JPH04335883A - 抗菌性ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
抗菌性ポリペプチドの製造方法Info
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- JPH04335883A JPH04335883A JP3138314A JP13831491A JPH04335883A JP H04335883 A JPH04335883 A JP H04335883A JP 3138314 A JP3138314 A JP 3138314A JP 13831491 A JP13831491 A JP 13831491A JP H04335883 A JPH04335883 A JP H04335883A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、双翅目または膜翅目に
属する昆虫の幼虫の体表障害時にその幼虫の体液中に誘
導される抗菌性ポリペプチドをコードする遺伝子を組み
込んだ形質転換体、及び該形質転換体を培養することに
よる該抗菌性ポリペプチドの製造方法に関する。
属する昆虫の幼虫の体表障害時にその幼虫の体液中に誘
導される抗菌性ポリペプチドをコードする遺伝子を組み
込んだ形質転換体、及び該形質転換体を培養することに
よる該抗菌性ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００２】更に詳細には、センチニクバエの幼虫の体
表に傷を与えることにより体液中に誘導される抗菌性を
有するポリペプチド、即ちザーペシン（Ｓａｐｅｃｉｎ
）をコードする遺伝子を宿主微生物である酵母に組み込
んで形質転換し、該酵母を培養することによってザーペ
シンを製造する方法に関する。
表に傷を与えることにより体液中に誘導される抗菌性を
有するポリペプチド、即ちザーペシン（Ｓａｐｅｃｉｎ
）をコードする遺伝子を宿主微生物である酵母に組み込
んで形質転換し、該酵母を培養することによってザーペ
シンを製造する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】細菌や異種の血球を、昆虫に接種したり
単に体表に傷をつけるといった刺激を与えると体液中に
数々の蛋白が誘導されることが知られている。これらの
物質は、抗体産生能を持たない動物の生体防御にとって
重要な係わりがあるものと考えられる。
単に体表に傷をつけるといった刺激を与えると体液中に
数々の蛋白が誘導されることが知られている。これらの
物質は、抗体産生能を持たない動物の生体防御にとって
重要な係わりがあるものと考えられる。
【０００４】これらのうちで、例えばセンチニクバエ（
Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）幼虫体
液中に誘導される活性蛋白として、血球凝集作用をもつ
蛋白〔Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５５巻、
２９１９−２９２４頁（１９８０）〕、抗菌活性を持つ
蛋白〔Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２１１巻、７２７−
７３４頁（１９８３）〕などが同定されている。
Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）幼虫体
液中に誘導される活性蛋白として、血球凝集作用をもつ
蛋白〔Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５５巻、
２９１９−２９２４頁（１９８０）〕、抗菌活性を持つ
蛋白〔Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２１１巻、７２７−
７３４頁（１９８３）〕などが同定されている。
【０００５】前者のレクチン様蛋白は、ザルコファルガ
（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）レクチンと命名され、マウス
の骨髄細胞やマクロファージの真菌殺能を増強させる、
ヒトＴ細胞よりのγ−インターフェロンの産生を導く、
生体防御等の作用が研究されている。
（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）レクチンと命名され、マウス
の骨髄細胞やマクロファージの真菌殺能を増強させる、
ヒトＴ細胞よりのγ−インターフェロンの産生を導く、
生体防御等の作用が研究されている。
【０００６】また後者の抗菌活性を持つ蛋白としては、
例えばザルコトキシン（Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ）Ｉと命
名されてその理化学的性質も明らかにされている（特開
昭５９−１３７３０）蛋白、ザルコトキシンＩＩと命名
されてその理化学的性質も明らかにされている（特開昭
６３−３５５９９）蛋白、および同じくセンチニクバエ
の幼虫体液から得られ、ザーペシン（Ｓａｐｅｃｉｎ）
と命名され、単離されてそのアミノ酸配列が決定されて
いる（特開昭６３−１８５９９７）蛋白等が知られてい
る。
例えばザルコトキシン（Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ）Ｉと命
名されてその理化学的性質も明らかにされている（特開
昭５９−１３７３０）蛋白、ザルコトキシンＩＩと命名
されてその理化学的性質も明らかにされている（特開昭
６３−３５５９９）蛋白、および同じくセンチニクバエ
の幼虫体液から得られ、ザーペシン（Ｓａｐｅｃｉｎ）
と命名され、単離されてそのアミノ酸配列が決定されて
いる（特開昭６３−１８５９９７）蛋白等が知られてい
る。
【０００７】これらは幅広い抗菌スペクトルを有するこ
とから、生体防御物質と考えられ、更にこれらの抗菌性
蛋白は特にグラム陰性菌の大腸菌及びグラム陽性菌の黄
色ブドウ状球菌に対して強い抗菌力を有している。しか
しながら、これらの蛋白を大量に、安価に生産する方法
に関しては報告されていない。
とから、生体防御物質と考えられ、更にこれらの抗菌性
蛋白は特にグラム陰性菌の大腸菌及びグラム陽性菌の黄
色ブドウ状球菌に対して強い抗菌力を有している。しか
しながら、これらの蛋白を大量に、安価に生産する方法
に関しては報告されていない。
【０００８】ザルコトキシンに関してはその前駆体のク
ローン化ＤＮＡ、その断片及びそれらが組み込まれたプ
ラスミドが報告されている（特開平１−５１０８４、特
開平１−５１０８５）。しかしながら、ザーペシンに関
してはその蛋白をコードする遺伝子は得られていない。 もちろん該遺伝子を宿主微生物に組み込んだ該蛋白の生
産方法に関しても報告されていない。
ローン化ＤＮＡ、その断片及びそれらが組み込まれたプ
ラスミドが報告されている（特開平１−５１０８４、特
開平１−５１０８５）。しかしながら、ザーペシンに関
してはその蛋白をコードする遺伝子は得られていない。 もちろん該遺伝子を宿主微生物に組み込んだ該蛋白の生
産方法に関しても報告されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は抗菌性蛋白、
とりわけザーペシンをコードするＤＮＡを組み込んだ酵
母を宿主として発現可能なプラスミド及び該プラスミド
を酵母に組み込んだ組換体、さらには該組換体を培養す
ることによるザーペシンの生産方法を提供するものであ
る。
とりわけザーペシンをコードするＤＮＡを組み込んだ酵
母を宿主として発現可能なプラスミド及び該プラスミド
を酵母に組み込んだ組換体、さらには該組換体を培養す
ることによるザーペシンの生産方法を提供するものであ
る。
【００１０】ザーペシンは抗菌作用を有しているため通
常の大腸菌を用いた遺伝子組換えによる方法では生産す
ることができない。本発明は抗菌性蛋白であるザーペシ
ンを酵母を組換体の宿主として選択することにより、該
蛋白を大量に生産する方法をはじめて可能にしたもので
ある。
常の大腸菌を用いた遺伝子組換えによる方法では生産す
ることができない。本発明は抗菌性蛋白であるザーペシ
ンを酵母を組換体の宿主として選択することにより、該
蛋白を大量に生産する方法をはじめて可能にしたもので
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ザーペシンの遺伝子を構築し、該遺伝子を組み込
んだ形質転換酵母を得、該形質転換体を培養することに
よってザーペシンを生産することに成功し、本発明を完
成した。
結果、ザーペシンの遺伝子を構築し、該遺伝子を組み込
んだ形質転換酵母を得、該形質転換体を培養することに
よってザーペシンを生産することに成功し、本発明を完
成した。
【００１２】即ち、本発明により配列番号：１に示され
るザーペシンを安価に、大量に生産することができ、得
られた蛋白は抗菌剤として利用できる。以下、本発明を
実施例、試験例を参照しながら詳細に説明する。
るザーペシンを安価に、大量に生産することができ、得
られた蛋白は抗菌剤として利用できる。以下、本発明を
実施例、試験例を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
実施例１ ザーペシン遺伝子の構築
■ ザーペシン遺伝子断片の調製
ザーペシンの遺伝子はセンチニクバエ胚由来の株化細胞
であるＮＩＨ−Ｓａｐｅ−４細胞を培養し、〔ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）， ２６３巻，１７１１７〜１７１２
１頁 （１９８８）〕に従って取得した。該遺伝子の
うち成熟タンパク部分（配列番号：１に示す）の遺伝子
をＰＣＲ法により増幅した。プライマーとしてはプライ
マー１（配列番号：２に示す）及びプライマー２（配列
番号：３に示す）を用いた。
であるＮＩＨ−Ｓａｐｅ−４細胞を培養し、〔ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）， ２６３巻，１７１１７〜１７１２
１頁 （１９８８）〕に従って取得した。該遺伝子の
うち成熟タンパク部分（配列番号：１に示す）の遺伝子
をＰＣＲ法により増幅した。プライマーとしてはプライ
マー１（配列番号：２に示す）及びプライマー２（配列
番号：３に示す）を用いた。
【００１４】プライマー１にはα因子のシグナルペプチ
ドの塩基配列の一部（ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む）が
含まれている。又、プライマー２にはストップコドンと
ＥｃｏＲＩサイトが含まれている。
ドの塩基配列の一部（ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む）が
含まれている。又、プライマー２にはストップコドンと
ＥｃｏＲＩサイトが含まれている。
【００１５】ＰＣＲ法の反応はＧｅｎｅ ＡｍｐＴＭ
ｋｉｔ〔パーキンエルマージャパン社製〕を用いＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔パーキンエルマ
ージャパン社製〕により行った。反応液の組成は該キッ
トに添付されている説明書に記載されている方法に従っ
た。
ｋｉｔ〔パーキンエルマージャパン社製〕を用いＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔パーキンエルマ
ージャパン社製〕により行った。反応液の組成は該キッ
トに添付されている説明書に記載されている方法に従っ
た。
【００１６】反応液の入ったチューブをＤＮＡ Ｔｈ
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットし、以下の条件で
反応を３５サイクル行い増幅した。 ９５℃、１分 ４０℃、２分 ７２℃、３分
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットし、以下の条件で
反応を３５サイクル行い増幅した。 ９５℃、１分 ４０℃、２分 ７２℃、３分
【００１７】その後、さらに７２℃で７分間インキュベ
ートした。反応後に反応液を取り出しこれをクロロホル
ムにて抽出した。次にこれを１．５％アガロースゲルに
て電気泳動し増幅されたＤＮＡのサイズと量を確認した
。その結果、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片が約０．２μｇ
得られた。
ートした。反応後に反応液を取り出しこれをクロロホル
ムにて抽出した。次にこれを１．５％アガロースゲルに
て電気泳動し増幅されたＤＮＡのサイズと量を確認した
。その結果、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片が約０．２μｇ
得られた。
【００１８】この１５０ｂｐのバンドを含むゲルを取り
出して、ＭＥＲＭＡＩＤＫｉｔ（Ｂｉｏ １０１社製
）を用いてキットに添付されている説明書に従ってＤＮ
Ａを抽出し回収した。さらに回収したＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡
績社製）にて消化し、アガロース電気泳動を行ない約１
５０ｂｐのザーペシン遺伝子断片をＭＥＲＭＡＩＤ
Ｋｉｔを用いて回収した。
出して、ＭＥＲＭＡＩＤＫｉｔ（Ｂｉｏ １０１社製
）を用いてキットに添付されている説明書に従ってＤＮ
Ａを抽出し回収した。さらに回収したＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡
績社製）にて消化し、アガロース電気泳動を行ない約１
５０ｂｐのザーペシン遺伝子断片をＭＥＲＭＡＩＤ
Ｋｉｔを用いて回収した。
【００１９】■ ザーペシン遺伝子への酵母分泌シグ
ナル、転写ターミネーターの付加得られたザーペシン遺
伝子断片を発現させるために、酵母において分泌発現が
可能なように分泌発現に必要なシグナルペプチドの塩基
配列と、転写の終結に必要な塩基配列（ターミネーター
）をザーペシン遺伝子断片に結合した。その工程を図１
および図２に示す。
ナル、転写ターミネーターの付加得られたザーペシン遺
伝子断片を発現させるために、酵母において分泌発現が
可能なように分泌発現に必要なシグナルペプチドの塩基
配列と、転写の終結に必要な塩基配列（ターミネーター
）をザーペシン遺伝子断片に結合した。その工程を図１
および図２に示す。
【００２０】より具体的に説明すると、まず酵母α因子
のシグナルペプチド部分の塩基配列を前述のＰＣＲ法を
用いて増幅し単離した。すなわち、酵母のゲノムＤＮＡ
（Ｃｌｏｎｔｅｃより購入）を鋳型ＤＮＡとし、プライ
マー３（配列番号：４に示す）及びプライマー４（配列
番号：５に示す）を用いてα因子のシグナルペプチド部
分の塩基配列を増幅した。増幅後、前述したように反応
液をアガロース電気泳動して増幅したＤＮＡ断片を確認
して、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを用いて抽出し
回収した。その結果、約０．５μｇの約３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。
のシグナルペプチド部分の塩基配列を前述のＰＣＲ法を
用いて増幅し単離した。すなわち、酵母のゲノムＤＮＡ
（Ｃｌｏｎｔｅｃより購入）を鋳型ＤＮＡとし、プライ
マー３（配列番号：４に示す）及びプライマー４（配列
番号：５に示す）を用いてα因子のシグナルペプチド部
分の塩基配列を増幅した。増幅後、前述したように反応
液をアガロース電気泳動して増幅したＤＮＡ断片を確認
して、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを用いて抽出し
回収した。その結果、約０．５μｇの約３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。
【００２１】ここで、プライマー３は制限酵素ＸｈｏＩ
のサイトを、プライマー４は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの
サイトをそれぞれ含んでいるので、得られたＤＮＡ断片
をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりα因
子のシグナルペプチドの塩基配列を含んだＤＮＡ断片の
両末端にそれぞれＸｈｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイ
トを導入できる。
のサイトを、プライマー４は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの
サイトをそれぞれ含んでいるので、得られたＤＮＡ断片
をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりα因
子のシグナルペプチドの塩基配列を含んだＤＮＡ断片の
両末端にそれぞれＸｈｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイ
トを導入できる。
【００２２】上記で得られたα因子のシグナルペプチド
の塩基配列を含んだＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩ（共に東洋紡績社製）で消化してブルースクリプト
ｋｓ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＸｈｏＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化したラージフラグメントとライゲーシ
ョンした。ライゲーション反応はライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて、キットに添付されている説明
書に従って行った。ライゲーション後、反応液で大腸菌
ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換はコ
ンピテントセルＤＨ５（東洋紡績社製）を用いて既知の
方法、例えば〔モレキュラー クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記
載されている方法により行った。
の塩基配列を含んだＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩ（共に東洋紡績社製）で消化してブルースクリプト
ｋｓ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＸｈｏＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化したラージフラグメントとライゲーシ
ョンした。ライゲーション反応はライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて、キットに添付されている説明
書に従って行った。ライゲーション後、反応液で大腸菌
ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換はコ
ンピテントセルＤＨ５（東洋紡績社製）を用いて既知の
方法、例えば〔モレキュラー クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記
載されている方法により行った。
【００２３】形質転換の結果、得られたアンピシリン耐
性の菌株よりプラスミドＤＮＡを既知の方法、例えば〔
モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記載されている方
法により調製した。このプラスミドをｐＢαと命名した
。
性の菌株よりプラスミドＤＮＡを既知の方法、例えば〔
モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記載されている方
法により調製した。このプラスミドをｐＢαと命名した
。
【００２４】次にこのプラスミドｐＢαをＨｉｎｄＩＩ
ＩとＥｃｏＲＩ（共に東洋紡績社製）で切断して得られ
たラージフラグメントと前述のザーペシン遺伝子をＨｉ
ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したフラグメントをライ
ゲーションした。
ＩとＥｃｏＲＩ（共に東洋紡績社製）で切断して得られ
たラージフラグメントと前述のザーペシン遺伝子をＨｉ
ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したフラグメントをライ
ゲーションした。
【００２５】ライゲーション後、前述同様にこれを用い
て大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得られた形質転換体よ
り前述の如くプラスミド（以下、プラスミドｐＢＳαと
いう）を調製し、以下の実験に用いた。
て大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得られた形質転換体よ
り前述の如くプラスミド（以下、プラスミドｐＢＳαと
いう）を調製し、以下の実験に用いた。
【００２６】次にプラスミドｐＢＳαのザーペシン遺伝
子の下流に酵母ＰＧＫ遺伝子のターミネーター配列を組
み込んだ。
子の下流に酵母ＰＧＫ遺伝子のターミネーター配列を組
み込んだ。
【００２７】まず、酵母ゲノムＤＮＡよりＰＧＫ遺伝子
のターミネーター配列を増幅し単離した。即ち、鋳型Ｄ
ＮＡとしては酵母ゲノムＤＮＡを、プライマーとしては
プライマー５（配列番号：６にしめす）及びプライマー
６（配列番号：７に示す）を用いてＰＣＲ法により増幅
した。反応液をアガロース電気泳動して、増幅したＤＮ
Ａ断片を確認し、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを用
いて抽出し回収した。その結果、約０．５μｇの約３０
０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
のターミネーター配列を増幅し単離した。即ち、鋳型Ｄ
ＮＡとしては酵母ゲノムＤＮＡを、プライマーとしては
プライマー５（配列番号：６にしめす）及びプライマー
６（配列番号：７に示す）を用いてＰＣＲ法により増幅
した。反応液をアガロース電気泳動して、増幅したＤＮ
Ａ断片を確認し、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを用
いて抽出し回収した。その結果、約０．５μｇの約３０
０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００２８】プライマー６はＥｃｏＲＩサイトをプライ
マー７はＢａｍＨＩサイトを含んでおり、得られた断片
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（東洋紡績社製）で消化する
ことにより、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター配列の両端
にそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨＩサイトを導入
することができる。
マー７はＢａｍＨＩサイトを含んでおり、得られた断片
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（東洋紡績社製）で消化する
ことにより、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター配列の両端
にそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨＩサイトを導入
することができる。
【００２９】得られたＰＧＫ遺伝子のターミネーター断
片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しこれと先程のプラ
スミドｐＢＳαをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したラ
ージフラグメントを前述同様にライゲーションし、形質
転換を行った。
片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しこれと先程のプラ
スミドｐＢＳαをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したラ
ージフラグメントを前述同様にライゲーションし、形質
転換を行った。
【００３０】得られたアンピシリン耐性の菌株よりプラ
スミドＤＮＡを調製しこれをプラスミドｐＢＧＳαと命
名し、以下の実験に用いた。
スミドＤＮＡを調製しこれをプラスミドｐＢＧＳαと命
名し、以下の実験に用いた。
【００３１】得られたプラスミドｐＢＧＳαの塩基配列
をシーケネースキット（東洋紡績社製）を用いて調べた
。その結果、ザーペシンの遺伝子の上流にα因子のシグ
ナルペプチドの塩基配列が、下流にＰＧＫ遺伝子のター
ミネーター配列が結合している構造をとっていることが
塩基配列レベルで確認された。
をシーケネースキット（東洋紡績社製）を用いて調べた
。その結果、ザーペシンの遺伝子の上流にα因子のシグ
ナルペプチドの塩基配列が、下流にＰＧＫ遺伝子のター
ミネーター配列が結合している構造をとっていることが
塩基配列レベルで確認された。
【００３２】さらに、α因子のシグナルペプチド部分の
塩基配列とザーペシン遺伝子の上流側のつなぎ目の塩基
配列をより詳細に調べたところ、その塩基配列はデザイ
ン通りであって、それは配列番号：８に示すようなもの
であった。
塩基配列とザーペシン遺伝子の上流側のつなぎ目の塩基
配列をより詳細に調べたところ、その塩基配列はデザイ
ン通りであって、それは配列番号：８に示すようなもの
であった。
【００３３】この部分がα因子の開始コドンであるメチ
オニンから順次アミノ酸に翻訳されると、グリシン−バ
リン−セリン−ロイシン−アスパラギン酸−リジン−ア
ルギニン−アラニン−トレオニン−システイン−アスパ
ラギン酸−ロイシン−ロイシンという配列になる。
オニンから順次アミノ酸に翻訳されると、グリシン−バ
リン−セリン−ロイシン−アスパラギン酸−リジン−ア
ルギニン−アラニン−トレオニン−システイン−アスパ
ラギン酸−ロイシン−ロイシンという配列になる。
【００３４】このうち最初のグリシンから７番目のアル
ギニンまではα因子のアミノ酸配列であり、８番目のア
ラニンからはザーペシン成熟体のＮ末端領域のアミノ酸
を示している。この配列中のリジン−アルギニンの配列
はα因子のシグナルペプチドがプロセッシングを受ける
部分であり、この部分でザーペシン成熟タンパクが切り
出され分泌されるものと予想される。
ギニンまではα因子のアミノ酸配列であり、８番目のア
ラニンからはザーペシン成熟体のＮ末端領域のアミノ酸
を示している。この配列中のリジン−アルギニンの配列
はα因子のシグナルペプチドがプロセッシングを受ける
部分であり、この部分でザーペシン成熟タンパクが切り
出され分泌されるものと予想される。
【００３５】実施例２ ザーペシン遺伝子のクローニ
ング プラスミドｐＢＧＳαをＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し
てアガロース電気泳動し、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を
確認し、この断片をＭＥＲＭＡＩＤ ｋｉｔにより回
収した。この断片は前述したα因子のシグナルペプチド
の塩基配列を上流に、ＰＧＫターミネーターを下流に持
ったザーペシン遺伝子を含む。このＤＮＡ断片を酵母−
大腸菌のシャトルベクターであるｐＡＭ８２Ｂにクロー
ニングした。
ング プラスミドｐＢＧＳαをＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し
てアガロース電気泳動し、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を
確認し、この断片をＭＥＲＭＡＩＤ ｋｉｔにより回
収した。この断片は前述したα因子のシグナルペプチド
の塩基配列を上流に、ＰＧＫターミネーターを下流に持
ったザーペシン遺伝子を含む。このＤＮＡ断片を酵母−
大腸菌のシャトルベクターであるｐＡＭ８２Ｂにクロー
ニングした。
【００３６】ベクターｐＡＭ８２ＢはｐＡＭ８２のデリ
バティブであり、ｐＡＭ８２のＰｖｕＩＩサイトにＢａ
ｍＨＩリンカーを組み込むことによりＢａｍＨＩサイト
を導入したものである。
バティブであり、ｐＡＭ８２のＰｖｕＩＩサイトにＢａ
ｍＨＩリンカーを組み込むことによりＢａｍＨＩサイト
を導入したものである。
【００３７】ｐＡＭ８２ＢのＸｈｏＩサイトのすぐ上流
には酵母の抑酸性性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５の
プロモーターが配置されており、ＸｈｏＩサイト下流に
適当な構造を持つ遺伝子を組み込むことでその遺伝子の
発現を行うことができる。
には酵母の抑酸性性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５の
プロモーターが配置されており、ＸｈｏＩサイト下流に
適当な構造を持つ遺伝子を組み込むことでその遺伝子の
発現を行うことができる。
【００３８】即ち、ｐＡＭ８２ＢをＸｈｏＩとＢａｍＨ
Ｉで消化したラージフラグメントと、前述の７５０ｂｐ
のＤＮＡ断片とをライゲーションし、これを用いて大腸
菌ＤＨ５を形質転換した。
Ｉで消化したラージフラグメントと、前述の７５０ｂｐ
のＤＮＡ断片とをライゲーションし、これを用いて大腸
菌ＤＨ５を形質転換した。
【００３９】得られたアンピシリン耐性の菌株よりプラ
スミド（以下、プラスミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｓａｐという
）を約５００μｇ調製し、以下の実験に供した。
スミド（以下、プラスミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｓａｐという
）を約５００μｇ調製し、以下の実験に供した。
【００４０】実施例３ プラスミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｓ
ａｐによる酵母ＳＨＹ２の形質転換 前述で得られたプラスミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｓａｐを用い
て酵母ＳＨＹ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４７７０）を形
質転換した。形質転換の方法は〔Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に記載されている方法に従って
行った。
ａｐによる酵母ＳＨＹ２の形質転換 前述で得られたプラスミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｓａｐを用い
て酵母ＳＨＹ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４７７０）を形
質転換した。形質転換の方法は〔Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に記載されている方法に従って
行った。
【００４１】酵母ＳＨＹ２の性状は（α，ｓｔｅ−ＶＣ
９，ｕｒａ３−５２，ｔｒｐ１−２８９，ｌｅｕ−３，
ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３−１，ｃａｎ１−１００）
であり、この株はロイシンの存在しない培地では成育で
きない。この株がプラスミドｐＡＭ８２Ｂを保持すれば
、プラスミドｐＡＭ８２Ｂの持つロイシン合成遺伝子の
働きによりロイシンが含まれていない培地でも成育でき
る株、即ちロイシン非要求性の株となる。従って、プラ
スミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｓａｐによる形質転換体の酵母は
ロイシン非要求性となる。
９，ｕｒａ３−５２，ｔｒｐ１−２８９，ｌｅｕ−３，
ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３−１，ｃａｎ１−１００）
であり、この株はロイシンの存在しない培地では成育で
きない。この株がプラスミドｐＡＭ８２Ｂを保持すれば
、プラスミドｐＡＭ８２Ｂの持つロイシン合成遺伝子の
働きによりロイシンが含まれていない培地でも成育でき
る株、即ちロイシン非要求性の株となる。従って、プラ
スミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｓａｐによる形質転換体の酵母は
ロイシン非要求性となる。
【００４２】形質転換を行った結果、５個の形質転換体
を得た。そのうちサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＳ
２と名付けた形質転換体（以下、ＹＳ２という）〔本株
は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２
２３７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３７）として寄託さ
れている。〕を以下の実験に供した。
を得た。そのうちサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＳ
２と名付けた形質転換体（以下、ＹＳ２という）〔本株
は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２
２３７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３７）として寄託さ
れている。〕を以下の実験に供した。
【００４３】実施例４ ＹＳ２の培養得られたＹＳ２
の培養は次のようにして行った。ＹＳ２を高リン酸Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地１０ｍｌに接
種して一晩３０℃で前培養した。尚、Ｂｕｒｋｈｏｌｄ
ｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地の組成は下記に示したとお
りである。 （ＮＨ４）２ＳＯ４
２
ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４
１．５ ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ
０．５ ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２
Ｈ２Ｏ
０．３３ ｇ／ｌ ＫＩ
０．１ ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．２５ ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４・４Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
（ＮＨ４）３ＰＯ４１２ＭｏＯ３・３Ｈ２Ｏ
０．０２ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ
０．３１ ｍｇ／ｌ イノシトール
１０ ｍｇ／ｌ チア
ミン
０．２ ｍｇ／ｌ
ピリドキシン
０．２ ｍｇ
／ｌ ｐａｎｔｏｔｅｎａｔｅ（Ｃａ ｓａｌ
ｔ） ０．２ ｍｇ／ｌ ナイアシ
ン
０．２ ｍｇ／ｌ
ビオチン
０．００２ｍｇ／ｌ
アスパラギン
２
ｇ／ｌ ヒスチジン
０．
０２ ｍｇ／ｌ トリプトファン
０
．０２５ｍｇ／ｌ ウラシル
０．０２０ｍｇ／ｌ グルコース
２０ ｇ／ｌ
の培養は次のようにして行った。ＹＳ２を高リン酸Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地１０ｍｌに接
種して一晩３０℃で前培養した。尚、Ｂｕｒｋｈｏｌｄ
ｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地の組成は下記に示したとお
りである。 （ＮＨ４）２ＳＯ４
２
ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４
１．５ ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ
０．５ ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２
Ｈ２Ｏ
０．３３ ｇ／ｌ ＫＩ
０．１ ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．２５ ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４・４Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
（ＮＨ４）３ＰＯ４１２ＭｏＯ３・３Ｈ２Ｏ
０．０２ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ
０．３１ ｍｇ／ｌ イノシトール
１０ ｍｇ／ｌ チア
ミン
０．２ ｍｇ／ｌ
ピリドキシン
０．２ ｍｇ
／ｌ ｐａｎｔｏｔｅｎａｔｅ（Ｃａ ｓａｌ
ｔ） ０．２ ｍｇ／ｌ ナイアシ
ン
０．２ ｍｇ／ｌ
ビオチン
０．００２ｍｇ／ｌ
アスパラギン
２
ｇ／ｌ ヒスチジン
０．
０２ ｍｇ／ｌ トリプトファン
０
．０２５ｍｇ／ｌ ウラシル
０．０２０ｍｇ／ｌ グルコース
２０ ｇ／ｌ
【００４４】前培
養液０．５ｍｌを１００ｍｌの高リン酸Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｍｉｎｉｍａｌ培地に接種して３０℃で振盪培養
しＯＤ６１０を経時的に測定した。
養液０．５ｍｌを１００ｍｌの高リン酸Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｍｉｎｉｍａｌ培地に接種して３０℃で振盪培養
しＯＤ６１０を経時的に測定した。
【００４５】ＯＤ６１０が１．０に達した時点で一旦培
養をやめ遠心分離（８０００×ｇ，５分）で菌体を回収
した。回収した菌体を今度は１００ｍｌの低リン酸Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地（高リン酸Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地よりＫＨ２
ＰＯ４を除き、代わりにＫＣｌを１．５ｇ／ｌで加えた
もの）に懸濁してさらに振盪培養を２４時間行った。
養をやめ遠心分離（８０００×ｇ，５分）で菌体を回収
した。回収した菌体を今度は１００ｍｌの低リン酸Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地（高リン酸Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地よりＫＨ２
ＰＯ４を除き、代わりにＫＣｌを１．５ｇ／ｌで加えた
もの）に懸濁してさらに振盪培養を２４時間行った。
【００４６】培養後、菌体を遠心分離（８０００×ｇ，
５分）により取り除き、培養上清を回収して以下の実験
に供した。またコントロールとしては、プラスミドｐＡ
Ｍ８２Ｂで形質転換されたＳＨＹ２（以下、ＹＳ０とす
る）を用いて上記と同様に操作して回収された培養上清
を用いた。
５分）により取り除き、培養上清を回収して以下の実験
に供した。またコントロールとしては、プラスミドｐＡ
Ｍ８２Ｂで形質転換されたＳＨＹ２（以下、ＹＳ０とす
る）を用いて上記と同様に操作して回収された培養上清
を用いた。
【００４７】実施例５ 培養上清の濃縮前記の培養上
清中に発現したザーペシンが含まれているかを調べるた
めに、まずＹＳ２とＹＳ０の培養上清をそれぞれ濃縮し
た。
清中に発現したザーペシンが含まれているかを調べるた
めに、まずＹＳ２とＹＳ０の培養上清をそれぞれ濃縮し
た。
【００４８】培養上清の濃縮にはＣＭセルロースカラム
（Ｗｈａｔｍａｎ ＣＭ５２使用；ベッドボリューム
５ｍｌ）を用いた。まず培養上清１００ｍｌを緩衝液Ａ
により５倍に希釈した。次にＣＭセルロースカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、この希釈した培養上清
をカラムにアプライした。アプライ後、更にカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、５００ｍｌの緩衝液Ｃ
にてカラムに吸着した成分を溶出し、０．５ｍｌずつフ
ラクションコレクターにより分取した。各フラクション
のＯＤ２８０を測定して、これらをＣＭセルロース吸着
画分として以下の実験に供した。尚、緩衝液Ａ、緩衝液
Ｂ及び緩衝液Ｃの組成は下記に示したとおりである。
（Ｗｈａｔｍａｎ ＣＭ５２使用；ベッドボリューム
５ｍｌ）を用いた。まず培養上清１００ｍｌを緩衝液Ａ
により５倍に希釈した。次にＣＭセルロースカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、この希釈した培養上清
をカラムにアプライした。アプライ後、更にカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、５００ｍｌの緩衝液Ｃ
にてカラムに吸着した成分を溶出し、０．５ｍｌずつフ
ラクションコレクターにより分取した。各フラクション
のＯＤ２８０を測定して、これらをＣＭセルロース吸着
画分として以下の実験に供した。尚、緩衝液Ａ、緩衝液
Ｂ及び緩衝液Ｃの組成は下記に示したとおりである。
【００４９】
■ 緩衝液Ａ
ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌ■ 緩衝液Ｂ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ １．４
６ｇ／ｌ■ 緩衝液Ｃ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ ３０．
４ｇ／ｌ
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌ■ 緩衝液Ｂ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ １．４
６ｇ／ｌ■ 緩衝液Ｃ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ ３０．
４ｇ／ｌ
【００５０】試験例１ ＣＭセルロース吸着
画分の抗菌活性の測定 ＹＳ２とＹＳ０の培養上清の各ＣＭセルロース吸着画分
の抗菌活性を以下の如く測定した。
画分の抗菌活性の測定 ＹＳ２とＹＳ０の培養上清の各ＣＭセルロース吸着画分
の抗菌活性を以下の如く測定した。
【００５１】Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ
３（以下、Ｍ３という）プレート培地（Ｄｉｆｃｏ社
製）に成育したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＦＤＡ２
０９Ｐ株をＭ３液体培地１０ｍｌに接種し、３７℃でＯ
Ｄ６５０＝０．３になるまで振盪培養した。
３（以下、Ｍ３という）プレート培地（Ｄｉｆｃｏ社
製）に成育したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＦＤＡ２
０９Ｐ株をＭ３液体培地１０ｍｌに接種し、３７℃でＯ
Ｄ６５０＝０．３になるまで振盪培養した。
【００５２】培養後、遠心分離（８０００×ｇ，１５分
）により菌体を回収して緩衝液Ｄ〔３０ｍＭ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．０），６０ｍＭ ＮａＣｌ
〕にＯＤ６５０が正確に０．３になるように懸濁した。 この懸濁液０．０４ｍｌに０．１６ｍｌのＭ３液体培地
と各ＣＭセルロース吸着画分０．１ｍｌと０．２％ＢＳ
Ａを含んだ緩衝液Ｄ ０．１ｍｌを試験管中で混ぜ合
わせて、３７℃で３時間振盪培養した。培養後、試験管
を氷中で１時間冷却後、培養液のＯＤ６５０を測定した
。ＣＭ吸着画分の代わりに、緩衝液Ｃを０．１ｍｌ加え
た時の培養液のＯＤ６５０の値をコントロールとして、
下記の式によりスタフィロコッカス・アウレウス Ｆ
ＤＡ２０９Ｐ株の増殖率を算出した。増殖率＝（各フラ
クションにおけるＯＤ６５０／コントロールのＯＤ６５
０）×１００
）により菌体を回収して緩衝液Ｄ〔３０ｍＭ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．０），６０ｍＭ ＮａＣｌ
〕にＯＤ６５０が正確に０．３になるように懸濁した。 この懸濁液０．０４ｍｌに０．１６ｍｌのＭ３液体培地
と各ＣＭセルロース吸着画分０．１ｍｌと０．２％ＢＳ
Ａを含んだ緩衝液Ｄ ０．１ｍｌを試験管中で混ぜ合
わせて、３７℃で３時間振盪培養した。培養後、試験管
を氷中で１時間冷却後、培養液のＯＤ６５０を測定した
。ＣＭ吸着画分の代わりに、緩衝液Ｃを０．１ｍｌ加え
た時の培養液のＯＤ６５０の値をコントロールとして、
下記の式によりスタフィロコッカス・アウレウス Ｆ
ＤＡ２０９Ｐ株の増殖率を算出した。増殖率＝（各フラ
クションにおけるＯＤ６５０／コントロールのＯＤ６５
０）×１００
【００５３】各フラクションに対して計算
された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を図３
及び図４に示した。
された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を図３
及び図４に示した。
【００５４】ＹＳ０の培養上清ではＯＤ２８０のピーク
はフラクション６〜１１にみられた。このとき、各フラ
クションに対する増殖率は全て１００以上を示しており
、抗菌活性はいかなるフラクションについても観察され
なかった。
はフラクション６〜１１にみられた。このとき、各フラ
クションに対する増殖率は全て１００以上を示しており
、抗菌活性はいかなるフラクションについても観察され
なかった。
【００５５】一方、ＹＳ２の培養上清ではフラクション
２〜５と９〜１２にかけてＯＤ２８０のピークが観察さ
れた。この時、各フラクションに対しての増殖率はフラ
クション１０，１１で著しく減少していることがわかっ
た。さらにフラクション９〜１３を加えたときの培養上
清をＭ３プレートにまき一晩３７℃で培養し、形成され
たコロニー数を測定したところ、フラクション９に比べ
てフラクション１０，１１では形成されたコロニーは著
しく少なかった。従って、フラクション１０，１１を加
えた培養液でＯＤ６５０が低かったのは、培養液中の生
菌数が少ないためであると考えられる。よって、フラク
ション１０，１１が抗菌活性を有することが明らかとな
った。
２〜５と９〜１２にかけてＯＤ２８０のピークが観察さ
れた。この時、各フラクションに対しての増殖率はフラ
クション１０，１１で著しく減少していることがわかっ
た。さらにフラクション９〜１３を加えたときの培養上
清をＭ３プレートにまき一晩３７℃で培養し、形成され
たコロニー数を測定したところ、フラクション９に比べ
てフラクション１０，１１では形成されたコロニーは著
しく少なかった。従って、フラクション１０，１１を加
えた培養液でＯＤ６５０が低かったのは、培養液中の生
菌数が少ないためであると考えられる。よって、フラク
ション１０，１１が抗菌活性を有することが明らかとな
った。
【００５６】以上のことにより、ＹＳ２の培養上清には
抗菌活性を持つ物質が含まれていることが明らかとなっ
た。この抗菌活性を持つ物質はＹＳ０の培養上清にはな
いことより、ザーペシンの遺伝子の存在に依存して発現
していることは明かである。従ってこの抗菌活性を持つ
物質は酵母で発現されたザーペシンであると考えられる
。
抗菌活性を持つ物質が含まれていることが明らかとなっ
た。この抗菌活性を持つ物質はＹＳ０の培養上清にはな
いことより、ザーペシンの遺伝子の存在に依存して発現
していることは明かである。従ってこの抗菌活性を持つ
物質は酵母で発現されたザーペシンであると考えられる
。
【００５７】試験例２ ＣＭセルロース吸着画分のウ
エスタンブロット解析 ＹＳ２の培養上清のＣＭセルロース吸着画分であるフラ
クション１０，１１の抗菌活性を示す物質がザーペシン
であることを更に確認するために、これら２つのフラク
ションを用いてウエスタンブロット解析を行った。
エスタンブロット解析 ＹＳ２の培養上清のＣＭセルロース吸着画分であるフラ
クション１０，１１の抗菌活性を示す物質がザーペシン
であることを更に確認するために、これら２つのフラク
ションを用いてウエスタンブロット解析を行った。
【００５８】ウエスタンブロット解析の方法は、概ねモ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）に記載されている方法に従
って行った。
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）に記載されている方法に従
って行った。
【００５９】下記に示す各サンプルをＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動を行ってそのゲルをクマーシブルーで
染色した結果を図５に、又同じ電気泳動を行い、ウサギ
抗ザーペシン抗体を用いてウエスタンブロット解析を行
った結果を図６に示した。それぞれのレーンには次のサ
ンプルがアプライされている。 レーン１；精製ザーペシン レーン２；ＹＳ２の培養上清ＣＭセルロース吸着画分、
フラクション１０ レーン３；同上、フラクション１１ レーン４；ＹＳ０培養上清ＣＭセルロース吸着画分、フ
ラクション１１ レーン５；同上、フラクション１２
ルアミド電気泳動を行ってそのゲルをクマーシブルーで
染色した結果を図５に、又同じ電気泳動を行い、ウサギ
抗ザーペシン抗体を用いてウエスタンブロット解析を行
った結果を図６に示した。それぞれのレーンには次のサ
ンプルがアプライされている。 レーン１；精製ザーペシン レーン２；ＹＳ２の培養上清ＣＭセルロース吸着画分、
フラクション１０ レーン３；同上、フラクション１１ レーン４；ＹＳ０培養上清ＣＭセルロース吸着画分、フ
ラクション１１ レーン５；同上、フラクション１２
【００６０】まず、クマーシブルーの染色結果ではレー
ン１に一本のバンドがみられた。これはザーペシンであ
る。ＹＳ２の培養上清のＣＭセルロース吸着画分をアプ
ライしたレーン２及び３でも同じ位置に一本のバンドが
観察され、他にはいかなるバンドも観察されなかった。
ン１に一本のバンドがみられた。これはザーペシンであ
る。ＹＳ２の培養上清のＣＭセルロース吸着画分をアプ
ライしたレーン２及び３でも同じ位置に一本のバンドが
観察され、他にはいかなるバンドも観察されなかった。
【００６１】一方、ＹＳ０の培養上清のＣＭセルロース
吸着画分をアプライしたレーン４及び５ではいかなるバ
ンドも観察されなかった。
吸着画分をアプライしたレーン４及び５ではいかなるバ
ンドも観察されなかった。
【００６２】次にウエスタンブロット解析の結果では、
ザーペシンをアプライしたレーン１で１本のシグナルが
クマーシブルーの染色で観察されたバンドの位置に観察
された。この時、レーン２及び３でも同じ位置にシグナ
ルがほぼ同じ強さで観察された。又、レーン４及び５で
はいかなるシグナルも観察されなかった。
ザーペシンをアプライしたレーン１で１本のシグナルが
クマーシブルーの染色で観察されたバンドの位置に観察
された。この時、レーン２及び３でも同じ位置にシグナ
ルがほぼ同じ強さで観察された。又、レーン４及び５で
はいかなるシグナルも観察されなかった。
【００６３】以上のことより、ＹＳ２の培養上清にはザ
ーペシンと同じ抗原性を持つザーペシンと同じ分子量の
物質が発現していることがわかった。この物質はザーペ
シン遺伝子の存在に依存して発現しており、これは酵母
で発現したザーペシンであると結論づけられた。
ーペシンと同じ抗原性を持つザーペシンと同じ分子量の
物質が発現していることがわかった。この物質はザーペ
シン遺伝子の存在に依存して発現しており、これは酵母
で発現したザーペシンであると結論づけられた。
【００６４】ところで、クマーシブルーの染色結果にて
レーン２及び３で観察されるバンドはレーン４，５で観
察されないことよりザーペシンのみによるものと考えら
れる。
レーン２及び３で観察されるバンドはレーン４，５で観
察されないことよりザーペシンのみによるものと考えら
れる。
【００６５】ザーペシン以外のタンパクによるバンドは
全く観察されないことより、このものはこの時点で既に
かなり精製が進んでいると考えられる。即ちこの方法に
よれば、ザーペシンはかなり簡便に精製できると考えら
れる。またＹＳ２でのザーペシンの産生量はウエスタン
ブロット解析の結果より、約０．５ｍｇ／ｌであると推
算された。
全く観察されないことより、このものはこの時点で既に
かなり精製が進んでいると考えられる。即ちこの方法に
よれば、ザーペシンはかなり簡便に精製できると考えら
れる。またＹＳ２でのザーペシンの産生量はウエスタン
ブロット解析の結果より、約０．５ｍｇ／ｌであると推
算された。
【００６６】この値はザーペシンを本来産生している昆
虫由来の細胞ＮＩＨ−ｓａｐｅ−４におけるザーペシン
の発現量に匹敵する。
虫由来の細胞ＮＩＨ−ｓａｐｅ−４におけるザーペシン
の発現量に匹敵する。
【００６７】
【発明の効果】酵母の培養は昆虫細胞の培養に比べ経済
的で技術的にも簡便であるから、ザーペシンを調製する
ための材料としてはＹＳ２は大変に優れている。また前
述した様にその精製は簡単であることが期待できる。以
上のことよりこの方法を用いればザーペシンを大量にし
かも安価に調製できる。
的で技術的にも簡便であるから、ザーペシンを調製する
ための材料としてはＹＳ２は大変に優れている。また前
述した様にその精製は簡単であることが期待できる。以
上のことよりこの方法を用いればザーペシンを大量にし
かも安価に調製できる。
【配列表】
【００６８】配列番号：１
配列の長さ：４０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列
Ａｌａ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｈｉ
ｓ Ｓｅｒ Ａｌａ １５Ｃｙｓ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ ３０Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙ
ｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｓｎ
４０
ｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｈｉ
ｓ Ｓｅｒ Ａｌａ １５Ｃｙｓ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ ３０Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙ
ｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｓｎ
４０
【００６９】配列番号：２
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＧＴＡＡＧＣＴＴＧ ＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧ Ｃ
ＣＡＣＴＴＧＣＧＡ ３０ＴＴＴＡＴＴＧＡＧＴ
４０
ＣＡＣＴＴＧＣＧＡ ３０ＴＴＴＡＴＴＧＡＧＴ
４０
【００７０】配列番号：３
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴ ＡＡＴＴＧＣＧＡＣＡ Ｔ
ＡＣＧＣＡＧＡＣＡ ３０ＧＣ
３２
ＡＣＧＣＡＧＡＣＡ ３０ＧＣ
３２
【００７１】配列番号：４
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴ ＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡ Ｔ
ＡＴＡＡＡＣＧＡＣ ３０ＣＡＡＡ
３４
ＡＴＡＡＡＣＧＡＣ ３０ＣＡＡＡ
３４
【００７２】配列番号：５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣ ＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴ Ｔ
ＴＡＧＣＡＧＣＡＡ ３０ＴＧＣＴ
３４
ＴＡＧＣＡＧＣＡＡ ３０ＴＧＣＴ
３４
【００７３】配列番号：６
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴ ＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴ Ｔ
ＧＡＡＡＴＣＧＡＴ ３０ＡＧＡ
３３
ＧＡＡＡＴＣＧＡＴ ３０ＡＧＡ
３３
【００７４】配列番号：７
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡ ＴＡＴＣＧＧＴＴＴＴ Ｔ
ＣＧＡＡＡＣＧＣＡ ３０ＧＡＡＴＴＴＴＣＧＡ
４０
ＣＧＡＡＡＣＧＣＡ ３０ＧＡＡＴＴＴＴＣＧＡ
４０
【００７５】配列番号：８
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＧＧＧＴＡＡＧＣＴ ＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧ Ａ
ＧＣＣＡＣＴＴＧＣ ３０ＧＡＴＴＴＡＴＴＧ
３
９
ＧＣＣＡＣＴＴＧＣ ３０ＧＡＴＴＴＡＴＴＧ
３
９
【図１】プラスミドｐＢＧＳαを作成する工程を示す。
【図２】プラスミドｐＢＧＳαからプラスミドｐＡＭ８
２Ｂ−Ｓａｐを作成する工程を示す。
２Ｂ−Ｓａｐを作成する工程を示す。
【図３】ＹＳ２の培養上清の各フラクションに対して計
算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を示
すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８０
の値を示す。
算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を示
すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８０
の値を示す。
【図４】ＹＳ０の培養上清の各フラクションに対して計
算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を示
すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８０
の値を示す。
算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を示
すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８０
の値を示す。
【図５】精製ザーペシン、ＹＳ２およびＹＳ０培養上清
のＣＭセルロース吸着画分である各フラクションについ
て、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ってそのゲ
ルをクマーシブルーで染色した結果を示す。
のＣＭセルロース吸着画分である各フラクションについ
て、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ってそのゲ
ルをクマーシブルーで染色した結果を示す。
【図６】精製ザーペシン、ＹＳ２およびＹＳ０培養上清
のＣＭセルロース吸着画分である各フラクションについ
て、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、ウサギ
抗ザーペシン抗体を用いてウエスタンブロット解析を行
った結果を示す。
のＣＭセルロース吸着画分である各フラクションについ
て、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、ウサギ
抗ザーペシン抗体を用いてウエスタンブロット解析を行
った結果を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号：１に示されるアミノ酸配列
を含有する抗菌性ポリペプチドをコードする塩基配列を
複製可能な発現ベクターに連結して該塩基配列と複製可
能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換えＤＮＡ
を得、該組換えＤＮＡで微生物を形質転換した形質転換
体。 - 【請求項２】 配列番号：１に示されるアミノ酸配列
を含有する抗菌性ポリペプチドをコードする塩基配列を
複製可能な発現ベクターに連結して該塩基配列と複製可
能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換えＤＮＡ
を得、該組換えＤＮＡで微生物を形質転換し形質転換体
を得、該形質転換体を培養することよりなる配列番号：
１に示されるアミノ酸配列を含有する抗菌性ポリペプチ
ドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3138314A JPH04335883A (ja) | 1991-05-14 | 1991-05-14 | 抗菌性ポリペプチドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3138314A JPH04335883A (ja) | 1991-05-14 | 1991-05-14 | 抗菌性ポリペプチドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04335883A true JPH04335883A (ja) | 1992-11-24 |
Family
ID=15218999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3138314A Pending JPH04335883A (ja) | 1991-05-14 | 1991-05-14 | 抗菌性ポリペプチドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04335883A (ja) |
-
1991
- 1991-05-14 JP JP3138314A patent/JPH04335883A/ja active Pending
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