JPH0436656A - 活性化ｔ細胞及び／又はヘルパーｔ細胞の分離材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リンパ球を構成する成分のうち、ヘルパーＴ
細胞又は活性化Ｔ細胞を分離するための分離材に関する
。上記分離材は、免疫異常が関与する疾患の診断および
血液体外循環治療等に利用可能である。

（従来技術とその問題点） リンパ球が生体の免疫機構において中心的な役割を果す
ことは良く知られている。リンパ球はＢ細胞、Ｔ細胞、
非Ｂ非Ｔ細胞の３つのサブポピユレーションに大別され
るが、機能的に重要なＴ細胞は更にヘルパーＴｗＵ胞、
サプレッサーＴ細胞なとのサブセットに分類される。ま
たＴ＠胞は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体との結合によって活性
化Ｔ細胞と非活性化Ｔ細胞とに識別され、それぞれには
前記サブセットで分類されるヘルパーＴ細胞とサプレッ
サーＴ＠胞か含まれる。

したがって本発明が分離の対象とする活性化Ｔ細胞及び
／又はヘルパーＴＭＪ胞とは、活性化サプレッサーＴ細
胞及び／又は活性化ヘルパーＴ細胞及び／又は非活性化
ヘルパーＴ細胞を指す。

近年、活性化Ｔ＠胞か慢性関節リウマチ（Ａｒｔｈｒｉ
ｔｉｓ　　Ｒｈｅｕｍ　　３１：８３４−８４３．１９
８８）、全身性エリテマトーデス（Ｊ、Ｒｈｅｕｍａｔ
ｏｌ　　１５：９４６−９５１．１９８８）強皮症（Ａ
ｎｎ　　ＲｈｅｕｍＤｉｓ　　４９：４０−４５．１９
９０）、多発性硬化症（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　Ｔｏ
ｄａｙ　　１０　：１０４−１０７．１９８９）ＨＴＬ
Ｖ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　Ｍｙｅｌｏｐａｔｈ
ｙ（ＲＡＭ）（Ａｎｎ　　Ｎｅｕｒｏｌ　　２４：２８
０−２８２，１９８８）、１型真性糖尿病（Ｎ。

Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、Ｍｅｄ、　　３０６：７８５−７８
７．９８２）などの疾患の病態に深く関与することが報
告されている。また各種の自己免疫疾患においてヘルパ
ーＴ細胞数とサプレッサーＴ細胞数の比が病態に関与す
ることも知られている。

以上のような免疫異常が関与する疾患において、活性化
Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴｗＪ胞を簡便に分離するこ
とが可能となれば、診断および血液体外循環治療等に有
力な手掛りを与える。しかしながら現在までのところ、
活性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞を簡便に分離で
きる材料および分離方法はほとんど報告されていない。

従来技術についてみると、繊維による白血球の分離・回
収・除去（特開昭５４−１１９０１３、特開昭６０−１
９３４６８、ＷＯ３７−０５８１２等）およびリンパ球
の分離・回収・除去（特開昭５５−６４５２等）、材料
によるＢ１Ｂ胞とＴ細胞の分離・回収・除去（特開昭５
８−１７０７１７、特開昭５９−２１６５８４等）など
があるが、いずれもリンパ球サブセットの分離に関して
は何ら開示していない。また理論的には、活性化Ｔ細胞
に対してはＬｅｕ　　ＨＬＡ−ＤＲ、ヘルパーＴ細胞に
対しては０ＫＴ４、Ｌｅｕ３ａなど、対応するモノクロ
ーナル抗体を不溶性担体に固定することにより、活性化
Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞を分離しつる分離材が
得られる。しかしながらこの方法ではモノクローナル抗
体が高価かつ安定して多量に入手することが困難である
こと、不溶性担体への固定時および滅菌時の抗体の変性
、失活及び血液体外循環治療時に抗体が微量ながら溶出
する危険性がある、等多くの問題がある。

（発明の目的） 本発明の目的は、モノクローナル抗体によらずにリンパ
球の中の活性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞を簡便
に分離するための分離材を提供することにある。

（発明の構成および作用） 本発明者等は、リンパ球の中の、種々の疾患の病態に深
く関与していると思われる活性化Ｔ＠胞及び／又はヘル
パーＴ細胞Ｂ胞を選択的に粘着させて分離するための分
離材の開発を行ってきた結果、い出し、本発明を完成す
るに至った。

即ち本発明は、表面に塩基性官能基を有する水不溶性固
体からなる、活性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の
分離材である。

本発明において水不溶性固体とは、全体として実質的に
水に不溶性である固体のことを言うものであり、水溶性
の低分子物質または高分子物質が、水に不溶性の固体に
結合されており水中に溶は出さないようになっているも
のも含む。実質的に水に不溶性であることの目安として
は、各種の医療用具について規定されている水を抽出溶
媒とした溶出物試験に合格することがあげられる。

本発明の分離材は、水不溶性固体の表面に塩基性官能基
を有する必要がある。理由は必ずしも明らかではないが
、リン酸緩衝液から血液まで、通常のリンパ球浮遊液中
において、塩基性官能基は正荷電を有し、一般に負荷電
を有する各種ｍ胞、特にリンパ球を静電的に吸着するも
のと考えられる。各種リンパ球の中で、活性化Ｔ細胞及
び／又はヘルパーＴ細胞が選択的に粘着する理由は、活
性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞において、他のリ
ンパ球成分と比較して負電荷の量が多いこと、また固体
表面に対する粘着性自体が高いことなどが推定される。

本発明でいう塩基性官能基としては、第１級アミノ基、
第２級アミノ基、第３級アミノ基、４級アンモニウム基
、ピリジル基やイミダゾリル基などの含窒素芳香環基等
があげられる。

本発明の分離材においては、水不溶性固体の表面に塩基
性官能基と共に親水性基を有することが好ましい。親水
性基を有することにより水不溶性固体の表面はより親木
的になり、非特異的なリンパ球サブセットの粘着が抑制
され、活性化ＴＭＪ胞及び／又はヘルパーＴ細胞の選択
的な粘着における選択性が向上する。

本発明でいう親水性基としては、ヒドロキシル基、アミ
ド基、ポリエチレンオキシド鎖などがあげられる。

本発明の分離材においては、水不溶性固体の表面に塩基
性官能基とともに酸性官能基を有することも好ましい。

酸性官能基は通常のリンパ球浮遊液中において負荷電を
有するので非特異的なリンパ球成分の粘着が抑制され、
活性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の選択的な粘着
における選択性が向上する。

本発明でいう酸性官能基としては、カルボキシル基、ス
ルホン酸基、リン酸基などがあげられる。

本発明のリンパ球サブセットの分離材において、水不溶
性固体の表面における塩基性官能基の量の好ましい範囲
は、共存する親水性基や酸性基の種類および量によって
影響を受けるが、−数的には、分離材の表面層において
乾燥状態の重量あたりの塩基性官能基中の塩基性の窒素
原子の含量として０．２か１０重量％である。上記の塩
基性窒素原子の全量か０２重量％より小さいと分離材に
対して活性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の粘着性
が小さすきて、これらの細胞の粘着による分離が効率よ
く行えなくなってしまう。また、上記塩基性窒素原子の
含量が１０重量％より大きいと、非特異的なリンパ球成
分の粘着が多くなるために、目的とする活性化Ｔ＠胞及
び／又はヘルパーＴ細胞の分離における選択性か低くな
ってしまう。上記の塩基性窒素原子の含量のより好まし
い範囲は０．５から５重量％であり、さらに好ましくは
１から３重量％である。なお、水不溶性固体の表面に親
水性基や酸性基が多量に存在する場合の好ましい上記の
塩基性窒素原子の含量の範囲は、親水性基や酸性基が多
量に存在しない場合に比較して、塩基性窒素原子含量が
多くなる。

本発明でいう分離材の表面層とは、リンパ球と相互作用
し得る範囲の分離材の表面部分のことを本発明の分離材
において、水不溶性固体表面における塩基性官能基の分
布状態は、均一に分布していてもよいし不均一に分布し
ていてもよい。ミクロ不均一に分布しているとリンパ球
成分のうちの非特異的粘着を抑制して好ましい場合があ
る。

本発明の分離材の形状としては、粒子状、繊維状、中空
糸状、膜状、多孔質膜状、などいずれの公知の形状も用
い得る。

粒子状の分離材の場合は、分離材を特定の容器に充填し
て分離器を作成する場合に分離材を均に充填しやすく、
従ってバラツキの少ない精密な分離がしやすくなるとい
う点で好ましい。粒子径に関しては、３０〜６００μｍ
が好ましい。

繊維状の分離材の場合は、取扱い性が良く、また特定の
容器に充填して分離器を作成した場合に一般に空隙率が
大きく圧力損失が小さくなるために、分離が迅速に行え
るという点で好ましい。繊維の集合状態としては、綿状
の繊維塊よりも織布または不織布の方が繊維の充填状態
を均一にしやすく、また圧力損失をより小さくできるの
で好ましい。特に繊維の径が小さい場合には不織布形状
が好ましい。また、繊維径に関しては１〜６０μｍが好
ましい。ｍ組径が１μｍ未満であると、非特異的なリン
パ球サブセットの粘着か多くなるために、目的とする活
性化Ｔｉ１ｌ胞及び／又はヘルパーＴ細胞の分離におけ
る選択性が低くなってしまう。一方、繊維径が６０μｍ
を越えると、単位体積あたりの分離材の表面積が小さす
ぎて、分離の効率が低くなってしまう。より好ましい繊
維径の範囲は１．５〜１５μｍであり、さらに好ましく
は３〜８μｍである。

多孔質膜状の分離材の場合は、材料表面へのリンパ球の
粘着効果の他に、多孔質の孔径によるふるい分けの効果
も利用することができるという点で好ましい。多孔部の
孔径は、３０〜６０μｍが好ましい。

本発明の分離材は、各種の公知の水不溶性固体の表面に
化学反応によって塩基性官能基や必要に応じて親水性基
、酸性基などを導入するか、これらの基を有する材料を
別途製造しておきこれをコーティング等の手段により物
理的に水不溶性固体の表面を覆う、等の方法によって製
造される。

上記の化学反応の具体的な方法としては、水不溶性固体
の表面に必要に応じて化学反応のための活性基を導入し
ておき、塩基性官能基や必要に応じて親木性基、酸性基
などを有する化合物をカップリングさせる方法や、上記
塩基性官能基等を有する千ツマ−を表面グラフト重合さ
せる方法などがある。

本発明の分離材は、リンパ球浮遊液の人口及び出口を有
する適当な容器に分離材を充填して分離器として使用す
るのが一般的である。

かくして得られた本発明の分離材を内蔵する分離器にリ
ンパ球浮遊液を通過させると、活性化Ｔ細胞及び／又は
ヘルパーＴ細胞が分離材に捕捉され、残りの成分を含む
液が分ｌｌＩ器出口より流出する。リンパ球浮遊液を本
発明の分離材に接触させる方法としては上記の如きクロ
マトグラフィー的操作が好ましいが、本発明の分離材を
リンパ球浮遊液中ｒ浸漬する方法も考えられる。本発明
の分離材を用いてリンパ球浮遊液処理を行う際の操作温
度は、細胞成分に障害を与えない温度であればよく、室
温（１５〜２５℃）から３７℃くらいまでが好ましい。

本発明の分離材を用いてリンパ球浮遊液から活性化Ｔ細
胞及び／又はヘルパーＴ細胞を分離する場合には、リン
パ球浮遊液を本発明の分離材に接触させた後に、表面に
酸性官能基を有する水不溶性固体に接触させることが好
ましい場合がある。

本発明の分離材を通過したヒトリンパ球浮遊液を、蛍光
物質を結合させた抗体を結合させることによりリンパ球
成分を分析する場合には、本発明の分離材を通過してき
たリンパ球に対し、抗体が非特異的に吸着してしまい、
リンパ球成分の分析が困難になってしまうことがある。

このような場合、本発明の分離材を通過したリンパ球を
続いて表面に酸性官能基を有する水不溶性固体に接触さ
せることにより、リンパ球に対する抗体の非特異的吸着
が解消されるのである。表面に酸性官能基を有する水不
溶性固体を本発明の分離材と併用する場合、前記酸性官
能基を有する水不溶性固体を、本発明の分離材と一緒に
該分離材の下流側に１つの分離容器内に充填しても良い
し別の容器に充填して本発明の分離材からなる分離器の
下流に直列につないでも良い。

本発明においてリンパ球浮遊液とは、リンパ球を生理食
塩液、リン酸緩衝液、血漿などの生理的液体に浮遊させ
たものを言い、ヒトまたは動物の末梢血、血液を遠心分
離等で分離して得られるリンパ球を有する分画、リンパ
液なども含まれる。

末梢血等においては、クエン酸、ヘパリンなどの抗凝固
剤を添加しておくのが一般的である。

本発明の分離材を用いて、リンパ球浮遊液を分離すると
、本発明の分離材に活性化Ｔｌｌ１ｌＩ胞及び／又はヘ
ルパーＴ細胞が選択的に粘着して捕捉される。粘着した
細胞成分は適当な方法により分離材から脱離させて回収
することもできる。

分離材に粘着した活性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細
胞の脱離・回収は、分離器に生理的液体を勢いよく流し
たり、分離器に振動を加えながら流すことによって、或
いは、分離器から分離材を取り比して生理的液体中で激
しく揺する等の操作によって、脱離細胞成分の浮遊液を
得るという形態で行われる。

以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明する
。

（実施例１および比較例１．２） ２−ヒドロキシエチル　メタアクリレート（ＨＥＭＡ）
の単独重合体ＨＥ−０、ＨＥＭＡとジエチルアミノエチ
ルメタアクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）の共重合体ＨＥ−
２０（２０は共重合体中のＤＥＡＥＭＡ単位の含量モル
％を表わす）、及びＨＥＭＡとメタアクリル酸（ＭＡＡ
）の共重合体ＨＡ−２０（２０は共重合体中のＭＡＡ単
位の含量モル％）を通常の溶液ラジカル重合によって合
成した。

重合条件としては、エタノール中の組子ツマー濃度１モ
ル／Ｉｔで開始剤としてアゾイソブチロニトリル（ＡＩ
　ＢＮ）１／２００モル／β存在下、６０℃で８時間重
合反応を行った。得られたポリマーの塩基性窒素原子の
含量を元素分析によフて求めた。平均直径７．２μｍの
ポリエチレンテレフタレート繊維よりなる不織布（１０
０ｇ／ｍ２目付）を直径１３ｍｍの円形に切断し、これ
を上記のポリマーの０．１％エタノール溶液に浸した後
、不織布に吸収された余分なポリマー溶液は押ししぼっ
て除去し、最後に乾燥空気により乾燥させた。

このようにして得られた表面被覆不織布を分離材として
、これをフィルターホルダー（柴田科学器械工業（株）
製）にセットして分離器を作成した。

実施例１ではＨＥ−２０コ一ト不縄布２枚（人口側）と
ＨＡ−２０コ一ト不織布２枚（出口側）を重ねてセット
し、比較例１ではＨＥ−０コ一ト不織布４枚をセットし
、比較例２ではＨＡ−２０コ一ト不織布４枚をセットし
た。

上記のように作成した分離器に、患者から採血した末梢
血（慢性関節リウマチの患者、強皮症の患者、ＨＴＬＶ
−Ｉ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＭｙｅｌｏｐａｔｈｙの患
者、ＨＴＬＶ−Ｉのキャリヤー、及び結節性多発動脈炎
の患者の血液サンプル合わせて１０サンプル）（１０％
クエン酸添加）を室温にて、０．６ｍｊ２７ｍｉｎの速
度でシリンジポンプを用いて流した。

分離器に流す前後での血液中のリンパ球成分の分析は、
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａ
ｔｅ　（ＦＩＴＣ）を結合させたＣＤ４抗体、ＦＩＴＣ
を結合させたＣＤ８抗体、及びｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒ
ｉ　ｎ　（ＰＥ）を結合させた抗体ＨＬＡ−ＤＲ抗体（
以上の抗体はＣｏｕｌｔｅｒ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
社より人手）をサンプルの血液に加えて、４℃で３０分
間インキュベートした後、溶血剤（Ｃｏｕｌｔｅｒ　　
１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ社より入手）を添加し、充分に洗
浄した後に得られた細胞をリン酸緩衝液に浮遊させ、フ
ローサイトメーター（ＦＡＣＳｔａｒ。

Ｂｅｃｔｏｎ　　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて解
析した。

表１に実施例１及び比較例１．２の分離器に前記患者か
ら採取した血液を流した際の分離器の前後にあける各種
細胞成分の含有量の変化を示す。

ｆｔ　オ、表１においてＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＤＲ＋
はそれぞれ以下の意である。

ＤＲ”：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体陽性細胞 （活性化Ｔ細胞他の細胞成分を表わす）ＣＤ４”　　：
ＣＤ４抗体陽性細胞 （ヘルパーＴ細胞他の細胞成分を表わす）ＣＤ８”　：
ＣＤ８　　抗体陽性細胞 （サプレッサーＴ細胞他の細胞成分を表わす） 実施例１において、ＣＤ４抗体陽性細胞とＣＤ８抗体陽
性細胞との比は有意に減少し、ヘルパーＴ細胞かサプレ
ッサーＴ＠胞に比較して分離材に選択的に粘着している
ことがわかる。また、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体陽性細胞の比
率も有意に減少しており、活性化Ｔ細胞が選択的に粘着
していることが分かる。更に、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体陽性
細胞中の、ＣＤ４抗体閣性細胞とＣＤ８抗体陽性細胞の
比率も有意に減少しており、活性化サプレッサーＴ！Ｂ
ＩＷ！に比べて活性化ヘルパーＴ細胞が選択的に粘着し
ていることが分かる。

方、比較例１．２においては、実施例１に見られるよう
な有意な変化はなく、選択的な粘着は起こっていないこ
とが分かる。なお、前記患者のサンプル血液１０例と健
常人の血液１０例についてリンパ球細胞の成分を比較す
ると抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体陽性リンパ球（活性化Ｔｌ１ｌ
ｆＩ胞他）の比率と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体陽性細胞中のＣ
Ｄ４抗体陽性リンパ球（ヘルパーＴ細胞他）とＣＤ８抗
体陽性リンパ球（サプレッサーＴ細胞他）の比率が、患
者の方が有意に高いことがわかる。

（発明の効果） 本発明の分離材を用いることにより、簡単な操作でリン
パ球浮遊液から活性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞
が選択的に分離することが可能となる。

本発明の分離材は、免疫異常が関与する各種疾患の診断
および血液体外循環治療、また免疫の基礎研究などに有
力な手段を提供するものである。

曳理人　弁理士　佐々木　俊哲

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 表面に塩基性官能基を有する水不溶性固体からなる、活
   性化Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の分離材。