JPH04341183A - 化学修飾セルラ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は修飾酵素に係り、より
詳細には、セルロ−ス分解酵素であるセルラ−ゼをポリ
マ−で化学修飾した化学修飾セルラ−ゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素は、それが示す反応特異性により、
生体触媒の一つとして種々の反応に利用されている。し
かしながら、酵素を単独で使用するこということは、酵
素活性の持続安定性、反応環境への適応性、さらに反応
終了後に酵素を回収して再び使用する再利用性などの実
用的見地からは、必ずしも有効ではない。

【０００３】そこで、酵素を固定化して使用する技術が
種々考案されている。そのような例としては、共有結合
、物理的吸着、イオン結合、生化学的特異結合などを利
用して担体に結合させる担体結合法、格子状物質やマイ
クロカプセルで酵素を包み込む包括法、酵素同士を架橋
剤で結合させる架橋法などを挙げることができる。また
、これらの方法を組み合わせた複合法もある。さらに、
酵素を両親媒性合成高分子で修飾することにより有機溶
媒可溶化酵素とする方法も提案されており、ポリエチレ
ングリコ−ル（ＰＥＧ）で修飾したカタラ−ゼ、ペルオ
キシダ−ゼ、キモトリプシン、リパ−ゼ、ヘム酵素など
が報告されている。

【０００４】しかしながら、植物の主要部分を形成する
セルロ−スを分解するセルラ−ゼについては、固定化や
化学修飾の研究事例がない。セルロ−スを分解して低分
子化することは、未利用有機資源の有効利用に直接結び
付く重要な技術である。例えば、セルロ−スの低分子化
はアルコ−ルへの変換の中間過程として有用であり、ま
た低分子化された物質は新たな原料として利用可能であ
る。

【０００５】セルロ−スを分解して低分子化するための
処理としては、従来、物理的処理としての粉砕を経た後
、強アルカリ処理、強酸処理等の化学的処理が行なわれ
ている。セルラ−ゼを用いた酵素処理も近年盛んに研究
され、多くの報告があるが、その多くはセルラ−ゼで総
称される酵素を精製分離して各成分の活性を調べる酵素
学的研究や、動植物、菌体等から新たなセルラ−ゼを得
る方向で進められている。また、高活性のセルラ−ゼを
産出するために、遺伝子操作も試みられてはいる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】セルロ−スの分解に酵
素を使用することは、分解後の処理を考えた場合、従来
の物理的および化学的処理による方法に比較して有利で
ある。しかしながら、酵素による分解は、反応速度が遅
いこと、酵素活性安定性が悪いこと、酵素が高価であり
、しかも再利用が難しいことなどが問題となっている。 特に、分解過程において、セルラ−ゼが基質であるセル
ロ−スに吸着してしまい活性を失ってしまうことが大き
な問題点であった。

【０００７】これに関しては、界面活性剤とセルラ−ゼ
との併用による活性向上を目的とした、Ｃａｓｔａｎｏ
ｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，　２
３，　１３６５　（１９８１））、Ｏｏｓｈｉｍａ　ら
（ｉｂｉｄ．，　２８，　１７２７　（１９８６））、
Ｐａｒｋ、Ｋａｊｉｕｃｈｉら（ｉｂｉｄ．，印刷中）
の研究があり、界面活性剤との併用は酵素活性の維持に
効果があるとされている。

【０００８】しかしながら、再利用という点からは、セ
ルラ−ゼが分離しやすい形態になっていることが望まし
い。また、固定化は、基質が固体もしくは高分子である
ため、適当な方法とはいえない。

【０００９】この発明は、活性安定性、ｐＨ安定性、耐
アルコ−ル性等の実用的見地から要求される諸性質が付
与され、かつ分離・回収を行ない易い形態であって再利
用が容易である化学修飾セルラ−ゼを提供することを目
的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記事情に
鑑み、鋭意研究の結果、ポリオキシアルキレングリコ−
ルアルキル（メタ）アリルエ−テル・無水マレイン酸共
重合体でセルラ−ゼを化学修飾することにより、前記目
的が達成されることを見出した。

【００１１】この発明の化学修飾セルラ−ゼにおいては
、ポリオキシアルキレングリコ−ルアルキル（メタ）ア
リルエ−テル・無水マレイン酸共重合体を修飾用高分子
として用いている。このような共重合体としては、例え
ば、下記化２に示される一般式（Ｉ）で表わされる共重
合体を挙げることができる。

【００１２】

【化２】

【００１３】上記一般式（Ｉ）において、ＡＯはオキシ
アルキレン基、Ｒはアルキル基、ｎは重合度、およびｋ
は共重合度をそれぞれ表わす。上記一般式（Ｉ）におい
て、ＡＯで表わされるオキシアルキレン基としては、エ
チレンオキシド［−（ＣＨ２　ＣＨ２　Ｏ）−　］、プ
ロピレンオキシド［−（ＣＨ２　（ＣＨ３　）ＣＨＯ）
−　］等を挙げることができる。 また、Ｒで表わされるアルキル基としては、炭素数　１
ないし１８のアルキル基が好ましい。さらに、重合度ｎ
は　５〜５０程度、および共重合度ｋは　５〜５０程度
がそれぞれ望ましい。

【００１４】上記一般式（Ｉ）で表わされる共重合体に
ついては、特開昭６４−１０８号公報、特開昭６４−１
０９号公報、特開平１−２８７４１１号公報、特開平２
−１３８３１７号公報、特開平２−１３８３１８号公報
、特開平２−１３８３１９号公報、特開平２−１３８３
２０号公報、および特開昭６３−２２６３５８　号公報
に詳細に記載されている。

【００１５】この発明において、化学修飾される酵素と
しては、一般にセルラ−ゼと総称されるセルロ−ス分解
酵素であればどのようなものでもよい。代表的なセルラ
−ゼとしては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　属や　Ａｃｒ
ｅｍｏｎｉｕｍ　類等の糸状菌が産生するセルラ−ゼを
挙げることができる。

【００１６】セルラ−ゼの修飾は、セルラ−ゼに存在す
るアミノ酸残基中のアミノ基（　−ＮＨ２　）と修飾用
高分子中に存在する無水マレイン酸基との反応を利用す
ることにより行なうことができる。この修飾反応は、例
えば、温度　５℃以下の条件で、適当濃度の酵素（粗酵
素でも精製酵素でもよい）水溶液と修飾用高分子とを緩
やかな撹拌条件下で徐々に混合して反応させることによ
り行なう。この際、反応ｐＨ　は　８以上に保つことが
肝要である。修飾用高分子の最終使用量は、所望する修
飾度によって異なるが、通常、酵素量の　０〜　１００
倍である。修飾酵素は、反応終了後の状態でそのまま使
用することも可能であるが、必要に応じて、脱塩・凍結
乾燥処理後、粉末として保存することができ、さらに有
機溶媒を用いて精製して精製修飾酵素として保存するこ
ともできる。

【００１７】

【実施例】

実施例１ 修飾用高分子としてＡＫＭ−０５３１　およびＡＫＭ−
１５１１　を用いて、市販のセルラ−ゼ（ヤクルト社、
オノズカＲ−１０　）を　０℃の条件下で修飾した。Ａ
ＫＭ−０５３１およびＡＫＭ−１５１１　は日本油脂（
株）から市販されているポリオキシアルキレングリコ−
ルアルキル（メタ）アリルエ−テル・無水マレイン酸共
重合体であり、いずれも上記一般式（Ｉ）で表わされる
構造を有している。上記一般式（Ｉ）における、それぞ
れのＲ、ＡＯ、ｎおよびｋは以下の通りである。

【００１８】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＫＭ−０５３
１　　　　　　　　　ＡＫＭ−１５１１　　　　　　　
　　Ｒ　　　　　　　　　　　　ＣＨ３　　　　　　　
　　　　　　　　ＣＨ３　　　　　　　　　ＡＯ　　　
　　　ＣＨ２　ＣＨ２　Ｏ　　　　　　ＣＨ２　ＣＨ２
　Ｏ　　　　　　　　ｎ　　　　　　　　　　　　　　
９　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　　　　
　　　　　ｋ　　　　　　　　　　　　　３０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　
ＭＷ　　　　　　　　　１８，０００　　　　　　　　
　　　　　　１６，０００　それぞれの高分子を用いて
得られた修飾セルラ−ゼの特性を調べた。その結果を以
下に示す。なお、酵素活性の測定における標準基質とし
ては、フィルタ−ペ−パ−（Ｔｏｙｏ　Ｒｏｓｈｉ　Ｃ
ｏ．、ＦＰ−５Ｃ）、ＣＭＣ（和光純薬社製）および　
Ａｖｉｃｅｌ（Ｍｅｒｃｈ　Ｃｏ．　）を用いた。

【００１９】ａ）化学修飾率および酵素活性修飾率は、
セルラ−ゼのアミノ酸残基中の未修飾アミノ基をＴＮＢ
Ｓ試薬で定量することにより決定した。ＡＫＭ−０５３
１　およびＡＫＭ−１５１１　で修飾した場合、最大修
飾率は５０％まで達した。

【００２０】ＡＫＭ−０５３１　およびＡＫＭ−１５１
１　で修飾したセルラ−ゼの酵素活性は、フィルタ−ペ
−パ−に対する活性で示すと、未修飾セルラ−ゼの活性
と比較して、修飾率２０％で約　０．９５　、同５０％
で０．８５〜０．９　であった。 これは、通常酵素の固定化で得られる残存活性よりも極
めて高い値である。比較のために無水マレイン酸で修飾
した場合には、修飾率は７０％まで達したが、残存活性
は　０．６程度まで低下した。

【００２１】ｂ）熱安定性 ｐＨ　５．６、温度５０℃の条件下において、未修飾セ
ルラ−ゼの活性は９０時間後には初期活性の８０％まで
低下し、その後も経過時間に比例して活性低下が見られ
た。これに対して修飾セルラ−ゼの場合には、同条件に
おける９０時間後の活性は、３０％修飾の酵素で８５％
であり、５０％修飾の酵素では活性の低下は見られなか
った。すなわち、高分子で修飾することにより、熱安定
性を付与することができた。

【００２２】ｃ）耐　ｐＨ　性 温度５０℃、ｐＨ　８．６で４８時間保存した後には、
未修飾セルラ−ゼはＣＭＣ、フィルタ−ペ−パ−のいず
れに対しても酵素活性が５０〜６０％に低下した。これ
に対して、修飾セルラ−ゼは、修飾率の増加と共に活性
の低下が少なくなる。上と同条件で保存した場合、４８
時間後の残存活性は、修飾率２０％で未修飾セルラ−ゼ
の　１．２〜１．３　倍、４０％で　１．６倍、および
５０％で約　１．７倍と高い活性を示した。特に、修飾
率５０％の場合には、修飾直後の活性が４８時間後にも
ほとんど維持されていた。このように、高分子で修飾す
ることにより、耐　ｐＨ　安定性を付与することができ
る。

【００２３】ｄ）耐エタノ−ル性 セルラ−ゼはエタノ−ル共存下では活性低下を生じる。 例えば、　５％エタノ−ル共存下では初期活性の４２％
、１０％エタノ−ル共存下では１５％程度まで低下して
しまう。 修飾セルラ−ゼはこの活性低下の割合を減ずることが可
能であり、　５％エタノ−ル共存下で未修飾セルラ−ゼ
の約　１．５倍、１０％エタノ−ル共存下で　２倍以上
の酵素活性を示した。

【００２４】ｅ）有機溶媒に対する溶解性と活性有機溶
媒としてアセトンを用いた場合を例にとると、未修飾セ
ルラ−ゼは、アセトン濃度５０％以上の水溶液では完全
に沈殿してしまい、溶液中の酵素活性は０となってしま
う。これに対して、修飾率４０％の修飾セルラ−ゼは、
アセトン濃度が８０％の水溶液でも完全に溶解し、溶液
中で酵素活性を維持する。すなわち、修飾セルラ−ゼは
有機溶媒に対する優れた溶解性を有しており、高濃度の
有機溶媒存在下においても酵素活性を示す。

【００２５】このようなアセトン水溶液に対する溶解性
を利用して、未溶成分と修飾セルラ−ゼとを容易に分離
することができる。また、回収した修飾セルラ−ゼの溶
液部分を凍結乾燥して得た精製修飾セルラ−ゼは、場合
によっては、初期活性以上の活性を示すこともある。

【００２６】以上のように、この発明による修飾セルラ
−ゼは、元の未修飾セルラ−ゼと比較して、耐熱性、耐
　ｐＨ　性、耐アルコ−ル性、耐有機溶媒性等の実用的
見地から要求される諸性質が向上していることが明らか
である。

【００２７】実施例２ 実施例１において調製した修飾セルラ−ゼを用いて、フ
ィルタ−ペ−パ−の糖化試験を行なった。

【００２８】ｐＨ　５．６、温度５０℃でフィルタ−ペ
−パ−を糖化させた場合には、反応初期には未修飾セル
ラ−ゼの方が糖転化率が高いものの、約３０時間後に転
化率が約３０％に達した時点で両者の差はなくなった。 その後、未修飾セルラ−ゼは転化速度が鈍り、９０時間
後の糖転化率が４０数％に止まった。一方、修飾セルラ
−ゼの転化速度はあまり低下せず、９０時間後には糖転
化率が５０数％と、未修飾セルラ−ゼの約　１．３倍と
なり、その後も両者の差は開く一方であった。

【００２９】このように、この発明による修飾セルラ−
ゼは、セルラ−ゼの実用性を高め、植物性バイオマスの
エネルギ−資源化など未利用有機資源の有効利用に好適
に用いることができる。

【００３０】

【発明の効果】以上のように、この発明の修飾セルラ−
ゼは、活性安定性、ｐＨ安定性、耐アルコ−ル性等の実
用的見地から要求される諸性質が向上している。したが
って、未修飾のセルラ−ゼでは使用不可能であった環境
で使用することが可能となり、その用途が拡大する。こ
のため、現在未利用の有機資源の有効利用等に有用であ
る。また、分離・回収を行ない易い形態であるため、容
易に再利用することができ、高価なセルラ−ゼを効率よ
く使用することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ポリオキシアルキレングリコ−ルアル
   キル（メタ）アリルエ−テル・無水マレイン酸共重合体
   で化学修飾されたセルラ−ゼ。
2. 【請求項２】　　前記ポリオキシアルキレングリコ−ル
   アルキル（メタ）アリルエ−テル・無水マレイン酸共重
   合体が、下記化１に示される一般式（Ｉ）で表わされる
   共重合体である請求項１記載の化学修飾セルラ−ゼ。 【化１】 （ここで、ＡＯはオキシアルキレン基、Ｒはアルキル基
   をそれぞれ表わし、ｎは５〜５０、ｋは　５〜５０であ
   る）