JPH04356186A - 基準長或いは屈折性体内芽胞を有した同調細胞群にクロストリジウム全体を転換させるための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は溶媒生産細胞群、酵素、
抗生物質、有用な毒性蛋白質あるいは屈折性体内芽胞の
生産に有用なクロストリジウム属（ｇｅｎｕｓＣｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ）の成長を同調化する方法に関する。ク
ロストリジウム属細菌の栄養細胞は基本的に同じ基準長
を有する同調化された溶媒生産細胞に全体的に変えられ
る、あるいは屈折性体内芽胞の生産のような方向に向う
変換へと選択的に誘導される。さらに特に、ランダムな
細胞成長になるのを避けるため、ゆっくり代謝される炭
素源（低代謝炭素源）を含む培養液内で選択的継代培養
をすることによって細胞数と細胞の量の両方が同調化さ
れる。同調化された細胞は少なくとも栄養細胞の長さの
３倍に伸張し、その時点で溶媒生産性になる。細胞の量
と数の同調性は培養液中に少なくとも約０．０１Ｍの２
価陽イオンの添加によって安定化される。溶媒生産が保
たれるために、成長は化学的あるいは物理学的方法によ
って阻害されなければならない。酵素、抗生物質あるい
は毒性蛋白質生産細胞の調製を目的とするならば、溶媒
生産期を過ぎた特定の時期において、細胞分裂あるいは
ＤＮＡ複製を阻害することによって、行うことができる
。

【０００２】

【従来の技術】クロストリジウム属に属するいくつかの
嫌気性、好温性、芽胞形成細菌は、酵素、抗生物質、毒
性蛋白質の代謝的生産、もしくはアセトン−ブタノール
−エタノール（ＡＢＥ）発酵による溶媒生産等に関して
限られた能力しか持っていない。この属の特別な能力は
大部分この幅広い遺伝的多様性に起因する、しかし一方
体内芽胞の顕著な生産は特別な生理的条件下でのみおき
る。体内芽胞は、栄養細胞の状態では破壊されるであろ
う極端な条件下でも耐え得るという能力によって特徴づ
けられる。クロストリジウム細胞におきる形態的変化は
細胞内の酵素活性の変化と関係している。培養条件に従
って、これら細菌はその成長過程で、酸生産相か溶媒生
産相のいづれかに入り得る。胞子形成の全過程の調節は
、従って細胞代謝物の商業的生産に必要な前提条件とな
る。

【０００３】クロストリジウム属の細菌の数種は、低価
格生物資源廃棄物たとえばキシランや他のペントースポ
リマー等を基質に、事前の解重合を経ずとも、直接溶媒
に変換することができる。あるクロストリジウムが嫌気
性で、好温性であるということから、この属を用いる工
業的発酵過程は比較的高温で行うことになる。結果とし
て、これら発酵産物の回収は発酵槽から直接に真空蒸留
によって得られるからあまりエネルギーを必要としなく
なる。真空蒸留による回収はさらに発酵細胞の溶媒毒性
に関連する問題を減少させる。クロストリジウム属は高
い代謝速度を有しているのでバイオリアクター内で要さ
れる残留時間を減少させ、細胞に対する最終産物の割合
を高め、全生物活性出力を極大にする。それに加えて、
高温性システムであることと共に、単純な培地、厳選さ
れた大量の細胞の接種等々の条件によって、このシステ
ムは先天的に雑菌の汚染が起り難いことを保証している
と言える。したがって、基質の滅菌を省略することがで
きる。

【０００４】細菌発酵工程に用いられる最も安価で最も
豊富な原料であるリグノセルロース性バイオマス物質は
、各々が別々に処理される必要がある３種類の主要な画
分、結晶セルロース、ヘミセルロースそしてリグニンか
らなる。セルロースは酸あるいは酵素等の触媒によって
グルコースに加水分解される。しかしながら酸触媒は生
成されたグルコースの分解を引き起こす。また、酵素的
方法はまだ十分に開発されておらず、未だコスト面で効
率が悪い。ヘミセルロースは大部分キシランからなる。 これは容易にキシロースに加水分解されるが、現存の発
酵技術では、これをエタノールに発酵させるのは困難で
ある。リグニンは糖ポリマーでは無く、エタノール発酵
の原料として利用することは出来ない。しかし熱化学的
に変換して液体燃料添加物として使用することが出来る
。

【０００５】工業的な溶媒生産を目的として、サトウキ
ビ糖蜜を原料として、嫌気性クロストリジウム　　アセ
トブチリカムが用いられたのは、少なくとも１９２０年
代である。しかしながら得られる最も良い溶媒回収率は
約１．８％である。そしてこの回収率でも、ファージ（
細菌のビールス）感染に対するクロストリジウム　　ア
セトブチリカムの感受性に起因して信頼性がなく不安定
であった。本発明の方法は発酵産物の生成速度と生産率
の制御を可能にするものであり、そしてより安価なリグ
ノセルロース性原料の使用を可能にするものである。特
に好ましい形態において、本発明はクロストリジウム属
の好温性を利用する、すなわちより高い温度下での成長
が可能なため、このプロセスはエネルギー的により効率
のよい方法となる。加えて好温性クロストリジウム類は
ファージ感染を受けない。

【０００６】クロストリジウム　　サーモサッカロリテ
イカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍａｓａｃ
ｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）の同調化伸張がアカデミッ
クプレス（ロンドン）、１９７６発行　　エドワード　
　ジェイ．シュー（本発明の一人）著・「スポアーリサ
ーチ」ｐｐ．２２３−２４２に記載されている、しかし
少なくとも最終増殖の期間中細胞を安定化できる２価陽
イオンの存在下での細胞の同調成長に関する記載に欠け
ている。

【０００７】クロストリジウム　　サーモサッカロリテ
イカムのエタノール生産変異がエドワード　　ジェイ．
シュー（本発明者の一人）によって出願された米国特許
第４、６５２、５２６号に記載されている。この特許は
２価イオンが細胞を安定化するために加えられた条件下
での成長培地中での細胞の同調成長の記載がない。

【０００８】ハートマニス等（アプライドマイクロバイ
オロジーアンドテクノロジー、２３巻（１９８６）３６
９−３７１ページ）は多量の２価イオンを含む成長培地
中でのクロストリジウム　　アセトブチリカム（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の
反復性継代培養について述べている。カルシウムの少量
が３回の交換後の細胞の脱落を防ぐため開始培地中に入
れられた。ＣａＣＯ３　の添加は脱落なしに１０回の交
換ができた。カルシウム添加は開始培地の調整のため多
数回の熱ショック処置への必要性をなくした。しかしな
がら、細胞の数とその効率的大きさへの同調化は実質的
に均一な細胞群を生産するために遂行されていない。著
者は、各々の継代培養が少なくとも２４時間の期間、熱
抵抗性胞子を生産するようになる過程を記載している。

【０００９】石田等による米国特許第４、７７８、７６
０号はクロストリジウム科（Ｃｌａｓｓ）の温度安定性
アルファーアミラーゼ好温性嫌気性細菌を安定化するた
めの少量のカルシウム（４ｐｐｍ）の効果をのべている
。しかしながら、カルシウムはバクテリア細胞のための
成長培地の成分として利用されていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこれまで得ら
れたものよりも顕著に高いレベルでエタノール、ブタノ
ールのような溶媒を選択的に生産するために有用である
ところのクロストリジウム属の細菌の調製法を提供する
。さらに加えて、酵素あるいは抗生物質も同時に選択的
に生産させることができる。同様に重要なのは、以前の
溶媒回収率は約１〜２％をこえていないが、この方法で
は、回収される溶媒は１１％となることである。ブタノ
ールとエタノールは、溶媒回収率が１１％の場合、２：
１の割合で回収される。エタノール回収率は６．５％の
溶媒回収率で１：１に増大する。大きな利点は、低コス
トの原料を特別に調製した細胞の成長培地として用いる
ことができることである。さらに付帯的には、本発明に
おける細胞調製のプロセスは芽胞形成を完全に遂行させ
ることができ、これは過去のいかなる実績よりもより効
果的に達成されうる。

【００１１】

【課題を解決するための手段】最も好ましいこれらの方
法は、嫌気性のクロストリディアを細胞数と細胞量の両
者の同調化によって特異細胞長を持つそれに変換させる
ことである。細胞は低コストの炭素源を原料とする成長
培地で回分培養される。同調培養で得られた細胞はその
分裂サイクルにおいて各々正確に同じステージにある。 個々の細胞とその各々の過程は“フェーズ内（ｉｎ　ｐ
ｈａｓｅ）　”にあると言える。目的とする最終産物に
よって、細胞を収穫して保存するかもしくは２価陽イオ
ンの添加によって細胞の安定化を図り、続けて成長の阻
害が行なわれる。このようにしてえられた細菌はかなり
長い期間、代謝を続けることができる。そのような細胞
から分離されうる代謝最終産物は溶媒、炭水化物分解酵
素、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、抗生物質
、パラスポロ様蛋白質結晶（ｐａｒａｓｐｏｒｏ−ｌｉ
ｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｒｙｓｔａｌｓ）、そして他
の毒性蛋白質、例えば有機性殺虫剤のようなものである
。

【００１２】好ましい成長培地は種特異的な基礎培地で
ゆっくり代謝される炭素源を０．１から１５．０％（重
量／体積）を含むものである。そのような培地中での細
菌の成長速度は、それらの最適成長培地中でのそれの最
大成長速度Ｋｍよりも１０〜９０％小さくなるべきであ
る。最も好ましい炭素源としてはペントースポリマー、
例えばキシランを含む経済的で得やすい麦わら、稲わら
、籾殻、トウモロコシの茎、トウモロコシの穂軸、果物
の皮、そして製紙工場のヘミセルロース性、セルロース
性廃棄物、あるいは他の適当な農業、工業、或いは都市
の有機性廃棄物である。

【００１３】細胞は反復希釈、遠心分離、あるいは膜ロ
過等のいずれか一つもしくはそれ以上の方法によって同
調化を行うことができる。そしていずれもその操作のあ
と反復継代培養が行われる。細胞は種特異的最適成長温
度よりもおおよそ−２０℃から＋１０℃の温度で培養す
る。培養期間は１．０から１．５世代、あるいは１．０
から１．５の“ダブリングタイム”すなわち最初の菌濃
度の２から３倍に増殖するための時間に限定する。細胞
の同調化を図るには、培養の過程で、３回から４回細胞
の代謝老廃物の除去のために培養を中断する必要がある
。この老廃物の除去は希釈、遠心分離、もしくは膜ロ過
のいずれか、もしくはその組合せを都合２〜３回反覆し
て行なう。好ましい実施例において同調化細胞は全て基
本的に同じ一定の長さ、すなわち正常栄養細胞のすくな
くとも３倍、望ましくは約４倍から２０倍の範囲の長さ
になる。しかし、細胞はその栄養細胞の長さよりも１０
０倍以上伸びることもある。

【００１４】伸張し、同調化した細胞はさらに約１．０
から１２．０世代増殖するため継代培養する。これは、
最初の濃度の２から４、０９６倍に増殖するために必要
とされる時間である。細胞はその活性の安定化を図るた
めとその死滅、溶菌あるいは凝集を防ぐためカルシウム
、マグネシウム、マンガン、鉄、あるいは亜鉛のような
２価陽イオンを含む培地で継代培養される。培地へ２価
陽イオンを少なくとも約０．０１Ｍ添加することによっ
て良い結果が得られる。２価陽イオンは増殖中の細胞に
継続して取込まれるので、溶解度を超える過剰量の２価
陽イオンを培地中に入れておくことができる。２価陽イ
オンの濃度を約０．０１Ｍから約０．２Ｍのレベルで維
持すれば、よりよい結果が得られ、その中でも２価陽イ
オンの濃度が少なくとも０．１Ｍの場合が最も望ましい
。３種類の培地を用いることができる：一つはキシラン
を唯一の炭素源とし、それに２価陽イオンを加えたもの
である；もう一つはキシランとそれ以外に炭素源として
２価の有機酸塩を補足したものである；さらにもう一つ
は、２価の有機酸塩を唯一の炭素源としたものである。 グルコン酸カルシウム、乳酸塩、酢酸塩、ブチル酸塩、
或いはギ酸塩のような有機酸のカルシウム塩が用いられ
る。グルコン酸カルシウム塩で安定化した同調化細胞は
、６ヶ月間成長阻害剤の存在化においてでも耐えられる
。グルコン酸カルシウムは最も好ましい２価陽イオン炭
素源である。この化合物は必要なカルシウムイオンを供
給するばかりでなく、グルコン酸はよりゆっくりした速
度であるがグルコースの場合と似た方法で代謝される卓
越した炭素源でもある。

【００１５】低代謝性炭素源を含む培地で、継代的に移
植（少なくとも２回継代培養）することによって得られ
た同調培養細胞は、その修飾された細胞分裂の様式に関
してクロストリジウム属を含む如何なるタイプのバクテ
リアにおいても過去に報告は見られない。本発明の結果
において細胞はたとえば１６倍から２０倍に伸張する。 そして普通にない修飾された仕方で、たとえばフィラメ
ントが等しく２細胞内に分割され伸張して残っているよ
うな仕方で細胞にひとつの隔膜を形成する。隔膜が形成
された８倍から１０倍の長さをもつ新しい細胞は、さら
にもう一度等しい細胞に分裂するか、あるいは最終的に
胞子隔膜を形成する。それ故、単一細胞はまず１６倍に
伸張し、次いで８倍に伸張したに等しい２細胞を形成す
るように分裂する、そして続いて４倍に伸張した（基準
長ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｌｅｎｇｔｈ）ままの、
４個の細胞を形成するように分裂する。

【００１６】ゆっくり代謝される炭素源の適当なものと
しては、アミグダリン、アラビノース、セロビオース、
ガラクトース、グリコーゲン、メロビオース、アルファ
ーメチルグルコシド、ベーターメチルグルコシド、ラフ
ィノース、サラシン、澱粉、トレハロース、キシラン、
酢酸カルシウム、ラク酸カルシウム、クエン酸カルシウ
ム、ギ酸カルシウム、グルコン酸カルシウム及び乳酸カ
ルシウムがある。クロストリジウム　　サーモサッカロ
リテイカム（Ｃ．　ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙ
ｔｉｃｕｍ）から独立した屈折性の胞子の比較的均一な
集団を形成しようとするこれまでの試みは不成功であっ
た。本発明の方法は、栄養細胞から基本的に１００％独
立した屈折性胞子が生産されるような完全な分化を起こ
す培養条件が包含される。

【００１７】目的とする最終産物が商品としての細胞で
ある場合、それらは収穫され、そして遠心分離と懸濁を
くり返すか、もしくはロ過等の方法によって洗滌されそ
して４℃で保存される。一方、もし目的とする最終産物
が胞子であるならば、安定化された培養の温度を成長適
温の範囲から適当に上げるかあるいは下げることを行う
。たとえば成長のための最適温度よりも−２０℃から約
＋１０℃上げるか下げることになる。細胞分裂はその温
度でとまるが、しかし、細胞分化、胞子形成そして代謝
は継続する。もし目的とする最終産物が伸張した胞子形
成細胞によって生産されるものであるならば、例えば溶
媒の場合、対象とする同調化し、安定化された細胞の成
長は、温度の変化、あるいは抗微生物化学試薬、たとえ
ば抗生物質や色素等を用いて阻害する必要がある。胞子
形成や細胞分裂はこのような処理によって、停止するが
、溶媒産生のような代謝過程は継続する。

【００１８】図１から明らかなように、伸張を誘導する
ところの調節をされ、同調化成長をしている細胞は、経
路Ｉ、ＩＩそしてＩＩＩ　として同定されたそれぞれ異
なる代謝過程を選択的に遂行するために用いることがで
きる。 細胞が経路Ｉによって表された過程に用いられた時、伸
張細胞は溶媒生産的で、溶媒は細胞分裂が停止してから
ある期間にわたって生産される。もし細胞分裂が温度の
変化のような物理的手段によって阻害され、一方インキ
ュベーションが続けられた場合、胞子形成が開始され、
そして究極的には胞子が最も多い産物になる。成長が抗
微生物試薬によって阻害され、その状態が長時間にわた
って持続されたとしても、溶媒は依然として主産物であ
る。細胞が経路ＩＩで示される過程に用いられたとき、
結果は主として胞子形成である。細胞が経路ＩＩＩ　に
よって示された過程によって用いられたときには基本的
に溶媒が生産される。

【００１９】より望ましいと考えられる方法に基づいて
、液状のペプトン−酵母抽出物、もしくは通常の他のあ
りふれた組成をもつその他の培地に低代謝性炭素源を補
強した基礎生長培地＃１が調整される。この好ましい培
地は最適種特異的成長培地で与えられる最大成長速度Ｋ
ｍよりも少なくとも１０％以上細菌の成長を制限する。 この観点から、好ましい成長培地は、キシランのような
ペントース物質である。ペントザンとして０．５％濃度
（重量／体積）になるよう、十分にキシランを与えられ
るべきである。

【００２０】植物細胞壁や木質組織中に普遍に存在して
いるペントサン化合物、キシランは麦の藁を粉末化する
ことによって、あるいはいろいろな農業的、工業的そし
て都会からの有機性廃棄物から得ることができる。キシ
ランは未処理のまま、もしくは粉末の形で基本培地に添
加できる。別の処理方法として、キシランを温めた希塩
酸あるいは他の酸によって加水分解してキシロースを得
ることができる、これは一般式Ｃ５　Ｈ１０Ｏ５　をも
って示される、一般に木糖（ｗｏｏｄ　ｓｕｇａｒ）と
よばれる結晶性のアルドース糖である。キシロースはセ
ルロース基本培地上で本法のクロストリジウム　　サー
モサッカロリテイカム（Ｃ．　ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）とともにクロストリジウム　　
サーモセラム（Ｃ．　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）　の
ようなセルロース分解性生物を共存培養することによっ
ても得ることができる。

【００２１】保存培養は適当なブロス培地にクロストリ
ジウム属の対数増殖期の細胞を移植することによって調
製される。特に好ましいクロストリジウム細菌はサーモ
サッカロリテイカム（アメリカンタイプカルチャーコレ
クション）（ＡＴＣＣ）＃７９５６、ナショナルカナー
アソシエーション（ＮＣＡ）、＃３８１４である。その
他のものとしては、パーフリンゲン（ｐｅｒｆｒｉｇｅ
ｎｓ）ＡＴＣＣ＃１３１２４，サーモセラムＡＴＣＣ＃
２７４０５，サーモハイドロサルフリカム（ｔｈｅｒｍ
ｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）　ＡＴＣＣ＃３５
０４５，アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃ
ｕｍ）ＡＴＣＣ＃８２４、サーモサルフリゲンス（ｔｈ
ｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ＃３３７
４３，サーモアセチカム　　ドイチェ　　サムルングフ
ォンミクロオーガニスメン（ＤＳＭ）＃５２１、サーモ
オウトトロフィカム（ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈ
ｉｃｕｍ）　ＤＳＭ＃１９７４、ベイジェリンキー（ｂ
ｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）　ＡＴＣＣ＃２５７５２，そ
してブチリカム（ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）　ＡＴＣＣ＃１
９３９８がある。

【００２２】細胞成長の同調化は通常の逐次希釈、ロ過
あるいは遠心分離技術によって達成できる。特定のクロ
ストリディア種の最適生長温度及び時間でインキュベー
トした細胞濃度が少なくとも１×１０６　に到達した時
点で、この基礎培養の１０倍容量のキシラン基礎培地に
移植し、回分培養としてインキュベートする。これは図
１の基礎培地＃１として示されている。

【００２３】クロストリジウム回分培養を含む基本培地
＃１が、初濃度の２から３倍に、あるいは約１から１．
５世代増殖するよう、与えられたいわゆる好ましいクロ
ストリジウム種がもつその固有の温度と時間インキュベ
ートを行なう。

【００２４】基本成長培地＃１と組成において同一であ
る基本成長培地＃２が次に調製される。培地＃１内のク
ロストリジウム培養の約１容量が１０容量の基本培地＃
２に各々移植され、再び回分培養としてインキュベーシ
ョンされる。この培養は、培地＃２内の培養が２から３
倍にあるいは１．０から１．５世代に増殖するまで、あ
るいは細胞が少なくとも約２．３×１０５　の濃度に到
達するまで、その種に固有の最適成長温度で培養される
。

【００２５】代謝経路ＩあるいはＩＩの一つにそって遂
行される細胞代謝を維持するのに用いられる成長培地は
、有機あるいは無機２価陽イオン源とともに先に記載さ
れたキシラン基本培地を供給することによって調製され
る。代謝経路ＩＩＩ　のための成長培地はペプトン−酵
母抽出物基本培地に唯一の炭素源である有機酸の２価陽
イオンを補強したものである。陽イオンは死滅、溶解、
凝集から細胞を守るのに用いられる。好ましい２価陽イ
オンはマグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、そしてカル
シウムである。特に好ましい陽イオン源には有機カルシ
ウム化合物が含まれる。

【００２６】もし溶媒生産細胞と胞子の両者を生産する
ことを望むならば、代謝経路Ｉが用いられる。そしてこ
れに関して好ましい安定化供給物はグルコン酸カルシウ
ムである。成長培地＃３は、すくなくとも重量、容量比
で約４．３％（０．１Ｍ）のグルコン酸カルシウムをキ
シラン基本培地に補強したものである。

【００２７】基本培地＃２のバッチ培養の約１容量を成
長培地＃３　　１００倍量に接種する。この１：１００
の希釈接種した培養は少なくとも約１から１２世代まで
、あるいは１から１２回の“グブリングタイム”までバ
ッチ培養としてインキュベートされる。これは細胞が初
濃度の約２×１０１０あるいは２から４０９６倍の濃度
に達するまでの時間であって、細胞が細胞数と大きさに
おいて高度の同調性を表す時間である。これらの細胞の
９０％かそれ以上は、最小でも４倍に伸張し、そしてそ
の修飾された異常な細胞分裂を示すものとして、少なく
とも３倍の基準長に、多くはその栄養細胞の長さの４倍
の伸張を見せる。同調性の溶媒産生細胞はこの時期の終
りに集菌される。これらの細胞集団には無視できる程度
の胞子しか存在しない。

【００２８】あるいは、溶媒生産性細胞を、その成長を
止める何らかの処置を行なうことによって、細胞代謝生
産物の回収を図ることができる。ＤＮＡ複製と細胞分裂
は細胞と成長培地の温度を上昇させたり低下させるよう
な物理的手段によって阻害することができる。それは種
に特異的な最適成長温度より１０℃上か−２０℃下であ
る。他の実施例を示すと、致死量以下の抗菌剤の投与に
よっても成長を阻害させることができる。特に好ましい
抗菌剤としてはクロラムフェニコール、マイトマイシン
、ナリジキシン酸、そしてアクリジンオレンジである。

【００２９】もし目的が代謝経路Ｉを用いる溶媒生産で
あるならば、伸張した溶媒産生細胞の分裂は阻害され、
そしてこの溶媒生産は付随的な胞子形成なしに、インキ
ュベーションが継続される間続行する。そしてパラフィ
ンオイルが付加的炭素源として利用される。図２に示さ
れたように、特別に調製され同調化された細胞を阻害す
ることによって、溶媒生産増進のステージにはいらせる
ことができる。ある期間の後、これは使用する細菌種に
依存して変化するが、溶媒生産能は低下を示す。これは
後期の胞子形成の再開を示すものである。

【００３０】もし、インキュベーションが続けられたな
らばポリミキシン、バチトラシンのような抗生物質、ア
ミラーゼの様な炭水化物分解酵素、プロテアーゼ、リパ
ーゼ、ヌクレアーゼ、パラスポロー様蛋白質結晶そして
究極的に屈折性、成熟したフリー胞子が生産される。

【００３１】もし、目的とする最終産物が胞子とそれに
関連した生産物であるならば、好ましい代謝経路は図１
の過程ＩＩによって表わすことができる。それの好まし
い２価陽イオン供給源は炭酸カルシウムである。成長培
地＃４は、炭酸カルシウムの重量／体積比約１．１％（
０．１Ｍ）をキシラン基本培地に補強して得られる。

【００３２】＃２基本培地で回分培養された種培養の約
１容量を１００容積の＃４成長培地に接種する。この１
：１００に薄められた＃４培養は、回分培養を行ない細
胞量及び細胞数について同調性が示され、更に培養中の
細胞が栄養細胞の４倍迄伸張した時点まで培養は継続さ
れる。その細胞分裂は修飾されたものであり、娘細胞は
基準長まで伸張したままの状態で存在する。同調化した
細胞の分裂は、物理的手段、例えば、培養温度を上昇、
低下させることによって阻害することができる。この分
裂が阻害された同調培養を継続してインキュベートする
ことによって抗生物質、酵素、パラスポロ様結晶、そし
て最終的に屈折性の成熟胞子と少量の溶媒が生産される
。

【００３３】もし目的とする最終産物が単に溶媒産生細
胞であるならば、好ましい代謝経路は図１のＩＩＩ　で
ある。そのなかで、唯一の低代謝性炭素源として有機カ
ルシウム化合物を普通の組成の液体ペプトン−酵母抽出
物培地に補足することによって、培地＃５が成長培地と
して使用される。好ましい有機カルシウム化合物は約４
．３％（重量／体積、０．１Ｍ）のレベルで存在するグ
ルコン酸カルシウムである。

【００３４】基本培地＃２内の回分培養の約１倍量の接
種が、成長培地＃５の各々約１００倍量に移植される。 １：１００希釈接種の＃５は、回分培養を行い、細胞が
細胞量と細胞数において同調性を示し、修飾された細胞
分裂によって、分裂した細胞が栄養細胞の長さの約４倍
の基準長に伸張するまでインキュベートされる。同調化
した溶媒生産細胞は、少量の副生した胞子と共に、この
培養の終りに集菌される。

【００３５】もし、目的が代謝経路ＩＩＩ　を用いる溶
媒生産である場合、ＤＮＡ複製や細胞分裂は温度変化さ
せるような物理的手段や抗生物質を使用することによっ
て阻害を行ない、インキュベートを更に継続することに
よって、培養生産を行うことができる。このインキュベ
ートは溶媒生産性が著るしく低下するまで継続される。

【００３６】経路Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ　の代謝産物は種
々の一般的方法を用いて回収される。例えば産物が溶媒
で、５０℃或いはそれ以上の高温で生産される場合、回
収は以下の著者によって記載される真空発酵によること
ができる：デー、エル、パビア等（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ　ｔｏ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａ　Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａ
ｒｙ　Ａｐｐｒｏａｃｈ５４８−５５２頁．ダブリュウ
、ビー、サンダース編１９７６）そして、シセブスキー
及びビルケ（”Ｒａｐｉｄ　Ｅｔｈａｎｏｌ　Ｆｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　Ｖａｃｕｕｍ　ａｎｄ
　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｃｙｃｌｅ”　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ＸＩＸ巻バ
イオテクノロジーとエンジニャリング、１１２５−１１
４３頁、１９７７）。

【００３７】もし溶媒が５０℃以下の温度で生産される
場合、産物は標準的な蒸留過程によって回収される。炭
水化物分解酵素のような酵素は菌体外に生産されること
が多く、ロ過あるいは遠心分離によって細胞残渣を除去
することで回収できる。もし粗抽出物からの酵素の精製
をのぞむならば、回収はデ．アイ．シ．ワング等によっ
て記載されているようにして行なわれる（Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｎｇｙｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、２３８−３１０頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆
　Ｓｏｎｓ　編１９７９）。パラスポロー様蛋白質結晶
と有用な毒性蛋白質が胞子内にふくまれているが、これ
らは遠心分離或いはロ過を反復することによって回収さ
れる。細胞は、遠心分離されあるいはロ過され、再懸濁
し、これを再び遠心分離或いはロ過し、これを数回繰り
返す。これによって、純粋な乾燥胞子が回収される。も
し産物が抗生物質であるならば、クルーガー　　アンド
　　クルーガー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　Ａ　
Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、９９−１０３頁、Ｓｉｎａｕｅ
ｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｔｅｃｈ．　１９８２）によって
記載されるプロパノール或いはブチル酢酸のような溶媒
をもちいる一般的な抽出法によって回収される。

【００３８】成長培地＃５は、上記に記載された方法に
おいて、キシラン基本培地＃１と＃２に置き換えること
ができる。その方法は、成長培地＃５中への最終１：１
００希釈を含め同じやり方で良い。希釈接種培養は、細
胞が先に記載された場合と同様に伸張し同調化しそして
修飾された細胞分裂を示すまで回分培養としてインキュ
ベートする。同調性の溶媒生産細胞はこの時間の終りに
回収される。胞子の形成は殆んど見られない。

【００３９】もう一つの方法として、同調化溶媒生産細
胞の、細胞分裂へのエネルギーの流れを阻害し、代謝の
方向へ切替えることによって、その代謝産物を継続して
回収することが可能となる。この成育阻害は、細胞及び
培地の温度を、その菌種に特異的な成長温度より約１０
℃上げるか、もしくは２０℃下げるか、或いは致死量以
下の抗菌剤で処理することによって達成される。この成
育阻害した培養は、さらにインキュベートし、無視でき
る程度の胞子形成をともないながら、溶媒生産が行なわ
れる。所定の時間が経過したあと、これは菌種によって
異なるが、その生産される溶媒のパーセンテージは、例
えば６％から高い場合は約１２％に及び、ブタノール：
エタノールの比もたとえば１：１〜２：１の間で変動す
る。

【００４０】他の実施例において第２の基本培地内で継
代が繰返され、そしてこの最初の新鮮培地への希釈が第
３の成長培地中に接種される前にこれを繰返す。初めの
新鮮基本培地中への希釈は約１：２〜１：１００であり
、繰返される。そして最終希釈は約１：２〜１：５００
になる。繰返される遠心分離或いは膜ロ過そして再懸濁
の方法は培養の同調化のための別法として、逐次の希釈
操作と置き換えてもよい。

【００４１】全ての試験した実施例において、長期間溶
媒産生を維持するには、伸張し、同調した細胞は低代謝
性炭素源を要求するように思われる；正常細胞分裂は温
度変更によって或いは化学的成長阻害剤の添加によって
停止しなければならない。そして細胞はカルシウムを取
込む必要がある。図３〜５は個々の同調化されたクロス
トリジウム　　サーモサッカロリテイカム（Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉ
ｃｕｍ）　細胞のカルシウム取込みと、典型的な非同調
性の短い栄養細胞のカルシウム取込みとを比較したもの
である。図のそれぞれに示した曲線Ａ１〜Ａ４によって
解かるように、カルシウムの取込みは溶媒生産細胞を安
定化し、そして続いて生産される溶媒の高濃度から細胞
を保護する。一方、過剰のカルシウム添加前の、非同調
性の、図の曲線Ｂで代表される細胞は典型的な短い栄養
細胞のままであり、高濃度のカルシウムを取込まず、し
かも酸産生的である。しかしながら酸産生細胞であって
も、３５℃への温度変更を起すことによって細胞分裂を
４５時間目で停止させた時、細胞は伸張し、溶媒生産性
であり、カルシウムの取込みの増加が見られた。

【００４２】

【実施例】

実施例Ｉ この実施例は野性型クロストリジウムサーモサッカロリ
テイカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｓａｃ
ｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）　（ＡＴＣＣ）＃７９５６
を用いた細胞の数と量に関する同調培養及び培養中の細
胞分裂の改変に関する好ましい方法の説明である。

【００４３】えんどう汁（Ｐｅａ　Ｂｒｏｔｈ）６個の
乾燥アラスカえんどう種子を２％ペプトン溶液１０ｍｌ
の中で１５分オートクレーブされ、直ちに殺菌バスパー
（ｓｔｅｒｉｌｅ　ｖａｓｐｅｒ）２ｍｌで覆われた。

【００４４】保存培養 対数増殖期にあるクロストリジウムサーモサッカロリテ
イカムをえんどうまめ汁に接種後、５６℃８時間インキ
ュベーションを行なった。この保存培養は４℃で保存し
、保存培養は３〜６月の間隔で植継ぎを行った。保存培
養は５６℃、１２時間のインキュベーションで活性化さ
れる。

【００４５】回分培養 １ｍｌの活性化された培養は回分培養として用いるため
、新鮮な基礎培地１０ｍｌに移植した。

【００４６】基礎培地 １リットル水中に ０．２％ペプトン ０．５％酵母抽出物 ０．０１％ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ ０．１％（ＮＨ２　）　４　ＳＯ４　 ０．０１％ＭｇＳＯ４　 ０．０１％ＭｎＳＯ４　・Ｈ２　Ｏ ０．０００５％ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ０．０００５
％ＣｕＳＯ４　・５Ｈ２　Ｏ０．０００１％（ＮＨ４　
）　６　Ｍｏ７　Ｏ２４・４Ｈ２　Ｏ ０．００００５％ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ０．０００
００２％パラーアミノ安息香酸０．０００１％チアミン
塩酸塩 ０．００００００１％ビオチン チアミン塩酸塩とビオチンはロ過による滅菌後、オート
クレーブした培地に加えられた。０．５％（重量／体積
）キシランが炭素源として加えられた。培地のｐＨは１
ＭのＮａＯＨで７．０に調整殺菌された。培地は５６℃
でプレインキュベートされた後１日以内に用いられた。

【００４７】方法 全ての方法はハンゲイト法（ｔｈｅ　Ｈａｎｇａｔｅ　
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて嫌気性条件で行なわれた
。保存培養を活性化し、プレインキュベートした炭素源
として０．５％キシランを含む基本培地に移植し、５６
℃、６時間インキュベートした。その時の細胞の密度は
約３×１０８　細胞／ｍｌであった。培養液の１ｍｌを
新鮮な、プレインキュベートされたキシラン基本培地の
１０ｍｌに無菌的に移植した。そして再び回分培養で５
６℃で培養した。４時間後、培養は約１×１０８　細胞
／ｍｌの細胞密度に達した。培養液の１ｍｌを、予めプ
レインキュベートされた少なくとも約４．３％（０．１
Ｍ）グルコン酸カルシウムが補足されているキシラン基
本培地の１００ｍｌに無菌的に移植した。培養は段階希
釈ボトル中に移植され、嫌気性の保持を確実にするため
滅菌パラフィンオイル４０ｍｌを重層した。培養は５６
℃、１５０ｒｐｍでロータリーウオーターバス振盪器中
でインキュベートした。 ４５時間後、培養は約２×１０９　細胞／ｍｌに達した
。

【００４８】これらの溶媒生産細胞は２２，０００×ｇ
３０分間遠心分離され、滅菌蒸留水に再懸濁、この操作
を都合３回繰り返した。細胞はこの状態で固定化に直ち
に用いることができ、４℃で保存された。

【００４９】細胞は条件を変えて、細胞の全数、個々の
細胞長、胞子嚢数そして屈折性胞子の数を決定するため
ペトロフハウザー計数器を用いて顕微鏡下で別々に計数
された。４００倍の倍率のオリンパス位相差顕微鏡が用
いられた。菌の形態は１、０００倍で確認した。

【００５０】培養の上清溶液は、フレームイオン化検出
器とストゥリップーチャート記録器を備えたヒュレット
ーパッカードＧＬＣ、モデル５７００を用いて液体ガス
クロマトグラフィー分析を行なった。一次代謝物は１０
％ＳＰ−１０００／１％　　Ｈ３　ＰＯ４　（スペルコ
、インク．）で被覆された１００／１２０クロモソルブ
ＷＡＷでパックされたステンレススチールカラム（１．
８２ｍで０．３１ｃｍの直径）で分離した。カラムは４
８時間２００℃で前調整された。分析のための、投入口
の温度は２００℃であり、検出器の温度は２５０℃であ
った。 精製窒素を４０ｍｌ／ｍｉｎの流速でキャリアーガスと
して用いた。水素と圧縮空気の流速は各々３０と３００
ｍｌ／ｍｉｎであった。エレクトロメーターのレンジは
１６と１０のレンジの減衰で１０−１１　Ａ／ｍｖでセ
ットされた。１０マイクロリッターのサンプルの注入後
、炉温は２分間８０℃に保たれた。次に８℃／分の割合
で１７０℃まで上昇させ、２分間保持した。代謝産物の
パーセンテージは、標準物質の対照ピークから計算し、
ミリモラー濃度に換算した。

【００５１】測定とＧＬＣ分析のためのサンプルは培養
液を３０分間２２００×ｇで遠心分離し、細胞と培地を
分離して得た。細胞は無菌蒸留水に再懸濁し、そしてこ
の方法を３回繰返した後、ペレットを５ｍｌの滅菌蒸留
水に再懸濁し、超音波破壊を行なった。９０％の細胞が
破壊されていることを位相差顕微鏡で確認した。

【００５２】ヒュレットパッカード９０００コンピュー
ターと自動サンプラーを備えたモデル４００ダイオネッ
クスイオンクロマトグラフがイオンクロマトグラフ分析
に用いられた。陽イオンはＣＳ−１カラムで分離された
。ナトリウム、アンモニウムそしてカリウムのための溶
出液は８ｍＭのＨＣｌと１ｍＭの２，３−ジアミノプロ
ピオシ酸で２．０ｍｌ／分であった。マグネシウムとマ
ンガンそしてカルシウムの溶出液は４８ｍＭのＨＣｌと
８ｍＭの２，３−ジアミノプロピオン酸で０．８ｍｌ／
ｍｉｎで行なわれた。陰イオンは１．９２ｍＭの炭酸ナ
トリウムと２．４ｍＭの重炭酸ナトリウムの溶出液を用
いてＡＳ４Ａカラムで分離された。

【００５３】結果 キシラン培地で６時間以内に、繰返し移植し、同調化し
た培養を、引続きキシランの存在下に、過剰のグルコン
酸カルシウムを補強した培地で４５時間成長させた培養
は、細胞の大きさと細胞数において高い同調性を示した
。細胞についての別々の計数では細胞の大きさにおいて
６９．３％同調しそして細胞数において７６．７％同調
していることが明らかにされた。これら同調性で溶媒生
産細胞の９０％以上は最低４倍には伸長し、そして修飾
された異常な細胞分裂の様相を示し、それは栄養細胞の
４倍の長さまで伸長していることである。屈折性胞子の
数は殆ど見られなかった。

【００５４】実施例ＩＩ 実施例Ｉの方法を基本的には繰返したが、最初の保存培
養の１：１０希釈のインキュベーション後に、新鮮で、
プレインキュベートしたキシラン基本培地で１：１０希
釈の第２インキュベーションを行なうことが異なってい
る。この希釈後再び５６℃で回分培養した。４時間後培
養は約１×１０８　の細胞密度に到達した。そして以降
は実施例Ｉの方法を踏襲した。これらの同調化細胞の９
０％以上は最低４倍以上伸長し、修飾された細胞分裂を
示すものとして、これらは少なくとも栄養細胞長の４倍
の長さの基準長に伸長したままの状態で保持されている
。 屈折性胞子の数は殆ど見られなかった。

【００５５】実施例ＩＩＩ 実施例Ｉの方法が基本的には踏襲されたが次の部分で異
なる：培養４５時間後、アイスバス中に培養を浸すこと
によって３５℃に下げ、そして３５℃のロータリーイン
キュベーターに移して培養した。培養は３５℃で、さら
に１３５時間（全インキュベーション時間は１８０時間
）インキュベートされた。１８０時間後、培養は約２×
１０９　細胞／ｍｌの細胞密度に達した。この方法で調
製された細胞はブタノール：エタノール割合が２：１で
ある溶媒１０．６％を生産した。

【００５６】細胞数と同調性との相関及び対応する溶媒
濃度との関係が図５に示されている。曲線Ａは全細胞計
数を示し、伴って同調性はパーセンテージとして弓型に
示される。曲線Ｂは生産された溶媒の絶対濃度を示し、
アルコール量は体積／体積当りで示されている。全ミリ
モル溶媒濃度は個々の溶媒（アセトン、ブタノール、エ
タノール、イソプロパノールそしてメタノール）の濃度
の総和である。

【００５７】溶媒は発酵の最初から生産されるけれども
、曲線Ｂに示される全ミリモル濃度は、曲線Ａに示され
る同調性成長期間中は比較的低い。温度が４５時間のイ
ンキュベーション後３５℃に変更された時、停止し、伸
長した細胞は時間とともに溶媒生産が増大し、１１５時
間で全濃度は３．６％、１３０時間で濃度は６．３％に
増大し、１４５時間でさらに９．８％に増大した。最も
高い溶媒濃度１０．６％は１７５時間後に観察された。

【００５８】実施例ＩＶ 実施例ＩＩＩ　の方法に以下の部分が改変された：温度
低下に続いて培養は３５℃で１５５時間（全２００イン
キュベーション時間）インキュベートされた。２００時
間後培養は２×１０９　細胞／ｍｌの細胞密度に達した
。この方法で調製された細胞はブタノール：エタノール
の割合１：１で溶媒６．５％を生産した。

【００５９】実施例Ｖ 実施例ＩＩＩ　の方法に以下の部分が改変された：温度
低下に続いて培養は３５℃で２００時間（全２４５イン
キュベーション時間）インキュベートされた。２４５時
間後培養は２×１０９　細胞／ｍｌの細胞密度に達した
。この方法で調製された細胞はポリミキシン、バチトラ
シンのような抗生物質、アミラーゼのような炭水化物分
解酵素、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ；パラ
スポー様蛋白質結晶及び屈折性で成熟したフリーの胞子
を有意な量生産した。

【００６０】実施例ＶＩ 実施例Ｉの方法に以下の部分が改変された；４５時間後
温度が７０℃のロータリーインキュベーターに培養を移
すことによって７０℃に上げられた。培養は７０℃でさ
らに１３５時間インキュベートされた（全インキュベー
ション時間は１８０時間）。１８０時間後培養は約２×
１０９　細胞／ｍｌの細胞密度になった。この方法で調
製された細胞はブタノール：エタノール比２：１で溶媒
１０．６％を生産した。

【００６１】実施例ＶＩＩ 実施例ＶＩの方法をもとに以下の部分を改変して行った
；培養を７０℃に上昇させた後培養は７０℃でさらに１
５５時間インキュベートされた（全インキュベーション
時間は２００時間）２００時間後、培養は２×１０９　
細胞／ｍｌの細胞密度に到達した。この方法で調製され
た細胞はブタノール：エタノール比１：１で溶媒６．５
％を生産した。

【００６２】実施例ＶＩＩＩ 実施例ＶＩの方法をもとに以下の部分を改変して行った
；７０℃に上昇させた後培養を７０℃でさらに２００時
間インキュベートし（全インキュベーション時間は２４
５時間）２４５時間後、培養は２×１０９　細胞／ｍｌ
の細胞密度に到達した。この方法で調製された細胞は抗
生物質、炭水化物分解酵素、パラスポロー様蛋白質結晶
、そして屈折性、成熟したフリーの胞子を生産した。

【００６３】実施例ＩＸ 以下の点を除いて実施例Ｉの方法が繰返された：４５時
間後クロラムフェニコールが細胞分裂を防ぐため２０マ
イクロモルの最終濃度に加えられた。培養をさらに２７
時間インキュベートした（全インキュベーション時間は
７２時間）。２７時間後培養は約２×１０９　細胞／ｍ
ｌの細胞密度に達した。この方法で調製された細胞はブ
タノール：エタノール比２：１の溶媒１０．６％を生産
した。

【００６４】実施例Ｘ クロラムフェニコールの添加後、培養をさらに４２時間
インキュベートする（全インキュベーション時間は８７
時間）以外は実施例ＩＸの方法が繰返された８７時間後
培養は細胞密度２×１０９　細胞／ｍｌに達した。この
方法で調製された細胞はブタノール：エタノール比１：
１である溶媒６．５％を生産した。

【００６５】グルコン酸カルシウムを補強したキシラン
基本培地中でインキュベートされた同調培養における個
々の細胞によるカルシウム取込みを図３に示す。最も高
い溶媒生産は曲線Ａ１〜Ａ４に示すように最も高いカル
シウム取込みを示す。細胞分裂は曲線Ａ１においてはク
ロラムフェニコールの添加によって４５時間で停止した
。曲線Ａ２ではナリジクス酸、曲線Ａ３ではマイトマイ
シン、そして曲線Ａ４ではアクリジンオレンジの添加に
よって停止された。曲線Ａ２のナリジクス酸で処理され
た細胞は７２時間の培養で溶媒７．１％を生産した。 そして３．１６２ナノモルの最も高いカルシウム取込み
を示した。アクリジンオレンジを同じ培地内で同調細胞
に添加すると、曲線Ａ４に示されるように、溶媒濃度は
８．１％に達し、カルシウム取込みは１．１６３ナノモ
ルであった。曲線Ｂは同じ培地内でインキュベートされ
た同調細胞内の個々の細胞によるカルシウム取込みを示
す。

【００６６】実施例ＸＩ 炭酸カルシウム１．１％（０．１Ｍ）を含有するキシラ
ンの胞子形成培地が用いられたことを除いて実施例Ｉの
方法が繰返された。４５時間後細胞は大きさと数におい
て高い同調性を示した。細胞について別々の測定では細
胞の大きさで４８．８％の同調性をまた細胞数では５６
．３％の同調性を示した。これらの同調化、溶媒生産細
胞の９０％以上が最小４倍に伸長し、そして修飾された
細胞分裂を示し、これらは少なくとも４倍の長さの栄養
細胞長の基準長に伸長したままの状態で保持されている
。屈折性、成熟したフリーの胞子は認められなかった。

【００６７】実施例ＸＩＩ ４５時間後、培養をアイスバス中に浸しさらに３５℃の
ロータリーインキュベーターに移すことによって３５℃
に下げた以外は実施例ＸＩの方法を繰返した。培養を３
５℃でさらに２００時間（全培養時間は２４５時間）イ
ンキュベートした。２４５時間後、培養は約２×１０９
　細胞／ｍｌに達した。この方法で調製された細胞は抗
生物質、炭水化物分解酵素、パラスポロー様蛋白質結晶
、そして屈折性、成熟したフリーの胞子を生産した。

【００６８】実施例ＸＩＩＩ ４５時間後、培養を７０℃のロータリーインキュベータ
ーに移すことによって７０℃に上げた以外は実施例ＸＩ
Ｉ　の方法が繰返された。培養は７０℃でさらに２００
時間（全培養時間は２４５時間）インキュベートされた
。２４５時間後、培養は約２×１０９　細胞／ｍｌに達
した。 この方法で調製された細胞は抗生物質、炭水化物分解酵
素、パラスポロー様蛋白質結晶、そして屈折性、成熟し
たフリーの胞子を生産した。

【００６９】実施例ＸＩＶ ４５時間後、さらに細胞分裂を防ぐためナルジクス酸を
２０マイクロモルの最終濃度になるように加えられた以
外は実施例ＸＩの方法を繰返した。培養はさらに２７時
間（全培養時間は７２時間）インキュベートされた。２
７時間後、培養は約２×１０９　細胞／ｍｌに達した。 この方法で調製された細胞は溶媒を殆ど生産せず、抗生
物質、炭水化物分解酵素、パラスポロー様蛋白質結晶、
そして屈折性、成熟したフリーの胞子を生産する。

【００７０】炭酸カルシウムを補強したキシラン基本培
地内で培養された同調性培養内の個々の細胞によるカル
シウム取込みを図４に示す。これらの細胞は高濃度の溶
媒を生産しないけれども曲線Ａ１〜Ａ４に示すように高
いカルシウム取込みと関連した最も高い溶媒生産（０．
２〜０．４％）を示す。細胞分裂は曲線Ａ１においてク
ロラムフェニコールの、曲線Ａ２においてナリジクス酸
、曲線Ａ３においてマイトマイシン、そして曲線Ａ４に
おいてアクリジンオレンジの添加によって４５時間で停
止された。曲線Ａ２のナリジクス酸で阻害された同調性
細胞は７２時間で１２、４９２ナノモルのカルシウム取
込みをし、そして細胞の４０〜４５％はステージＩＶか
らＶの胞子形成を示す最後の膨張の兆候を示した。対照
的に曲線Ａ４のアクリジンオレンジで阻害された同じ培
地内の同調細胞は７５４ナノモルのカルシウムを取込み
溶媒０．４％を生産した。曲線Ｂは同じ培地内で培養さ
れた非同調性培養物中への個々のカルシウム取込みを表
す。

【００７１】実施例ＸＶ 唯一の炭素源として少なくとも４．３％グルコン酸カル
シウムを含む胞子形成培地が用いられた以外は実施例Ｉ
の方法が繰返された。４５時間後培養は約２×１０９　
細胞／ｍｌに達した。この方法で生産された細胞は高度
に伸張し、溶媒生産性を示した。屈折性、成熟しフリー
胞子あるいは屈折性胞子嚢は有意な量生産されなかった
。

【００７２】実施例ＸＶＩ ４５時間後、培養をアイスバス中に浸し、３５℃に下げ
、さらに３５℃のロータリーインキュベーターに移して
培養する以外は実施例ＸＶの方法が繰返された。培養を
３５℃でさらに１３５時間（全培養時間は１８０時間）
インキュベートした。１８０時間後、培地は約２×１０
９　細胞／ｍｌに達した。この方法で調製された細胞は
ブタノール：エタノール比２：１の溶媒１０．６％を生
産した。

【００７３】実施例ＸＶＩＩ 温度を低下させた後、細胞をさらに１５５時間（全培養
時間は１９５時間）インキュベートした以外は実施例Ｘ
Ｖの方法が繰返された。１９５時間後、培地は約２×１
０９　細胞／ｍｌに達した。この方法で調製された細胞
はブタノール：エタノール比１：１の溶媒６．５％を生
産した。

【００７４】実施例ＸＶＩＩＩ ４５時間後、温度７０℃のロータリーインキュベーター
に培養を移すことによって７０℃に上げた以外は、実施
例ＸＶの方法が繰返された。培地を７０℃でさらに１３
５時間インキュベートした（全インキュベーション時間
は１８０時間）。１８０時間後培地は約２×１０９　細
胞／ｍｌの細胞密度になった。この方法で調製された細
胞はブタノール：エタノール比２：１である溶媒１０．
６％を生産した。

【００７５】実施例ＸＩＸ 温度上昇後細胞がさらに１５５時間（全培養時間は１９
５時間）インキュベートされた以外は実施例ＸＶＩＩＩ
　の方法が繰返された。１９５時間後、培養は約２×１
０９　細胞／ｍｌに達した。この方法で調製された細胞
はブタノール：エタノール比で１：１である溶媒６．５
％を生産した。

【００７６】実施例ＸＸ ４５時間後細胞分裂を防ぐためにクロラムフェニコール
を２０マイクロモルの最終濃度になるように加えた以外
は実施例ＸＶの方法が繰返された。培養はさらに２７時
間インキュベートした（全インキュベーション時間は７
２時間）。２７時間後培養は２×１０９　細胞／ｍｌの
細胞密度に達した。この方法で調製された細胞はブタノ
ール：エタノール比２：１である溶媒１０．６％を生産
した。

【００７７】実施例ＸＸＩ クロラムフェニコールの添加後、培養をさらに４２時間
インキュベートした以外は実施例ＸＶの方法が繰返され
た（全インキュベーション時間は８７時間）。８７時間
後培養は２×１０９　細胞／ｍｌの細胞密度に達した。 この方法で調製された細胞からの溶媒はブタノール：エ
タノール比１：１である溶媒６．５％を生産した。

【００７８】グルコン酸カルシウム培地中でインキュベ
ートされた同調培養物中の個々の細胞によるカルシウム
取込みを図５に示す。溶媒生産のピークとカルシウム取
込みとの間の関連性を曲線Ａ１〜Ａ４に示す。細胞分裂
は曲線Ａ１においてはクロラムフェニコールの、そして
曲線Ａ２ではナリジクス酸、曲線Ａ３ではマイトマイシ
ン、そして曲線Ａ４ではアクリジンオレンジの添加によ
って２６時間で停止された。曲線Ａ２のナリジクス酸で
処理された同調性細胞は７２時間の培養で９．１％の溶
媒を生産した。そして１，９４０ナノモルのカルシウム
取込みを示した。曲線Ｂは同じ培地内でインキュベート
された同調細胞内の個々の細胞によるカルシウム取込み
を示す。

【００７９】実施例ＸＸＩＩ 唯一の炭素源として少なくともグルコン酸カルシウム４
．３％を含む基本培地が用いられた以外は実施例Ｉの方
法が繰返された。２６時間後培養は約２×１０９　細胞
／ｍｌに達した。この方法で生産された細胞は高度に伸
張し、溶媒生産性であった。屈折性、成熟しフリー胞子
あるいは屈折性胞子嚢は有意な量生産されなかった。

【００８０】実施例ＸＸＩＩＩ ２６時間後、培養をアイスバス中に浸し、温度を３５℃
に下げ、そして３５℃のロータリーインキュベーターに
移すこと以外は実施例ＸＩＩ　の方法が繰返された。培
養は３５℃でさらに１３５時間（全培養時間は１８０時
間）インキュベートされた。１８０時間後、培養は約２
×１０９　細胞／ｍｌに達した。この方法で調製された
細胞はブタノール：エタノール比２：１である溶媒１０
．６％の溶媒を生産した。

【００８１】実施例ＸＸＩＶ 温度を低下させた後、細胞をさらに１５５時間（全培養
時間は１９５時間）インキュベートする以外は実施例Ｘ
ＸＩＩの方法が繰返された。１９５時間後、培養は細胞
密度約２×１０９　細胞／ｍｌに達した。この方法で調
製された細胞はブタノール：エタノール比１：１である
溶媒６．５％を生産した。

【００８２】実施例ＸＸＶ ２６時間後、培養を７０℃のロータリーインキュベータ
ーに移すことによって７０℃に上げられた以外は実施例
ＸＸＩＩの方法が繰返された。培養はさらに１３５時間
（全培養時間は１８０時間）３５℃でインキュベートさ
れた。１８０時間後、培養は細胞密度約２×１０９　細
胞／ｍｌに達した。この方法で調製された細胞はブタノ
ール：エタノール比２：１である溶媒１０．６％を生産
した。

【００８３】実施例ＸＸＶＩ 温度を上昇させた後、培養を７０℃でさらに１５５時間
（全培養時間は１９５時間）インキュベートする以外は
実施例ＸＸＶ　の方法が繰返された。１９５時間後、培
養は約２×１０９　細胞／ｍｌに達した。この方法で調
製された細胞はブタノール：エタノール比１：１の溶媒
６．５％を生産した。

【００８４】実施例ＸＸＶＩＩ ２６時間後、クロラムフェニコールを細胞分裂を防ぐた
め２０マイクロモルの最終濃度になるように加えた以外
は実施例ＸＸＩＩの方法が繰返された。培養はさらに２
７時間インキュベートされた（全インキュベーション時
間は７２時間）。２７時間後培養は２×１０９　細胞／
ｍｌの細胞密度に達した。この方法で調製された細胞は
ブタノール：エタノール比２：１である溶媒１０．６％
を生産した。

【００８５】実施例ＸＸＶＩＩＩ クロラムフェニコールの添加後さらに４２時間インキュ
ベートされた（全インキュベーション時間は８７時間）
以外は実施例ＸＸＩＩの方法が繰返された。８７時間後
、培養は２×１０９　細胞／ｍｌの細胞密度に達した。 この方法で調製された細胞はブタノール：エタノール比
１：１である溶媒６．５％を生産した。

【００８６】細胞増殖の期間、成長培地を被覆するため
の油性材料の使用は、２次的炭素源を提供すると同時に
細胞の成長のための嫌気性環境を維持するためにも使わ
れ、２重の機能を有する。パラフィンオイルのような飽
和炭化水素は合理的なコストで利用でき、油性試薬とし
て好ましい。さらに成長培地上に乗せるパラフィンオイ
ルの使用は発酵のために用いられる標準的な容器となる
。普通の冷却装置、エアレーションそして攪拌手段を備
え付けた過大な発酵装置の必要性が小さくなる。本方法
において、成長培地のゆっくりした機械的攪拌は油性層
の粘着特性と酸素除去の干渉しない条件下に適当である
。上部が開口しているコンクリート、金属、或いは木製
の容器がこの観点から適当であり、既存の構造が利用で
きる。

【００８７】同様に要求される唯一の外部エネルギーは
、要求されるレベルに、例えば、クロストリジウム　　
サーモサッカロリテイカムの場合は約５６℃に成長培地
温度を上げることであるという事実に基づいて、温度は
太陽熱から得られる熱エネルギーが多くの場合適してお
り、特にもし成長培地が太陽に露光される金属壁のある
容器に導入されることが適当であろう。炭素源が、パル
プ工場からの廃液の場合、その液は一般に少なくとも約
９０℃の温度で工場から排出される。従ってここで述べ
た発酵過程の開始前に望ましいレベルに冷やすことが唯
一の必要なことである。

【図面の簡単な説明】

【図１】胞子のみ、胞子プラス溶媒生産細胞、及び溶媒
生産細胞のみの産生のための選択経路の概略図を示す。

【図２】グルコン酸カルシウムを補強したキシラン基本
培地中でインキュベートされた培養による、同調成長、
溶媒の生産、そしてパラフィンオイル（それぞれ曲線Ａ
，Ｂ，Ｃ）の利用の相関関係を示したものである。

【図３】グルコン酸カルシウムを補強したキシラン基本
培地内でインキュベートされた同調培養中の個々の細胞
によるカルシウム取込みを示したものである。

【図４】炭酸カルシウムを補強したキシラン基本培地内
でインキュベートされた同調培養中の個々の細胞による
カルシウム取込みを示したものである。

【図５】グルコン酸カルシウム培地内でインキュベート
された同調培養中の個々の細胞によるカルシウム取込み
を示したものである。

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　炭素源から得られ、そして溶媒、酵素
   、抗生物質、有用な毒性蛋白質及び胞子からなる群より
   選択される代謝最終産物を生産するために有用な、次の
   工程よりなる、特別に調製された細菌の調製方法：その
   中に少なくとも約１×１０６　細胞／ｍｌのクロストリ
   ジウム属（ｇｅｎｕｓ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の細
   菌を含む成長培地中に、ゆっくり代謝される炭素源を加
   えること、該細菌は遺伝的に予め定められた条件下で炭
   素源を代謝して該溶媒、酵素、抗生物質、蛋白質及び胞
   子から選択される代謝産物を生産することができるもの
   であること、該細胞を安定化するため２価陽イオンの少
   なくとも約０．０１Ｍを加えること、そして、該細胞数
   の増加とその効果量とを次の（ａ）〜（ｃ）によって同
   調化する間に、少なくとも基準長の約３倍に細胞伸張を
   誘導すること、（ａ）種特異的最適成長温度の約−２０
   ℃から＋１０℃の範囲に成長培地を維持している間に、
   該成長培地中で初期濃度の２〜３倍にだけ増殖するよう
   に細胞を継代培養すること、（ｂ）その後、工程（ａ）
   の範囲内の温度に維持され、該細胞の同調成長を実質的
   にさまたげるのに充分な量の細胞代謝産物の欠けている
   成長培地中で前記濃度の２〜３倍にだけ細胞をさらに増
   殖するよう、再び細胞を継代すること、（ｃ）その後該
   細胞を安定化するため少なくとも約０．０１Ｍの２価陽
   イオンを添加して工程（ｂ）の該成長培地中で前の濃度
   の少なくともさらに約２倍に増殖するよう細胞を再び継
   代すること；そして工程（ｃ）から得られる細胞を細胞
   分裂を阻害する条件で処理すること。
2. 【請求項２】　　工程（ｃ）が、該２価陽イオン源の少
   なくとも約０．０１Ｍから約０．２Ｍを添加することを
   含む請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】　　工程（ｃ）が、該２価陽イオン源を少
   なくとも約０．１Ｍ添加することを含む請求項１に記載
   の方法。
4. 【請求項４】　　該細胞数の増加と効果量との同調が次
   の工程（ｄ）及び（ｅ）によって達成される請求項１に
   記載の方法： （ｄ）工程（ｃ）の代り工程（ｂ）を繰返すこと、そし
   て（ｅ）再び該細胞を安定化するため２価陽イオン源を
   添加するとともに工程（ｂ）を再び繰返すこと、そして
   その後、それらの以前の濃度の少なくとも２倍にさらに
   増殖するため細胞を再び継代すること；そして工程（ｅ
   ）から得られる該細胞を細胞分裂を阻害する条件を受け
   させること。
5. 【請求項５】　　工程（ｃ）から得られる細胞に細胞分
   裂を阻害する処理条件を受けさせる工程が抗生物質を添
   加することを含むものである請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】　　抗生物質が、クロラムフェニコール、
   マイトマイシン、ナリジクス酸及びアクリジン　　オレ
   ンジからなる群より選ばれるものである請求項５記載の
   方法。
7. 【請求項７】　　工程（ｃ）から得られる細胞に細胞分
   裂を阻害する処理条件を受けさせる工程が、工程（ａ）
   で特定される範囲以下に該細胞の温度を低下させること
   を含むものである請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】　　工程（ｃ）から得られる細胞に細胞分
   裂を阻止する処理条件を受けさせる工程が、工程（ａ）
   で特定された範囲以上に該細胞の温度を上昇させること
   を含むものである請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】　　成長培地中の炭素源が、最適成長培地
   中の該細菌の最大成長速度Ｋｍよりも少なくとも約１０
   ％以下であるところのものである請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】　　成長培地がペントースポリマーを実
    質的な割合で含有するものである請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】　　成長培地が、アミグダリン、アラビ
    ノース、セロビオース、ガラクトース、グリコーゲン、
    メロビオース、α−メチルグルコシド、β−メチルグル
    コシド、ラフィノース、サラシン、澱粉、トレハロース
    、キシラン、酢酸カルシウム、ラク酸カルシウム、クエ
    ン酸カルシウム、ギ酸カルシウム、グルコン酸カルシウ
    ム及び乳酸カルシウムよりなる群から選択されるゆっく
    り代謝される炭素源を実質的な割合で含有している請求
    項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】　　成長培地が、麦わら、稲わら、籾殻
    、とうもろこし茎及びとうもろこし芯、鋸屑、木片、セ
    ルロース及びヘミセルロース残渣よりなる群から選択さ
    れる出発物質を実質的な割合で含有する培地である請求
    項１記載の方法。
13. 【請求項１３】　　該２価陽イオン源が、マグネシウム
    、マンガン、鉄、亜鉛及びカルシウムよりなる群から選
    択される陽イオンを含むものである請求項１記載の方法
    。
14. 【請求項１４】　　該２価陽イオン源が有機カルシウム
    化合物である陽イオンを含むものである請求項１記載の
    方法。
15. 【請求項１５】　　該２価陽イオン源がグルコン酸カル
    シウム、乳酸カルシウム、酢酸カルシウム、ラク酸カル
    シウム、ギ酸カルシウム、炭酸カルシウム及び硫酸カル
    シウムからなる群より選択されるものである請求項１記
    載の方法。
16. 【請求項１６】　　該２価陽イオン源がグルコン酸カル
    シウムである請求項１記載の方法。
17. 【請求項１７】　　請求項１の方法により得られる製品
    。
18. 【請求項１８】　　炭素源から得られ、溶媒、酵素、抗
    生物質、有用な毒性蛋白質及び胞子からなる群より選択
    される代謝最終産物を生産するために有用な、次の工程
    よりなる、特別に調製された細菌の調製方法：その中に
    少なくとも約１×１０６　細胞／ｍｌ以上のクロストリ
    ジウム属（ｇｅｎｕｓ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の細
    菌を含む成長培地中に、ゆっくり代謝される炭素源を加
    えること、該細菌は遺伝的に、予め定められた条件下で
    炭素源を代謝して該溶媒を生産することができるもので
    あること；該細胞数の増大とその効果量とを次の（ａ）
    〜（ｃ）の工程によって同調している間に、少なくとも
    基準長の約３倍に細胞の長さを誘導するものであること
    、（ａ）種特異的最適成長温度の約−２０℃から＋１０
    ℃の範囲の温度に培地を維持している間に、細胞を該成
    長培地中で少なくとも約２×１０５　／ｍｌ乃至約３×
    １０５　／ｍｌの濃度に達するまで単に増殖するように
    該細胞を継代すること、（ｂ）該細胞を含む成長培地の
    一部を除去し、そして新鮮な成長培地で約１：２〜約１
    ：１００にこの除去した成長培地を希釈すること、そし
    てその後、工程（ａ）の範囲中の温度に培地を維持して
    いる間に該培地中で少なくとも約２×１０６　／ｍｌ乃
    至約３×１０６　ｍｌになるまで細胞をさらに増殖だけ
    を行なうこと、（ｃ）その後該細胞を安定化するため２
    価陽イオン源の少なくとも約０．０１Ｍを添加して工程
    （ｂ）を約１：２〜１：５００の希釈で繰返し、その後
    、該培地内で少なくとも約２×１０６　／ｍｌの濃度に
    達するまでさらに細胞を増殖させること；そして工程（
    ｃ）から得られる細胞を細胞分裂を阻害する処置条件で
    処理すること。
19. 【請求項１９】　　工程（ｃ）が２価陽イオン源の少な
    くとも約０．０１Ｍから約０．２Ｍを含む請求項１８記
    載の方法。
20. 【請求項２０】　　工程（ｃ）が前記２価陽イオン源を
    少なくとも約０．１Ｍを含む請求項１８記載の方法。
21. 【請求項２１】　　該細胞の伸長、及び細胞数の増大と
    効果量との同調が次の工程によって達成される請求項１
    ８記載の方法： （ｄ）工程（ｃ）の代りに工程（ｂ）を繰返すこと、そ
    して（ｅ）細胞を安定化させるため２価陽イオンの添加
    とともに約１：２〜１：５００に希釈して工程（ｂ）を
    繰返すこと、そしてその後再び該培地中で少なくとも２
    ×１０６　／ｍｌの濃度に達するまで該培地をさらに増
    殖させること、工程（ｅ）から得られる細胞を細胞分裂
    を阻止する処理条件を受けさせること。
22. 【請求項２２】　　該細胞伸長、及び細胞数の増大とそ
    の効果量との同調が、次の工程（ｅ）及び（ｆ）によっ
    て達成される請求項１７記載の方法： （ｅ）成長培地から該細胞の分離及び新鮮な成長培地に
    それを再懸濁すること、その後、工程（ａ）の範囲内の
    温度にその培地の温度を維持している間に該細胞が少な
    くとも約４×１０６　／ｍｌから約６×１０６　／ｍｌ
    の濃度に達するまで再び細胞の増殖だけを行なうこと；
    そして （ｆ）該細胞が少なくとも約４×１０６　／ｍｌの濃度
    に達するまで工程（ｅ）を繰返すこと。
23. 【請求項２３】　　分離工程が遠心分離によって実施さ
    れる請求項２２記載の方法。
24. 【請求項２４】　　分離の工程が膜口過によって実施さ
    れる請求項２２記載の方法。
25. 【請求項２５】　　請求項１８の方法によって得られる
    産物。
26. 【請求項２６】　　アルコール類を含む溶媒を生産する
    ための発酵方法に有用な、次の工程よりなる、特別に調
    製された細菌の調製方法：クロストリジウム属（ｇｅｎ
    ｕｓ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）細菌が少なくとも約１
    ×１０６　細胞／ｍｌその中に含まれている成長培地中
    に、ゆっくり代謝される炭素源を加えること、該細菌は
    予め定められた条件下で遺伝的に炭素源を代謝して該溶
    媒を生産することができるものであること；該細胞数の
    増大とその効果量とが次の工程によって同調している間
    に、少なくとも基準長の約３倍に細胞の伸張を誘導する
    ものであること；（ａ）種特異的最適成長温度の約−２
    ０℃から＋１０℃の範囲内の温度にそのような培地を維
    持して細胞を維持している間に約１．０から１．５世代
    だけ該培地中で細胞が増殖するように継代すること、（
    ｂ）その後再び、工程（ａ）の範囲内の温度を維持し、
    該細胞の同調成長に実質的にさまたげるに充分な量の細
    胞代謝物を避けた成長培地で約１．０から１．５世代だ
    けさらに細胞を増殖するように継代すること、（ｃ）該
    細胞を安定化するため２価陽イオン源の少なくとも約０
    ．０１Ｍの添加とともに工程（ｂ）を繰返すこと、そし
    てその後再び少なくとも約１．０世代さらに増殖を行な
    うこと；そして工程（ｃ）から得られる細胞に細胞分裂
    を阻害する処置条件を行なうこと。
27. 【請求項２７】　　工程（ｃ）が少なくとも該２価陽イ
    オン源約０．０１Ｍから約０．２Ｍを加えてなる請求項
    ２６記載の方法。
28. 【請求項２８】　　工程（ｃ）が少なくとも約０．１Ｍ
    の該２価陽イオン源を加えてなる請求項２６記載の方法
    。
29. 【請求項２９】　　該細胞の伸張、及び該細胞の増大と
    その効果量の同調が次の工程によって達成される請求項
    ２６記載の方法： （ｄ）工程（ｃ）の代りに工程（ｂ）を繰返すこと、そ
    して （ｅ）該細胞を安定化するため２価陽イオン源を添加し
    て工程（ｂ）を繰返すこと；そして工程（ｅ）から得ら
    れる細胞に細胞分裂を阻害する処理条件を受けさせるこ
    と。
30. 【請求項３０】　　請求項２６の方法で得られる産物。
31. 【請求項３１】　　炭素源から得られ、溶媒、酵素、抗
    生物質、有用な毒性蛋白質、及び胞子よりなる群から選
    択される代謝最終生産物を生産するために有用な、次の
    工程よりなる特別に調製された細菌の調製方法：その中
    にクロストリジウム属（ｇｅｎｕｓ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
    ｉｕｍ）の細菌を少なくとも約１×１０６　細胞／ｍｌ
    含む成長培地中に、ゆっくり代謝される炭素源を加える
    こと、該細菌は予め定められた条件下で遺伝的に炭素源
    を代謝して該溶媒、酵素、抗生物質、蛋白質及び胞子か
    ら成る群より選択される代謝産物を生産できるものであ
    ること；連続した継代培養及び種−特異的最適成長温度
    の約−２０℃乃至＋１０℃の範囲の温度で希釈すること
    により、そして細胞増殖がそれぞれの継代培養の間最初
    の細胞濃度の２乃至３倍を越えないようなそれぞれの継
    代培養時間行なうことによって該細胞数の増大と効果量
    とを同調している間に、少なくとも基準長の３倍に細菌
    細胞を同調伸長することを含むこと；そして少なくとも
    ２価陽イオン源の約０．０１Ｍを加えることによって最
    終細胞増殖期間中細胞を安定化させること。
32. 【請求項３２】　　成長培地中で増殖している細胞の嫌
    気性成長条件が成長培地上に油性物質層を被覆すること
    によって達成され、そして同様に２次的に炭素源として
    も使われる請求項３１記載の方法。
33. 【請求項３３】　　該油性物質がパラフィンオイルであ
    るところの請求項３２記載の方法。
34. 【請求項３４】　　成長培地内の細胞の増殖の間、その
    上の油性層の密封性を壊す酸素をさまたげること無しに
    成長培地を機械的に攪拌する工程を含む請求項３２記載
    の方法。