JPH04349900A - Ｐｃｒ法用試料の調製方法 - Google Patents
Ｐｃｒ法用試料の調製方法Info
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- JPH04349900A JPH04349900A JP40625190A JP40625190A JPH04349900A JP H04349900 A JPH04349900 A JP H04349900A JP 40625190 A JP40625190 A JP 40625190A JP 40625190 A JP40625190 A JP 40625190A JP H04349900 A JPH04349900 A JP H04349900A
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- Japan
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- sample
- urine
- peg
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用
いて液体試料、特には生体試料中のＤＮＡを増幅する際
に、予備試料を前処理して、ＰＣＲ法用の液体試料を調
製する方法に関する。
ｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用
いて液体試料、特には生体試料中のＤＮＡを増幅する際
に、予備試料を前処理して、ＰＣＲ法用の液体試料を調
製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】種々の核酸を含有する混合物の中から、
所望の核酸だけを選択的に増幅する技術は、特に診断上
の用途において有用である。とりわけ、近年開発された
ＰＣＲ法を利用するウイルス感染症の診断方法は、その
特異性および迅速性の点で優れている。
所望の核酸だけを選択的に増幅する技術は、特に診断上
の用途において有用である。とりわけ、近年開発された
ＰＣＲ法を利用するウイルス感染症の診断方法は、その
特異性および迅速性の点で優れている。
【０００３】ＰＣＲ法は、微量の細胞ＤＮＡから、目的
とするＤＮＡ領域のみを自動的に約１００万倍にまで増
幅することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７
−４９１，１９８８）。ＰＣＲ法では、増幅させるＤＮ
Ａ領域を挟んで＋鎖および−鎖に対する２種のＤＮＡプ
ライマーと耐熱性ポリメラーゼとを用いて増幅サイクル
を繰り返す。
とするＤＮＡ領域のみを自動的に約１００万倍にまで増
幅することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７
−４９１，１９８８）。ＰＣＲ法では、増幅させるＤＮ
Ａ領域を挟んで＋鎖および−鎖に対する２種のＤＮＡプ
ライマーと耐熱性ポリメラーゼとを用いて増幅サイクル
を繰り返す。
【０００４】ＰＣＲ法による診断方法においては、検査
対象目的物（例えば、ウイルス）を含有している疑いの
ある試料（例えば、血液、尿、唾液、胃洗浄液、便、産
道ぬぐい液、母乳、髄液、涙等）に対してＤＮＡ増幅工
程を行う前に、一般的にはＤＮＡ抽出処理を実施してい
る。例えば、プロテネースＫおよびプロテアーゼ処理後
に、フェノール／クロロホルム処理を行っている。
対象目的物（例えば、ウイルス）を含有している疑いの
ある試料（例えば、血液、尿、唾液、胃洗浄液、便、産
道ぬぐい液、母乳、髄液、涙等）に対してＤＮＡ増幅工
程を行う前に、一般的にはＤＮＡ抽出処理を実施してい
る。例えば、プロテネースＫおよびプロテアーゼ処理後
に、フェノール／クロロホルム処理を行っている。
【０００５】しかしながら、試料中の共存物質（例えば
、治療薬としての抗生物質または抗ガン剤等、更に、種
々の生体無機物質および有機物質、例えばカリウム、カ
ルシウム、アンモニアまたは電解物質）によって、ｐＨ
変化やタンパク質の変性が起きたり、ＰＣＲ法に用いら
れるポリメラーゼの活性が阻害されるために、結果的に
ＰＣＲ反応が阻害されてしまい、例えば、ウイルス陽性
試料が、ＰＣＲ法では陰性になる等の不都合な点があっ
た。
、治療薬としての抗生物質または抗ガン剤等、更に、種
々の生体無機物質および有機物質、例えばカリウム、カ
ルシウム、アンモニアまたは電解物質）によって、ｐＨ
変化やタンパク質の変性が起きたり、ＰＣＲ法に用いら
れるポリメラーゼの活性が阻害されるために、結果的に
ＰＣＲ反応が阻害されてしまい、例えば、ウイルス陽性
試料が、ＰＣＲ法では陰性になる等の不都合な点があっ
た。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、特に診断
において、ＰＣＲ法によってウイルス等を確実に増幅し
て検出する際に、試料中の共存物質による影響を排除す
る方法を鋭意研究したところ、ＰＣＲ法の操作を開始す
る前に、被検試料をポリエチレングリコールで前処理す
ることにより、共存物質による妨害を排除ないし軽減す
ることができることを見出した。本発明は、かかる知見
に基づくものである。
において、ＰＣＲ法によってウイルス等を確実に増幅し
て検出する際に、試料中の共存物質による影響を排除す
る方法を鋭意研究したところ、ＰＣＲ法の操作を開始す
る前に、被検試料をポリエチレングリコールで前処理す
ることにより、共存物質による妨害を排除ないし軽減す
ることができることを見出した。本発明は、かかる知見
に基づくものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、液体
予備試料をポリエチレングリコールで処理することを特
徴とする、ＰＣＲ法用の液体試料の調製方法に関する。
予備試料をポリエチレングリコールで処理することを特
徴とする、ＰＣＲ法用の液体試料の調製方法に関する。
【０００８】別の観点から言えば、本発明は、液体液体
試料をポリエチレングリコールで処理することを特徴と
する、ＰＣＲ法用の液体試料の前処理方法に関する。
試料をポリエチレングリコールで処理することを特徴と
する、ＰＣＲ法用の液体試料の前処理方法に関する。
【０００９】本発明で前処理の対象となる「液体予備試
料」とは、従来のＰＣＲ法ではそのまま検査用試料とし
て直接に使用されていた試料を意味するが、本発明方法
ではそれを前処理してからＰＣＲ法による操作を行うの
で、特に予備試料と称する。従って、液体予備試料とし
ては、従来のＰＣＲ法における任意の検査用試料、例え
ば、血液、尿、唾液、胃洗浄液、便、産道ぬぐい液、母
乳、髄液または涙を挙げることができる。
料」とは、従来のＰＣＲ法ではそのまま検査用試料とし
て直接に使用されていた試料を意味するが、本発明方法
ではそれを前処理してからＰＣＲ法による操作を行うの
で、特に予備試料と称する。従って、液体予備試料とし
ては、従来のＰＣＲ法における任意の検査用試料、例え
ば、血液、尿、唾液、胃洗浄液、便、産道ぬぐい液、母
乳、髄液または涙を挙げることができる。
【００１０】本発明方法で用いることのできる非イオン
性界面活性剤であるポリエチレングリコール（以下、Ｐ
ＥＧともいう）の分子量は、２００〜２，０００，００
０、好ましくは、１，０００〜５０，０００である。Ｐ
ＥＧは、適当な溶媒（例えば、蒸留水）中の溶液、特に
は水溶液の形で用いる。使用するＰＥＧ溶液の濃度は特
に制限されないが、好ましくは、処理液中の最終濃度と
して１〜１６％の範囲で用いる。使用するＰＥＧの分子
量によって適切な濃度は変化するが、当業者が必要に応
じて濃度の調節をすることができる。一般に、ＰＥＧの
分子量が大きくなるのに応じて最終濃度を低くする。ま
た、分子量の異なる複数のＰＥＧを用いても良い。
性界面活性剤であるポリエチレングリコール（以下、Ｐ
ＥＧともいう）の分子量は、２００〜２，０００，００
０、好ましくは、１，０００〜５０，０００である。Ｐ
ＥＧは、適当な溶媒（例えば、蒸留水）中の溶液、特に
は水溶液の形で用いる。使用するＰＥＧ溶液の濃度は特
に制限されないが、好ましくは、処理液中の最終濃度と
して１〜１６％の範囲で用いる。使用するＰＥＧの分子
量によって適切な濃度は変化するが、当業者が必要に応
じて濃度の調節をすることができる。一般に、ＰＥＧの
分子量が大きくなるのに応じて最終濃度を低くする。ま
た、分子量の異なる複数のＰＥＧを用いても良い。
【００１１】本発明方法の処理は、液体予備試料（例え
ば、尿）またはその希釈液（例えば、無菌水による希釈
液）にＰＥＧ溶液を添加し、必要に応じて添加剤（例え
ば、無機塩溶液、例えば、塩化ナトリウム溶液）を加え
、低温下（例えば、０〜５℃）で、少なくとも１時間以
上、好ましくは６時間程度放置することによって行う。 処理温度が高い（例えば、約２５℃以上）とウイルス粒
子やウイルスＤＮＡが分解されやすく、また、阻害物等
が析出するおそれがあるので好ましくなく、低すぎる（
例えば、約０℃以下）と試料が凍結するので好ましくな
い。また、処理時間が短い（例えば、１時間未満）とウ
イルス粒子が沈澱として得にくくなるので好ましくなく
、長すぎても（例えば、約２４時間以上）ウイルス粒子
やウイルスＤＮＡが分解されやすくなるので好ましくな
い。
ば、尿）またはその希釈液（例えば、無菌水による希釈
液）にＰＥＧ溶液を添加し、必要に応じて添加剤（例え
ば、無機塩溶液、例えば、塩化ナトリウム溶液）を加え
、低温下（例えば、０〜５℃）で、少なくとも１時間以
上、好ましくは６時間程度放置することによって行う。 処理温度が高い（例えば、約２５℃以上）とウイルス粒
子やウイルスＤＮＡが分解されやすく、また、阻害物等
が析出するおそれがあるので好ましくなく、低すぎる（
例えば、約０℃以下）と試料が凍結するので好ましくな
い。また、処理時間が短い（例えば、１時間未満）とウ
イルス粒子が沈澱として得にくくなるので好ましくなく
、長すぎても（例えば、約２４時間以上）ウイルス粒子
やウイルスＤＮＡが分解されやすくなるので好ましくな
い。
【００１２】前記の処理により、主にＤＮＡおよびウィ
ルスを沈澱させることができ、ＰＣＲ法の妨害物質また
は不必要な共存物質と極めて容易に分離することができ
る。この作用は、現在のところ解明されていないが、主
としてＰＥＧ分子空間内にＤＮＡやウィルスが選択的に
入り込むことにより共存物質との分離が容易に行われる
ものと考えられる。
ルスを沈澱させることができ、ＰＣＲ法の妨害物質また
は不必要な共存物質と極めて容易に分離することができ
る。この作用は、現在のところ解明されていないが、主
としてＰＥＧ分子空間内にＤＮＡやウィルスが選択的に
入り込むことにより共存物質との分離が容易に行われる
ものと考えられる。
【００１３】得られた沈澱を分取（例えば、遠心分離）
し、沈澱物を適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液
）に懸濁させ、得られた懸濁液をＰＣＲ法による増幅工
程にかける。
し、沈澱物を適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液
）に懸濁させ、得られた懸濁液をＰＣＲ法による増幅工
程にかける。
【００１４】本発明方法のＰＥＧによる前処理の後で、
場合により、例えばタンパク尿等に対して界面活性剤（
例えば、オクチルフェニル−エチレンオキサイドまたは
ラウリル硫酸ナトリウム）および／またはタンパク分解
酵素で更に処理してから遠心処理を行うと、沈澱を緩衝
液に容易に懸濁させることができるので好ましい。
場合により、例えばタンパク尿等に対して界面活性剤（
例えば、オクチルフェニル−エチレンオキサイドまたは
ラウリル硫酸ナトリウム）および／またはタンパク分解
酵素で更に処理してから遠心処理を行うと、沈澱を緩衝
液に容易に懸濁させることができるので好ましい。
【００１５】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない
。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない
。
【００１６】実施例１：プライマーの合成試料中のサイ
トメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：
ＣＭＶ）を検出するために、第１のプライマーとして ５′−ＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡ
ＴＧＣ−３′ を使用するものとし、第２のプライマーとして５′−Ｔ
ＴＣＴＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＡＧＣ−
３′ を使用するものとした（なお、前記の式で、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、そしてＴはチミンで
ある）。
トメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：
ＣＭＶ）を検出するために、第１のプライマーとして ５′−ＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡ
ＴＧＣ−３′ を使用するものとし、第２のプライマーとして５′−Ｔ
ＴＣＴＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＡＧＣ−
３′ を使用するものとした（なお、前記の式で、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、そしてＴはチミンで
ある）。
【００１７】これらのプライマーの合成は、３８１型自
動ＤＮＡ合成装置（アプライド バイオシステムズ社
）にシトシンＣＰＧカラムを装着して行った。アンモニ
ア水（約３０％）２．５ｍｌを入れたディスポシリンジ
（２．５ｍｌ）を、合成工程が完了したＣＰＧカラムに
接続し、アンモニア水をカラム内に押し出して、合成し
たＤＮＡフラグメントを溶出した。回収したＤＮＡアン
モニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、６５℃で６時
間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮した。濃縮物
を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテ
ート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ７．４）に溶解
し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型高速液体クロマ
トグラフィー装置（日立製作所）（以下、ＨＰＬＣと称
す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ
Ｍ３１３：株式会社ＹＭＣ）を装着し、５％アセトニト
リルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニトリルと
による濃度勾配を用いて精製し、メインピークを集めた
。 得られた残渣に８０％酢酸（アセトニトリルで調整）を
加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してから減圧乾燥
した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解し、ジエチ
ルエーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾燥したＤＮ
Ａ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いてから、２回
目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピークを集めた
。こうして得られたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の
ＭＩＥＡ（Ｍａｊｏｒ ＩｍｍｅｄｉａｔｅＥａｒｌ
ｙ Ａｎｔｉｇｅｎ）を認識するプライマーである精
製ＤＮＡを減圧乾燥して保存し、後記の実施例３で用い
た。
動ＤＮＡ合成装置（アプライド バイオシステムズ社
）にシトシンＣＰＧカラムを装着して行った。アンモニ
ア水（約３０％）２．５ｍｌを入れたディスポシリンジ
（２．５ｍｌ）を、合成工程が完了したＣＰＧカラムに
接続し、アンモニア水をカラム内に押し出して、合成し
たＤＮＡフラグメントを溶出した。回収したＤＮＡアン
モニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、６５℃で６時
間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮した。濃縮物
を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテ
ート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ７．４）に溶解
し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型高速液体クロマ
トグラフィー装置（日立製作所）（以下、ＨＰＬＣと称
す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ
Ｍ３１３：株式会社ＹＭＣ）を装着し、５％アセトニト
リルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニトリルと
による濃度勾配を用いて精製し、メインピークを集めた
。 得られた残渣に８０％酢酸（アセトニトリルで調整）を
加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してから減圧乾燥
した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解し、ジエチ
ルエーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾燥したＤＮ
Ａ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いてから、２回
目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピークを集めた
。こうして得られたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の
ＭＩＥＡ（Ｍａｊｏｒ ＩｍｍｅｄｉａｔｅＥａｒｌ
ｙ Ａｎｔｉｇｅｎ）を認識するプライマーである精
製ＤＮＡを減圧乾燥して保存し、後記の実施例３で用い
た。
【００１８】実施例２：尿試料の調製
サイトメガロウイルス含有尿を排泄するてんかんの患者
から採取した尿（以下、患者尿と称す）を予備試料とし
て用い、各種の前処理を行ってＰＣＲ法用の試料を調製
した。
から採取した尿（以下、患者尿と称す）を予備試料とし
て用い、各種の前処理を行ってＰＣＲ法用の試料を調製
した。
【００１９】（１）加熱処理
患者尿３０μｌと、患者尿５μｌを滅菌水で６倍に希釈
して調製した尿希釈液３０μｌとを、それぞれ１０分間
煮沸処理した後、急冷し、２種類の試料を調製した。こ
の加熱処理を施した患者尿および尿希釈液を、それぞれ
加熱処理尿試料Ａおよび加熱処理希釈試料Ｂとする。
して調製した尿希釈液３０μｌとを、それぞれ１０分間
煮沸処理した後、急冷し、２種類の試料を調製した。こ
の加熱処理を施した患者尿および尿希釈液を、それぞれ
加熱処理尿試料Ａおよび加熱処理希釈試料Ｂとする。
【００２０】（２）酵素処理
５０ｍＭ−ＫＣｌ、２５ｍＭ−ＭｇＣｌ２ 、０．５％
オクチルフェニル−エチレンオキサイド（ノニデット
Ｐ−４０：シグマ社）、０．０１％ゼラチンおよび０
．００６％プロテアーゼ（プロテアーゼＫ：ベーリンガ
ーマンハイム社）を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）（以下、検体処理液と称す）２５μｌを患者
尿５μｌに加え、５５℃で１時間処理した。更に、１０
分間煮沸処理した後、急冷して調製した試料を、酵素処
理試料Ｃとする。
オクチルフェニル−エチレンオキサイド（ノニデット
Ｐ−４０：シグマ社）、０．０１％ゼラチンおよび０
．００６％プロテアーゼ（プロテアーゼＫ：ベーリンガ
ーマンハイム社）を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）（以下、検体処理液と称す）２５μｌを患者
尿５μｌに加え、５５℃で１時間処理した。更に、１０
分間煮沸処理した後、急冷して調製した試料を、酵素処
理試料Ｃとする。
【００２１】（３）ＰＥＧ処理
分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０
００：和光純薬）の２０％水溶液（１００μｌ）と２Ｍ
−ＮａＣｌ（５０μｌ）とを患者尿（１００μｌ）に加
え、４℃で６時間および１６時間放置した。次に、４℃
で遠心処理（１０，０００ｒｐｍ：２０分間）し、上清
を除去し、沈澱物を集めた。次に、５０ｍＭ−ＫＣｌ、
２．５ｍＭ−ＭｇＣｌ２ 、０．５％ノニデット Ｐ
−４０、０．０１％ゼラチンおよび０．００６％プロテ
アーゼＫを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３
）２０μｌに前記の沈澱物を懸濁させて２種類のＰＥＧ
処理尿を調製した。これらを、それぞれ６−ＰＥＧ処理
尿（ＰＥＧ存在下で６時間放置したもの）および１６−
ＰＥＧ処理尿（ＰＥＧ存在下で１６時間放置したもの）
とする。各ＰＥＧ処理尿１μｌ（尿５μｌに相当）およ
び６μｌ（尿３０μｌに相当）に滅菌水をそれぞれ２９
μｌおよび２４μｌ加え、１０分間煮沸処理した後、急
冷し、４種類の試料を調製した。これらを、それぞれ６
・５ＰＥＧ試料Ｄ（６−ＰＥＧ処理尿を３０倍に希釈し
て調製した試料）、６・３０ＰＥＧ試料Ｅ（６−ＰＥＧ
処理尿を５倍に希釈して調製した試料）、１６・５ＰＥ
Ｇ試料Ｈ（１６−ＰＥＧ処理尿を３０倍に希釈して調製
した試料）、そして１６・３０ＰＥＧ試料Ｉ（１６−Ｐ
ＥＧ処理尿を５倍に希釈して調製した試料）とする。
００：和光純薬）の２０％水溶液（１００μｌ）と２Ｍ
−ＮａＣｌ（５０μｌ）とを患者尿（１００μｌ）に加
え、４℃で６時間および１６時間放置した。次に、４℃
で遠心処理（１０，０００ｒｐｍ：２０分間）し、上清
を除去し、沈澱物を集めた。次に、５０ｍＭ−ＫＣｌ、
２．５ｍＭ−ＭｇＣｌ２ 、０．５％ノニデット Ｐ
−４０、０．０１％ゼラチンおよび０．００６％プロテ
アーゼＫを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３
）２０μｌに前記の沈澱物を懸濁させて２種類のＰＥＧ
処理尿を調製した。これらを、それぞれ６−ＰＥＧ処理
尿（ＰＥＧ存在下で６時間放置したもの）および１６−
ＰＥＧ処理尿（ＰＥＧ存在下で１６時間放置したもの）
とする。各ＰＥＧ処理尿１μｌ（尿５μｌに相当）およ
び６μｌ（尿３０μｌに相当）に滅菌水をそれぞれ２９
μｌおよび２４μｌ加え、１０分間煮沸処理した後、急
冷し、４種類の試料を調製した。これらを、それぞれ６
・５ＰＥＧ試料Ｄ（６−ＰＥＧ処理尿を３０倍に希釈し
て調製した試料）、６・３０ＰＥＧ試料Ｅ（６−ＰＥＧ
処理尿を５倍に希釈して調製した試料）、１６・５ＰＥ
Ｇ試料Ｈ（１６−ＰＥＧ処理尿を３０倍に希釈して調製
した試料）、そして１６・３０ＰＥＧ試料Ｉ（１６−Ｐ
ＥＧ処理尿を５倍に希釈して調製した試料）とする。
【００２２】（４）ＰＥＧ酵素処理
各ＰＥＧ処理尿（６−ＰＥＧ処理尿および１６−ＰＥＧ
処理尿）６μｌと、各ＰＥＧ処理尿１μｌに滅菌水を加
えて６倍希釈して調製した希釈液６μｌとに、それぞれ
検体処理液２４μｌを加え、５５℃で１時間放置した。 続いて、１０分間煮沸処理した後、急冷し、４種類の試
料を調製した。これらを、それぞれ６ＰＥＧ酵素尿試料
Ｆ（６−ＰＥＧ処理尿をそのまま検体処理液で処理して
調製した試料）、６ＰＥＧ酵素希釈試料Ｇ（６−ＰＥＧ
処理尿の希釈液を検体処理液で処理して調製した試料）
、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊ（１６−ＰＥＧ処理尿をその
まま検体処理液で処理して調製した試料）、そして１６
ＰＥＧ酵素希釈試料Ｋ（１６−ＰＥＧ処理尿の希釈液を
検体処理液で処理して調製した試料）とする。
処理尿）６μｌと、各ＰＥＧ処理尿１μｌに滅菌水を加
えて６倍希釈して調製した希釈液６μｌとに、それぞれ
検体処理液２４μｌを加え、５５℃で１時間放置した。 続いて、１０分間煮沸処理した後、急冷し、４種類の試
料を調製した。これらを、それぞれ６ＰＥＧ酵素尿試料
Ｆ（６−ＰＥＧ処理尿をそのまま検体処理液で処理して
調製した試料）、６ＰＥＧ酵素希釈試料Ｇ（６−ＰＥＧ
処理尿の希釈液を検体処理液で処理して調製した試料）
、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊ（１６−ＰＥＧ処理尿をその
まま検体処理液で処理して調製した試料）、そして１６
ＰＥＧ酵素希釈試料Ｋ（１６−ＰＥＧ処理尿の希釈液を
検体処理液で処理して調製した試料）とする。
【００２３】実施例３：ＰＣＲ法によるＣＭＶ─ＤＮＡ
の増幅 実施例２で調製した１１種の各試料３０μｌに、Ｇｅｎ
ｅＡｍｐ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキ
ット（宝酒造）の１０×ＰＣＲ用緩衝液（加熱処理尿試
料Ａおよび加熱処理希釈試料Ｂには５μｌ、酵素処理試
料Ｃには２μｌ、６・５ＰＥＧ試料Ｄ、６・３０ＰＥＧ
試料Ｅ、１６・５ＰＥＧ試料Ｈ、１６・３０ＰＥＧ試料
Ｉには５μｌ、６ＰＥＧ酵素尿試料Ｆ、６ＰＥＧ酵素希
釈試料Ｇ、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊそして１６ＰＥＧ酵
素希釈試料Ｋには２μｌ）と、ｄＮＴＰ混合液８μｌと
、２０倍希釈したＴａｇポリメラーゼ５μｌと、前記実
施例１で調製した２種のプライマー各１μＭとを加え、
滅菌水で全体を５０μｌに調整した後、ＤＮＡサーマル
サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）を用いて、１サイクルが（１）９４℃で１分間、（
２）６０℃で２分間、および（３）７２℃で３分間の処
理からなる工程を３０サイクル行い、最後に７２℃で７
分間の処理を行うプログラムでＤＮＡの増幅を行った。
の増幅 実施例２で調製した１１種の各試料３０μｌに、Ｇｅｎ
ｅＡｍｐ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキ
ット（宝酒造）の１０×ＰＣＲ用緩衝液（加熱処理尿試
料Ａおよび加熱処理希釈試料Ｂには５μｌ、酵素処理試
料Ｃには２μｌ、６・５ＰＥＧ試料Ｄ、６・３０ＰＥＧ
試料Ｅ、１６・５ＰＥＧ試料Ｈ、１６・３０ＰＥＧ試料
Ｉには５μｌ、６ＰＥＧ酵素尿試料Ｆ、６ＰＥＧ酵素希
釈試料Ｇ、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊそして１６ＰＥＧ酵
素希釈試料Ｋには２μｌ）と、ｄＮＴＰ混合液８μｌと
、２０倍希釈したＴａｇポリメラーゼ５μｌと、前記実
施例１で調製した２種のプライマー各１μＭとを加え、
滅菌水で全体を５０μｌに調整した後、ＤＮＡサーマル
サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）を用いて、１サイクルが（１）９４℃で１分間、（
２）６０℃で２分間、および（３）７２℃で３分間の処
理からなる工程を３０サイクル行い、最後に７２℃で７
分間の処理を行うプログラムでＤＮＡの増幅を行った。
【００２４】実施例４：電気泳動による増幅ＤＮＡの確
認 電気泳動用のゲルは、トリス塩基５．４ｇと硼酸２．７
５ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２ｍｌとを含む緩衝液（ｐＨ
８．０）（以下０．５×ＴＢＥと称す）１リットルにア
ガロースゲル１８ｇまたは７ｇを溶解し、ムピド（アド
バンス社）のゲルプレートに流して調製した。次に、Ｐ
ＣＲ反応後の溶液１０μｌに、０．２５％ブロモフェノ
ールブルーおよびフィコールタイプ４００（ファルマシ
ア社）の１５％水溶液２μｌを混合し、その混合物をサ
ンプルウエルに入れた。０．５×ＴＢＥを電極層に入れ
て、室温で１００Ｖにて、４５分間電気泳動を行った。 電気泳動終了後に、アガロースゲルをエチジウムブロマ
イドで染色し、ＵＶイルミネイター照射下で電気泳動の
結果を確認した。結果を図１に模式的に示す。図１にお
いて、Ａは加熱処理尿試料Ａ、Ｂは加熱処理希釈試料Ｂ
、Ｃは酵素処理試料Ｃ、Ｄは６・５ＰＥＧ試料Ｄ、Ｅは
６・３０ＰＥＧ試料Ｅ、Ｆは６ＰＥＧ酵素尿試料Ｆ、Ｇ
は６ＰＥＧ酵素希釈試料Ｇ、Ｈは１６・５ＰＥＧ試料Ｈ
、Ｉは１６・３０ＰＥＧ試料Ｉ、Ｊは１６ＰＥＧ酵素尿
試料ＪおよびＫは１６ＰＥＧ酵素希釈試料Ｋの結果を示
し、ＸはＤＮＡマーカーであり、Ｙは陰性コントロール
であり、そして、Ｚは陽性コントロールである。また、
ＳおよびＲは、それぞれ未反応プライマーおよびプライ
マーのダイマーと思われる。なお、使用したプライマー
の組合せから、ＣＭＶ含有試料においては、１８１ｂｐ
の位置にＤＮＡバンドが期待される。
認 電気泳動用のゲルは、トリス塩基５．４ｇと硼酸２．７
５ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２ｍｌとを含む緩衝液（ｐＨ
８．０）（以下０．５×ＴＢＥと称す）１リットルにア
ガロースゲル１８ｇまたは７ｇを溶解し、ムピド（アド
バンス社）のゲルプレートに流して調製した。次に、Ｐ
ＣＲ反応後の溶液１０μｌに、０．２５％ブロモフェノ
ールブルーおよびフィコールタイプ４００（ファルマシ
ア社）の１５％水溶液２μｌを混合し、その混合物をサ
ンプルウエルに入れた。０．５×ＴＢＥを電極層に入れ
て、室温で１００Ｖにて、４５分間電気泳動を行った。 電気泳動終了後に、アガロースゲルをエチジウムブロマ
イドで染色し、ＵＶイルミネイター照射下で電気泳動の
結果を確認した。結果を図１に模式的に示す。図１にお
いて、Ａは加熱処理尿試料Ａ、Ｂは加熱処理希釈試料Ｂ
、Ｃは酵素処理試料Ｃ、Ｄは６・５ＰＥＧ試料Ｄ、Ｅは
６・３０ＰＥＧ試料Ｅ、Ｆは６ＰＥＧ酵素尿試料Ｆ、Ｇ
は６ＰＥＧ酵素希釈試料Ｇ、Ｈは１６・５ＰＥＧ試料Ｈ
、Ｉは１６・３０ＰＥＧ試料Ｉ、Ｊは１６ＰＥＧ酵素尿
試料ＪおよびＫは１６ＰＥＧ酵素希釈試料Ｋの結果を示
し、ＸはＤＮＡマーカーであり、Ｙは陰性コントロール
であり、そして、Ｚは陽性コントロールである。また、
ＳおよびＲは、それぞれ未反応プライマーおよびプライ
マーのダイマーと思われる。なお、使用したプライマー
の組合せから、ＣＭＶ含有試料においては、１８１ｂｐ
の位置にＤＮＡバンドが期待される。
【００２５】図１から明らかなように、尿をＰＥＧ処理
していない加熱処理尿試料Ａ、加熱処理希釈試料Ｂおよ
び酵素処理試料ＣではＤＮＡのバンドが確認できないが
、６・５ＰＥＧ試料Ｄおよび６・３０ＰＥＧ試料Ｅでは
１８１ｂｐの位置にＤＮＡバンドが確認できた。また、
１６・５ＰＥＧ試料Ｈおよび１６・３０ＰＥＧ試料Ｉで
も同様のＤＮＡバンドが確認できた。従って、６時間程
度のＰＥＧ処理により、ウイルスの濃縮および阻害物質
の除去が可能であることが分かる。
していない加熱処理尿試料Ａ、加熱処理希釈試料Ｂおよ
び酵素処理試料ＣではＤＮＡのバンドが確認できないが
、６・５ＰＥＧ試料Ｄおよび６・３０ＰＥＧ試料Ｅでは
１８１ｂｐの位置にＤＮＡバンドが確認できた。また、
１６・５ＰＥＧ試料Ｈおよび１６・３０ＰＥＧ試料Ｉで
も同様のＤＮＡバンドが確認できた。従って、６時間程
度のＰＥＧ処理により、ウイルスの濃縮および阻害物質
の除去が可能であることが分かる。
【００２６】また、６ＰＥＧ酵素尿試料Ｆ、６ＰＥＧ酵
素希釈試料Ｇ、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊ、そして１６Ｐ
ＥＧ酵素希釈試料Ｋでも、それぞれ試料Ｄ、試料Ｅ、試
料Ｈおよび試料Ｉと同様にＤＮＡバンドが確認できた。 従って、ＰＥＧ処理後に得られたウイルス粒子を検体処
理液で容易に懸濁することができ、ウイルスＤＮＡを得
ることができることが分かる。なお、腎臓病の患者から
取得したタンパク尿を試料として用いた前記と同様の試
験においては、６ＰＥＧ酵素尿試料Ｆ、６ＰＥＧ酵素希
釈試料Ｇ、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊ、そして１６ＰＥＧ
酵素希釈試料Ｋに相当する試料において明瞭なＤＮＡバ
ンドを観察することができた。
素希釈試料Ｇ、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊ、そして１６Ｐ
ＥＧ酵素希釈試料Ｋでも、それぞれ試料Ｄ、試料Ｅ、試
料Ｈおよび試料Ｉと同様にＤＮＡバンドが確認できた。 従って、ＰＥＧ処理後に得られたウイルス粒子を検体処
理液で容易に懸濁することができ、ウイルスＤＮＡを得
ることができることが分かる。なお、腎臓病の患者から
取得したタンパク尿を試料として用いた前記と同様の試
験においては、６ＰＥＧ酵素尿試料Ｆ、６ＰＥＧ酵素希
釈試料Ｇ、１６ＰＥＧ酵素尿試料Ｊ、そして１６ＰＥＧ
酵素希釈試料Ｋに相当する試料において明瞭なＤＮＡバ
ンドを観察することができた。
【００２７】以上、サイトメガロウイルスを検出する操
作に沿って本発明方法を具体的に説明したが、本発明方
法は任意のＰＣＲ法に応用できるものである。
作に沿って本発明方法を具体的に説明したが、本発明方
法は任意のＰＣＲ法に応用できるものである。
【図１】ＰＣＲ法で処理した各試料を電気泳動にかけた
結果を模式的に示す説明図である。
結果を模式的に示す説明図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 液体予備試料をポリエチレングリコー
ルで処理することを特徴とする、ＰＣＲ法用の液体試料
の調製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP40625190A JPH04349900A (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | Ｐｃｒ法用試料の調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP40625190A JPH04349900A (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | Ｐｃｒ法用試料の調製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349900A true JPH04349900A (ja) | 1992-12-04 |
Family
ID=18515866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP40625190A Pending JPH04349900A (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | Ｐｃｒ法用試料の調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04349900A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0879894A3 (en) * | 1997-05-20 | 1999-08-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Sample preparation for nucleic acid based diagnostic tests |
| WO2007060949A1 (ja) * | 2005-11-25 | 2007-05-31 | K.K. Dnaform | 核酸検出及び増幅方法 |
| JP2024009064A (ja) * | 2018-01-24 | 2024-01-19 | ペルキネルマー ヘルス サイエンシーズ， インコーポレイテッド | 分離によるマイクロ流体チップ内の核酸の精製 |
-
1990
- 1990-12-07 JP JP40625190A patent/JPH04349900A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0879894A3 (en) * | 1997-05-20 | 1999-08-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Sample preparation for nucleic acid based diagnostic tests |
| WO2007060949A1 (ja) * | 2005-11-25 | 2007-05-31 | K.K. Dnaform | 核酸検出及び増幅方法 |
| US8097414B2 (en) | 2005-11-25 | 2012-01-17 | K. K. Dnaform | Method for detecting and amplifying nucleic acid |
| JP5150829B2 (ja) * | 2005-11-25 | 2013-02-27 | 株式会社ダナフォーム | 核酸検出及び増幅方法 |
| JP2024009064A (ja) * | 2018-01-24 | 2024-01-19 | ペルキネルマー ヘルス サイエンシーズ， インコーポレイテッド | 分離によるマイクロ流体チップ内の核酸の精製 |
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