JPH04349892A - 核酸の単離方法 - Google Patents
核酸の単離方法Info
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- JPH04349892A JPH04349892A JP11588591A JP11588591A JPH04349892A JP H04349892 A JPH04349892 A JP H04349892A JP 11588591 A JP11588591 A JP 11588591A JP 11588591 A JP11588591 A JP 11588591A JP H04349892 A JPH04349892 A JP H04349892A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［発明の目的］
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸を含有する生体試
料から核酸を単離する方法に関する。
料から核酸を単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の中でも、ＤＮＡ（遺伝子）に刻み
込まれた遺伝情報は、メッセンジャーＲＮＡを介して蛋
白質あるいは酵素として表現される。この蛋白質や、酵
素の働きにより様々な化合物が生成され、それらの集合
体として生物が存在しているのである。ヒトの遺伝子の
総数は、５万〜１０万といわれているが、近年の分子生
物学の発展により、その解析が分子レベルで急速に進ん
でいる。現在、世界的行われているヒト・ゲノム・プロ
ジェクトはその代表例である。ヒト・ゲノム・プロジェ
クトとはヒト遺伝子の配列をすべて決定しようとする試
みである。また、遺伝子の異常に伴うような疾患を、直
接それらの遺伝子を解析することで診断する、遺伝子診
断と呼ばれる技術が、近年になって注目を集めている。 ヒトの遺伝子の解析を行う際には、まず、組織細胞ある
いは末梢血から、ＤＮＡを含む核酸を抽出し、精製する
必要がある。
込まれた遺伝情報は、メッセンジャーＲＮＡを介して蛋
白質あるいは酵素として表現される。この蛋白質や、酵
素の働きにより様々な化合物が生成され、それらの集合
体として生物が存在しているのである。ヒトの遺伝子の
総数は、５万〜１０万といわれているが、近年の分子生
物学の発展により、その解析が分子レベルで急速に進ん
でいる。現在、世界的行われているヒト・ゲノム・プロ
ジェクトはその代表例である。ヒト・ゲノム・プロジェ
クトとはヒト遺伝子の配列をすべて決定しようとする試
みである。また、遺伝子の異常に伴うような疾患を、直
接それらの遺伝子を解析することで診断する、遺伝子診
断と呼ばれる技術が、近年になって注目を集めている。 ヒトの遺伝子の解析を行う際には、まず、組織細胞ある
いは末梢血から、ＤＮＡを含む核酸を抽出し、精製する
必要がある。
【０００３】以下に従来、一般的に行われている生体の
全血試料からのＤＮＡの単離方法を示す。まず、凝結防
止のためヘパリン処理した全血から、白血球を採取し、
蛋白質分解酵素の存在下で界面活性剤を用いて試料中の
細胞を破壊させる。界面活性剤は、細胞壁のみならず細
胞内の核膜を破壊し、また、蛋白質分解酵素は、細胞内
の余分な蛋白質を分解する。次に、フェノールおよびク
ロロホルムを加えることにより、残存物質である蛋白質
を変性させ不溶化させる。不溶物およびフェノール層あ
るいはクロロホルム層を除去した水層にエタノールを加
えて、核酸を沈殿させる。得られ核酸はほとんどがＤＮ
Ａよりなるが、さらに精製を必要とする場合には、核酸
中にＤＮＡと共に含まれるＲＮＡを分解して除去するた
めに、ＲＮａｓｅ処理をし、再びエタノールを加えてＤ
ＮＡを沈殿させる。従来は以上のようにして、精製され
たＤＮＡを得ていた。
全血試料からのＤＮＡの単離方法を示す。まず、凝結防
止のためヘパリン処理した全血から、白血球を採取し、
蛋白質分解酵素の存在下で界面活性剤を用いて試料中の
細胞を破壊させる。界面活性剤は、細胞壁のみならず細
胞内の核膜を破壊し、また、蛋白質分解酵素は、細胞内
の余分な蛋白質を分解する。次に、フェノールおよびク
ロロホルムを加えることにより、残存物質である蛋白質
を変性させ不溶化させる。不溶物およびフェノール層あ
るいはクロロホルム層を除去した水層にエタノールを加
えて、核酸を沈殿させる。得られ核酸はほとんどがＤＮ
Ａよりなるが、さらに精製を必要とする場合には、核酸
中にＤＮＡと共に含まれるＲＮＡを分解して除去するた
めに、ＲＮａｓｅ処理をし、再びエタノールを加えてＤ
ＮＡを沈殿させる。従来は以上のようにして、精製され
たＤＮＡを得ていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以上のような工程でＤ
ＮＡを得る際、核酸を単離するまでの工程では、細胞を
破壊させるために蛋白質分解酵素の存在下で界面活性剤
を用いるが、細胞膜や核膜を核酸の単離可能な状態にま
で破壊するためには、界面活性剤を加えてから少なくと
も４〜５時間の時間を必要としていた。そのため、多数
のサンプルの解析を必要とする遺伝子解析の作業におい
ては効率が悪く、短時間で、核酸の単離を行う方法が求
められていた。また、残存物質である細胞内の蛋白質を
変性させるために、従来はフェノール、クロロホルムな
どの実験者の健康に有害な有機溶媒を使用していた。
ＮＡを得る際、核酸を単離するまでの工程では、細胞を
破壊させるために蛋白質分解酵素の存在下で界面活性剤
を用いるが、細胞膜や核膜を核酸の単離可能な状態にま
で破壊するためには、界面活性剤を加えてから少なくと
も４〜５時間の時間を必要としていた。そのため、多数
のサンプルの解析を必要とする遺伝子解析の作業におい
ては効率が悪く、短時間で、核酸の単離を行う方法が求
められていた。また、残存物質である細胞内の蛋白質を
変性させるために、従来はフェノール、クロロホルムな
どの実験者の健康に有害な有機溶媒を使用していた。
【０００５】以上のような問題に鑑み、第１の発明の目
的は、全血などの生体試料からの核酸の単離を短時間で
行うことのできる核酸の単離方法を提供することである
。また、第２の発明の目的は、有機溶媒を使用せずに、
安全に作業を行うことのできる核酸の単離方法を提供す
るものである。 ［発明の構成］
的は、全血などの生体試料からの核酸の単離を短時間で
行うことのできる核酸の単離方法を提供することである
。また、第２の発明の目的は、有機溶媒を使用せずに、
安全に作業を行うことのできる核酸の単離方法を提供す
るものである。 ［発明の構成］
【０００６】
【課題を解決するための手段および作用】本発明の第１
の発明は、化学的に細胞を破壊する工程と、破壊された
細胞の蛋白質を変性させ不溶化する工程と、不溶化した
蛋白質を除去する工程を備えた核酸の単離方法において
、細胞を化学的に破壊する際に細胞に衝撃力を加えるこ
とを特徴とする核酸の単離方法である。また、本発明の
第２の発明は、細胞を破壊する工程と、破壊された細胞
の蛋白質を変性させ不溶化する工程と、不溶化した蛋白
質を除去する工程を備えた核酸の単離方法において、酸
または熱の少なくとも一方を加えることにより破壊され
た細胞の蛋白質を変性させ不溶化することを特徴とする
核酸の単離方法である。
の発明は、化学的に細胞を破壊する工程と、破壊された
細胞の蛋白質を変性させ不溶化する工程と、不溶化した
蛋白質を除去する工程を備えた核酸の単離方法において
、細胞を化学的に破壊する際に細胞に衝撃力を加えるこ
とを特徴とする核酸の単離方法である。また、本発明の
第２の発明は、細胞を破壊する工程と、破壊された細胞
の蛋白質を変性させ不溶化する工程と、不溶化した蛋白
質を除去する工程を備えた核酸の単離方法において、酸
または熱の少なくとも一方を加えることにより破壊され
た細胞の蛋白質を変性させ不溶化することを特徴とする
核酸の単離方法である。
【０００７】生体試料から、核酸を単離するためには、
まず最初に、生体試料に由来する細胞の細胞膜や核膜を
破壊する工程が必要である。前記の工程で破壊された細
胞を含む試料の中には核酸以外の残存物質が含まれてい
る。試料中の残存物質の多くは生体内で機能分子として
働いている蛋白質である。次に、核酸の単離のためには
、まずそれらの蛋白質の変性工程を行い、その後、変性
された蛋白質の除去工程を行うことが必要である。
まず最初に、生体試料に由来する細胞の細胞膜や核膜を
破壊する工程が必要である。前記の工程で破壊された細
胞を含む試料の中には核酸以外の残存物質が含まれてい
る。試料中の残存物質の多くは生体内で機能分子として
働いている蛋白質である。次に、核酸の単離のためには
、まずそれらの蛋白質の変性工程を行い、その後、変性
された蛋白質の除去工程を行うことが必要である。
【０００８】本発明の第１の発明は、細胞を破壊する工
程に関する発明で、細胞を破壊するために、化学的方法
に加え、細胞に衝撃力を加えるものである。それにより
、細胞の破壊工程を従来よりも短時間で行うことができ
る。
程に関する発明で、細胞を破壊するために、化学的方法
に加え、細胞に衝撃力を加えるものである。それにより
、細胞の破壊工程を従来よりも短時間で行うことができ
る。
【０００９】化学的に細胞を破壊する方法としては、界
面活性剤を使用する。界面活性剤としては、例えば、サ
ポニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００などを用いる。
面活性剤を使用する。界面活性剤としては、例えば、サ
ポニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００などを用いる。
【００１０】細胞に衝撃力を与える方法としては、例え
ば、適当な大きさの破壊用小片を生体試料溶液に加え、
激しく攪拌する方法がある。破壊用小片の材質はセラミ
ックス、ガラス、樹脂等、核酸の単離に悪影響を及ぼさ
ない限り、特に制限はない。破壊用小片の形状も特に制
限はない。破壊用小片の大きさとしては、例えば形状が
球形の場合、直径０．０１ｍｍから１ｍｍ 程度のもの
が好ましい。破壊用小片が小さすぎると、破壊用小片が
細胞に衝突しても細胞が破壊されにくく、大きすぎると
、攪拌効率が悪くなるためである。また、この他の方法
としては、超音波を加える方法などがある。
ば、適当な大きさの破壊用小片を生体試料溶液に加え、
激しく攪拌する方法がある。破壊用小片の材質はセラミ
ックス、ガラス、樹脂等、核酸の単離に悪影響を及ぼさ
ない限り、特に制限はない。破壊用小片の形状も特に制
限はない。破壊用小片の大きさとしては、例えば形状が
球形の場合、直径０．０１ｍｍから１ｍｍ 程度のもの
が好ましい。破壊用小片が小さすぎると、破壊用小片が
細胞に衝突しても細胞が破壊されにくく、大きすぎると
、攪拌効率が悪くなるためである。また、この他の方法
としては、超音波を加える方法などがある。
【００１１】以上のようにして、細胞の破壊工程を行っ
た後、蛋白質を変性し不溶化する工程を行う。蛋白質を
変性し不溶化する工程は従来のようにフェノールやクロ
ロホルムなどの有機溶媒を加えることにより行っても良
いし、以下に示す本発明の第２の発明によって行っても
良い。
た後、蛋白質を変性し不溶化する工程を行う。蛋白質を
変性し不溶化する工程は従来のようにフェノールやクロ
ロホルムなどの有機溶媒を加えることにより行っても良
いし、以下に示す本発明の第２の発明によって行っても
良い。
【００１２】第２の発明は、前工程で細胞膜や核膜を破
壊された細胞を含む試料溶液に、酸または熱の少なくと
も一方を加え、不純物である蛋白質を変性させ不溶化す
るものである。熱または、酸により細胞の蛋白質を変性
するため、有害な有機溶媒を用いる必要がない。
壊された細胞を含む試料溶液に、酸または熱の少なくと
も一方を加え、不純物である蛋白質を変性させ不溶化す
るものである。熱または、酸により細胞の蛋白質を変性
するため、有害な有機溶媒を用いる必要がない。
【００１３】上記の酸としては、塩酸、酢酸、硝酸、硫
酸など核酸の単離に悪影響を及ぼさない限り、特に制限
はない。酸の濃度としては、０．１Ｎ以上、１Ｎ以下程
度が好ましい。以上のような酸を試料溶液に加え作用さ
せることにより、試料中に可溶であった蛋白質が不溶化
し、コロイド状態となる。また、試料溶液に加える熱と
しては、試料溶液が沸騰する程度に加熱すれば良い。５
分以上加熱し、沸騰を継続することにより試料中に可溶
であった蛋白質が変性して不溶化し、コロイド状態とな
る。酸、および熱はどちらか一方を試料溶液に作用させ
れば良い。また、酸、および熱を共に作用させても良い
。
酸など核酸の単離に悪影響を及ぼさない限り、特に制限
はない。酸の濃度としては、０．１Ｎ以上、１Ｎ以下程
度が好ましい。以上のような酸を試料溶液に加え作用さ
せることにより、試料中に可溶であった蛋白質が不溶化
し、コロイド状態となる。また、試料溶液に加える熱と
しては、試料溶液が沸騰する程度に加熱すれば良い。５
分以上加熱し、沸騰を継続することにより試料中に可溶
であった蛋白質が変性して不溶化し、コロイド状態とな
る。酸、および熱はどちらか一方を試料溶液に作用させ
れば良い。また、酸、および熱を共に作用させても良い
。
【００１４】また、細胞中の蛋白質を分解し、蛋白質の
変性を促進するために、細胞を破壊する工程時に蛋白質
分解酵素（プロテアーゼ）を加えて作用させてもよい。 蛋白質分解酵素のなかでも、特に多種の蛋白質を分解可
能なプロテイナーゼＫが好ましい。
変性を促進するために、細胞を破壊する工程時に蛋白質
分解酵素（プロテアーゼ）を加えて作用させてもよい。 蛋白質分解酵素のなかでも、特に多種の蛋白質を分解可
能なプロテイナーゼＫが好ましい。
【００１５】最後に、不溶化した蛋白質の除去工程を行
う。不溶化した蛋白質の除去は、遠心分離・吸引による
分離、あるいは、フィルタによる濾過分離などをおこな
い、試料溶液中の上清を得る。得られた上清中には、核
酸が含まれているので、それをエタノール等の溶媒を用
いて抽出し、核酸を得ることができる。
う。不溶化した蛋白質の除去は、遠心分離・吸引による
分離、あるいは、フィルタによる濾過分離などをおこな
い、試料溶液中の上清を得る。得られた上清中には、核
酸が含まれているので、それをエタノール等の溶媒を用
いて抽出し、核酸を得ることができる。
【００１６】以上のようにして、得られた核酸にさらに
精製を必要とする場合には、ＤＮＡを選択的に吸着する
シリカなどのガラスビーズを用いる方法や、ＲＮａｓｅ
処理を行う方法などがある。ＤＮＡを選択的に吸着する
ガラスビーズを用いる方法は、操作が容易かつ高純度の
ＤＮＡが得られるため、好ましい。手順としては、ＤＮ
Ａを選択的に吸着するガラスビーズおよび、吸着を促進
する電解質を高濃度で加え、ＤＮＡをガラスビーズに吸
着させた後、バッファーで洗浄し若干の加熱下で水また
はＴＥバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＥＤＴＡ ）中
に溶出させる。 以下に実施例により本発明を詳しく説明する。
精製を必要とする場合には、ＤＮＡを選択的に吸着する
シリカなどのガラスビーズを用いる方法や、ＲＮａｓｅ
処理を行う方法などがある。ＤＮＡを選択的に吸着する
ガラスビーズを用いる方法は、操作が容易かつ高純度の
ＤＮＡが得られるため、好ましい。手順としては、ＤＮ
Ａを選択的に吸着するガラスビーズおよび、吸着を促進
する電解質を高濃度で加え、ＤＮＡをガラスビーズに吸
着させた後、バッファーで洗浄し若干の加熱下で水また
はＴＥバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＥＤＴＡ ）中
に溶出させる。 以下に実施例により本発明を詳しく説明する。
【００１７】
（実施例１）
【００１８】ヘパリン採血した全血２００ μｌに、０
．１ｍｍ φのガラス製のビーズを加え、５％サニポン
５００ μｌ、細胞溶解液（１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００と０．５％ＳＤＳ ５０ｍＭ ＥＤＴＡ ）で２ｍ
ｌチューブを満たし、３分間激しくボルテックスにかけ
、細胞を破壊した。次に、９０℃で１５分間インキュベ
ートし、蛋白質を変性し不溶化させた。不溶化した蛋白
質を除くため、フィルタ（Ｐｏｒｅ Ｓｉｚｅ ０．４
５μｍ ）を用いてろ過した。ろ液に３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび、２．５倍量のエタノールを加え、糸状のＤＮ
Ａをガラス棒で巻き取った。得られたＤＮＡを７０％エ
タノールで洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
，１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０ ））２００μｌ
に溶解してＤＮＡ試料液を得た。２００μｌの全血から
約３〜４μｇのＤＮＡが得られ、制限酵素で切断可能で
あった。所要時間は約１時間であった。 （実施例２）
．１ｍｍ φのガラス製のビーズを加え、５％サニポン
５００ μｌ、細胞溶解液（１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００と０．５％ＳＤＳ ５０ｍＭ ＥＤＴＡ ）で２ｍ
ｌチューブを満たし、３分間激しくボルテックスにかけ
、細胞を破壊した。次に、９０℃で１５分間インキュベ
ートし、蛋白質を変性し不溶化させた。不溶化した蛋白
質を除くため、フィルタ（Ｐｏｒｅ Ｓｉｚｅ ０．４
５μｍ ）を用いてろ過した。ろ液に３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび、２．５倍量のエタノールを加え、糸状のＤＮ
Ａをガラス棒で巻き取った。得られたＤＮＡを７０％エ
タノールで洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
，１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０ ））２００μｌ
に溶解してＤＮＡ試料液を得た。２００μｌの全血から
約３〜４μｇのＤＮＡが得られ、制限酵素で切断可能で
あった。所要時間は約１時間であった。 （実施例２）
【００１９】ヘパリン採血した全血２００ μｌに、実
施例１と同様にして細胞を破壊した試料溶液を得た。つ
いで、０．５ＮのＨＣｌを５００μｌ加え、３７℃で１
５分間インキュベートし、蛋白質を変性させ、不溶化し
た。その後、沈殿をフィルターろ過した。ろ液をＮａＯ
Ｈで中和し、エタノールを加えてＤＮＡを沈殿後、遠心
によってＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを７０％エタノ
ールで洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１
ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０ ））２００μｌに溶
解してＤＮＡ試料液を得た。２００μｌの全血から約３
〜４μｇのＤＮＡが得られ、制限酵素で切断可能であっ
た。所要時間は約１時間であった。 （実施例３）
施例１と同様にして細胞を破壊した試料溶液を得た。つ
いで、０．５ＮのＨＣｌを５００μｌ加え、３７℃で１
５分間インキュベートし、蛋白質を変性させ、不溶化し
た。その後、沈殿をフィルターろ過した。ろ液をＮａＯ
Ｈで中和し、エタノールを加えてＤＮＡを沈殿後、遠心
によってＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを７０％エタノ
ールで洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１
ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０ ））２００μｌに溶
解してＤＮＡ試料液を得た。２００μｌの全血から約３
〜４μｇのＤＮＡが得られ、制限酵素で切断可能であっ
た。所要時間は約１時間であった。 （実施例３）
【００２０】ヘパリン採血した全血２００ μｌに、実
施例１と同様にして、蛋白質を変性後フィルターろ過し
た、ＤＮＡを含むろ液に３倍量のヨウ化ナトリウムおよ
びＤＮＡ吸着ビーズを加え、室温で１０分間放置した。 さらに洗浄用バッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））を用いてＤＮＡ吸着
ビーズを洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０ ））を加え、５０
℃に５分間放置して、ＤＮＡを溶出させた。２００μｌ
の全血から約２μｇの純粋なＤＮＡを得た。制限酵素で
切断可能であり、所要時間は約１．５時間であった。 （比較例１）
施例１と同様にして、蛋白質を変性後フィルターろ過し
た、ＤＮＡを含むろ液に３倍量のヨウ化ナトリウムおよ
びＤＮＡ吸着ビーズを加え、室温で１０分間放置した。 さらに洗浄用バッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））を用いてＤＮＡ吸着
ビーズを洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０ ））を加え、５０
℃に５分間放置して、ＤＮＡを溶出させた。２００μｌ
の全血から約２μｇの純粋なＤＮＡを得た。制限酵素で
切断可能であり、所要時間は約１．５時間であった。 （比較例１）
【００２１】ヘパリン採血した全血２００ μｌに２〜
３倍量の氷冷した０．２％ＮａＣｌを加えて赤血球を破
壊し、４℃ ５０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈渣を得
た。この操作を４回繰り返すことにより赤血球を完全に
除いた。得られた沈渣に１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５ ）を加え、同様に遠心して、白血球の洗
浄を行った。氷冷した細胞溶解液（０．３２Ｍ Ｓｕｃ
ｒｏｓｅ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
）を０．５ｍｌ 加え、懸濁した後に、氷中に５〜１０
分放置した。次に４℃ ５０００ｒｐｍ で１５分間
遠心し、得られた沈殿に氷冷した２５ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０ ）（７５ｍＭ ＮａＣｌ 含有）０．５
ｍｌ１，１０％ ＳＤＳ ５０ μｌ 、およびプロテ
イナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ ）２０μｌ を加えた後
、３７℃で２時間放置した。細胞を破壊する工程に、合
計２時間４５分かかった。等量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０ ））飽
和フェノールを加え、ゆっくり１０分間混和した後３０
００ｒｐｍ で１０分間遠心し水層を取りフェノール・
クロロホルム溶液（１：１混合）、クロロホルムで同様
に抽出した。２．５ 倍量のエタノールを加え糸状のＤ
ＮＡをガラス棒で巻き取り、７０％エタノールで洗い、
乾燥した。得られたＤＮＡは制限酵素で切断可能であり
、全工程を行う所要時間は約３時間４５分であった。
３倍量の氷冷した０．２％ＮａＣｌを加えて赤血球を破
壊し、４℃ ５０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈渣を得
た。この操作を４回繰り返すことにより赤血球を完全に
除いた。得られた沈渣に１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５ ）を加え、同様に遠心して、白血球の洗
浄を行った。氷冷した細胞溶解液（０．３２Ｍ Ｓｕｃ
ｒｏｓｅ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
）を０．５ｍｌ 加え、懸濁した後に、氷中に５〜１０
分放置した。次に４℃ ５０００ｒｐｍ で１５分間
遠心し、得られた沈殿に氷冷した２５ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０ ）（７５ｍＭ ＮａＣｌ 含有）０．５
ｍｌ１，１０％ ＳＤＳ ５０ μｌ 、およびプロテ
イナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ ）２０μｌ を加えた後
、３７℃で２時間放置した。細胞を破壊する工程に、合
計２時間４５分かかった。等量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０ ））飽
和フェノールを加え、ゆっくり１０分間混和した後３０
００ｒｐｍ で１０分間遠心し水層を取りフェノール・
クロロホルム溶液（１：１混合）、クロロホルムで同様
に抽出した。２．５ 倍量のエタノールを加え糸状のＤ
ＮＡをガラス棒で巻き取り、７０％エタノールで洗い、
乾燥した。得られたＤＮＡは制限酵素で切断可能であり
、全工程を行う所要時間は約３時間４５分であった。
【００２２】実施例１〜３と比較例１とを比較してわか
るように、細胞を破壊する工程にかかる時間が、実施例
１〜３が３分程度、比較例では２時間４５分程度かかる
事から、本発明によれば、核酸の単離が短時間で行われ
ることが分かる。また、本発明によれば有機溶媒を用い
ずに核酸の単離を行うことができることがわかる。
るように、細胞を破壊する工程にかかる時間が、実施例
１〜３が３分程度、比較例では２時間４５分程度かかる
事から、本発明によれば、核酸の単離が短時間で行われ
ることが分かる。また、本発明によれば有機溶媒を用い
ずに核酸の単離を行うことができることがわかる。
【００２３】
【発明の効果】以上の述べたように、第１の発明の方法
によれば、短時間で核酸の単離を行うことができ、生体
試料から核酸の単離を必要とする遺伝子解析などの作業
の効率を向上させることができる。また、第２の発明の
方法によれば、人体に有害な有機溶媒を用いることなく
安全に作業を行うことができ、有益である。
によれば、短時間で核酸の単離を行うことができ、生体
試料から核酸の単離を必要とする遺伝子解析などの作業
の効率を向上させることができる。また、第２の発明の
方法によれば、人体に有害な有機溶媒を用いることなく
安全に作業を行うことができ、有益である。
Claims (2)
- 【請求項１】化学的に細胞を破壊する工程と、破壊され
た細胞の蛋白質を変性させ不溶化する工程と、不溶化し
た蛋白質を除去する工程とを備えた核酸の単離方法にお
いて、細胞を化学的方法を用いて破壊する際に細胞に衝
撃力を加えることを特徴とする核酸の単離方法。 - 【請求項２】細胞を破壊する工程と、破壊された細胞の
蛋白質を変性させ不溶化する工程と、不溶化した蛋白質
を除去する工程を備えた核酸の単離方法において、酸ま
たは熱の少なくとも一方を加えることにより破壊された
細胞の蛋白質を変性させ不溶化することを特徴とする核
酸の単離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11588591A JPH04349892A (ja) | 1991-05-21 | 1991-05-21 | 核酸の単離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11588591A JPH04349892A (ja) | 1991-05-21 | 1991-05-21 | 核酸の単離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349892A true JPH04349892A (ja) | 1992-12-04 |
Family
ID=14673597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11588591A Pending JPH04349892A (ja) | 1991-05-21 | 1991-05-21 | 核酸の単離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04349892A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0657530A3 (en) * | 1993-11-29 | 1995-08-30 | Gen Probe Inc | Process for the extraction of nucleic acids from a wide range of organisms. |
| GB2338236A (en) * | 1998-06-13 | 1999-12-15 | Aea Technology Plc | Processing of an aqueous suspension of cells involving a vortex mixer and a lysis reagent |
| KR100456284B1 (ko) * | 2002-07-09 | 2004-11-09 | 학교법인 인하학원 | 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법 |
| JP2008298615A (ja) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Canon Inc | 細胞構成成分取出し機能付血液採取用の容器及び核酸検出方法 |
| JP2009254384A (ja) * | 1997-10-31 | 2009-11-05 | Bbi Bioseq Inc | 圧力強化抽出及び精製方法 |
-
1991
- 1991-05-21 JP JP11588591A patent/JPH04349892A/ja active Pending
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| GB2338236B (en) * | 1998-06-13 | 2003-04-09 | Aea Technology Plc | Microbiological cell processing |
| KR100456284B1 (ko) * | 2002-07-09 | 2004-11-09 | 학교법인 인하학원 | 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법 |
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