JPH0436185A - 融合抗原ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主！上図■反公国 本発明は、非Ａ　１１１−　Ｂ型肝炎（Ｃ型肝炎）関連
抗原に由来する抗原ポリペプチドと該抗原ポリペプチド
とは異種のポリペプチド（異種ポリペプチド）とが融合
した融合抗原ポリペプチド、該融合抗原ポリペプチドを
コードするＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミド、該
組換え体プラスミドを含む微生物を用いる融合抗原ポリ
ペプチドの製造法および該融合抗原ポリペプチドを用い
た抗Ｃ型肝炎ウィルス抗体検出法に関する。抗原抗体反
応は、医療および学術分野の種々の領域において応用さ
れており、本発明の融合抗原ポリペプチドは幅広い分野
において用途が期待される。

の　′と。　占 Ｃ型肝炎は非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス［）Ｉｅｐａｔｉ　
ｔｉｓＣｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ　）またはｎｏｎＡ、　　
ｎｏｎＢ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ（ＮＡＮＢＶ
　）とも言うが、ここではＨＣＶを用いる。〕が原因ウ
ィルスと考えられており、ＨＣＶ感染の血清診断は、Ｃ
型肝炎の診断および輸血等によるＨＣＶ怒染の予防のた
めに重要な口ｎ床診断技術である。これは血清中のＨＣ
Ｖ関連抗原に対する抗体の有無を抗原抗体反応を利用し
て調べることにより、行われている。

チターらは、チンパンジー血清からのＨＣＶのクローン
化に成功し〔チコーら（Ｃｈｏｏ、　Ｑ、　−Ｌ、。

ｅｔ　ａｌ　）サイエンス（５ｃｒｅｎｃｅ　）　　２
４４　、　３５９−３６２（１９８９））、それにより
、Ｃ型肝炎診断検査薬が開発された〔クオら（Ｋｕｏ、
　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ　）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）　２４４　、３６２−３６４　（１９８９）　；ＥＵ
ＲＯＰＥＡＮ　ＰＡＴＥＮＴ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ
　０３１８２１６　）　。

Ｃ型肝炎患者血清からＨＣＶ関連遺伝子がクローン化〔
有馬ら、実験医学ＶＯ１，７，Ｎ（Ｌ２．　９４−１（
１１　（１９８９）　ｉ有馬ら、ガストロエンターロロ
ジア　ジャポニカ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉ
ａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　）ｌ、５４０−５４８（１９８
５））され、Ｃ型肝炎検査に用いられている。上記従来
法では、Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドと異種蛋白とを
融合させた融合抗原ポリペプチドを微生物で生産させて
使用している。融合させる異種蛋白として、チョーらは
、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄ
ｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ、以下ＳＯＤと略記する）を、有
馬らは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ　−ｇａｌ
ａｃｔｏｓｉｄａｓｅ。

以下β−ｇａｌ　と略記する）を用いている。

個人によっては、血清中には、これら異種蛋白に対する
自然抗体が存在しており、この抗体が、異種蛋白と反応
してしまう可能性がある。そのため診断検査薬のカット
オフ値が高値になるばかりではなく、検査に先立ってそ
の異種蛋白を血清に加えることにより、抗体に吸収をか
ける必要が生じ、操作が非常に煩雑になり、診断の正確
性の著しい低下をまねく場合がある。

このような場合、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅｓ
ｅｒｕｒａ　ａｌｂｕｍｉｎ　）などの担体に抗原ポリ
ペプチドを化学的に結合させた融合抗原ポリペプチド、
数種の抗原分子の混合物あるいは、病原体の粗抽出液が
用いられているが、融合抗原ポリペプチドのれているが
、抗原ポリペプチドの分子量、安定性、毒性の面から、
発現が困難な場合が多く、抗原ポリペプチドを安定かつ
安価に供給することはできない。

環ポリペプチドの製造法について研究をした結果、１種
以上のＣ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザケ成長ホ
ルモン（ｃｈｕｍ　ｓａｌｍｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏ
ｒｍｏｎｅ以下ｓＧＨと略記する）とがメチオニンを介
して融合した形の融合抗原ポリペプチドの製造法を確立
した。

本発明者らは、またこの融合抗原ポリペプチドを用いた
抗Ｃ型肝炎抗体検出法は、従来報告されている検出法で
は検出できない検体についても検出できることを確認し
、従来法より優れていることを見い出し本発明を完成す
るに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、Ｃ型肝炎関連抗原に由来する抗原ポリペプチ
ド（以下Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドと略記する）の
少なくとも１つと、該抗原ポリペプチドとは異種のポリ
ペプチド（以下異種ポリペプチドと略記する）の少なく
とも１つとが融合した融合抗原ポリペプチド、該融合抗
原ポリペプチド−をコードするＤＮＡを組み込んだ組換
え体プラスミド、咳組換え体プラスミドを含む微生物を
用いる融合抗原ポリペプチドの製造法および該融合抗原
ポリペプチドを用いた抗Ｃ型肝炎ウィルス抗体（抗ＨＣ
Ｖ抗体）の検出法を提供する。

本発明に用いるＣ型肝炎関連抗原ポリペプチドとしては
ＨＣＶ関連抗原であればいかなるものも用いることがで
きる。具体的にはＨＣＶ関連抗原として有馬らがクロー
ン化した、クローンＮα２、クローンＮα１８〔有馬ら
、ガストロエンターロロジア・ジャポニカ（Ｇａｓｔｒ
ｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ）坦、５
４０−５４８（１９８９））およびクローンＮα１４を
用いることができる。

これらクローンＮＯで示される抗原を以下Ｃ−２゜Ｃ−
１８およびＣ−１４と略記する。これら抗原のアミノ酸
配列およびそれをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列
を式１〜３に示す。

１０　　　　　２０　　　　．３υ　・　　　　　４υ
ＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧ
ＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧ　１　ｕＰｈｅ
Ｇ　ｌｎＧ　ｌ　ｕＬｙｓＬｙｓＧ　１ｙＧ　ｌ　ｕＡ
　１　ａｓｅｒＡｓｎＧ　１ｙＧ　１ｕＡ　ｌａ（式中
、記号は下記アミノ酸残基を示す。

Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｖａｌニバリン、Ｐｒｏニ
ブロリン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｔｈｒ：スレオニン
、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌｙニゲリシン、Ｇｌｕ：グル
タミン酸、Ｌｅｕ　：ロイシン、Ｇｌｎ：クルクミン、
Ａｒｇ：アルギニン、Ｍｅｔ：メチオニン、Ｌｙｓ　：
リジン、Ａｓｎ：アスパラギン、Ｓｅｒ：セリン、＾ｌ
ａ：ｌミニアラニンｓ：ヒスチジン、Ａｓｐ：アスパラ
ギン酸、Ｃｙｓ　ニジスティン、Ｔｒｐ：　）リプトフ
ァン、ヌクレオチド配列中Ａはアデニン、Ｔはチミン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシン残基をそれぞれ示す、以下
同じ） これら３種のクローンの取得方法は、以下の通りである
。まず材料としてＣ型肝炎患者の血漿を用いる。この血
漿よりＲＮＡを抽出し、ランダムプライマー法によりｃ
ＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡをｃ　ＤＮＡ　ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅＩ＋＋　λｇｔｌｌキット（アマ
ージャム社）を用いてｃＤＮＡライブラリィ−を作製す
る。このライブラリィ−をニトロセルローズ膜へ転写し
、ゑ、性肝炎回復期血清と慢性肝炎患者からの血清を大
腸菌菌体成分で吸収操作したものでイムノスクリーニン
グを行う。

これら３種のクローンの患者血清との反応性は、日本臨
床土ｉ、　　２７−３２　（１９９０）に記載の方法で
検出する。

ＨＣＶ関連抗原としては、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）２４４．３５９−３６２（１９８９）、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）　ＬＬｌ、　３６２−３６４　（１９
８９）、およびＥＵＲＯＰＩＡＮ　ＰＡＴＥＮＴ　ＡＰ
ＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　０３１８２１６に記載の抗原を用
いることもできる。

本発明に用いる異種ポリペプチドはヒト血清中の抗体と
特異的に反応せず、Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドと融
合した形で微生物により発現されるものならいかなるも
のも用いることができる。

具体的には、シロザケ成長ホルモン（ｓＧＨ）のポリペ
プチドが好適に用いられる。シロザケ成長ホルモンの配
列、遺伝的情報、製造法などについては、プロシイ−デ
ィング・オプ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、　、　ｉｌｌ、　
４３０６−４３１０（１９８５）、特開昭６１−１５６
９９　、同６１−９３１９６　、同６１−９３１９７お
よび同６１−２１（１１（１０に記載されている。

融合抗原ポリペプチドは、ＨＣＶ関連抗原が好ましくは
メチオニンを介して、分子量２（１００以上の異種ポリ
ペプチドに結合した融合抗原ポリペプチドをコードする
ＤＮＡを岨換えＤＮＡ技術により遺伝子の読みとりフレ
ームを合わせてベクターＤＮＡに組み込むことにより組
換え体プラスミドを造成し、これを用いて微生物を形質
転換させ、この形質転換微生物を培養し、培養物中に該
融合抗原ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該
融合抗原ポリペプチドを採取することにより得られる。

ベクターＤＮＡとしては挿入したＤＮＡが微生物中で発
現できるものならいずれでも用いることができる。好ま
しくは、適当なプロモーター、例えばトリプトファン（
ｔｒｐ系）、ラクトース（ｌａｃ系）のプロモーターを
持ち、その下流に目的ＤＮＡを挿入でき、しかもシャイ
ンダルガーノ配列と翻訳開始コドンとの間を適当な距離
、例えば６〜１８塩基数に［ｆｊしたプラスミドを用い
ることができる。

具体的に好適なベクターＤＮＡとしては、ｐＧＥＬｌ　
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２９、特開昭６ｌ−９３１９７）
、ｐＫＹＰｌｏ（特開昭５８−１１０６（１０）　、Ｐ
　Ｇ　ＨＡ　２　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４（１０、特開昭
６０−２２１０９１）などが挙げられる。

微生物としては、本発明の融合抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡが発現して、培養物中に該ポリペプチドを
生成蓄積できるものならいかなるものも用いることがで
きる。好適にはエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）に属する微生物明細書の浄書（
内容に変更なし） が用いられる。

以下、シロザケ成長ホルモンとＨＣＶ関連抗原とを結合
させた融合抗原ポリペプチドの製造法について具体的に
説明する。

シロザケ成長ホルモンとＨＣＶ関連抗原とをメチオニン
を介して結合させた融合抗原ポリペプチドは以下の工程
に従って製造される。

〔工程１）ＨＣＶ関連抗原およびリンカ−遺伝子の合成 まず、下記式４，５，６，７，８．９，１０゜１１．１
２，１３．１４，１５．１６，１７゜１８、および１９
で示されるＤＮＡを化学合成する。

５’　ＡＡＴＴＣＣＣＡＡ　ＣＧＣＧＴＣＧＧＣＴ　Ｔ
ＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＣＣＧＡＣＣＣＧ
ＣＧＣＴ　ＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧ　Ｇ　３　　　　　　
　（式４）％式％ ＧＧＧＣＣＡＡＧＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＧ　Ｇ　３’
　　　　　　　（式５）明細書の浄！（内容に変更なし
） ５’　ＡＡＴＴＣＣＧＡＧ＾＾ＣＡＡＧＡＣＣＡ　ＧＡ
ＴＡＡＡＡＡＣＣ＾＾＾ＧＡＣＡＧ＾＾ＣＡＣＡＡＣＡ
ＧＡＧ＾＾ＡＧ　３　　　　　　　　　　　（式６）％
式％ ＴＡＴＣＴＧＧＴＣＴ　ＴＧＴＴＣＴＣＧＧ　３’　　
　　　　　（式７）５゛＾ＣＧＡ＾＾＾ＧＡＡＧＣＡＣ
Ｃ＾＾ＴＣＧＣＡＧＧＣＧ＾＾ＧＣ＾＾＾ＡＡＣＧ＾＾
Ａ＾＾＾＾＾Ａ　ＡＡ＾＾＾＾＾ＧＧ　３’　　　　　
　（式８）％式％ ＣＧＡＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴ　３　　　　　　　　　
　　　（式９）５′＾ＡＴＴＣＣ＾＾Ｇ　　ＡＡＡＡ人
＾＾ＧＧＧ　　ＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＡ
ＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＧＡ　Ｃ３’　　　　　　　　　
　　（式１０）％式％ ＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴ　ＴＣＴＴＧＧ　　３’　　　　
　　　（式１１）明細書の浄書（内容に変更なし） ＡＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡ　ＧＧＴＡＣ
ＡＡＡＧＡ　ＡＡＡＡＧＡＡＡ＾＾ＡＣＧＧＣＡＡＣＡ
Ａ　　ＡＴ （式１２） 明細書の浄書（内容に変更なし） ＧＡＴＣＡＴＧＧＡＡ　　ＴＴＣＴＡＡＧＴＡＡ　　Ｇ
ＴＡＡＡ丁ＧＣＡ　　３’（式１８） ％式％ （式１３） ＡＡＣＣＣＡＧＧ　　ＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＧＣ
ＣＡＡＧＡＧ　　ＴＧＧＧＣＡＧＡＡ丁ＡＡＡＡＡＡＣ
ＴＧＧ　ＡＡＣ３’ （式１４） ％式％ （式１５） ＣＧＧＧＡＯＧ　　ＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡ　　ＣＧＣＡ
ＴＡＴＣＡＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡ＾ ０ＡＣＧＧ ３′ （式１６） ％式％ ＣＣ３（式１７） ５　丁ＴＴＡＣ丁　ＴＡＣＴＴＡＧＡＡＴ　　ＴＣＣＡ
Ｔ　　　３（式１９） （式中、Ａ、Ｇ、Ｃ，Ｔはそれぞれアデニン、グアニン
、シトシン、チミン塩基を有するデオキシオリゴヌクレ
オチドを表す、以下同じ）これらのＤＮＡの合成はリン
酸アミダイト法による固相合成法を用いて、ＤＮＡ自動
合成機により行う。

式４で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ４という）と式５で
表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ５という）から形成され
る二重ｔＮ　Ｄ　Ｎ　Ａを用いて、下記式２゜で表され
る二重鎖ＤＮＡ断片（以下遺伝子２ｏという）を持った
プラスミドを造成する。

明細書の浄８（内容に変更なし） （式中、ＥｃｏＲＩに向かう引出し線は、これらの制限
酵素による切断部位を示す。以下同じ）同様にして、式
６で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ６という）と式７で
表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ７という）から形成される
二重鎖ＤＮＡと、式８で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ
８という）と式９で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ９と
いう）から形成される二重１！１ＤＮＡとをリガーゼで
結合して、下記式２１で表される二重鎖ＤＮＡ断片（以
下遺伝子２１という）を持ったプラスミドを造成する。

明ａ８の浄書（内容に変更なし） 同様に式１０で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡｌ０とい
う）と式１１で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ１１とい
う）から形成される二重鎖ＤＮＡと、式１２で表される
ＤＮＡ　（以下ＤＮＡ１２という）と式１３で表される
ＤＮＡ　（以下ＤＮＡ１３という）から形成される二重
Ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａと、式１４で表されるＤＮＡ　（以下Ｄ
ＮＡ１４という）と式１５で表されるＤＮＡ　（以下Ｄ
ＮＡ１５という）から形成される二重鎖ＤＮＡと、式１
６で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ１６という）と、式１
７で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ１７という）から形
成される二重鎖Ｄ’ＮＡとをリガーゼで結合して、下記
式２２で表される二重鎖ＤＮＡ断片を持ったプラスミド
を造成する。

ＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡ　　ＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡ　　Ａ
’ｌＡＡししし八ｕｕ　　ハｈｈ＊ｈｈしｈｓハＴＴＴ
ＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴ　ＴＡＴＴＧＧ
ＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴ明細書の浄書（内容に変
更なし） ＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣＴＴＡ　ＴＴＴＴ
ＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＣＣ（式２２）ＥｃｏＲ
Ｉ 同様に式１８で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ１８とい
う）と式１９で表されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ１９とい
う）から形成される二重鎖ＤＮＡを用いて、下記式２３
で表される二重鎖ＤＮＡ断片（以下遺伝子２３という）
を持ったプラスミドを造成する。

これら合成したＤＮＡにより調製された二重鎖ＤＮＡ断
片は、各々、遺伝子２０はＣ−２からなるペプチドを、
遺伝子２１はＣ−１４からなるペプチドを、遺伝子２２
はＣ−１８からなるペプチドをコードしている塩基配列
を有している。遺伝子２３は、シロザケ成長ホルモンと
各クローンを明細書の浄書（内容に変更なし） 連結するためのリンカ−で、メチオニン、グルタミン酸
、フェニルアラニン、そのす（後に！止コドンをコード
している塩基配列を有しグルタミン酸、フェニルアラニ
ンをコードしている塩基配列は、ＥｃｏＲＩ認識サイト
となる。

〔工程２〕リンカーン遺伝子のｓＧＨ発現プラスミドへ
の組込み： 特開昭６１−９３１９７に記載された方法に従って製造
したｓＧＨ遺伝子の発現に用いるプラスミドｐｓＧＨＩ
Ｂ２を用いる。ｐｓＧＨＩＢ２のＢｇｌ　ＩＩ　−Ｐｖ
ｕ　Ｉ消化断片（約１．１７ｋｂ）とｐＳＧ）ＩＩＢ２
のＮｓｉ　Ｉ　−ＰｖｕＩ消化断片（約１．８０　ｋｂ
）と、ＤＮＡ１８、ＤＮＡ１９、とを混合しＤＮＡリガ
ーゼで二重鎖ＤＮＡ間を結合し、アミノ末端のメチオニ
ンとｓＧＨの１番目から１０３番目のアミノ酸からなる
ポリペプチドにメチオニンを介してグルタミン酸・、フ
ェニルアラニンが結合したポリペプチドをコードする遺
伝子を有するプラスミドｐｓＧＨＥ１を造成する（第１
図参照）。

式２４にｐｓＧＩ（Ｅｌが発現する融合ポリペプチド明
Ｍ書の浄書（内容に変更なし） のアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ配列およびＥ
ｃｏＲＩ認識サイトを示す。式中下線はリンカ−領域を
示す。

明細書の浄書（内容に変更なし） 〔工程３）　　ＨＣＶ関連抗原遺伝子のｓＧＨ発現プラ
スミドへの組み込み。

工程２で造成したｐｓＧＨＥｌをＥｃｏＲＩで切断後、
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔａｓｅ　（ＢＡＰ）で処理する。ついで旧ｎｄＩ［
［、Ｐｖｕｌで切断し、約３２０ｂ、のＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄ　［１断片と、約１．８　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−
Ｐｖｕ　■断片を単離する。　　ｐｓＧＨＥ　１を旧ｎ
ｄｌ　＋　Ｐｖｕｌで切断後、約８５０ｂｐの旧ｎｄｌ
［［−Ｐｖｕｌ消化断片を単離する。上記ＤＮＡ断片と
ＤＮＡ４〜ＤＮＡ５から形成される二重鎖ＤＮＡ断片を
ＤＮＡリガーゼで結合すると、プラスミドｐＳＧＨＥＣ
−２が得られる（第２図参照）。ｐＳＧＨＥＣ−２は、
ｐｓＧＨＥｌがコードするｓＧＨ遺伝子と、Ｃ−２がコ
ードしている遺伝子をメチオニンをコードする遺伝子を
介して保持する０式２５にｐＳＧＨＥＣ−２が発現する
融合抗原ポリペプチドのアミノ酸配列とそれをコードす
るＤＮＡ配列を示す０式中下線はＣ−２領域を示す。

（式２４） 明細書の浄書（内容に変更なし） ＴｙｒＰｒｏＳｅｒＧｌｎＴｈｒＬｅｕ口ｅＩｌｅＳｅ
ｒＡｓｎＳｅｒＬｅｕＭｅｔＶｉ明細書の浄書（内容に
変更なし） ら形成される二重鎖ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで結合
すると、プラスミドｐＳＧＨＥＣ−１４が得られる（第
３図参照）。ｐＳＧＩ（ＥＣ−１４は、ｐＳＧＨＥ　ｌ
がコードするｓＧＨ遺伝子さ、Ｃ−１４がコードしてい
る遺伝子をメチオニンをコードする遺伝子を介して保持
する。式２６にｐＳＧＨＥＣ−１４が発現する融合抗原
ポリペプチドのアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ
配列を示す。式中下線はＣ−（式２５） 工程２で造成したｐＳＧＨＥ　１をＥｃｏＲＩで切断後
、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓｅ　（ＢＡＰ）で処理する。ついで旧ｎｄ　
ｍ　、　ＰｖｕＩで切断し、約３２０ｂｐのＥｃｏＲＩ
　−Ｈｉｎｄ　Ｉ［［断片と、約１．８　ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−Ｐｖｕｌ断片を単離する。ｐｓＧＨＥ　１を旧ｎ
ｄｌ［ｌ　・、　Ｐｖｕ　Ｉで切断後、約８５０ｂｐの
Ｈｉｎｄ　ｍ　−Ｐｖｕ　ｌ消化断片を単離する。上記
ＤＮＡ断片とＤＮＡ６〜ＤＮＡ９か＾ＡＧＧＡＡＴＴＣ Ｗ上ゴ）互 （式２６） 明細書の浄書（内容に変更なし） 工程２で造成したｐＳＧＨＥ　ｌをＥｃｏＲＩで切断後
、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓｅ　（ＢＡＰ）で処理する。ついで旧ｎｄｌ
［Ｉ、　ＰｖｕＴで切断し、約３２０ｂｐのＥｃｏＲＩ
−Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片と、約１．８　ｋｂのＥｃｏＲＩ
　−Ｐｖｕｌ断片を単離する。　　Ｉ）ＳＧＨＥ　１を
旧ｎｄｌ［［、Ｐｖｕｌで切断後、約８５０ｂｐのＨｉ
ｎｄｌ［Ｉ　−Ｐｖｕ　Ｉ消化断片を単離する。上記Ｄ
ＮＡ断片とＤＮＡｌ０〜ＤＮＡ１７から形成される二重
＠ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで結合すると、プラスミ
ドｐＳＧＨＥＣ−１８が得られる（第４図参照）　、　
ｐＳＧＨＥＣ−１８は、ｐＳＧＨＥ　１がコードするｓ
ＧＨ遺伝子と、Ｃ−１８がコードしている遺伝子をメチ
オニンをコードする遺伝子を介して保持する０式２７に
ｐＳＧＨＥＣ−’１８が発現する融合抗原ポリペプチド
のアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示す０
式中下線はＣ−１８ｆｆｌｉ域を示す。

明細書の浄書（内容に変更なし） 〔工程４　）　　ｐＳＧＨＥＣ−１８（７）プロモー９
−’１ｔｌＪｐＳＧ）ＩＥＣ−１８を旧ｎｄｌ［［、Ｐ
ｖｕｌで切断後、約２．３６ｋｂのＤＮＡ断片を単離す
る。　ｐＫＹＰｌ　０をＨｉｎｄｌＩ［Ｐｖｕ　　ｒで
切断後、約１．ＯｋｂのＤＮＡ断片を単離する。上記Ｄ
ＮＡをＤＮＡリガーゼで結合すると、ｐＳＧＨＥＣ−１
Ｂ　Ｓが得られる（第５図参照）。ｐＳＧ）ＩＥＣ−Ｉ
　８Ｓは、ｐｓＧＨＥｃ　−１８（Ｄプロモーターを置
換したもので、ｓＧＨをコードする遺伝子と、Ｃ−１８
がコードしている遺伝子をメチオニンをコー明細書の浄
書（内容に変更なし） ドする遺伝子を介して保持する。　ｐＳＧＨＥＣ−１８
Ｓが発現する融合抗原ポリペプチドのアミノ酸配列とそ
れをコードするＤＮＡ配列は弐２７に示される０式中下
線は、Ｃ−１８ｗ４域を示す。

〔工程５）　　ＨＣＶ関連抗原遺伝子を２個以上もしく
は２種以上保持する発現ベクターの構築工程３で造成し
たｐＳＧＨＥＣ−１４を使用した代表例を示す、　ｐＳ
ＧＨＥＣ−１４をＰｓｔｌで切断する。ついで制限酵素
ＥｃｏＲＩで部分分解し、約１．４０ｋｂのＥｃｏＲＩ
−Ｐｓｔｌ断片と約１．８５ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｐｓ
ｔｌ断片を単離する。上記ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼ
で結合するとプラスミドｐｓＧＨＥｃ−１４１４が得ら
れる（第６図参照）、ρ５ＧＨＥＣ−１４１４は、ｐＳ
ＧＨＥ　１のｓＧＨをコードする遺伝子と、Ｃ−１４を
２個コードしている遺伝子をメチオニンをコードする遺
伝子を介して保持する０式２８にｐＳＧＨＥＣ−１４１
４が発現する融合抗原ポリペプチドのアミノ酸配列とそ
れをコードするＤＮＡ配列を示す０式中下線は、Ｃ−１
４が２連結した領域を示す、なおこの工程５により、種
類の違う抗原遺伝子の連結が可能と明細書の浄書（内容
に変更なし） なり、キメラ抗原作製に利用できる。

（式２８） 〔工程６〕　シロザケ成長ホルモンとＨＣＶ関連抗原が
結合した融合抗原ポリペプチドの生産と単離・精製 工程２、工程３、工程４、工程５で製造したプ明細書の
浄書（内容に変更なし） ラスミドｐＳＧＨＥ　１、ｐＳＧＨＥＣ−２、ｐＳＧＨ
ＥＣ−１４、ｐＳＧＨＥＣ−１８３，またはｐｓＧＨＥ
ｃ−１４１４を大腸菌に導入し、得られた形質転換大腸
菌を培地に培養して該培養物よりシロザケ成長ホルモン
とＨＣＶ関連抗原とが結合した融合抗原ポリペプチドを
採取する。大腸菌菌体内に生産された目的の融合抗原ポ
リペプチドは非水溶性の顆粒として存在する。

培養終了後、菌体を集め、これを破砕し、破砕液を遠心
分離し、シロザケ成長ホルモンとＨＣＶ関連抗原とが結
合した融合抗原ポリペプチドを含有する顆粒を分離する
。

以下、融合抗原ポリペプチドの精製法について説明する
。プラスミドｐＳＧＨＥ　１　、ｐＳＧＨＥＣ−２、ｐ
ＳＧＨＥＣ−１４、ｐＳＧＨＥＣ−１８Ｓ　、　ｐＳＧ
ＨＥＣ−１４１４を保持する大腸菌が生産する融合抗原
ポリペプチドは、それぞれ５ＧＨＥ　１．５ＧＨＥＣ−
２，５ＧＨＥＣ１４，５ＧＨＥＣ−１８Ｓ、　　５ＧＨ
ＥＣ１４１４と記す。

融合抗原ポリペプチドの精製 （１）融合抗原ポリペプチドの粗精製画分の調製粗精製
画分の調製は既知の方法を組合せることにより可能であ
るが、好ましくは下記の通りである。

融合抗原ポリペプチドが顆粒として生産された場合は、
特開昭６０−２４４２５９に示された方法にしたがって
顆粒を取得し、変性剤（好ましくは４Ｍ以上の尿素、ま
たは３Ｍ以上のグアニジン塩酸）を含む緩衝液（ｐ＋（
５〜１２）または可溶化側溶液（好ましくは５０％以上
のギ酸）に溶解する。その上清を必要に応じて変性剤ま
たは可溶北側存在下で精製後、変性剤又は可溶化剤を除
去し、粗精製画分とする。変性剤または可溶化側存在下
での精製および、変性剤または可溶化剤の除去は既知の
方法〔特開平１−１３１１９５、日本生化学合綴、生化
学実験講座１．タンパク質の化学■〔東京化学同人、Ｐ
、１１〜Ｐ、　３５４　（１９７６）、日本生化学合綴
、続生化学実験講座２．タンパク質の化学上、東京化学
同人、Ｐ、３〜１２、Ｐ、８〜ｌ　８６　（１９８７）
　）を組み合わせることによってできる。

融合抗原ポリペプチドが菌体内可溶性画分に生産された
場合は、待１ｆｌ＠６１−１６３４１３に示された方法
にしたがって菌体破砕後、その上清を粗精製画分とし、
融合蛋白質が培養上清に生産された場合は、遠心分離に
より培養上清を調製し、粗精製画分とする。

（２）融合抗原ポリペプチドの精製方法粗精製画分から
の融合抗原ポリペプチドの精製は既知の方法〔日本生化
学合綴、生化学実験講座１、タンパク質の化学■、東京
化学同人、Ｐ、１１〜３５４　、Ｐ、　８１−１８６　
（１９８７））を組み合わせることによって可能である
。

本発明は、また上記融合抗原ポリペプチドを用いる抗Ｈ
ＣＶ抗体検出法を提供する。

以下、融合抗原ポリペプチドを用いた抗ＨＣＶ抗体検出
方法について説明する。

本発明で用いる免疫学的方法としては、下記のものがあ
げられ、各文献記載の方法を用いて実施できる。

Ｏエンザイム・イムノアッセイ（以下ＥＩＡという） 酵素免疫測定法、医学書院、石川栄治ら、１９７８年、 Ｏラジオ・イムノアッセイ　（以下ＲＩＡという）免疫
血清学、医歯蘂出版、稲井真彌ら、１９８１年Ｏフルオ
レッセンス・イムノアッセイ（ツ下ＦＩＡという） 同　　　　　上 Ｏ逆受身凝集反応 同　　　　上 Ｏフィトヘマトアグリチネーション 同　　　　　上 Ｏレーザーネフロメトリ− 同　　　　　上 Ｏ免疫溶血反応（赤血球またはリボソームを用いる方法
） 同　　　　　上 Ｏパーティクルアグリチネーション 最新検査、医典社、ＶＯＬ、２　　Ｎｏ、２．１５１〜
１５７．１９８４、Ｇａｎｎ　　７５．８４５．１９８
４０ウエスタン・フ゛ロンティング ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡにおいては、均一系のみならず
、サンドインチ法などの不均一系の分析方法も可能であ
る。

具体例としてＥＩＡをサンドインチ法で行う例を下記に
示す。

融合抗原ポリペプチドをマイクロタイタープレートのウ
ェルにコーティングし、血清試料を適当な緩衝液たとえ
ば緩衝液Ａ　（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，１％ゼラ
チン、１％生血清アルブミンおよび０、　Ｉ　ＮａＮｘ
を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２
））で希釈した液をウェルに入れ、４〜３７°Ｃ１１時
間〜１週間静置し、適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂ（
０，（１５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，２）　）でウェルをよく洗浄する。

ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のＦａｂフラグメント
とホースラデイツシュパーオキシダーゼとを過沃素酸法
により結合させたコンジュゲートを適当な緩衝液、たと
えば緩衝液Ｂで希釈した液をウェルに入れる。４〜４５
°Ｃで１〜２４時間静Ｗ移、同じ緩衝液で洗浄する。つ
いで適当な基質溶液たとえばオルソ・フェニレンジアミ
ン基質溶液（０，（１２％、オルソ・フェニレンジアミ
ンおよび３５ｍＭ過酸化水素を含む１／１５Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，２））をウェルに入れ、１５
〜３７°Ｃで５〜６０分間靜置す装、　２ＮＨ２ＳＯ４
で反応を停止させ、室温で１〜１０分間放置後、マイク
ロクイタープレート用フォトメーターで４１０ｎｍおよ
び６（１０ｎｍにおける吸光度（０，Ｄ、　）を測定し
、前者の値から後者の値を差し引いた値を抗体値とする
。

ここに示した方法は一例示であり、抗体や基質液、発色
剤などの変更は、適宜行うことができる。

ウェスタン・プロッティング法で行う抗ＨＣＶ抗体測定
例を下記に示す。

精製された融合抗原ポリペプチドを直接レムリのサンプ
ルバッファーで加熱、溶解後、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲルで泳動する。同一ゲル上のｉ白ｉをニトロセルロ
ース膜に移した後、正常人血清、Ｃ型肝炎患者血清を用
いてウェスタン・プロッティング〔バーネット（Ｂｕｒ
ｎｅｔζ）、アナ−）Ｌｉ　　バイオケミカル（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１１２　、１９５（１９８１
）〕を行う。

上託組換えＤＮＡ技術における反応の条件は、−船釣に
下記のとおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１〜２０
μｇのＤＮＡを２〜２（１０ｍＭ（好ましくは１０−１
０−４Ｏのトリス−）１ｃ／！　（ｐ）１６．０〜９．
５好ましくはｐＨ７，０〜８．０）　、Ｏ〜２（１０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１またはＫＣＪ２．２〜３０ｍＭ（好ましく
は５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｆｚ　、Ｏ〜２０ｍＭの２−
メルカプトエタノールを含む反応液中で、制限酵素０．
１〜１（１０単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対して
１〜３単位）を用い、２０〜７０°Ｃ（至適温度は用い
る制限酵素により異なる）において、１５分間〜２４時
間行う。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、ＬＧ
Ｔ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによって
行う。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２（１０１ＩＩＭ（好ま
しくは１０〜４（１１）のトリス−）１ｉ（ｐＨ６，１
〜９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０　）　、２〜
２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍと）のＭｇＣｆ□、０
．１〜１０ｍＭ（好ましくは０．５〜２．０　ｍＭ）の
ＡＴＰ、１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のジ
チオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７°Ｃ（好ましくは
３〜２０’Ｃ）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜
２０時間）行う。

結合反応によって止したＭｌ換え体プラスミドＤＮＡは
、必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ・コ
ーエン（Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）　　ら：プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、）、ＵＳＡ、、６９　　、２１１０　（１９７２）
）によって、大腸菌に導入する。

組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から咳ＤＮＡの
単離は、セシウム・クロライド−エチジウム・プロミド
密度勾配超−遠心法〔デイ−・ビー・フレウェル（Ｄ、
　Ｂ、　Ｃｌｅｗｅｌｌ）　　ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オプ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、
　　ＵＳＡ。

旦２　、１１５９　（１９６９））あるいはバーンボイ
ム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）らの方法〔エイチ・シー・バー
ンボイム（Ｈ，Ｃ８Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら：ヌクレイッ
ク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、）ユ、　１５１３（１９７９）　）などを用い
て行う。

プラスミドＤＮＡを制氷酵素で消化後アガロースゲル電
気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動により
切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定する
必要があるときはマキサム・ギルバート法〔プロシーデ
ィング・オプ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オプ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、）、　ＵＳＡ　、ユ土、５６０（１９７７））また
はＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法
〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら：プロシーディング・オ
プ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　
ＬＩＳＡ：１４　、５４６３（１９７７）　ニアマージ
ャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）社　Ｍ１３クローニング・
アンド・シークエニ／シングー／’１ンドブツク（Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂ
ｏｏｋ　）ゴによって決定する。

本発明の融合抗原ポリペプチドは以下のとおりに製造で
きる。

すなわち、プラスミドを用いて大腸菌Ｗ３１１０ｓ　ｔ
ｒＡやＨＢＩＯＩを形質転換させ、アンピシリン耐性の
コロニーの中からプラスミドを有する大腸菌を選び出す
、プラスミドを有する大腸菌を培地に培養することによ
り培養物中に融合抗原ポリペプチドを生成させることが
できる。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに融合抗
原ポリペプチドの生産に好適なものならば合成培地、天
然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロース、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、Ｎ）１．ｃｆ。

（ＮＨ４）　ｔｓＯａ　、カザミノ酸、酵母エキス、ポ
リペプトン、肉エキス、バタトトリプトン、コーン・ス
テイープ・リカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ
２ＨＰＯ，、ＫＨ２ＰＯ，、ＮａＣｊ２　、　ＭｇＳＯ
４、ビタミンＢ１、ＭｇＣ１ｚなどが使用できる。

培養はｐＨ５，５〜８．５、温度１８〜４０°Ｃで通気
撹拌培養により行われる。

培養５〜９０時間で培養菌体中に該融合抗原ポリペプチ
ドが非水溶性の顆粒として蓄積するので、培養物から菌
体を集菌し、菌体を破砕し、破砕液を遠心分離して得ら
れる沈殿物よりゲル濾過カラムクロマトグラフィー　Ｈ
ＰＬＣ等を用いて該融合抗原ポリペプチドを採取する。

また該融合抗原ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レ
ムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）のサンプルバッファー〔レム
リ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）　、ネイチ＋　　（Ｎａｔｕｒ
ｅ　）２２７６８０（１９７０））に加熱、溶解後、５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ　）の方法：同上文献〕にかけ、クマシーブリリアン
トブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　
Ｂｌｕｅ　）色素〔バイオ・ランド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
）社製〕を用いて染色して行う。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例Ｉ　　ＤＮＡ４〜１９の製造 ＤＮＡ４〜１９の合成はリン酸アミダイト法による固相
合成法（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅら、テトラヘドロン
・レクーズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
　）　　２２工１８５９（１９８１）、Ｌ、　Ｊ、Ｍｃ
Ｂｒｉｅ　ら、同Ｉ土、　　２４５（１９８３））に従
い、アプライｌ−”／＼イオシステム社のＤＮＡ自動合
成ｉ３８’ＯＡを用いて下記のとおり行った。

シリカゲルを固相担体とし、これに３′水酸基ヲ介して
結合したヌクレオチドの５′水酸基に（１）ヌクレオチ
ドをリン酸アミダイト法により縮合しく２）縮合したヌ
クレオチドの亜リン酸結合を沃素で酸化してリン酸結合
にし、（３）縮合したヌクレオチドの５′水酸基上の保
護基をトリフルオロ酢酸で除去した６次に（１）の工程
に戻って次のヌクレオチドを同様に縮合した。こうして
（１）〜（３）の工程が繰り返されてＤＮＡが担体上に
合成された。合成終了後、ＤＮＡの結合した担体をチオ
フェノール溶液中に室温で１時間放置してリン酸の保護
基を除去した後、濃アンモニア水中に室温で１時間放置
してＤＮＡを担体から遊離させた。ＤＮＡを含む濃アン
モニア水を密封容器中６０°Ｃにて１２時間加熱して塩
基上の保護基を除去した。

ＤＮＡ４を例にとると、０．２μｍｏｌｅのヌクレオチ
ドの結合した担体を用いて合成を行い、次いで保護基の
除去と固相からの遊離反応を行ってＤＮＡ４の粗生成物
２１０．０．単位（２６０ｎｍで測定）を得た。この粗
生成物の５　０．０．単位を７Ｍ尿素を含むトリス−硼
酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて１０％ポリアクリルアミド
ゲル（２ＩＩＩ１１厚、１３ｃｍＸ１３ｃｍ）の電気泳
動で精製し、ＤＮＡ４を含むゲルの領域をとり、０．２
Ｍ炭酸トリエチルアミン緩衝液（ｐ）１Ｂ　）　（以下
ＴＥＡＢという）１ｍ７！でＤＮＡ４を１８時間かけて
抽出し、ついでその抽出液をセファデックスＤＥ５２の
カラム（径６＃１Ｉ１１、長さ５　ｍｍ）に通してＤＮ
Ａ４を吸着させた。２ＭＴＥＡＢ２　ｔａｒ！で溶出し
て１．４　０．０．単位のＤＮＡ４の純品を得た。

ＤＮＡ４以外のＤＮＡも同程度の収率で合成された。

これらＤＮＡの５′水酸基をファージＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼと（Ｔ−”Ｐ）ＡＴＰを用いる常法〔＾、
　Ｍ、　Ｍａｘａｌｌｌら、メソッヅ・イン・エンザイ
モロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　）　Ｖｏｌ。

６５、　Ｐａｒｔｌ、　ｐ、４９９＋　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８０））でリン酸化して放射性ラ
ベルをつけた。ラベルをつけたＤＮＡを７Ｍ尿素を含む
トリス−硼ｖｉ緩衝液で１２％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行い、ＤＮＡの純度と鎖長を確認した。

実施例２　プラスミドｐＫＹＰ１０およびｐｓＧＨＩＢ
２の分離精製 ｐＫＹＰｌｏを含む大ｕＩ菌〔ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ　ＨＢ１（１１＋ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ
）　　ら；ジーン（Ｇｅｎｅ）、−；シー、７５（１９
７７）　）およびｐｓＧＨＩ　Ｂ２を含む大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢＩＯＩ）　　（特開昭
６１−９３１９７　）をそれぞれ５０μｇ　／　＋ａ　
ｌのアンピシリンを含むし培地（１％バタトトリプトン
、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ！ｐＨ７，５）　
　１０　、ｔａｌ、−Ｔ：　３７°Ｃ１１８時間培養し
た。

この培養液全量を５０μｇ　／　ｍ　１のアンピシリン
を含むし培地１！に植菌し、３７°Ｃで培養した。４時
間後に、クロラムフェニコールを１７０μｇ／ｍｌとな
るように加え、さらに３７°Ｃ１１６時間培養した。遠
心分離法（５，（１０Ｏｒｐｍ　　１０分間）により集
菌を行い、０．８％ＮａＣｊ２で菌体を洗浄した後、５
（１１トリス塩酸ＣｐＨＢ、　Ｏ）　２０　ｍｉ！、に
懸濁し、氷冷した。１０ｍｇ／ｍｊ２のりゾチームを８
ｍｊ２加え水中に１０分間静置した後、０．５　Ｍ　　
ＥＤＴＡを９．６ｍｊ２加え、水中に１０分間静置し、
２％トリトンＸ−１（１０（和光純薬工業社製）を２．
３ｍｌ加え米中にさらに１時間静置した。　５０，０Ｏ
ＯＸ　ｇで４°Ｃ１１時間超遠心分離を行い、上清的４
０ｔｎｌを得た０次にこの上清に３Ｍ　　ＮａＯＨを加
えｐＨを１２．５として、室温で１０分間静かに攪拌し
た。

２Ｍ）リス塩酸（ｐＦＩ７．５　）を加え、ｐ）Ｉを８
．５にもどし、さらに３分間攪拌した。この時点で液の
容量は約５５ｍ１であった。１／９容の５Ｍ　　ＮａＣ
！！。

を加えた後、１０ａＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、１１
１ＭＥＤＴＡで飽和したフェノールを等量加え、激しく
攪拌した後、低速遠心分離法（３，３０Ｏｒｐｍ、　　
１０分間、以下同条件）により水層を集めた（以下、こ
の処理をフェノール抽出と略記する。　）　、　１／２
５０容の５ｔｍｇ／　ｍｌ！　ＲＮａｓｅ　Ａ（シグマ
社製）を加え、３７°Ｃ１１時間ＲＮＡ分解反応を行っ
た後１１５容の５Ｍ　　ＮａＣ！！を加え、１／３容の
３０％Ｐ　Ｅ　０６（１００（半井化学薬品社製）を加
え一２０°Ｃに２時間静置した。遠心分離法で沈殿を集
め、ｌｏｉＭトリス塩酸（ｐ）１７．５）および１　ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡからなる液２ｍ１２にｔ容かし、ソジウ
ム・ドデシル・サルレフエイト（ＳＯＳ）を０．５％と
なるように加え、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（シグマ社製
）を５０μｇ、／ｍｌとなるように加えて、３７°Ｃ１
１時間蛋白質分解反応を行った。

フェノール抽出を３回繰り返し行った後、等量のクロロ
ホルムを加え、激しく攪拌した後低速遠心分離法により
水層を集めた。　１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加
え、２．５倍容のエタノールを加え、−２０°Ｃ，１時
間静置した。冷却遠心分離法（４”Ｃ，１１，ＯＯＯｒ
ｐｍ　１０分間）で沈殿を集め、１０ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ７，５）および１ｍＭ　　ε［ｌＴＡからなる液１
　＋ａｆに溶かした。このようにしてｐＫＹＰｌＯおよ
びｐｓＧ）１１８２を各々８（１０ｔｔｇを得ることが
できた。　ｐＫＹＰｌｏの構造は、ＥｃｏＲＩ、　Ｘｐ
ｎｌ、ＢａｍＨＩ、　ＢｇｌＩＩ、Ｐｓｔｌ（宝酒造社
製）で切断してアガロースゲル電気泳動でＷ認した。ま
た、ｐｓＧＨＩＢ２の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｂｉｎｄｌ
Ｉ［、ＢｇｌＩＩ、Ｂａ５ｅｒ　、　Ｎ５ｉｌ、Ｐｓｔ
ｌ　（全酒造社製）で切断してアガロースゲル電気泳動
で確認し実施例３　プラスミドｐ：　ＧＨＥＩの作製実
施例２で得たプラスミドｐｓＧＨＩＢ２２μｇを制限酵
素Ｐｖｕｌ　（全酒造社製）１０単位、ＢｇｌＩ［（全
酒造社製）１０単位、Ｎ５ｉｌ　（全酒造社製）１０単
位を含む溶液（１０ｍＭ）リス−〇Ｃ／！　（ｐＨ７，
５）、７ｎＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、６ｍＭ　　２−メルカ
プトエタノ−１　０　０ｍＭ　ＮａＣｊｌり　３　０　
ｕｌ．に溶解し、３７°Ｃ、２時間消化反応を行った．
この反応液をエチジウムプロミドを含むアガロースゲル
電気泳動にかけ、紫外線（波長３（１２ｎｍ）で検出し
て約１．１７ｋｂと約１．　８　０　ｋｂのＤＮＡを含
むゲル片を切り出した。

ゲル片にフェノール０．５ｍｆを加えて凍結・溶解し、
水層をクロロホルムで洗浄後、エタノール沈殿により上
部ＤＮＡを回収した。

ＤＮＡ１８，ＤＮＡ１９各ＩＱｐｍｏｌｅを各々Ｔ４４
ポリヌクレオチドキナーゼ応用緩衝液〔５０ＩＩＩＭト
リスーＨ（ｆ！　（ｐＨ７．　５　）、１　０＋ｎＭ　
ＭｇＣｊ２ｇ　、５ｓＭジチオスレイトール（以下ＤＴ
Ｔと略記する）、１ｍＭ　　ＡＴＰ，０．１ａ＋Ｍスペ
ルミジン、０．１１１ＭＥＤＴＡ３３０μｌずつに溶解
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造社製）３単
位を加え、３７°Ｃ、４０分間リン酸化反応を行った後
、６５°Ｃで１５分間加熱して酵素を失活させた。この
反応液を４ｐｌずつ混合し、上記で得たＤＮＡ断片を各
々０．　０　８　ｐｍｏｌｅ加え、Ｔ４リガーゼ反応用
緩衝液（２８ｏ＋Ｍ）リス−Ｈｉ（ｐＨ７．５）、９ｍ
ＭＭｇｃＬ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ，０．０３ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ，０．７ｍＭＡＴＰ、０．０３ｍＭスペルミジン
〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒
造社製）１７５単位を加え、３０μｌとした．４°Ｃで
１６時間結合反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩ株〔ポリバー（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ）ら；ジーン（Ｇｅｎｅ）　、７．　　７
　５　（１９７７））ヲＣｏｈｅｎうの方法〔ニス・エ
ヌ・コーエン（Ｓ．Ｎ、Ｃｏｈｅｎ　）ら；プロシーデ
ィング・オプ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オプ・サ
イエンス（　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．）＋ＵＳＡ，６９．
　２１１０（　１９７２　））により形質転換し、アン
ピシリン耐性（　Ａｐ’　）のコロニーを得た．このコ
ロニーよりアルカリ処理法〔マニアティス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら編；モレキュラー。

クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）
、ｐ．３６８，　］　−ルド・スプリングハーバ−（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｒ＋ｒ）社刊〕によっ
てプラスミドＤＮＡを回収し、ｐｓＧｌ（Ｅｌを得た。

ｐｓＧＨＥｌの構造は、Ｂｇｊ！Ｉｔ、Ｐｖｕｌ，　Ｈ
ｉ＋＋ｄＩｆｆ、ＥｃｏＲＩ　、　ＮｓｉＩで切断して
アガロースゲル電気泳動により確認した．制限酵素の切
断反応は１０ｍＭトリス−ＨＣｊ２　（ｐＨ７．５）　
、７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、６ｍＭ　　２−メルカプトエ
タノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（
０　〜２　０　０＋ｎＭ　）　ＮａＣｌを加えた反応液
を用いて行った。

実施例４　プラスミドｐＳＧ）ＩＥＣ−　２の作製実施
例３で得たプラスミドｐｓＧＩＩＥ１の２μｇを実施例
３に示した制限酵素用反応液（１（１０ｍＭ　　Ｎ，：
Ｃ　４２　）３０ｕｌ！に溶解し、ＥｃｏＲＩ　（全酒
造社製）１０単位を加え３７°Ｃで２時間消化反応を行
った．次にこの反応液にＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａ
ｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（全酒造社製）を１
単位加え６５°Ｃで３０分間反応させた．ついで旧ｎｄ
ｌＩ［（全酒造社製）１０単位、Ｐｖｕｌ　（全酒造社
製）１０単位を加え３７°Ｃで２時間消化反応を行った
．同時にｐｓＧＨＥｌを．Ｈｉｎｄｎ［　（宝酒造社製
）１０単位、Ｐｖｕｌ　（全酒造社製）１０単位を加え
、３７°Ｃ１２時間消化反応を行った。

上記反応液をエチジウムプロミドを含むアガロースゲル
電気泳動にかけ、紫外線（波長３（１２ｎｍ）で検出し
て約３２０ｂ、約８５Ｑｂと約１８ｋｂのＤＮＡ断片を
切り出した。ゲル片にフェノール０．５１１１ｊ２を加
えて凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタ
ノール沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

ＤＮＡ４．ＤＮＡ５．各Ｉ　Ｑ　ｐｍｏｌｅを各々Ｔ４
４ポリヌクレオチドキナーゼ応用緩衝液〔５（１１ＴＩ
ＭトリスーＨＣｆ　　（ｐ）１７．５　）　、１０ｍＭ
　　ＭｇＣｆ□、５１ＤＴＴ、　　１ｍＭ　　ＡＴＰ、
　、　Ｏ，１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）　３０　ｕ　１ずつに熔解し、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（全酒造社製）３単位を加え３７°Ｃ１４０
分間リン酸化反応を行った後、６５°Ｃで１５分間加熱
して酵素を失活させた。この反応液を４ｐｌずつ混合し
、上記で得たＤＮＡ断片を各々０．０８　ｐｍｏｌｅを
加え、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液（２Ｂ＋ａＭ　）リス
−〇Ｃｊ２　（、ｐＨ７，５）　、９ｍＭ　　ＭｇＣｆ
　ｚ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．０３ｍＭ　　ＥＤＴＡ
、０．７ｍＭＡＴＰ、０．０３１１＋Ｍスペルミジン〕
の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造
社製）１７５単位を加え、３０μ２とした。４°Ｃで１
６時間結合反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌）ＩＢＩＯＩ株をＣｏｈｅｎ
らの方法により形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｐ’
　）のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＳＧＨＥＣ−
２を得た。　ｐＳＧｌ（ＥＣ−２の構造は、ＢｇＩｌＩ
［、Ｐｖｕｌ、　ＨｉｎｄＩｎ、ＥｃｏＲＩで切断して
アガロースゲル電気泳動により確認した。制限酵素の切
断反応は１０＋Ｍ）リス−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）　、
７ｍＭ　　ＭｇＣｆｚ、６ｍ？Ｉ　２−メルカプトエタ
ノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０
〜２（１０ｍＭ　）　ＮａＣｊｌ！を加えた反応液を用
いて行った。

ｐＳＧＨＥＣ−２を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ　５ＧＨＥＣ２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７
３２としてブダペスト条約の条件で工業技術院微生物工
業技術研究所（微工研）に平成２年１月１８日付で寄託
しである。

実施例５　プラスミドｐＳＧＨＥＣ−１４の作製実施例
３で得たプラスミドｐｓＧＨＥ１の２μｇを実施例２に
示した制限酵素用反応液（１（１０ｎ＋Ｍ　　ＮａＣｆ
）３０μ２に溶解し、ＥｃｏＲＩ　（全酒造社製）１０
単位を加え３７°Ｃで２時間消化反応を行った。次にこ
の反応液にＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（全酒造社製）を１単位加え６５
゛Ｃで３０分間反応させた。ついで旧ｎｄＩ［Ｉ（全酒
造社製）１０単位、Ｐｖｕｌ　（全酒造社製）１０単位
を加え３７°Ｃで２時間消化反応を行った。同時にｐｓ
ＧＨＥｌを旧ｎｄＩ［［（全酒造社製）１０単位、Ｐｖ
ｕｌ　（全酒造社製）１０単位を加え、３７°Ｃ１２時
間消化反応を行っ１こ。

この反応液をエチジウムプロミドを含むアガロ−、スゲ
ルミ気泳動にかけ、紫外線（波長３（１２ｎｍ）検出し
て約３２０ｂ、約８５０ｂと約１．８　ｋｂのＤＮＡ断
片を切り出した。ゲル片にフェノール０．５ｍ１．を加
えて凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタ
ノール沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

ＤＮＡ６−９．各１０ｐｍｏｌｅを各々Ｔ４４ポリヌク
レオチドキナーゼ応用緩衝液〔５０ｍＭトリスＨ１（ｐ
Ｈ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ！２．５ｍＭ　ＤＴ
Ｔ。

１ｍＭ　　ＡＴＰ、０．１　ｍＭ　スヘルミシン、０．
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）３０μβずつにン容解し、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造社製）３単位を加え
、３７°Ｃ１４０分間リン酸化反応を行った後、６５°
Ｃで１５分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を
４μｒずつ混合し、上記で得たＤＮＡ断片を各々０．０
８ｐｍｏｌｅを加え、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液（２８
ｍＭトリス−ＨＣｌ２　（ｐＨ７，５）、９ｍＭ　　Ｍ
ｇＣＪｉ！ｚ　、１０ｍＭＤＴＴ、０．０３ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ、　０．７ｍＬ　ＡＴ　Ｐ、　０．０３ｍＭスペ
ルミジン〕の組成になるよう調整し、Ｔ４Ｄ　Ｎ　Ａ　
’Ｊガーゼ（全酒造社製）１７５単位を加え、３０ｊ７
βとした。４°Ｃで１５時間結合反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌８８１（１１株をＣｏｈｅｎ
らの方法により形質転換し、アンピシリン性（Ａｔ）’
　）のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐｓＧＨＥｃ１
４を得た。ｐｓＧＨＥｃ　−１４の構造は、Ｂｇｊｌ！
ＩＩ、ＰｖｕｌＳＨ４ｎｄＩ［［、ＥｃｏＲＴで切断し
てアガロースゲル電気泳動により確認した。制限酵素の
切断反応は１０ｍＭ）リス−ＨＣｆ　（ＰＨ７，５）　
、７ｍＭ　　ＭｇＣ２２，６ｍＭ２−メルカプトエタノ
ールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０〜
２（１０ｍＭ　）　ＮａＣ１を加えた反応液を用いて行
った。

ｐＳＧＨＥＣ−１４を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｔ　５ＧＨＥＣ１４、ＦＥＲＭ　ＢＰ−
２７３１としてブダペスト条約の条件で工業技術院微生
物工業技術研究所（微工研）に平成２年１月１８日付で
寄託しである。

実施例６　プラスミドｐＳＧＨＥＣ−１８の作製実施例
３で得たプラスミドｐｓＧｌ（Ｅｌの２μｇを実施例２
に示した制限酵素用反応液（１（１０ｍＭ　　ＮａＣ１
，）３’Ｏμｆに溶解し、ＥｃｏＲＩ　（全酒造社製）
１０単位を加え３７℃で２時間消化反応を行った。次に
この反応液にＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（全酒造社製）を１単位加え６
５°Ｃで３０分間反応させた。ついで旧ｎｄｌＩ［（全
酒造社製）１０単位、ＰｖｕＩ　（全酒造社製）１０単
位を加え３７°Ｃで２時間消化反応を行った。同時にｐ
ｓＧＨＥＩをＨ４ｎｄｌ［［（全酒造社製）１０単位、
ｐｖｕｌ　（全酒造社製）１０単位を加え、３７°Ｃ１
２時間消化反応を行った。

この反応液をエチジウムプロミドを含むアガロースゲル
電気泳動にかけ、紫外線（波長３（１２ｎｍ）検出して
約３２０ｂ、約８５０ｂと約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を
切り出した。ゲル片にフェノール０．５ｍ／！を加えて
凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノー
ル沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

ＤＮＡ１０〜１７．各ＩＱｐｍｏｌｅを各々Ｔ４４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ応用緩衝液（５０ｍＭ　）リス−
ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　　ＭｇＣｆｚ、
５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰ、０．１ｍＭスペルミ
ジン、０、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）　３０　、ｌｊ　ｌず
つに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造社
製）３単位を加え３７°Ｃ１４０分間リン酸化反応を行
った後、６５°Ｃで１５分間加熱して酵素を失活させた
。この反応液を４μβずつ混合し、上記で得なりＮＡ断
片を各々０．０８　ｐｍｏｌｅを加え、Ｔ４リガーゼ反
応用緩衝液［２ＢｍＭ）リス−ＨＣ１，（ｐＨ７゜５）
、９ｍＭＭｇＣ／！ｚ　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．０
３ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

０、７ｍＭ　　ＡＴ　Ｐ、　０．０３ｍＭスペルミジン
〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒
造社製）１７５単位を加え、３０μｌとした。４　’Ｃ
で１６時間結合反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌Ｈ８１（１１株をＣｏｈｅｎ
らの方法により形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｐｒ
　）のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＳＧＨＥＣ−
１８を得た。ｐＳＧＨＥＣ−１８の構造は、ＢｇｆＩＩ
、Ｐｖｕ　Ｉ、Ｈｉｎｄ　Ｉ［［、ＥｃｏＲＩで切断し
てアガロースゲル電気泳動により確認した。制限酵素の
切断反応は１１（１１ＩトリスＨＣｊ！　（ｐＨ７，５
）　、７ｍＭ　　ＭｇＣｊ！ｚ、６ｍＭ　　２−メルカ
プトエタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になる
よう（０〜２（１０ｍＭ）ＮａＣｊ！を加えた反応液を
用いて行った。

実施例７　プラスミドｐＳＧＨＥＣ−１８Ｓの作製実施
例６で得たプラスミドｐＳＧ）ＩＥＣ−１８とｐＫＹＰ
ｌｏ（特開昭５８−１１０６（１０）の各２ＪＪｇを、
ＨｉｎｄＩＩｌ　（全酒造社製）１０単位、Ｐｖｕｌ　
（全酒造社製）１０単位を含む溶液（１０ｍＭ）リス−
ＨＣｊｌ！　（ｐＨ７，５）、７　ｍＭ　　ＭｇＣｊ２
　ｚ、６ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、ｌｏｏｍ
Ｍ　　ＮａＣｆ）３０μｆに？容解し、３７°Ｃ１２時
間消化反応を行った。この反応液をエチジウムプロミド
を含むアガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３
（１２ｎｍ）で検出してｐＳＧ）ＩＥＣ−１８の約２．
３６ｋｂ　　ＤＮＡ断片とｐＫ’／ＰＬＯの約１．１ｋ
ｂＤＮＡ断片を切り畠した。ゲル片にフェノール　０．
５ｍｆを加えて凍結・熔解し、水石をクロロホルムで洗
浄後、エタノール沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した
。

上記で得たＤＮＡ断片を各々０．０８　ｐｍｏｌｅを混
合し、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液［２８ｍＭト’Ｊスー
ＨＣｊ２　（ｐＨ７，５）、９　ｍＭ　　ＭｇＣＱ　ｚ
　、１０ｍＭ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ、０、０３　ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、０．７ｍＭ　　ＡＴＰ、０．０３ｍ−スペルミジ
ン〕−の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
全酒造社製）１７５単位を加え、３０μ２とした。４°
Ｃで１６時闇結合反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌１（８１（１１株をＣｏｈｅ
ｎらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｐ
’　）のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処
理法によってブラスミＦ’　Ｄ　Ｎ　Ａを回収し、ｐＳ
ＧＨＥＣ−１ＢＳを得た。ｐＳＧＨＥＣ−１８３の構造
は、ＢｇｌＵ、Ｐｖｕｌ、　Ｈ４ｎｄ■、ＥｃｏＲＩで
切断してアガロースゲル電気泳動により確認した。制限
酵素の切断反応は１１（１１ＲトリスＨＣｊ！　（ｐＨ
７，５）　、？＋ａＭ　　ＭｇＣ１！、ｚ、６ｉＭ　　
２−メルカプトエタノールの組成の溶液に各酵素の至ｉ
！！ｉ１度になるよう（０〜２ｏｏＩＩＩＭ）ＮａＣ４
１！を加えた反応液を用いて行った。

ｐＳＧＦＩＥＣ−１８Ｓを含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｒａｃｏｌｉ　５ＧＨＥＣ１８Ｓ、　ＦＥＲＭ
　　ＢＰ　−２７２９としてブダペスト条約の条件で工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に平成２年１
月１８日付で寄託しである。

実施例８　プラスミドｐＳＧ）ＩＥｃ−１４１４の作製
実施例５で得たプラスミドｐＳＧＨＥＣ−１４の５！ｇ
を実施例３に示した制限酵素用反応液（１（１０ｍＭＮ
ａＣｉｉ）３０ｕｆ２に溶解し、Ｐｓｔｌ　（宝酒造社
製）１０単位を加え、３７℃で２＃間消化反応を行った
。次にこの反応液にＥｃｏＲＩ　（宝酒造社製）１単位
を加え３７°Ｃで１時間部分消化を行った。この反応液
をエチジウムプロミドを含むアガロースゲル電気泳動に
かけ、紫外線（波長３（１２ｎｍ）検出して約１．４ｋ
ｂのＤＮＡ断片と約１．８５ｋｂのＤＮＡ断片を切り出
した。ゲル片にフェノール０．５ｍｌを加えて凍結・溶
解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノール沈殿に
より上記ＤＮＡ断片を回収した。

上記で得たＤＮＡ断片各々０．０８　ｐｍｏｌｅを１０
μｌになるよう混合し、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液（２
ＢｍＭ）リス−〇Ｃ１（ｐＨ７，５）、９ＩｎＭ　　Ｍ
ｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、　０．０３ｍＭ　　Ｉ
ＥＤＴＡ、　Ｏ，’１ｍＦＩ　　ＡＴＰ　。

０．０３ｍＭスペルミジン〕の組成になるよう調整し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１７５単位を加え、
３０ｕｌ！とした。４　’Ｃで１６時間結合反応を行っ
た。

この反応液を用いて大腸菌＋（８１（１１株をＣｏｈｅ
ｎらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性（ＡＰ
’　）のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処
理法によってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＳＧＨＥＣ
１４１４を得た。ｐＳＧＨＥＣ−１４１４の構造は、Ｂ
ｇｊ２Ｉ［、Ｐｖｕｌ、　ｔ（ｉｎｄ　ＩＩＴ　、　Ｅ
ｃｏＲＩで切断してアガロースゲル電気泳動により確認
した。制限酵素の切断反応は１０ｍＭ）リスＨＣＩ！、
（ｐＨ７，５）　、７ｍＭ　　ＭｇＣｆｚ、５ｍＭ２−
メルカプトエタノールの組成の）８液に各酵素の至適濃
度になるよう（０〜２（１０ｍＭ）ＮａＣｌを加えた反
応液を用いて行った。

ｐＳＧ）ＩＥＣ−１４１４を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　５ＧＨＥＣ１４１４、ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ　　２７３０としてブダペスト条約の条件で
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に平成２年
１月１８日付で寄託しである。

実施例９　プラスミドｐｓＧＨＥ１を導入した大腸菌に
−よる５ＧＨＥＩの生産 実施例３で得られたｐｓＧＨＥｌを用いて実施例３に示
した方法で大Ｕ４菌−３１１（１５ｔｒＡ（ＦＥＲＭ　
ＢＰ　　７３２　）を形質転換した。得られたＡｐ　ｒ
のコロニーを８ｍｌのＬＧ培地（１％バタトトリプトン
、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣＩ２．０．１％
グルコース、５０ｐｇ／ｍ！！アンピシリン、ｐＨ７，
４）に接種し、３０゛Ｃ１１６時間培養した。この培養
液２（１０ｕｌを１０＋ｎｊ！のＭＣＧ培地（０，６％
ＮａｚＨＰＯａ、０．３％に８２ＰＯ，，０，（１５％
ＮａＣｊ２，０．１％Ｎ＋（、ＣＩ！、０．５％グルコ
ース、０．５％カザミノ酸、ｌｌ１１Ｍ月ｇＳＯ，，０
、１ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　、４　ｕｇ／ｍ！！ビタミンＢ
、、ｐＨ７，４）に５０μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリ
ンを添加した培地に接種し、３０°Ｃ１２４時間培養し
た。

培養液を７　、　ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離して菌
体を集め、この菌体をレムリ（Ｌａｅｍｌｉ）のサンプ
ルバッファーに溶解し、加熱後、レムリの方法に従って
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマ
シーブリリアントブルーを用いて染色した結果、分子量
的１２６（１０の部位にポリペプチドバンドを検出した
（第７図Ａ参照）。ｐｓＧ）ＩＥＩを含まない大腸菌Ｗ
３１１０　ｓｔｒ＾株には相当するバンドは存在しなか
った。このことは５ＧＨＥ１を保有する大Ｘｉ菌Ｗ３１
１（１５ｔｒＡ株が５ＧＨＥｌを生産していることを示
してしる。

実施例１０　プラスミドｐＳＧＨＥＣ−２を導入した大
腸菌による５ＧＨＥＣ−２の生産 実施例４で得られたｐｓＧＨＥｃ　−２を用いて実施例
３に示した方法で大腸菌−３１１（１５ｔｒＡ（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ　−７３２）を形質転換した。得られた／ｌ　
ｐ　ｒのコロニーを実施例９と同様にＬＧ培地に接種し
、３０°Ｃ１１６時間培養した。

この培養液２（１０μ！を１（１１ｍ１のＭＣＧ培地に
５０μｇ／ｒａｉｌのアンピシリンを添加した培地に接
種し、３０°Ｃ１２４時間培養した。培養液を７．（１
０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を集め、この菌体
をレムリのサンプルバッファーに溶解し、加熱後、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシー
ブリリアントブルーを用いて染色した結果、分子量約１
４８（１０の部位にポリペプチドバンドを検出した（第
７図Ｃ参照）、　ｐＳＧＨＥＣ−２を含まない大腸菌Ｗ
３１１（１５ｔｒＡ株には相当するバンドは存在しなか
った。このことは、ｐＳＧＨＥＣ−２を保有する大腸菌
Ｗ３１１（１５ｔｒＡ株が、Ｃ−２によりコードされる
ＨＣＶ関連抗原とｓＧＨとの融合抗原ポリペプチド５Ｇ
ＨＥＣ−２を生産していることを示している。

実施例１１　プラスミドｐＳＧ）ＩＥＣ−１４を導入し
た大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例５で
得られたｐＳＧＨＥＣ−１４を用いて実施例３に示した
方法で大腸菌Ｗ３１１（１５ｔｒＡ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
７３２）を形質転換した。得られたＡｐ　ｒのコロニー
を実施例９と同様にＬＧ培地に接種し、３０゛Ｃ１１６
時間培養した。

この培養液２（１０μｆを１０ｍ！のＭＣＧ培地に５０
μｇ／ｌｌ１ｌのアンピシリンを添加した培地に接種し
、３０°Ｃ１２４時間培養した。培養液を７．（１００
ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を集め、この菌体をレ
ムリのサンプルバッファーに溶解し、加熱後、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動ヲ行い、クマシーブリ
リアントブルーを用いて染色した結果、分子量約１７１
（１０の部位にポリペプチドバンドを検出した（第７図
Ｃ参照）　、　ｐＳＧＨＥＣ−１４を含まない大腸菌Ｗ
３１１（１５ｔｒＡ株には相当するバンドは存在しなか
った。このこ、とは、ｐＳＧＨＥＣ−１４を保有する大
腸菌Ｗ３１１（１５ｔｒＡ株が、Ｃ１４によりコードさ
れるＨＣＶ関連抗原とｓＧＨ七の融合抗原ポリペプチド
５ＧＨＥＣ］　４を！していることを示している。

実施例１２　プラスミドｐｓＧＨＥｃ−１８３を導入し
た大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例７で
得られたｐＳＧＨＥＣ−１８Ｓを用いて実施例３に示し
た方法で大腸菌−３１１（１５ｔｒＡ株（ＦＥＲＭＢＰ
−７３２）を形質転換した。得られたＡｐｌのコロニー
を実施例９と同様にＬＧ培地に接種し、３０°Ｃ１１６
時間培養した。

この培養液２（１０μ！を２５μｇ／ｍｆのトリプトフ
ァンと３０μｇ／ＩＩＩ！！、のアンピシリンを含むＭ
ＣＧ培地（ＮａｚＨＰ０４０．６％、ＫＨ２ＰＯ４０，
３％、ＮａＣｌ２　０．５％、カザミノ酸０．５％、Ｍ
ｇＳＯ４，１ｍＦＩ、ビタミンＢ１４ｕｇ　／　ｔｎｌ
、　ｐＨ７，４）　１０　ｒａｆ２．に接種し、３０°
Ｃで４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質であ
る３β−インドールアクリル酸（３β−１ｎｄｏｌｅａ
ｃｒｙｌｉｃａｃｉｄ　＋以下ＩＡＡと略す）を１０μ
ｇ／ｌａｎ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。

培養液を７．　ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離して菌体
を集め、この菌体をレムリのサンプルハフ７アーに溶解
し、加熱後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した
結果、分子量約２０４（１０の部位にポリペプチドバン
ドを検出した（第７図り参照）。

ｐＳＧＨＥＣ−１８５を含まない大腸菌Ｗ３１１（１５
ｔｒＡ株には相当するバンドは存在しなかった。このこ
とは、ｐＳ（ＪＥＣ−１８３を保存する大腸菌Ｗ３１１
（１５ｔｒＡ株が、Ｃ−１８によりコードされるＨＣＶ
関連抗原とｓＧＨとの融合抗原ポリペプチド５ＧＨＥＣ
−１８３を生産していることを示している。

実施例１３　プラスミドｐＳＧＨＥＣ−１４１４を導入
した大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例８
で得られたｐｓＧＨＥｃ−１４１４を用いて実施例３に
示した方法で大ｖＡ菌Ｗ３１１（１５ｔｒＡ（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−７３２）’を形質転換した。得られたＡｐｒの
コロニーを実施例９と同様にＬＧ培地に接種し、３０°
Ｃ１１６時間培養した。この培養液２（１０μｌをＬＯ
ｔａｌのＭＣＧ培地に５０ｕｇ／ｍｌ：のアンピシリン
を添加した培地に接種し、３０　’Ｃ１２４時間培養し
た。培養液を７．（１０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して
菌体を集め、この菌体をレムリのサンプルバッファーに
溶解し、加熱後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色
した結果、分子量的２１７（１０の部位にポリペプチド
バンドを検出した（第７図Ｅ参照）　、　ｐＳＧＨＥＣ
−１４１４を含まない大腸菌−３１１０ｓ　ｔｒＡ株に
は相当するバンドは存在しなかった。このことは、ｐｓ
ＧＨＥｃ−１４１４を保有する大腸菌Ｗ３１１０ｓ　ｔ
ｒＡ株が、Ｃ−１４にコードされているＨＣＶ関連抗原
を２個とｓＧＨとの融合抗原ポリペプチド５ＧＨＥＣ−
１４１４を住産していることを示している。

実施例１４　大腸菌によって産生された５ＧＨＥＣ−１
４ポリペプチドの精製 実施例１１によって得られた培養液を８（１００ｒｐｍ
、４０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ　ＮａＣｆ！、３
（１１Ｔｒｉｓ　−ＨＣｉ！緩衝液（ｐＨ７，５）で洗
浄した。５ＧＨＥＣ−１４は大腸菌内に顆粒として発現
した。まず、洗浄菌体から５ＧＨＥｃ−，１４顆粒を特
開昭６０−２４４２５９に示された方法に従い純度９０
％にまで精製した。

この顆粒８（１０ｍｇを７０％ギ酸に可溶化し、４０ｍ
１とし、１２（１００ｒｐｍ、２０分間遠心後、逆相Ｈ
ＰＬＣを用い、５ＧＨＥＣ−１４を精製した。逆相ＨＰ
ＬＣの操作条件は以下のとおりである。

カラム：Ｈ４ＰＯＲＥ　　Ｃ−２１，５ｍｍＸ２５ａｎ
　（バイオランド社製） Ａ　液：０．１％トリフルオロ酢酸、１５％アセトニト
リル Ｂ　液：０．１％トリフルオロ酢酸、９０％アセトニト
リル グラジェント： 度９０％以上であった。

同様な方法で５ＧＨＥ１．５Ｇ）ＩＥＣ２，５ＧＨＥＣ
１８ｓｓＧＨＥＣ１４１４も精製可能である。

実施例１５　　ＨＣＶ関連融合抗原ポリペプチドを以下
余白 流　速：２０ｍｆ！／分 検　出：紫外吸収　２２０ｎｍ カラム温度二３５°Ｃ ５ＧＨＥＣ−１４は逆相ＨＰＬＣにおいて、グラジェン
ト開始後２６〜２８分に溶出された。この溶出画分４０
ｍ１を１　ｍ’ｌずつ分注後、凍結乾燥し、５ＧＨＥＣ
ｌ　４の標品を得た。この１バイアルを０．１％トリフ
ルオロ酢酸１　　ｍｌに溶解後タンノ々り譬アッセイキ
ット（バイオラ・ンド社製）ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルにより分析したところ、蛍白濃度０．２〜０．６
ｍｇ／　ｍｌ２　（５ＧＨＥＣ−１４の場合０．４４　
ｍｇ／　ｍｆ！、、生血清アルブミン換算）、純用いた
抗ＨＣＶ抗体の検出 人血清を試料として、ウェスタンブロッティングＣ以下
ＷＢと略記する）を行った〔バーネット（Ｂｕｒｎｅｔ
ｔ）　、アナールバイオケミ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｌ！１．）１１２　、１９５（１９８１）　）。

使用したＨＣＶ関連融合抗原としては、実施例１４で得
た精製されたＣ−１４融合抗原ポリペプチドを用いた。

精製されたＣ−１４融合抗原ポリペプチド１（１０μｇ
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動後、同一ゲル
をニトロセルロース膜に電気的にブロッティングした〔
トウビイン（Ｔｏｗｂｉｎ）　＋　プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　）Ｑ、　４３５０（１９７９））。プロッティン
グ後、プロット（１０ｍＭリン酸バッフｙ　−ｐＨ７，
２、５（１０ｍＭＮａＣｌ、５％　スキムミルク、消泡
剤１滴）液に浸し、室温で２時間振とうした。振とう後
、ニトロセルロース膜を短冊状に切り、蛋白量３μｇ／
短冊になるようにした。この短冊を３　ｍｌのプロット
に浸し人血清を３０μ！加え室温で一夜処理した。次い
でフィルターをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳ（１０ｍＭリンａｔ
ハソフｙ　−ｐＨ１，２，５（１０ｍＭ　　ＮａＣｆ、
　０．（１５％　Ｔｗｅｅｎ　２０　）で洗浄した後、
抗人イムノグロブリンズ・パーオキシダーゼコンジュゲ
ートを加え室温で２時間反応させた。次にＴｗｅｅｎ　
−Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄し最後にＰＢＳで洗浄した後、発色
剤を加えた。発色剤は、４−クロロ−１−ナフトール（
バイオランド社）６０ｍｇに、冷メタノールを加えたも
のと、ＰＢＳ１（１０ｍＩ！、に過酸化水素水６０μｌ
を混合したものを用いた。発色反応は遮光し、３０分間
反応させた後、水で洗浄して終了した。

使用した血清は以下の通りである。なおＰＩＢ法とはプ
ラーク・イムノ・プロット法〔有馬ら、日本臨床４８　
、２７−３２　　（１９９０））の略であり、カイロン
法はＫｕｏ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　　
２４４．３６２３６４（１９８９）に記載の方法である
：血清（１）（２）は、ＦＩＢ法Ｃ−１４（−）、Ｃ−
１８（＋）患者血清：（３）〜（１０）はＰＩＢ法Ｃ−
１４（＋）、、患者血清：（１１）〜（１５）は、ＰＩ
Ｂ法Ｃ−１４（−）患者血清：（ＩＥ）〜（１４Ｅ）は
ＰＩＢ法Ｃ−１４（−）患者血清：　（１５Ｅ）はＰＴ
Ｂ法Ｃ−１４（−）　、カイロン法（＋）血清：　（１
６Ｅ）はＰＩＢ法Ｃ−１４（−）カイロン法（−）であ
る。第１表は血清（１）〜面までのウェスタンブロンテ
ィングの結果を示す。第２　表ｆ；［＋［（ＩＥ）〜（
１６Ｅ）までのウェスタンブロンティングの結果を示す
。

（１）〜（１０）ニオイテ従来法ＰＩＢによるＣ−１４
判定と本発明にかかわるＷＢ判定は、非常によい相関を
示した。（１０〜（１５）、　　（ＩＥ）〜（１６Ｅ）
においては、従来法のＰＩＢ法によるＣ−１４判定陰性
検体を、本発明で用いた融合抗原ポリペプチドによるＷ
Ｂ法では検出することができた。また（１６Ｅ）におい
ては、カイロン法で陰性判定の検体を、本発明によるＷ
Ｂ法で検出することができた。融合させたｓＧＨポリペ
プチドのみを用いたＷＢ法では、いずれも血清と反応性
を示さないことが判明した。

従って、本発明の融合抗原ポリペプチドは、抗ＨＣＶ抗
体を検出する血清診断に用いるに極めて有効であると考
えられる。

Ｓ　Ｇ：セーグレン症候群 ＨＢＶｎＢ型肝炎ウィルス葆持者 第２表 患者血清の検定比較 第１図 ７　ｋ　ｌ＋　１１ ８（月＜ｈｐ １”廊し九展 本発明によれば、抗原ポリペプチドが異種ポリペプチド
と融合した形の融合抗原ポリペプチドを大量に製造する
ことができる。該融合抗原ポリペプチドは、Ｃ型肝炎ウ
ィルスに感染した患者の正確な血清診断に利用すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１〜６回はそれぞれプラスミドｐｓＧＨＥ　１　。 ｐｓＧＨＥｃ−２，ｐｓＧＨＥｃ−１４，ｐｓＧＨＥｃ
−１８，ｐＳＧＨＥＣ−１８Ｓ、　ｐｓＧＨＥｃ−１４
１４の造成工程を示す、第７図Ａ。 Ｂ、Ｃ，Ｄ、ＥはそれぞれプラスミドｐＳＧ）ＩＥ　１
　。 ｐＳＧＨＥＣ−２，ｐｓＧＨＥｃ　　１４．　ｐＳＧＨ
ＥＣ−１８３，ｐＳＧＨＥＣ−１４１４を導入した大腸
菌が生産する融合抗原ポリペプチドの５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動の結果を示す、それぞれの矢印
が目的とする融合抗原ポリペプチドのバンドを示してい
る。 特許出願人　（１（１２）協和醗酵工業株式会社第２図 ２０ｂｐ ５０ｂｐ １．８１ｃｂ ３２０ｂｐ 第３図 ５０ｂｐ １．８ｋｂ 第５図 第４図 １４ｇ ■ ＋１１１１ ４０ｋｂｐｌ）ＮＡ ８５　ｋ　ｂ　ｐ　Ｌ）　ＮＡ １１ｉ＋＋ｄ［ｌ 第７図 →・

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｃ型肝炎関連抗原に由来する抗原ポリペプチド（
   以下Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドと略記する）の少な
   くとも１つと、該抗原ポリペプチドとは異種のポリペプ
   チド（以下異種ポリペプチドと略記する）の少なくとも
   １つとが融合した融合抗原ポリペプチド。
2. （２）異種ポリペプチドがシロザケ成長ホルモンのポリ
   ペプチドまたはその一部であり、かつヒト血清中の抗体
   と特異的に反応しないものである請求項１記載の融合抗
   原ポリペプチド。
3. （３）Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドが下記の式１〜３
   から選ばれる配列を有するポリペプチドである請求項１
   記載の融合抗原ポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 （式中、記号は下記アミノ酸残基を示す。Ｐｈｅ：フエ
   ニルアラニン、Ｖａｌ：バリン、Ｐｒｏ：プロリン、Ｉ
   ｌｅ：イソロイシン、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｔｙｒ：チ
   ロシン、Ｇｌｙ：グリシン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｌ
   ｅｕ：ロイシン、Ｇｌｎ：グルタミン、Ａｒｇ：アルギ
   ニン、Ｍｅｔ：メチオニン、Ｌｙｓ：リジン、Ａｓｎ：
   アスパラギン、Ｓｅｒ：セリン、Ａｌａ：アラニン、Ｈ
   ｉｓ：ヒスチジン、Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｃｙｓ：
   システイン、Ｔｒｐ：トリプトファン、以下同じ）
4. （４）Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザケ成長ホ
   ルモンのポリペプチドとがメチオニンを介して結合した
   形のポリペプチドである請求項１記載の融合抗原ポリペ
   プチド。
5. （５）Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａの少なくとも１つと異種ポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡの少なくとも１つとが組み込まれた組換え体プラス
   ミド。
6. （６）異種ポリペプチドがシロザケ成長ホルモンのポリ
   ペプチドまたはその一部であり、かつヒト血清中の抗体
   と特異的に反応しないものである請求項５記載の組換え
   体プラスミド。
7. （７）Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａが式１〜３から選ばれる配列を有するＤＮＡである請
   求項５記載の組換え体プラスミド。
8. （８）Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザケ成長ホ
   ルモンのポリペプチドとがメチオニンを介して結合した
   ポリペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれた組換え
   体プラスミド。
9. （９）プラスミドｐＳＧＨＥＣ−２、ｐＳＧＨＥＣ−１
   ４、ｐＳＧＨＥＣ−１８、ｐＳＧＨＥＣ−１８Ｓおよび
   ｐＳＧＨＥＣ−１４１４から選ばれる請求項５記載の組
   換え体プラスミド。
10. （１０）５〜９から選ばれる請求項記載の組換え体プラ
    スミドを保有する微生物を培地に培養し、培養物中に融
    合抗原ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から融合
    抗原ポリペプチドを採取することを特徴とする融合抗原
    ポリペプチドの製造法。
11. （１１）微生物がエッシエリヒア・コリに属する請求項
    １０記載の製造法。
12. （１２）Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザケ成長
    ホルモンのポリペプチドとがメチオニンを介して融合し
    た融合抗原ポリペプチドを抗原物質として用いる免疫学
    的方法により試料中の抗ＨＣＶ抗体を検出する抗ＨＣＶ
    抗体の検出法。
13. （１３）免疫学的方法が、ラジオ・イムノアッセイ、エ
    ンザイム・イムノアッセイ、フルオレッセンス・イムノ
    アッセイ、逆受身凝集反応、フィトヘマトアグリチネー
    ション、パーティクルアグリチネーション、レーザーネ
    フロメトリー、ウェスタン・ブロッティングおよび免疫
    溶血反応（赤血球またはリボソームを用いる方法）から
    選ばれる請求項１２記載の検出法。
14. （１４）固相にコーティングされた抗原物質を用いる請
    求項１３記載の検出法。
15. （１５）固相が、合成樹脂、ガラス製のチューブ、ガラ
    ス製のビーズまたはガラス製のマイクロタイタープレイ
    トである請求項１４記載の検出法。