JPH04360680A - 培地、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ｐａｐ　遺伝子が導入
されたバチルス属微生物の培養に好適な培地、およびペ
プチド又は蛋白質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近年
、微生物を培養して酵素などの有用物質を製造する方法
が検討されている。この方法において、エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　　ｃｏｌｉ）やバチ
ルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｂｒｅｖｉｓ）
を、グリシンやイソロイシンを添加した培地で培養する
と、分泌される蛋白質の量が増加することが報告されて
いる［ジャーナル・オブ・ファーメンターション・アン
ド・バイオエンジニアリング（Ｊ．　Ｆｅｒｍｅｎｔ．
　Ｂｉｏｅｎｇ．），　６８，　２４３，　１９８９　
、アグリカルチュアル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），
　４４，　１０５，　１９８０］。また、特開昭６１−
８１７７５号公報には、好アルカリ性バチルス細菌やパ
ン酵母を、グリシンやマンガン塩を添加した培地で培養
すると、蛋白質の全生産量が増大し、しかも菌体外への
分泌効率が向上することが報告されている。

【０００３】しかしながら、遺伝子組換え技術を利用し
て、微生物により異種由来のペプチドや酵素などの蛋白
質を生産させる場合、有用物質の生産量が増大すること
は知られていない。

【０００４】従って、本発明の目的は、バチルス属微生
物を宿主とし、異種由来の有用なペプチド又は蛋白質を
効率よく多量に製造する上で好適な培地、およびペプチ
ド又は蛋白質の製造方法を提供することにある。

【０００５】

【発明の構成】本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭
意検討した結果、ｐａｐ　遺伝子が導入されたバチルス
属微生物を宿主とし、可溶性デンプン、マンガン塩の少
なくとも一方を添加した培地で培養すると、異種由来の
有用物質の生産量が増大することを見いだし、本発明を
完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、ｐａｐ　遺伝子が導
入されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物を培養
する培地であって、可溶性デンプンおよびマンガン塩の
少なくとも１つの成分を含む培地を提供する。

【０００７】また、本発明は、ペプチド又は蛋白質をコ
ードする遺伝子を含むプラスミドにより、ｐａｐ　遺伝
子が導入されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物
を形質転換し、可溶性デンプンおよびマンガン塩の少な
くとも１つの成分を含む培地で培養し、ペプチド又は蛋
白質を回収するペプチド又は蛋白質の製造方法を提供す
る。

【０００８】本発明の培地は、種々のバチルス属微生物
の培養に適用できるが、バチルス属微生物としては、人
体への寄生やエンドトキシンなどの毒素の生産がなく、
ペプチドや蛋白質を菌体外に分泌する能力を有するバチ
ルス・ズブチリス（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ
）が好ましい。

【０００９】バチルス属微生物に導入されたｐａｐ　遺
伝子は、バチルス・ズブチリスのα−アミラーゼ、及び
プロテアーゼの生産性を同時に増大させる遺伝子として
知られている［バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．）
，　５０，　７６５，　１９７３　］。このｐａｐ　遺
伝子をプロテアーゼ生産性の低いバチルス・ズブチリス
に導入すると、逆に、プロテアーゼ生産性がさらに低い
バチルス・ズブチリスが得られる（特開平１−３７２８
４号公報）。従って、ｐａｐ　遺伝子はプロテアーゼ生
産性の低いバチルス・ズブチリスに導入されているのが
好ましい。

【００１０】ｐａｐ　遺伝子が導入された菌株には、例
えば、バチルス・ズブチリスＤＹ−１６株（微工研菌寄
第９４８８号）、特願平１−２８１４４０号において本
発明者らが提案したように、バチルス・ズブチリス１０
４ＨＬ株（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケーションズ，　１２８，　６０
１，　１９８５）にｓｐｏ　０ＡΔ６７７　変異遺伝子
を導入したバチルス・サブチリスＳＰ０１１株（微工研
菌寄第１０９８７号）、バチルス・サブチリスＤＹ−１
６株にｓｐｏ　ＯＡ△６７７　変異遺伝子を導入したバ
チルス・サブチリスＳＰＬ１４株（微工研菌寄第１０９
８８号）などが含まれる。

【００１１】このようなバチルス属微生物は、異種由来
のペプチド又は蛋白質を生産させるため、ＤＮＡ組換え
菌株として繁用される。

【００１２】前記異種由来のペプチド又は蛋白質は、そ
の構造遺伝子の上流にバチルス属微生物において機能す
る、発現のための制御部位であるプロモータ、リボソー
ム結合部位、さらに必要ならば分泌シグナルが結合した
ＤＮＡ断片と、バチルス属微生物において複製可能なベ
クターＤＮＡとが結合した発現プラスミドを構築できる
限り、特に限定されない。

【００１３】ペプチド及び蛋白質には、例えば、インス
リン、α，β，又はγ−インターフェロン、インターロ
イキンＩ，ＩＩ，ＩＩＩ、ガストリン、各種オピオノイ
ドペプチド、上皮細胞成長因子、エンドセリン、バソア
クティブ・インテスティナル・ポリペプチド［Ｖａｓｏ
ａｃｔｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｐｏｌｙｐｅｐ
ｔｉｄｅ　（ＶＩＰ）］、心房性利尿ホルモン（ＡＮＰ
）、サブスタンスＰ、カルシトニン、インシュリン様成
長因子Ｉ，ＩＩ、ガラニン、モチリン、バソプレシンな
どの各種の生理活性ペプチドまたはこれらの前駆体；β
−ラクタマーゼ、ヒルジン、エグリンＣ、分泌性白血球
由来プロテアーゼインヒビターなどの阻害剤、ヒトアル
ブミン、血液凝固因子、リンフォカイン、神経成長因子
、肝細胞再生因子などの各種の分化誘導因子、成長因子
などの蛋白質またはこれらの前駆体が含まれる。

【００１４】ベクターとしては、例えば、スタフィロコ
ッカス属由来のプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＨＹ３００
ＰＬＫ、ｐＣ１９４、ｐＢＤ６４、ｐＥ１９４、ｐＳＡ
Ｏ５０１、ｐＴ１２７およびこれらの誘導体が挙げられ
る。これらのプラスミドを有するバチルス・ズブチリス
は、いずれもオハイオ大学バチルスストックセンター（
住所：４８４，　Ｗｅｓｔ　１２ｔｈ　Ａｖｅｎｕｅ，
　Ｃｏｌｕｍｕｓ　Ｏｈａｉｏ，　４３２１０　Ｕ．Ｓ
．Ａ．）から入手できる。

【００１５】前記発現プラスミドは、慣用の遺伝子操作
技術、例えば制限酵素を用いて切断したＤＮＡとベクタ
ーＤＮＡとをリガーゼを用いて連結する制限酵素法、リ
ンカー法などにより調製できる。

【００１６】なお、前記ペプチド又は蛋白質をコードす
る構造遺伝子の上流にキャリアーを連結し、ペプチド又
は蛋白質を融合蛋白質として生産してもよい。キャリア
ーとしては、例えば、α−アミラーゼ、中性又はアルカ
リ性プロテアーゼ、セルラーゼ、β−ラクタマーゼ、β
−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ、ＲｅｃＡ蛋白質、ｔｒｐＥ、ヒトイ
ンターロイキン−２、ヒト成長ホルモン、ジヒドロ葉酸
還元酵素、プロテインＡ、λｃＩＩ、アルカリフォスフ
ァターゼ、ペニシリナーゼなどの全部又はその一部；こ
れらの誘導体が挙げられる。

【００１７】好ましいキャリアーには、黄色ブドウ状球
菌［スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　］由来のプロテイン
Ａなどが含まれる。黄色ブドウ状球菌のプロテインＡに
は、遺伝子の発現に関与するプロモーター、リボソーム
結合部位、分泌シグナル及びタンパク質をコードする領
域が含まれている。

【００１８】さらに、融合蛋白質は、複数のペプチド又
は蛋白質がタンデムに結合したタンデム型融合蛋白質と
して生産してもよい。この場合、複数のペプチドをコー
ドする遺伝子の構築、各遺伝子断片の連結には、慣用の
遺伝子操作法が利用できる。その際、大腸菌の宿主ベク
ターなどを利用することもできる。

【００１９】前記発現プラスミドにより、ｐａｐ　遺伝
子が導入されたバチルス属微生物を形質転換すると、ペ
プチド又は蛋白質を生産する微生物が得られる。前記プ
ラスミドによる宿主微生物の形質転換は、慣用の方法、
例えば、チャン（Ｃｈａｎｇ）　らのプロトプラスト化
法［Ｃｈａｎｇ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．
　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　１６８，　１１１−１１
５　（１９７９）］などを利用して行なうことができる
。

【００２０】このような微生物を、本発明の培地で培養
すると、ペプチド又は蛋白質の生産量が著しく増大する
。しかも、ｐａｐ　遺伝子が導入された宿主微生物はプ
ロテアーゼ生産性が低いので、分泌発現したペプチド又
は蛋白質の分解を著しく抑制できる。

【００２１】本発明の培地は、慣用の培養に使用される
培地に可溶性デンプン、マンガン塩の少なくとも一方の
成分が添加されている。培地としては、微生物が増殖し
得る限り、合成培地、天然培地のいずれも使用でき、そ
の種類は問わない。培地の炭素源としては、例えば、グ
ルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン
、デンプンなどの糖類；ソルビトール、エタノール、グ
リセロールなどのアルコール類；フマル酸、クエン酸、
コハク酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその
塩類；パラフィンなどの炭化水素類；これらの混合物な
どが使用できる。窒素源としては、例えば、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの
無機酸のアンモニウム塩；フマル酸アンモニウム、クエ
ン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩；肉エ
キス、酵母エキス、麦芽エキス、トリプトン、ペプトン
、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、尿素
などの無機又は有機含窒素化合物；これらの混合物が使
用できる。培地には、無機塩、微量金属塩、ビタミン類
などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加しても
よい。また、必要に応じて、培地には、微生物の増殖を
促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質などを
添加してもよい。

【００２２】可溶性デンプンやマンガン塩の添加量は、
微生物の生育を阻害せず、しかもペプチド又は蛋白質の
生産量が増大する範囲で適当に選択できる。前記可溶性
デンプンの添加量は、例えば、培地に対して１．０〜５
．０重量％、好ましくは１．０〜３．０重量％程度であ
る。マンガン塩の種類は、特に制限されないが、水可溶
性塩、例えば、塩化マンガン、硫酸マンガン、硝酸マン
ガン、酢酸マンガン、クエン酸マンガン、チオシアン酸
マンガンなどが挙げられる。マンガン塩の添加量は、例
えば、培地に対して１０〜７５０μＭ、好ましくは５０
〜５００μＭ程度である。

【００２３】前記可溶性デンプンとマンガン塩は単独で
使用してもよいが、併用することにより、ペプチド又は
蛋白質の生産量が相乗的に増大する。

【００２４】前記形質転換された宿主微生物を培養する
ことにより前記ペプチド又は蛋白質が産生する。宿主微
生物の培養は、生育に適した条件下、慣用の液体培養法
、例えば、振盪培養又は通気撹拌培養法により行なうこ
とができる。培地のｐＨは、例えば、６．５〜８．５、
好ましくは７〜８程度である。培養は、微生物の培養に
採用される通常の条件、例えば、嫌気的又は好気的条件
下、温度１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、培養
時間６〜１２０時間程度の条件で行なうことができる。

【００２５】産生したペプチド又は蛋白質は、慣用の方
法、例えば、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法な
どの慣用の分離精製手段により、単離精製できる。なお
、ペプチド又は蛋白質が菌体内やペリプラズムに蓄積さ
れる場合には、慣用の方法、例えば、菌体を破砕するこ
とにより、ペプチド又は蛋白質を得ることができる。

【００２６】

【発明の効果】本発明の培地および方法によれば、バチ
ルス属微生物を宿主とし、異種由来の有用なペプチド又
は蛋白質を効率よく多量に製造できる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００２８】参考例１ バチルス・ズブチリスＳＰＬ１４株の作製ｓｐｏ０Δ６
７７　変異遺伝子、及びリンコマイシン耐性遺伝子（以
下、Ｌｉｎｒ　という）を有するバチルス・ズブチリス
ＡＴＣＣ３９０９６株を、ＬＢ培地（１．０重量％トリ
プトン、０．５重量％酵母エキス、０．５重量％ＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．５）を用いて、温度３７℃で対数増殖期ま
で振盪培養した。次いで、培養液５０ｍｌ中に含まれる
菌体を集め、斎藤・三浦の方法［バイオチム・バイオフ
ィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　
Ａｃｔａ），　７２，　６１９，１９６３　］により染
色体ＤＮＡを抽出精製した。得られた染色体ＤＮＡを用
いて、コンピテントセル形質転換法によりバチルス・ズ
ブチリスＤＹ−１６株を形質転換した。

【００２９】そして、得られた形質転換株を、５μｇ／
ｍｌのリンコマイシンを含むＬＢ寒天平板培地上に塗布
し、Ｌｉｎｒ　が導入された株を選択した。その結果、
約８００株のリンコマイシン耐性株を得た。次いで、以
下の指標に従って、これらの形質転換株から胞子成形欠
損株を分離した。

【００３０】指標１．胞子形成培地に形質転換株を塗布
し、そのコロニーがメラニン色素性生産能を失ったこと
２．温度８０℃、１０分間の熱処理に耐性を示さないこ
と ３．顕微鏡検査により胞子成形を認めないことさらに、
得られた胞子形成能欠損株のプロテアー活性を測定し、
プロテアーゼ活性の低い株を、以下の方法で選別した。

【００３１】先ず、１．０重量％のカゼインを含むＬＢ
寒天平板培地に、胞子形成能欠損株と親株であるＤＹ−
１６株とを別々に植菌し、温度３７℃で２４時間培養し
た。菌体が分泌するプロテアーゼによりカゼインが分解
されるので、カゼインの分解により形成される菌体の回
りのクリアゾーン（Ｈａｌｏ）の大きさを指標として、
ＤＹ−１６株よりもプロテアーゼ生産能が低下した菌株
を分離した。次に、これらの株をＬＢ培地１０ｍｌを用
いて一晩培養した後、培養液１ｍｌを遠心分離し、その
上清に存在するプロテアーゼの活性を、ＦＩＴＣ−カゼ
イン（シグマ社製）を基質として測定した。すなわち、
０．２％のＦＩＴＣ−カゼイン、１００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭ塩化カルシウムを含む基質液
１００μｌに、プロテアーゼを含む上清試験溶液１００
μｌを添加し、３７℃で３時間反応させた。反応終了後
、反応液に、２００μｌの７．５％トリクロロ酢酸を添
加して反応を停止し、遠心分離により得られた上清液を
、５００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で中和
した後、励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２５ｎｍの螢
光を測定した。

【００３２】プロテアーゼ活性は、カゼインから１分間
に１μｍｏｌのチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶
性ペプチドを遊離する酵素活性を１Ｕとし、プロナーゼ
（科研製薬製）を標品として算出した。その結果、プロ
テアーゼ活性が親株のＤＹ−１６株に比べて極端に低下
した４株を得、それぞれ、バチルス・ズブチリスＳＰＬ
９、ＳＰＬ１１、ＳＰＬ１４、ＳＰＬ３９株とした。

【００３３】そして、これら４株のプロテアーゼ活性を
さらに詳しく測定するため、これらの菌株を１０ｍｌの
ＬＢ培地で１８時間培養した後、５０ｍｌのＭｅｄｉｕ
ｍＡ培地［ジャーナル・オブ・バクテオロジー（Ｊ．　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），　１６５，　７９６，　１９
８６］に菌体を移し、４８時間培養した後、培養上清液
について、上記と同様にしてプロテアーゼ活性を測定し
た。結果を表１に示す。

【００３４】

【表１】 なお、表中、ＯＤ６００　は、波長６００ｎｍにおける
培養液の吸光度を示す。また、割合は、親株であるＤＹ
−１６株のプロテアーゼ活性を１００としたときの相対
値を示す。

【００３５】表１より、これら４株のプロテアーゼ活性
は、親株のプロテアーゼ活性の１／２以下である。特に
、ＳＰＬ１４株のプロテアーゼ活性は、親株であるＤＹ
−１６株の約３％である。このＳＰＬ１４株は、遺伝子
マーカーｈｉｓ、ｌｅｕ、ｎｐｒＲ２、ｎｐｒＥ１８、
ΔａｐｒＡ３、Ｃｙｃ−ｒ、ｐａｐＳ、ｓｐｏＯＡΔ６
７７、ｌｉｎを有しており、遺伝子組換え実験において
宿主に要求される複数の栄養要求性を有している。

【００３６】参考例２ β−ラクタマーゼ分泌発現プラスミドｐＴＵＢ２９１の
構築 プラスミドｐＴＵＢ２９１を、図１に示す方法で構築し
た。すなわち、バチルス・スブチリス由来のα−アミラ
ーゼ遺伝子のプロモーターと、バチルス・アミロリキフ
ァシエンス（Ｂａｃｉｌｕｓ　　　ａｍｙｌｏｌｉｑｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）由来のα−アミラーゼ遺伝子のプロモ
ーターとをタンデムに有する、β−ラクタマーゼ分泌発
現プラスミドｐＴＵＢ２６１［ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．），　９９，
１１８１，　１９８６］を、制限酵素ＸｂａＩで切断し
た後、制限酵素ＨｉｎｆＩで部分切断し、長鎖断片を得
た。このＤＮＡ断片に、図２に示す塩基配列を有する合
成ＤＮＡ断片（バチルス・スブチリス由来のα−アミラ
ーゼ遺伝子のリボゾーム結合部位領域の配列）をＴ４　
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、β−ラクタマーゼ分泌
発現プラスミドｐＴＵＢ２９１を得た。

【００３７】参考例３ プロテインＡ−ＶＩＰ−ＧｌｙＬｙｓＡｒｇ融合蛋白質
分泌発現プラスミドの構築 （１）ＶＩＰ−ＧｌｙＬｙｓＡｒｇ（以下、ＶＩＰ−Ｇ
ＫＲという）遺伝子の構築 バチルス・ズブチリスを用いてペプチドを融合蛋白質と
して生産させるために、生理活性ペプチドＶＩＰの前駆
体であるＶＩＰ−ＧＫＲをモデルペプチドとして、その
遺伝子を化学合成した。ＶＩＰは、下記式［Ｉ］で示さ
れる２８個のアミノ酸残基からなるアミド体のペプチド
であり、サッド（ｓａｉｄ）とムット（Ｍｕｔｔ）によ
り、ブタ十二指腸粘膜から単離され、その構造が決定さ
れている［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１６９，　
１２１７，　１９７０］。

【００３８】 　　Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−　　Ａ
ｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ２　　　　
　　　　　　　　　　　［Ｉ］このＶＩＰの前駆体であ
るＶＩＰ−ＧＫＲの構造遺伝子を構築するため、ＶＩＰ
−ＧＫＲのアミノ酸配列に従って、対応する遺伝子コド
ンをバチルス・ズブチリスの使用頻度に合わせ、図３に
示す配列からなる合成ＤＮＡを作製した。

【００３９】得られた合成ＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩ
、ＳｐｈＩで切断したベクタープラスミドｐＵＣ１９と
、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プラスミドｐ
ＭＤ３２１ＫＲａを構築した（図４）。

【００４０】次いで、ｐＭＤ３２１ＫＲａ中に存在する
制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉ部位に、図５に示されるように
、合成ＤＮＡ（ＶＩＰ−ＧＫＲ）を挿入し、２つのＶＩ
Ｐ−ＧＫＲ構造遺伝子がタンデムに連なったプラスミド
ｐＭＤ３２１Ｒ２ＫＲａを構築した。上記と同様の操作
を繰返し、ＶＩＰ−ＧＫＲ構造遺伝子部分が３、４、５
個とタンデム化したプラスミドｐＭＤ３２１Ｒ３ＫＲａ
、ｐＭＤ３２１Ｒ４ＫＲａ、およびｐＭＤ３２１Ｒ５Ｋ
Ｒａを構築した（図５）。 （２）プロテインＡ−ＶＩＰ−ＧＫＲ融合蛋白質分泌発
現プラスミドの構築バチルス・ズブチリスを用い、ＶＩ
Ｐ−ＧＫＲをプロテインＡとの融合蛋白質として生産さ
せるため、以下の操作を行った。

【００４１】先ず、図６に示すＤＮＡ塩基配列からなる
バチルス・スブチリス由来のα−アミラーゼ遺伝子のプ
ロモーター・リボソーム結合部位・シグナル配列領域を
合成した。得られた合成ＤＮＡ、プロテインＡ遺伝子を
含むプラスミドｐＤＣＰ２４０（特開昭６３−２４５６
７７号公報）、及び上記（１）の操作により得られたプ
ラスミドｐＭＤ３２１ＫＲａ〜ｐＭＤ３２１Ｒ５ＫＲａ
を用いて、図７に示す方法でプロテインＡ−ＶＩＰ−Ｇ
ＫＲ融合蛋白質分泌発現プラスミドｐＭＤ５１０〜ｐＭ
Ｄ５１０Ｒ５を構築した。

【００４２】実施例１ プラスミドｐＴＵＢ２９１によるβ−ラクタマーゼの分
泌生産 参考例２で構築したプラスミドｐＴＵＢ２９１を用いて
、バチルス・ズブチリス１０４ＨＬ株、及びＤＹ−１６
株を、チャン（Ｃｈａｎｇ）らの方法［モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃ．
　Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．），　１６８，　１１１，　１
９７９　］に従って形質転換した。

【００４３】得られた形質転換株１０４ＨＬ（ｐＴＵＢ
２９１）株、及びＤＹ−１６（ｐＴＵＢ２９１）株を、
ＬＧ培地（１．０重量％トリプトン、０．５重量％酵母
エキス、０．５重量％ＮａＣｌ、０．２重量％グルコー
ス、ｐＨ７．２）で３７℃、１６時間培養した。

【００４４】１００ｍｌのＬＧ培地に３．０重量％の可
溶性デンプンを添加した培地を入れた５００ｍｌの坂口
フラスコに、前記培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、１２
５ストローク／分で振盪培養した。培養開始から６時間
、１２時間後に培養液をサンプリングし、菌体濃度（波
長６００ｎｍにおける吸光度：ＯＤ６００　）を測定す
ると共に、培養液を遠心分離して得られた培養上清液中
のβ−ラクタマーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）を、ニトロセフィ
ンを用いる方法［アンチマイクロビアル・エイジェンズ
・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａ
ｇ．　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．），　１，　２８３，　１
９７２　］で測定した。結果を表２に示す。

【００４５】

【表２】 表２より、培地に可溶性デンプンを添加して培養すると
、培養上清液中のβ−ラクタマーゼ活性が増大し、かつ
その活性が安定に維持されていた。また、この傾向は、
１０４ＨＬ株よりも、ｐａｐ　遺伝子を導入したＤＹ−
１６株の方が顕著であった。

【００４６】実施例２ 融合蛋白質発現プラスミドによる融合蛋白質の分泌生産
参考例３で構築したプラスミドの中から、ＶＩＰ−ＧＫ
Ｒ遺伝子が５個タンデム化したプラスミドｐＭＤ５１０
Ｒ５を用いて、バチルス・ズブチリスＳＰＬ１４株をチ
ャン（Ｃｈａｂｇ）らの方法に従って形質転換した。

【００４７】得られた形質転換株ＳＰＬ１４（ｐＭＤ５
１０Ｒ５）株を、ＭｅｄｉｕｍＡ培地で３７℃で、１３
時間培養した。この培養液１２ｍｌを、下記の培地１．
２Ｌを入れたミニジャー（ビー・ブラウン社製）に植菌
し、温度３７℃、通気量１．２Ｌ／分、撹拌速度３００
〜６００ｒｐｍ　、ｐＨ６．８〜７．２の条件で培養し
た。

【００４８】（１）　ＬＧＳ培地（２．０重量％トリプ
トン、１．０重量％酵母エキス、１．０重量ＮａＣｌ、
０．５Ｍコハク酸Ｎａ、ｐＨ７．０） （２）　１００μＭになるように塩化マンガンを添加し
たＬＧＳ培地 （３）　１．０重量％可溶性デンプンを添加したＬＧＳ
培地（４）　１００μＭ塩化マンガンと１．０重量％可
溶性デンプンを添加したＬＧＳ培地 培養開始から１６時間、３２時間経過後に培養液をサン
プリングし、菌体濃度（波長６００ｎｍにおける吸光度
：ＯＤ６００　）を測定すると共に、培養液を遠心分離
して得られた培養上清液１０μｌをＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動終了後、ゲル
をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、デンシトメ
ーター（アトー社製）を用いて、目的とするプロテイン
Ａ−ＶＩＰ−ＧＫＲ融合蛋白質の生産量を測定した。結
果を表３に示す。

【００４９】

【表３】 表３より、培地に可溶性デンプン、マンガン塩の一方を
添加して培養すると、融合蛋白質の生産量が増加する。 さらに、可溶性デンプンとマンガン塩の双方の成分を添
加して培養すると、生産量が相乗的に大幅に増加する。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＴＵＢ２９１の構築図である。

【図２】プラスミドｐＴＵＢ２９１の構築に用いた合成
ＤＮＡの塩基配列を示す図である。

【図３】ＶＩＰ−ＧＫＲを含む合成ＤＮＡの塩基配列を
示す図である

【図４】ｐＭＤ３２１ＫＲａの構築図である。

【図５】ｐＭＤ３２１Ｒ２ＫＲａ〜ｐＭＤ３２１Ｒ５Ｋ
Ｒａの構築図である。

【図６】ｐＭＤ５１０〜ｐＭＤ５１０Ｒ５の構築に用い
たα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター・リボソーム結
合部位・シグナル配列領域のＤＮＡ塩基配列を示す図で
ある。

【図７】ｐＭＤ５１０〜ｐＭＤ６１０Ｒ５の構築図であ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ｐａｐ　遺伝子が導入されたバチルス
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物を培養する培地であって
   、可溶性デンプンおよびマンガン塩の少なくとも１つの
   成分を含む培地。
2. 【請求項２】　　ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝
   子を含むプラスミドにより、ｐａｐ　遺伝子が導入され
   たバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物を形質転換し
   、可溶性デンプンおよびマンガン塩の少なくとも１つの
   成分を含む培地で培養し、ペプチド又は蛋白質を回収す
   るペプチド又は蛋白質の製造方法。