JPH0436197A - 尿路感染症原因菌の検査方法 - Google Patents
尿路感染症原因菌の検査方法Info
- Publication number
- JPH0436197A JPH0436197A JP2144195A JP14419590A JPH0436197A JP H0436197 A JPH0436197 A JP H0436197A JP 2144195 A JP2144195 A JP 2144195A JP 14419590 A JP14419590 A JP 14419590A JP H0436197 A JPH0436197 A JP H0436197A
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- Japan
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- bacteria
- filter
- dna
- bacterium
- urine
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
本発明は、例えば細菌尿より細菌を集め、ＤＮＡ１抽出
し、検査する方法に関するものである。
し、検査する方法に関するものである。
（ロ）従来の技術
臨床診断や研究の分野において、生物試鋳中の細菌の種
類？同定したジ、その購ｉＥ成分倉分析する次めに細菌
を撞々の方法で寒天プレート上で培養するここに以前〃
１ら付わ几ていた７細床尿中にある線菌ｒ溶菌して菌体
成分？得る従来の方法汀誠←の÷濁液を培地につげて敞
日間層塗ｒ打い、得らｆＬ念コロニーを採取してこｎ２
遠心分癒し新体を分離回収する。
類？同定したジ、その購ｉＥ成分倉分析する次めに細菌
を撞々の方法で寒天プレート上で培養するここに以前〃
１ら付わ几ていた７細床尿中にある線菌ｒ溶菌して菌体
成分？得る従来の方法汀誠←の÷濁液を培地につげて敞
日間層塗ｒ打い、得らｆＬ念コロニーを採取してこｎ２
遠心分癒し新体を分離回収する。
そしてこｎ’２溶液中でプロテネースにのような酵素あ
るいにドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤ある
いは不酸化ナトリウムのようなアルカリを用いて各歯さ
せた夛、超音波、あるいはミルのような物理的破砕方法
で細菌を破砕したりすることで菌体成分を得る。
るいにドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤ある
いは不酸化ナトリウムのようなアルカリを用いて各歯さ
せた夛、超音波、あるいはミルのような物理的破砕方法
で細菌を破砕したりすることで菌体成分を得る。
また従来の細菌同定法では例えばある特定の抗生物賀を
含んだ寒天などの培地に前記試料ｔまき、その結果とし
て生えてくる菌体群ｒ分別しさらにこの分別さ九た菌体
＃ｔま次別の抗生物置の含まｎる培地にまき分別に燥、
＃）返す分離培養法・あるいに菌体に固ＭＯ抗体ｔラテ
ックスビーズに固定しこｆＬｔ−前記試料中に添加し、
ビーズ表面の抗体が菌体を認識することにエルビーズが
凝集することを利用するラテックス凝集法、ポリエチレ
ン製プレヒトビーズＶｃ１次抗体を結合さぞ、こｎＫ菌
体を作用させ、抗原−抗体反応によ夕結合するものと、
しないものとＦＪ分け、さらに酵素や螢光物質により標
識さ九た２次抗体を作用さぜＢ／Ｆ分離俊酵素活注や螢
光強度ｒ測定することで同定するサンドイッチ抗体法、
′；ｊ）るいは前記コロニー會メンブランフィルタ−に
転写し溶菌後特異的ＤＮＡ断片に酵素や放射活性物質な
どｔ標絨したＤＮＡプロー１７作用させて遺伝子レベル
で検出するＤＮＡプローブ法がある。この方法はコロニ
ー中のＤＮＡ中にＤＮＡ７”ローブと相補的な塩基配列
があると両者の間に水素結合が生じること金利用して目
的の細菌等上検出する方法である。
含んだ寒天などの培地に前記試料ｔまき、その結果とし
て生えてくる菌体群ｒ分別しさらにこの分別さ九た菌体
＃ｔま次別の抗生物置の含まｎる培地にまき分別に燥、
＃）返す分離培養法・あるいに菌体に固ＭＯ抗体ｔラテ
ックスビーズに固定しこｆＬｔ−前記試料中に添加し、
ビーズ表面の抗体が菌体を認識することにエルビーズが
凝集することを利用するラテックス凝集法、ポリエチレ
ン製プレヒトビーズＶｃ１次抗体を結合さぞ、こｎＫ菌
体を作用させ、抗原−抗体反応によ夕結合するものと、
しないものとＦＪ分け、さらに酵素や螢光物質により標
識さ九た２次抗体を作用さぜＢ／Ｆ分離俊酵素活注や螢
光強度ｒ測定することで同定するサンドイッチ抗体法、
′；ｊ）るいは前記コロニー會メンブランフィルタ−に
転写し溶菌後特異的ＤＮＡ断片に酵素や放射活性物質な
どｔ標絨したＤＮＡプロー１７作用させて遺伝子レベル
で検出するＤＮＡプローブ法がある。この方法はコロニ
ー中のＤＮＡ中にＤＮＡ７”ローブと相補的な塩基配列
があると両者の間に水素結合が生じること金利用して目
的の細菌等上検出する方法である。
ｅラ 発明が屏決しようとする課題
しかしながら前記の菌体成分子得る方法にいずｎも培養
に長時間を要するため、菌体成分を迅速に得ることがで
きないのが難点である。とぐに尿路感染症ケ起こす工う
な原因菌の場合、早期に原因菌の特定し抗生甥頁などの
投与會行うことが病原菌の蔓延の阻止及び治療に大きな
勺果ｔもたらす、Ｘ発明の目的はこｎらのＭ’ｃ＠ｆＫ
同定し得る細菌検査法を提供することにある。
に長時間を要するため、菌体成分を迅速に得ることがで
きないのが難点である。とぐに尿路感染症ケ起こす工う
な原因菌の場合、早期に原因菌の特定し抗生甥頁などの
投与會行うことが病原菌の蔓延の阻止及び治療に大きな
勺果ｔもたらす、Ｘ発明の目的はこｎらのＭ’ｃ＠ｆＫ
同定し得る細菌検査法を提供することにある。
に）課題ｒｍ決する九めの手段
大発明の方法はフィルター内で、Ｗ菌全含む懸濁液から
菌体成分を採取し、上記菌体成分を含む溶液？ポリメラ
ーゼ連鎖反応法に付して、所望の菌のＤＮＡｇ増幅し、
前記増幅したＤＮＡ會用いて前記懸濁液中の所望の菌の
有無を検査する細菌検査法である− （ホ）作用 本発明は菌會含む懸濁液ｆ７４ｆｉ７ターホルダー中に
通し、フィルターホルダー内に配置さ九たフィルターで
懸濁液から菌を分離する。次にフィルターに溶菌ｇｋ遡
して菌Ａ成分ケ得る。
菌体成分を採取し、上記菌体成分を含む溶液？ポリメラ
ーゼ連鎖反応法に付して、所望の菌のＤＮＡｇ増幅し、
前記増幅したＤＮＡ會用いて前記懸濁液中の所望の菌の
有無を検査する細菌検査法である− （ホ）作用 本発明は菌會含む懸濁液ｆ７４ｆｉ７ターホルダー中に
通し、フィルターホルダー内に配置さ九たフィルターで
懸濁液から菌を分離する。次にフィルターに溶菌ｇｋ遡
して菌Ａ成分ケ得る。
得た菌体成分はポリメラーゼ連鎖反応ｒ用いるため検査
法全体としても迅速かつ簡便なものとなる。また迅速に
結果がでるため病原菌に特異的に作用する抗生物質の投
与を行うことができる。
法全体としても迅速かつ簡便なものとなる。また迅速に
結果がでるため病原菌に特異的に作用する抗生物質の投
与を行うことができる。
（へ） 央 施 例
（試料液の調＃）
ヒト尿１ｍｌに、標的菌１０１［！’に懸濁させ試料液
を得た。鷹的薗が大傷直の場合は入ＴＣＣ２３５１９ｋ
、プロテウス菌の場合はＪＣＭ１６６ｇを用いた。
を得た。鷹的薗が大傷直の場合は入ＴＣＣ２３５１９ｋ
、プロテウス菌の場合はＪＣＭ１６６ｇを用いた。
（ｉ過処理）
上記で得ら７′２．た試料液を用いてｉ過処理上行つ念
。まず、第１図に示すごとくシリンジ２に前記の試料液
１ｒ入ｎ、シリンジ２とフィルター４に接続して濾過し
、次いでフィルターに５０ｍＭ燐酸バッファ −ｐＨ７
，０（以下ｐＢ）５ｍｌで洗浄した。
。まず、第１図に示すごとくシリンジ２に前記の試料液
１ｒ入ｎ、シリンジ２とフィルター４に接続して濾過し
、次いでフィルターに５０ｍＭ燐酸バッファ −ｐＨ７
，０（以下ｐＢ）５ｍｌで洗浄した。
（溶菌処理）
次いで新たにシリンジ３に溶Ｎ液５（プロテネース！１
■／ｍ１． ｓＤ３０．１３％、 ！ＩＬＳＯ，１３％
ｐｇ＠Ｑ ） ｋ ２５０ ｐ １人ｎ、フイｋｌ−４
（Ｍ＋１１ｉｐＱｒ８９ ＭＥＬ、ＬＥＸ−ＰＦ Ｏ，
ｇμｍＦＩ Ｉ ｔｅｒ υｎ１１）Ｋ接続し穴。さ
らに塔石液５紫、ンリンジ３ヶ操乍しフィルター４内に
導いた。フィルター４の先に蓋６ｔつけて、６０°Ｃの
ウォーターバヌ７で１０分間インキ−ベートした俊、シ
リンジ３ｒ操作し溶菌液５を回収した。
■／ｍ１． ｓＤ３０．１３％、 ！ＩＬＳＯ，１３％
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（Ｍ＋１１ｉｐＱｒ８９ ＭＥＬ、ＬＥＸ−ＰＦ Ｏ，
ｇμｍＦＩ Ｉ ｔｅｒ υｎ１１）Ｋ接続し穴。さ
らに塔石液５紫、ンリンジ３ヶ操乍しフィルター４内に
導いた。フィルター４の先に蓋６ｔつけて、６０°Ｃの
ウォーターバヌ７で１０分間インキ−ベートした俊、シ
リンジ３ｒ操作し溶菌液５を回収した。
（除ＳＤ８処理）
得らｆした溶出液のうち５００μｍ ’！” ］ 、５
ｍｌ 容マイタロテヌトチーープに取や、４？量の５０
０ｍＭＫＣｌ水浴液を加え、沈澱する画分子遠心分離に
工り取り除いて溶出液に得た。
ｍｌ 容マイタロテヌトチーープに取や、４？量の５０
０ｍＭＫＣｌ水浴液を加え、沈澱する画分子遠心分離に
工り取り除いて溶出液に得た。
（熱処理）
得らｆ′Ｌ几溶出液ケ９５′Ｃで１０分インキ−ベート
し、プロテネースに２失活させ念。
し、プロテネースに２失活させ念。
（ＤＮＡの増幅）
上記溶出液に５声１取り特異的に目的ＤＮＡ【増やす方
法であるポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ法５ａｉｋ
ｉ 、 Ｒ、に、 ｅｔ ａｌ 、 ５ｃｉｅｎｃｅ
２３ｇ４８７−４９１ （１９８８） ） ｋ４時間で
行った。ここで上記ＰＣＭ法に以下の条件で打つ念。
法であるポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ法５ａｉｋ
ｉ 、 Ｒ、に、 ｅｔ ａｌ 、 ５ｃｉｅｎｃｅ
２３ｇ４８７−４９１ （１９８８） ） ｋ４時間で
行った。ここで上記ＰＣＭ法に以下の条件で打つ念。
すなわち、蒸留Ｘ２６．５μＩ、 ｄＮＴＰ ８戸１（
１゜２５墓Ｍ各ｄＮＴＰ） 、プライマー２．５μｍ（
２０戸Ｍ）２Ｐｉ、１０倍緩＃液５μＩ（パーキンエル
マーシータス裏）、τａｑポリメラーゼ２．５ユニット
（同社製）の合計５０μＩＶｃミネラル油１００μＩ］
蒸発防止剤として重層して、ＤＮＡ ｒｈｅｒ＋ａａｌ
（同社製）にセットし次。ここで言うプライマーとは
我々が独自で開発した２０塩基対のオリゴヌクレオチド
である（特許出願予定）。まえ、ここで言う１０倍緩＃
液とに１ｏｏＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）
、５００ ｍ Ｍ Ｋ （１、１５ｗ＝ Ｍ舅ｇｃ１２
である。
１゜２５墓Ｍ各ｄＮＴＰ） 、プライマー２．５μｍ（
２０戸Ｍ）２Ｐｉ、１０倍緩＃液５μＩ（パーキンエル
マーシータス裏）、τａｑポリメラーゼ２．５ユニット
（同社製）の合計５０μＩＶｃミネラル油１００μＩ］
蒸発防止剤として重層して、ＤＮＡ ｒｈｅｒ＋ａａｌ
（同社製）にセットし次。ここで言うプライマーとは
我々が独自で開発した２０塩基対のオリゴヌクレオチド
である（特許出願予定）。まえ、ここで言う１０倍緩＃
液とに１ｏｏＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）
、５００ ｍ Ｍ Ｋ （１、１５ｗ＝ Ｍ舅ｇｃ１２
である。
ＰＣＲ反尤の温度サイクＡ／は変性９４℃１分、アニー
リング３７°Ｃ１分、鎖長伸長６０’ＣＩ分、１サイク
ル５．７分、４２サイクルで行り几。
リング３７°Ｃ１分、鎖長伸長６０’ＣＩ分、１サイク
ル５．７分、４２サイクルで行り几。
（検出）
上記ＰＣＭ後の溶液’に２０μｍとり、エチジウムブロ
マイドを含む２ｇ６アガローヌゲルで１００ Ｖ３５分
間電気泳＃ｒｈっ逢俊、トランヌイルξネター上にゲ〜
ｔ−ｆｆ１き波長３２（１−のＵＶ光を照射したところ
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡは螢光を発し友。その螢光
ｒインスタントフィルムｔｉ着したカメラにて撮影した
結果？第２凶に示した。レーン１．５に故意に細菌を入
へず尿だけを試料液と同様に処理したパターンである。
マイドを含む２ｇ６アガローヌゲルで１００ Ｖ３５分
間電気泳＃ｒｈっ逢俊、トランヌイルξネター上にゲ〜
ｔ−ｆｆ１き波長３２（１−のＵＶ光を照射したところ
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡは螢光を発し友。その螢光
ｒインスタントフィルムｔｉ着したカメラにて撮影した
結果？第２凶に示した。レーン１．５に故意に細菌を入
へず尿だけを試料液と同様に処理したパターンである。
レーン２．６はそｎ （Ｊｎ大腸菌、プロテウス菌につ
いて本発明を実施したパターンである。レーン３．７に
各りの菌のポジティブコントロー〜である。レーン４．
８に溶出ｆｉｋ入ｎずにＰＣＲ法會行上行ものである。
いて本発明を実施したパターンである。レーン３．７に
各りの菌のポジティブコントロー〜である。レーン４．
８に溶出ｆｉｋ入ｎずにＰＣＲ法會行上行ものである。
Ｍは Ｘ１７４ＤへＡｉ制限酵素Ｈｉｎｃ で完全消
化して得らｎた分子量マーカーであ夛、Ａ、、 Ｂ、
Ｃ，Ｄ、に対応する塩基対の数である。
化して得らｎた分子量マーカーであ夛、Ａ、、 Ｂ、
Ｃ，Ｄ、に対応する塩基対の数である。
大腸菌がサンプル中（尿中）に含まｎている懸濁液を本
発明による方法を実施した後の電気泳ａパターンを第２
Ｉ１８１１のレーン２に示す。その結果４９１塩基対の
位置にバンドが出現した。こｎは同時に電気泳動し之ポ
ジティブコントロールサンデ／Ｌ／（２区のレーン３）
と同じ位置であることから大、偶ｄＭｙｔ特異的に検出
でき次ことがわかる。ここで言うポジティブコントロー
ルとに例えば大腸菌の場合は大腸菌ＡＴＣＣ２３５１９
ｋ液体培地中で純培養し之もの？＃素、界面活注剤で浴
薗した後フェノール、クロロ＊ ｐ ム抽出エタノール
沈、搬を施して得たＤＮＡ溶ｇ？用いたものである。７
°ロチウス菌の場合も同様にして入手したもの盆用い念
。
発明による方法を実施した後の電気泳ａパターンを第２
Ｉ１８１１のレーン２に示す。その結果４９１塩基対の
位置にバンドが出現した。こｎは同時に電気泳動し之ポ
ジティブコントロールサンデ／Ｌ／（２区のレーン３）
と同じ位置であることから大、偶ｄＭｙｔ特異的に検出
でき次ことがわかる。ここで言うポジティブコントロー
ルとに例えば大腸菌の場合は大腸菌ＡＴＣＣ２３５１９
ｋ液体培地中で純培養し之もの？＃素、界面活注剤で浴
薗した後フェノール、クロロ＊ ｐ ム抽出エタノール
沈、搬を施して得たＤＮＡ溶ｇ？用いたものである。７
°ロチウス菌の場合も同様にして入手したもの盆用い念
。
ポジティブコントロールによるバンドと同じ長さのバン
ド（４６１塩基対）が検出できたことから標的菌が特異
的ＶＣ＠呂できたことがわかる。
ド（４６１塩基対）が検出できたことから標的菌が特異
的ＶＣ＠呂できたことがわかる。
上記結果からこの発明の細菌検査法によれば尿１ｍｌに
大腸菌、プロテウス菌が少なくとも１０’個含′１ｆ′
してい九は上記方法にょシ簡便かつ５時間以内という短
時間で検出できることがわかった。
大腸菌、プロテウス菌が少なくとも１０’個含′１ｆ′
してい九は上記方法にょシ簡便かつ５時間以内という短
時間で検出できることがわかった。
（トフ 発明の効果
不発明に示した方法を用いることで細菌尿のような生体
試料中に含ま几るＤＮＡ；２含んだ菌体成分を入手する
ことができる。
試料中に含ま几るＤＮＡ；２含んだ菌体成分を入手する
ことができる。
ｉｒ＝、４−
Ｍ発明（係る細Ｍ険査方法では、迅速かつ簡丈′ｆｘ第
１の発明に係る菌体成分採取方法を採用しかつ、不すメ
ラーゼ連鎖反応ｒ用い＠ｔめ横置法全体としても２便な
ものとなり、５時間以内という短時間で目的の病原菌ｒ
同定することができる。
１の発明に係る菌体成分採取方法を採用しかつ、不すメ
ラーゼ連鎖反応ｒ用い＠ｔめ横置法全体としても２便な
ものとなり、５時間以内という短時間で目的の病原菌ｒ
同定することができる。
第１区は、各々この発明の菌体成分採取方法を実施した
過程？示す説明図である。 第２凶にこの発明の方法ｒ実施した麦の電気泳動パター
ンである。
過程？示す説明図である。 第２凶にこの発明の方法ｒ実施した麦の電気泳動パター
ンである。
Claims (1)
- （１）細菌尿中の細菌をフィルター上に分離することと
、 前記フィルターに溶菌液を流通させて菌体成分を採取す
ることと、採取した菌体成分を含む溶液をポリメラーゼ
連鎖反応法に付して、所望の菌のＤＮＡを増幅すること
と、 前記増幅したＤＮＡを用いて前記懸濁液中の所望の菌の
有無を検査することと、 を含む尿路感染症原因菌の検査方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2144195A JPH0436197A (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | 尿路感染症原因菌の検査方法 |
| EP91108811A EP0461477A1 (en) | 1990-05-31 | 1991-05-29 | Method of bacterial examination and apparatus therefor |
| KR1019910008959A KR950010187B1 (ko) | 1990-05-31 | 1991-05-30 | 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2144195A JPH0436197A (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | 尿路感染症原因菌の検査方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0436197A true JPH0436197A (ja) | 1992-02-06 |
Family
ID=15356425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2144195A Pending JPH0436197A (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | 尿路感染症原因菌の検査方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0436197A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011512861A (ja) * | 2008-03-14 | 2011-04-28 | ビオメリュー | 凝集反応による液体培地中の微生物のリアルタイム検出のための方法 |
| JP2018151392A (ja) * | 2007-10-10 | 2018-09-27 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドＰｏｃａｒｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． | 光学分析装置及び流体サンプル中の微生物のタイプと量とを同定する方法 |
-
1990
- 1990-05-31 JP JP2144195A patent/JPH0436197A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018151392A (ja) * | 2007-10-10 | 2018-09-27 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドＰｏｃａｒｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． | 光学分析装置及び流体サンプル中の微生物のタイプと量とを同定する方法 |
| US10656140B2 (en) | 2007-10-10 | 2020-05-19 | Pocared Diagnostics Ltd. | System for conducting the identification of bacteria in urine |
| JP2011512861A (ja) * | 2008-03-14 | 2011-04-28 | ビオメリュー | 凝集反応による液体培地中の微生物のリアルタイム検出のための方法 |
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