE102016117039A1 (de) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Fanuc Corporation | Laserbearbeitungssystem zum überwachen von verunreinigungsgas in einem laserstrahlengang |
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