JPH04335895A - シクロスポリンａを発酵生産および分離するための方法ならびに新規なシクロスポリン生産品種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、環状オリゴペプチドであるシクロスポリンＡ
の製造方法に関する。特に、本発明は、新規な生産品種
を使用した微生物的方法並びに有効成分の分離精製に関
する。

【０００１】シクロスポリンＡは、炎症抑制、免疫抑制
、抗真菌および抗寄生虫特性を備えた環状ウンデカペプ
チドのグループに属する。人間医学にとって特に興味深
いのは、移植手術および自己免疫疾病の治療に悠揚な免
疫調節特性のあることが判明したことである。

【０００２】特許明細書ＣＨ−ＰＳ　　５８９７１６お
よびＣＨ−ＰＳ　　６０３７９０で、この新規な物質類
がシクロスポリンとして最初に記載され、ボレルの論文
（シクロスポリン、アレルギーにおける進歩３８、カル
ガー出版、１９８６）の中で、その化学的構造および生
物学的−薬理学的効果が総括的に報告されている。

【０００３】シクロスポリンＡの製造方法では、シクロ
スポリンを自然に合成する微生物の能力を利用すること
が公知であり、そこでは、微生物の特定品種を、発酵方
法における生産菌として、複雑な培養基を含む栄養溶液
中で通常の培養条件を維持しながら培養し、やはり公知
の方法で有効成分を分離、精製する。

【０００４】広範囲なスクリーニング研究により、シク
ロスポリン生産能力を備えた数多くの真菌類が発見され
た。ドライ−フス（Ｓｙｄｏｗｉａ，　Ｂｄ．３９、１
９８６、２２−３６）は、真菌属シリンドロカルポン（
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）およびフサリウム（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ）に対して液上（ｅｍｅｒｓｅ）シクロ
スポリン形成能力のみを報告しており、一方、菌糸真菌
品種のトリポクラジウム　　ゲオデス、トリコデルマ　
　ビリデ、ネオコスモスポラ　　ヴァシンフェクタ、イ
サリア　　フェリナ、ヴァーチシリウム品種、アクレモ
ニウム品種、およびビューベリア　　ニベア（本来トリ
ポクラジウム　　インフラタムとして報告されている）
に対しては、浸漬培養でシクロスポリン形成が報告され
ている。 有効成分の最も高い生産性は、真菌品種ビューベリア　
　ニベアにより達成されている。そのため、シクロスポ
リンＡの大量生産では、この品種が特に重要になってい
る。トラバーら（Ｊ．アンティバイオティックス、第４
２巻、１９８９、５９１〜５９７）の報告によると、ビ
ューベリア　　ニベアの高性能突然変異体（記事の中で
は、トリポクラジウム　　インフラタムＮＲＲＬ８０４
４の突然変異体として記載されている）は１リットルあ
たり約５００ｍｇのシクロスポリンＡを生産する。主成
分のサッカロースおよび炭素源としてリンゴ酸および窒
素源としてアンモニウムイオンを含む化学的に限定され
た合成媒体中で、コベルおよびトラバー（Ｅｕｒｏｐ．
　Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．第１４巻、１９８２、２３７〜２４０）
は、１４培養日間で、１リットルあたり１０１ｍｇシク
ロスポリンＡの収量を達成している。この生産菌に精選
したアミノ酸を８ｇ／ｌ　の濃度で補給することにより
、収量は向上するが、技術的に関連のある方法にとって
、経済的に生産性のある溶液にはならない。

【０００５】同様な欠点が、アガトスら（Ａｎｎ．　Ｎ
．　Ｙ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　５０６、１９８７、６
５７〜６６２）による発酵でも示されており、半合成培
養基中で１６培養日後に、１リットルあたり５３０ｍｇ
シクロスポリンＡの収量が報告されているが、そこでは
炭素源として、技術的方法方法としては経費が掛かり過
ぎると考えられるマルトースを使用している。

【０００６】生産品種の経済的利用という意味で、一つ
の技術的製造方法に対する上記の空間−時間−収量はあ
まりにも不十分であり、その上、必然的に有効成分の損
失に結び付く、各種シクロスポリン、特にシクロスポリ
ンＡの分離および精製に不利な影響を及ぼす。上記の、
様々な菌種の培養分散物からシクロスポリンＡを分離す
るための方法は、シクロスポリンＡ分子内のペプチド結
合に予想される傷つき易さをあらゆる場合について考慮
に入れており、高温を避け、培養分散物の液体−液体抽
出または分離した湿った菌糸体の抽出から始めている［
ＵＳ−ＰＳ４１１７１１８、ＵＳ−ＰＳ　　４２１５１
９９、ＤＥ−ＰＳ　　２４５５８５９、ＢＥ−ＰＳ８６
６８１０、Ｖ．ワルブルグら、Ｈｅｌｖ．　Ｃｈｉｍ．
Ａｃｔａ５５（１９７６）１０７５］。抽出残留物はほ
とんどの場合、３０％メタノールおよび石油エーテル間
に分配し、その様にして予め脱脂した物質をシリカゲル
、酸化アルミニウム、および／またはセファデックスＬ
Ｈ２０で繰り返しクロマトグラフィーにかけるが、その
際、部分的に、培養基の１０００倍までの大量の吸着体
を使用する（ＤＥ−ＰＳ　　２４５５８５９）。この様
に精製経費が高くなること、並びに湿った菌糸体処理の
際に収穫した培養液を直ちに処理しなければならないこ
とから、公知の技術の欠点は明らかである。さらに、現
在公知の方法の欠点は、特に環境との相容性が低い溶剤
を大量に使用することである。

【０００７】本発明の目的は、利用できる高生産性シク
ロスポリン生産菌の数を拡大し、これらの新規な微生物
を使用することにより、シクロスポリンＡの生産を合成
媒体中で、複雑な窒素培養基を使用せずに達成する、経
済的に効率的な微生物学的方法を提供することである。 さらに、本発明の目的は、技術的に有利であり、環境と
の相容性が良く、効率的で、高収量のシクロスポリンＡ
の分離および精製方法を提供することである。その際、
助剤の使用量をできるだけ小さく抑え、環境との相容性
がある物質に限定すべきである。

【０００８】本発明の中で、自然の亜熱帯気候区域の環
境から、新規な、これまで知られていない微生物を分離
し、純粋培養したが、この微生物は、目的とする物質グ
ループを代謝物質として蓄積するだけではなく、これら
の物質および特にシクロスポリンＡを、適切な品種調整
の後、突然変異生成および選別処理の結果、浸漬培養条
件下で、多段階発酵方法の枠内で、まったく予期しなか
った様な高率で生産する。これまで化学的にはっきりし
た完全合成培養基は、この様な高率における生産培養基
の有効成分合成には適していないと考えられていたので
、この結果は特に驚くべきことである。

【０００９】本来の微生物は、シエラ　　デル　　ロザ
リオ（Ｓｉｅｒｒａ　ｄｅｌ　Ｒｏｓａｒｉｏ）（キュ
ーバ）から得た土壌試料から分離し、系統学的にセスキ
シリオプシス　　ロザリエンシスＧ．アーノルド（Ｓｅ
ｓｑｕｉｃｉｌｌｉｏｐｓｉｓ　ｒｏｓａｒｉｅｎｓｉ
ｓ　Ｇ．ＡＲＮＯＬＤ）　の名称で新しい属および品種
に分類された、不完全菌糸真菌の代表である。

【００１０】この微生物は、通常の真菌用栄養を含む各
種の培養基上で成長する。麦芽−寒天上で、自然な昼−
夜リズムで育成することにより、１０日以内に、弱い、
軽い薄片状の、コロニー縁部まで伸びた白色空気菌糸を
有する約８ｃｍ大のコロニーが生じる。リング形成は、
コロニーの外部でほんの僅か観察される。スープ調味料
の様な弱い臭気が確認される。この空気菌糸は、全体と
して白く見える、節のある枝別れした菌糸からなる。立
ち上がりかけた、ないし垂直の分生子担体は、一般に強
く、多かれ少なかれ輪生または不規則に枝分れしており
、その枝の末端に多くの、無色の、錐状の、細い梗子が
ある。分生子は梗子の先端に次々に形成され、細長く、
単細胞で、透明な、平滑および薄壁で小さな頭を付けて
いる。有莢子は観察されない。　　梗子性分生子細胞を
有するすべての属（例えば微小分生子を形成するフサリ
エン（Ｆｕｓａｒｉｅｎ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉ
ｏｃｌａｄｉｕｍ）　、ヴァーチシリウム（Ｖｅｒｔｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ）、セスキシリウム（Ｓｅｓｑｕｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ）　、シンポジオフォラ（Ｓｙｍｐｏｄｉｏ
ｐｈｏｒａ）　）とは、セスキシリオプシス　　ロザリ
エンシス　　Ｇ．アーノルドは、上記の特殊性、とりわ
け分生子遺伝子細胞の配置の種類および様式により異な
っている。

【００１１】本方法でシクロスポリンの製造に使用する
この新規な微生物は、ブダペスト条約により、ＩＭＥＴ
供託所、ドイツ連邦共和国、Ｏ−６９００イエナ、ボイ
テンベルグ通り、１１に、番号ＩＭＥＴ４３８８８で供
託され、同様に高生産性品種Ｆ６０５も供託番号ＩＭＥ
Ｔ４３８８７で供託されている。

【００１２】それによって、本発明は無論、野生品種ま
たは上記の突然変異体の突然変異および／または選別に
より培養された他のすべての異形品種を含む。

【００１３】トリポクラジウム　　インフラタム（Ｔｏ
ｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍｉｎｆｌａｔｕｍ　）の異形品
種Ｗｂ６−５は、化学的にはっきりした栄養媒体上にお
ける高性能単胞子類の選別により、特に培養基中にカル
シウムイオンおよび亜鉛イオンの存在により、分離する
ことができた。特に驚くべきことは、この異形品種の分
離も、文献で述べられている、「シクロスポリン形成は
ペプトンあるいは特定のアミノ酸の様な複雑な栄養素の
存在下でのみ、経済的な生産を可能にする量で行われる
」という見解に基づいていることである。品種トリポク
ラジウム　　インフラタムの選別品種Ｗｂ６−５は、イ
エナのＩＭＥＴ供託所に、ブダペスト条約により、登録
番号ＩＭＥＴ４３８９９で供託されている。　　本発明
に係わる方法では、トリポクラジウムインフラタムの選
別品種Ｗｂ６−５またはセスキシリオプシス　　ロザリ
エンシスの異形品種Ｆ６０５を、唯一の窒素源としてア
ンモニウム塩を含み、場合によりクエン酸塩を加え、精
選した２価の陽イオンが存在する培養基中で培養する。 その上、個々の品種の発酵の際に、鉱物塩−グルコース
−寒天上にアンモニウム塩と共に載せた、赤褐色ないし
黒褐色−紫色に着色した液上（Ｅｍｅｒｓ）　培養基か
ら出発すると、安定したシクロスポリンＡの生産を確保
できるので有利であることが分かった。 さらに、異形品種Ｗｂ６−５には、生産培養基中に、硫
酸アンモニウムおよび／または硫酸水素二アンモニウム
を無機窒素化合物として使用するのが特に有利である。 亜鉛イオン濃度は、この品種の培養では、０．５ｍｇ／
ｌ〜５．０ｍｇ／ｌの範囲にするのが効果的である。選
別品種Ｗｂ６−５の生産性は、驚くべきことに、カリウ
ム塩ないしカリウムイオンの存在により不利な影響を受
けることがあるのが目立つ。このことは、この品種に対
して発表されているすべての培養基がカリウム塩を含ん
でいるので、なおさら驚くべきことである。その様な依
存性はセスキシリオプシス　　ロザリエンシス　　Ｇ．
アーノルド種の品種Ｆ６０５には確認されていない。こ
の品種にとっては、発酵媒体中に特定の２価金属イオン
が存在することの方がはるかに重要であり、特にマグネ
シウム、鉄、亜鉛、およびカルシウムのイオンが存在す
ることが、程度の差こそあれ、合成活性に直接的な影響
を及ぼす。そのため、品種Ｆ６０５の発酵は、好ましく
はマグネシウム濃度２５０ｍｇ／ｌ、鉄濃度２０ｍｇ／
ｌおよび亜鉛濃度０．７ｍｇ／ｌで行うべきである。特
に、カルシウムが存在しないと、残りの条件をすべて維
持しても、品種Ｆ６０５の生産性は効果的ではないので
、カルシウムイオンの適量には注意することが重要であ
り、その際、イオン濃度は好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜２
００ｍｇ／ｌにすべきである。同時に、これらの異形品
種には、生産培養を、５ｇ／ｌ　〜３０ｇ／ｌ　の範囲
のクエン酸イオンの存在下で行うのが明らかに有利であ
る。

【００１４】生産培養基中の特定の２価陽イオンの量に
関して、個々のシクロスポリンＡ生産品種の要求に差が
あることは分かっているが、本方法のすべての品種に対
して、経費の掛かる、その構成が不均質な、複雑な窒素
源をなくすことは、プロセスエンジニヤリング上の非常
に重要な進歩である。アガトスら（Ｊ．Ｉｎｄ．　Ｍｉ
ｋｒｏｂｉｏｌ．第１巻、１９８６、３９〜４８）によ
りアンモニウムおよび硝酸塩がシクロスポリン生産に関
して不適当であることが分かり、そのためにこれらの研
究者は唯一のＮ含有培養基として複雑な窒素源を採用し
た時には、この結果は予期できなかった。後に発表され
た無機Ｎ−供給源による結果（マルガリティスおよびチ
ャハル、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｌｅｔｔ．第１１巻
、１９８９、７６５〜７６８）も上記の報告を立証して
いる。

【００１５】発酵は、１ないし２段階前培養の後、好気
性の無菌条件下で、浸漬主培養基中で行うが、その際、
様々な生産品種を液体培養基中で、２０〜３０℃の温度
で、３．０〜７．５の酸性度で、５〜１１日間培養する
。

【００１６】本方法の全工程は次の様に実行する。

【００１７】品種Ｗｂ６−５の液上（Ｅｍｅｒｓ）　培
養基から得た菌糸密集部分およびその胞子を０．９％Ｎ
ａＣｌ溶液に分散させ、炭素源としてモノ−またはジサ
ッカライド並びに窒素源として硫酸アンモニウムを含む
栄養寒天上に延ばし、１４〜２１日間、２４〜２８℃、
好ましくは２４℃で培養する。品種Ｆ６０５の育成も同
様に行うが、栄養寒天中に硫酸アンモニウムは含まない
。生じた単一コロニーから、空気菌糸の少ない、赤褐色
から黒褐色に着色した試料を選別し、鉱物塩−炭水化物
−寒天上に移した後、２〜４ｃｍ大の菌糸密集面積の調
製に使用する。これを寒天の中身として最初の浸漬前培
養通路に移し、それを、容積のそれぞれ２０％だけ培養
基を含む１００ｍｌないし５００ｍｌの三角フラスコ中
で培養する。この栄養溶液は、炭素源としてグルコース
、マルトースまたはサッカロース、さらに有機または無
機窒素培養基並びに鉱物塩を含み、接種後、４８〜９６
時間、２４〜２８℃で、回転振とう装置上で１００〜２
４０ｒｐｍ　で振とうしながら培養する。液体培養基（
最初の前培養に相当）における最初の育成が完了した後
、必要に応じて、次の培養の栄養溶液の体積の５〜１０
％を接種することにより、第二の育成（第二の前培養に
相当）の接種を行う。この工程は、１００ｍｌの上記媒
体を含む５００ｍｌ三角フラスコ、または温度調節およ
び換気用の通常の技術的設備である、正味容積５〜２５
　ｌの攪拌および換気した小型発酵装置で行う。４８〜
９６時間の培養後、唯一の窒素源としてアンモニウム塩
を含む主培養基に、その体積の５〜１０％の量で、前培
養基を接種し、５〜２０日間、攪拌および換気、ないし
回転振とうしながら培養する。この条件下で、発酵混合
物は、公知の方法でＨＰＬＣにより測定して、１リット
ルあたり３０００ｍｇまでのシクロスポリンＡを生産で
きる性能に達する。この培養分散物は、収穫時点まで、
赤褐色ないし黒褐色を呈する。

【００１８】培養分散物からシクロスポリンＡを分離す
るための本発明に係わる方法は、この培養分散物に濾過
助剤を加え、続いて濾過し、湿った生物材料（Ｂｉｏｍ
ａｓｓｅ）を乾燥し、得られた生物材料と濾過助剤の混
合物を低級カルボン酸エステルまたは臨界超過ガス、好
ましくはＣＯ２　で抽出し、抽出物を水を含むメタノー
ルおよび石油エーテルの間で分配することにより脱脂し
、その様にして予備精製した抽出物をシリカゲルおよび
／または酸化アルミニウムのクロマトグラフィーにかけ
る。この分離方法の利点は、とりわけ、 −　　粒子径は小さいが生物材料を損失無く分離でき、
安定した、貯蔵可能で、抽出可能な、乾燥可能な物質が
得られ、 −　　低い精製経費で、少量のバラスト材を使用して抽
出でき、 −　　その後の製造工程が使用する生産菌の特性に適合
し、 −　　抽出剤の使用料を低減できることにある。

【００１９】その際、使用する生産菌の生物材料が、通
常好まれる様な菌糸形ではなく、粒径が１０〜３０μｍ
　の粒状になり、濾過性が悪く、分離が困難なフィルタ
ーケーキを形成するのが難点である。この難点は、本発
明により、培養基分散物に直接、または予め遠心分離に
より濃縮した後、十分な分離効果を備えた濾過助剤（例
えば再結晶した石膏＝プレコシト、カルシトメール）を
加えてから濾過することにより解決できる。濾過助剤／
乾燥生物材料の量比率（１〜４）：１により、良好な濾
過性、迅速な乾燥、および抽出後の効果的な残留物分離
が確保される。

【００２０】この様にして得た、なお３５〜６０重量％
の培養濾液を含む湿った生物材料は、驚くべきことに、
そのペプチドの性質にも関わらず、事実上物質損失無く
、対流乾燥（例えば真空乾燥炉、空気循環炉、渦巻き層
またはバンド乾燥装置）により、８０℃までの、好まし
くは４０〜６０℃の温度で、貯蔵可能な乾燥菌糸製材に
転換することができるが、その湿分：固体の量的比率は
（０．０２〜０．１５）：１にするのが適切である。 あるいは、凍結乾燥によっても、同様に安定した、抽出
可能な乾燥製品を得ることができる。

【００２１】その後に続く２回ないし３回抽出には、使
用するバラスト材が例えばエタノールやアセトンより著
しく少量で済む、酢酸のエチルエステルが好ましい。こ
れは、抽出の回数が２回に限定される場合に、特に当て
はまる。

【００２２】蒸発後の残留物は、それ自体公知の方法で
、水を含むメタノールまたはエタノールおよび石油エー
テルの間で分配して部分的に脱脂することにより、すで
に４０重量％の物質含有量になる。抽出前にアンモニア
水で菌糸を湿すのが効果的な場合がある。抽出が困難な
菌糸種を処理する場合は、抽出前にその菌糸を２０〜４
０重量％、好ましくは２５重量％で８〜７２時間膨潤さ
せ、最初の抽出をウルトラ−タラックスで行う。

【００２３】有機溶剤により固体−液体抽出する代わり
に、臨界超過ガス、好ましくはＣＯ２　により、乾燥菌
糸から有効成分を抽出することもできる。圧力および温
度はガスにより異なる。ＣＯ２　には、約１００〜３０
０バールおよび３５〜６０℃の範囲が適切である。牽引
剤、例えばＣＯ２　に対して０．５〜１．５重量％のエ
タノールを加えて抽出を支援するのも効果的である。不
純物、特に脂肪は、多段階抽出ないし分留により分離す
ることができる。

【００２４】最初のカラムクロマトグラフィー精製は、
選択により、酸化アルミニウム中性（５０〜１００倍量
）またはシリカゲル（３０〜６０倍量）で、展開相とし
て酢酸のエチルエステルを使用し、次の精製は、常にシ
リカゲルで、好ましくは４０倍量の酢酸エチルで行う。 臨界超過抽出に続いては、常圧液体クロマトグラフィー
の代わりに、ＨＰＬＣによる有効成分選別も可能である
。 実施例１ トリポクラジウム　　インフラタムＷｂ６−５品種の表
面培養の菌糸密集部分を先ず、（ｇ／ｌ単位で）グルコ
ース　　２０、（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　　　５、ＫＨ
２　ＰＯ４　２、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．５
、ＣａＣＯ３　　　３．４、寒天２０、ｐＨ値５．３〜
５．７、１２０℃で３０分間殺菌、からなるグルコース
−鉱物塩−寒天上に移す。ペトリー皿で、２４℃で１４
〜２１日間培養した後、生じた面積から赤褐色−黒褐色
に着色した部分を選別する。第一浸漬前培養の接種は、
約１ｃｍ２　大の菌糸密集部分を、（ｇ／ｌ単位で）グ
ルコース　　５０、カゼインペプトン１０、ＫＨ２　Ｐ
Ｏ４　　　１、ＫＣｌ　　２．５、蒸留水　　１　ｌ、
ｐＨ値５．３〜５．６、１２０℃で３０分間殺菌、から
なる培養基１００ｍｌに移して行う。５００ｍｌの培養
フラスコを２４〜２５℃で７２時間、回転振とう装置上
で１８０〜２２０ｒｐｍ　で培養すると、熟成基準とし
て黒褐色を呈し、５％の量で主培養基の接種材料として
使用する。その主培養基は、５００ｍｌの三角フラスコ
中に各１００ｍｌ充填し、（ｇ／ｌ単位で）グルコース
　　８０、（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　　　５、（ＮＨ４
　）２　ＨＰＯ４　　　２、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ
　　０．５、ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．００８
、ＣａＣＯ３　　　５．１、蒸留水　　１ｌ　、ｐＨ値
５．３〜５．９、１２０℃で３０分間殺菌、からなる。 培養は、回転振とう装置上１８０ｒｐｍ　で、２４〜２
５℃で、１１日間行う。

【００２５】発酵収量後、その培養液体にメタノールを
５：１（ｖ／ｖ）　の比で加え、抽出液を評価に使用す
る。この評価は、それ自体公知の方法で、ＨＰＬＣ−カ
ラムにより行う。この種の発酵混合物の性能は、１リッ
トルあたり１１００ｍｇシクロスポリンＡである。 実施例２ 麦芽エキス寒天（麦芽エキス２０ｇ／ｌ）　に載せたセ
スキシリオプシス　　ロザリエンシスＦ６０５品種の液
上（Ｅｍｅｒｓ）　培養基から、２４℃で少なくとも１
４日間培養した後、前培養の接種に使用する胞子分散物
を調製する。この前培養基は、（ｇ／ｌ単位で）マルト
ースまたはグルコース　　７５、カゼインペプトン　　
２５、ＫＨ２　ＰＯ４　　　１、ＫＣｌ　　２．５、脱
イオン水　　１　ｌ、ｐＨ値５．５、１２０℃で３０分
間殺菌、からなる。１００ｍｌの前培養基に２・１０７
　個の胞子を接種し、５００ｍｌ三角フラスコ中で、２
４℃で７２時間、回転振とう装置上で１９０ｒｐｍ　で
培養する。続いて、この培養基を、（ｇ／ｌ単位で）グ
ルコース　　１００、クエン酸水素二アンモニウム　　
１５、ＫＨ２　ＰＯ４　　　１、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２
　Ｏ２．５、ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．１、Ｚ
ｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．００３、脱イオン水　
　１　ｌ、ｐＨ値５．５〜５、１１０℃で６０分間殺菌
、からなる主培養基に１：１０の比で移す。培養条件は
すべて前培養に対応して選択する。１１培養日目に測定
したシクロスポリンＡの含有量は、培養分散物１リット
ルあたり最高１１５０ｍｇ／ｌであった。有効成分の測
定は実施例１に記載する様にして行った。 実施例３ 品種Ｆ６０５の育成および培養を実施例２に記載する様
な前培養基中で行うが、実施例２と異なり、生産品種を
前培養の後、すでに実施例２に記載する主培養基を含み
、２００〜５００分−１で攪拌し、０．２５〜１．０／
分／ｌ　の体積流で換気している、５　ｌの実験室用発
酵装置に移す。１４日間まで行った発酵により、最高３
１５０ｍｇ／ｌのシクロスポリンＡ収量が得られた。 実施例４ 品種Ｆ６０５に対して、実施例２と同様に接種材料を育
成した後、（ｇ／ｌ単位で）グルコース　　５０、粗挽
き大豆　　２．５、（ＮＨ４　）２ＳＯ４　　　４．１
、ＫＨ２　ＰＯ４　　　５．０、ｐＨ値５．５、１１０
℃で６０分間殺菌、からなる栄養溶液を含む攪拌発酵装
置に、媒体１リットルあたり２・１０８　個の胞子を接
種する。温度、攪拌および換気は、実施例３で主培養基
に対して記載した条件に準じる。その様にして４日間保
持した培養基を、実施例２に記載する主培養栄養溶液を
含み、上に前培養に関して記載した条件を維持して培養
する、合金鋼製の４５０　ｌ発酵器における生産工程用
の１０％接種材料として使用する。上記の様に行った発
酵において、平均１４培養日間の後、培養分散物１リッ
トルあたり、２ｇのシクロスポリンＡが形成された。

【００２６】実施例５ セスキシリオプシス　　ロザリエンシスＧ．アーノルド
（ＩＭＥＴ４３８８７）属の品種Ｆ６０５の６　ｌ培養
分散物を、プレコシト被覆したハンドフィルタープレー
トを通して吸引し、得られた湿った物質を空気循環乾燥
炉中で、５０℃で６時間乾燥する。

【００２７】２４６ｇの、約５０重量％のプレコシトを
含む乾燥菌糸−プレコシト混合物が得られる。

【００２８】この混合物を６０ｍｌの１０％アンモニア
水溶液で１５分間膨潤させ、合計４．２　ｌの酢酸エチ
ルを３回に分け、各３０分間ずつ振とうする。その固体
物質から濾別した抽出液から溶剤を蒸留分離した後、２
１ｇの残留物が得られるが、この残留物は、５％の水を
含む１００ｍｌのエタノールに入れ、各３００ｍｌの石
油エーテルで３回振とうし、メタノールを蒸発させた後
、１４ｇに減少した。

【００２９】酢酸エチル中１０００ｇの酸化アルミニウ
ム、中性、活性段階Ｉのカラムクロマトグラフィーで、
約５００ｍｌ流出後、１４５０ｍｌの主画分が得られ、
残留物をシリカゲル６０メルク（０．０６３〜０．２ｍ
ｍ）　で、同じ溶剤および７倍量のｎ−ヘキサンで混合
して再クロマトグラフィー処理することにより、５．２
ｇのほとんど白色の、ＨＰＬＣにより９９重量％のシク
ロスポリンＡを含む生成物が得られる。 実施例６ ３２７．５　ｌ量の、２１．２％生物乾燥材料を含む、
実施例５に記載する突然変異体の培養分散物を、１３．
１ｋｇのプレコシトと混合し、２回に分けて、０．５　
ｍ２　のフィルター面積を備えた圧力フィルター（遠心
ディスクフィルター、ザイツ型）で濾過する。フィルタ
ー表面は、予め、１回あたり２５０ｇのプレコシト−濾
過助剤で覆っておく。湿ったフィルターケーキ（重量２
８．５ｋｇ）　を渦巻き層乾燥機中で、換気温度３５〜
５５℃で乾燥することにより、乾燥菌糸−プレコシト混
合物が１５．４ｋｇ得られる。得られた乾燥物を攪拌漏
斗中で、先ず１００　ｌの、次いで７０　ｌの酢酸エチ
ルで各３０分間攪拌する。浄化し、予備精製した抽出液
を、先ず真空循環蒸発装置で、次いで真空回転蒸発装置
でオイル状の残留物になるまで濃縮し、これを８　ｌの
メタノールに入れる。０．４　ｌの水を加えた後、各１
６　ｌの石油エーテルで３回攪拌する。分離したメタノ
ール層を真空回転蒸発装置で濃縮し、６００ｇの残留物
を得る。

【００３０】酢酸エステル中、２４ｋｇシリカゲル６０
メルクのカラムクロマトグラフィーによる最初の精製に
より、２７５ｇの７９重量％の粗製シクロスポリンが得
られる。２．５重量％のメタノールを含む塩化メチレン
中、１４ｋｇのシリカゲル６０メルクにより再クロマト
グラフィー処理を行う。収量：１０２ｇ、含有量（ＨＰ
ＬＣ）９７．５重量％シクロスポリンＡ 実施例７ ０．３　ｍ２　フィルター面積を有する真空回転セルフ
ィルターを、濾過助剤として１０ｋｇのプレコシトで被
覆する。そのフィルターを通して、実施例５に記載する
突然変異体の培養分散物を濾過する。この培養分散物に
は、先ず６０ｇ／ｌ　のプレコシトを加える。含水量５
５．４％の湿ったフィルターケーキ６２．５ｋｇが得ら
れる。

【００３１】この湿った材料５０ｋｇを渦巻き層中で乾
燥し、有効成分含有量６．３ｇ／ｋｇの乾燥菌糸−プレ
コシト混合物が２２．５ｋｇ得られる。 実施例８ ２０ｋｇの実施例７で得られた乾燥菌糸−プレコシト混
合物を５　ｌのメタノールで湿し、密閉容器中で、室温
で２４時間放置する。

【００３２】その後、この物質を５０　ｌの酢酸エチル
に採り、ウルトラ−タラックスで４０分間回転させる。 吸引濾過した後、フィルター残留物をさらに５０　ｌの
酢酸エチルで１０分間攪拌し、吸引分離する。抽出液を
合わせ、残留物を実施例６と同様に処理し、６１．５ｇ
の精製シクロスポリンＡを得る。 実施例９ ０．５２ｋｇの実施例７で得られた乾燥菌糸−プレコシ
ト混合物（ＴＭＰ）を、５．２〜６．５ｋｇ／ｈの臨界
超過ＣＯ２　により、３００バール、４０℃で、５０〜
８０ｍｌのエタノールを加え、６時間かけて抽出する。 約６０％の、ＴＭＰ中に含まれるシクロスポリンＡが抽
出される。得られた抽出液を実施例６と同様に処理し、
精製する。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】窒素基質および炭素基質並びに鉱物塩を含
   む培養基中で真菌性微生物の好気性発酵によりシクロス
   ポリンＡを発酵生産し、分離するための方法であって、
   発酵に、真菌種セスキシリオプシス　　ロザリエンシス
   　　Ｇ．アーノルドの新規な品種、または突然変異およ
   び／または選別によりそれから得た異形品種を生産菌品
   種として使用し、唯一の窒素源としてアンモニア塩、炭
   素源および場合によりクエン酸塩、並びに２価の陽イオ
   ンを含む培養基中で培養し、培養分散物にフィルター助
   剤を加え、続いて濾過し、このようにして得られた、湿
   った生物材料およびフィルター助剤の混合物を乾燥し、
   低級カルボン酸エステルまたは臨界超過ガス、好ましく
   はＣＯ２　で抽出し、この抽出液を場合により水を含む
   メタノールおよび石油エーテルの間で分配して脱脂し、
   そうして前精製した抽出液をそれ自体公知の方法でシリ
   カゲルおよび／または酸化アルミニウムないし調整ＨＰ
   ＬＣによりクロマトグラフィー処理することを特徴とす
   る、方法。
2. 【請求項２】真菌種セスキシリオプシス　　ロザリエン
   シス　　Ｇ．アーノルド　　ＩＭＥＴ４３８８８の新規
   な品種を使用することを特徴とする、請求項１に記載す
   る方法。
3. 【請求項３】真菌種セスキシリオプシス　　ロザリエン
   シス　　Ｇ．アーノルド　　Ｆ６０５、ＩＭＥＴ４３８
   ８７の新規な品種を使用することを特徴とする、請求項
   １に記載する方法。
4. 【請求項４】真菌品種セスキシリオプシス　　ロザリエ
   ンシス　　Ｇ．アーノルド　　ＩＭＥＴ番号４３８８８
   。
5. 【請求項５】真菌品種セスキシリオプシス　　ロザリエ
   ンシスＦ６０５　　Ｇ．アーノルドＩＭＥＴ番号４３８
   ８８。
6. 【請求項６】唯一の窒素源としてアンモニウム塩を含む
   鉱物塩−グルコース−寒天上に載せた、赤褐色ないし黒
   褐色に着色した液上培養基から出発することを特徴とす
   る、請求項１に記載する方法。
7. 【請求項７】発酵を、亜鉛イオン、鉄イオンおよび／ま
   たはカルシウムイオンの存在下で行うことを特徴とする
   、請求項１に記載する方法。
8. 【請求項８】フィルター助剤として、再結晶化した石膏
   、好ましくはプレコシトまたはカルシトメールを使用す
   ることを特徴とする、請求項１に記載する方法。
9. 【請求項９】乾燥した生物材料−フィルター助剤−混合
   物用の抽出剤として酢酸のエチルエステルまたは臨界超
   過ガス、好ましくはＣＯ２　を使用することを特徴とす
   る、請求項１に記載する方法。
10. 【請求項１０】乾燥した生物材料−フィルター助剤−混
    合物を、抽出前に、メタノールまたは水性アンモニアで
    前膨潤させることを特徴とする、請求項１〜９のいずれ
    か１項に記載する方法。