JPH04368332A - 動物の悪性腫瘍抑制剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人を含む動物の悪性腫
瘍抑制剤の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】動物の悪性腫瘍抑制剤及びその製造方法
は、特開昭５９−３３２２３号，特開昭６０−２８９３
０号として提案されている。

【０００３】そして、悪性腫瘍細胞の細胞培養で発見さ
れた悪性腫瘍細胞増殖抑制活性物質は分離同定を経て、
その主成分がＬ−乳酸オリゴマー及びＬ−乳酸の環状低
縮合物または若干修飾された低分子量Ｌ−乳酸縮合体で
あることが判ってきた。

【０００４】Ｌ−乳酸（α−ヒドロキシプロピオン酸）
オリゴマーの製法には種々あるが、低分子量オリゴマー
は、粘着性が強く、相互溶解及びマスキング効果がある
ために、活性部単離が困難であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ−
乳酸オリゴマーまたは若干修飾された低分子量Ｌ−乳酸
縮合体及びＬ−乳酸の環状低縮合物を主成分とする人を
含む動物の悪性腫瘍抑制剤を製造する方法を提供するこ
とにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の動物の悪性腫瘍
抑制剤の製造方法は、常圧又は減圧下でＬ−乳酸を窒素
ガス等の不活性ガスを導入しながら加熱し、先ずモノマ
ー共存水、続いて縮合反応で生成した水分を反応系外に
溜去し、得られたＬ−乳酸低縮合物をメタノールに溶解
懸濁させ、一定温度の雰囲気中で平衡化後瀘別し、該メ
タノール溶液を減圧乾燥した後、アセトニトリルに溶し
、予めＰＨ２〜３の１０〜２５％アセトニトリル水で平
衡化しておいた逆相系ＯＤＳカラムにかけ、アセトニト
リル濃度を順次上げてステップワイズ溶出を行い、ＰＨ
２〜３の４０〜５０％アセトニトリル水溶出後、８０％
以上のアセトニトリル濃度で溶出した分画を採取する。

【０００７】また、常圧又は減圧下でＬ−乳酸を窒素ガ
ス等の不活性ガスの雰囲気下で加熱し、先ずモノマー共
存水、続いて縮合反応で生成した水分を反応系外に溜去
し、得られたＬ−乳酸低縮合物をメタノールに溶解懸濁
させ、一定温度の雰囲気中で平衡化後瀘別し、該メタノ
ール溶液に水を１／３〜１／４量加え、中和し、減圧乾
燥した後、アセトニトリルに溶かし、予めアセトニトリ
ルで洗い、水で平衡化しておいたＯＤＳカラムにかけ、
水でモノマーを溶離後、２０〜２５％アセトニトリル水
でナトリウム塩を溶出し、次いでアセトニトリルで残り
を溶出する。活性部分は２５％アセトニトリル溶出部で
ある。

【０００８】常圧下加熱は１５０℃以上で行う。

【０００９】減圧下加熱は１２０℃以上で段階的に圧力
を下げて行われる未反応Ｌ−乳酸モノマー及び低沸点生
成物の溜去は、常圧下、低温で加熱し、モノマーの共存
水及び縮合反応で生成した水分を溜去後、減圧と昇温と
を２〜３段階で行い２０ｍｍＨｇ以下，１５０〜１７０
℃まで進め、最後に１０ｍｍＨｇ以下１８０〜２００℃
で１〜２時間加熱して行なう。

【００１０】Ｌ−乳酸（α−ヒドロキシプロピオン酸）
は室温では液体で、通常２分子が水素結合で結合した状
態で存在し、その濃厚溶液中にはｌａｃｔｉｃ　　ａｎ
ｈｙｄｒｉｄｅ（２分子縮合したもの）が１０〜１５％
含まれる。Ｌ−乳酸は、加熱により容易に脱水縮合し、
重合体に変化し固化する。縮合度は共存する水分量及び
反応温度により調節できるが、水の溜去時に蒸発熱が奪
われて反応液温度が低下するので、水分溜去には加熱温
度に見合った蒸発速度が必要になる。

【００１１】ここで必要とするＬ−乳酸オリゴマーは、
分子量１３００以下でプロピレングリコールに溶解する
か、少なくとも分散液となるものでなければならない。 例えば１８５℃で常圧下で攪拌し、窒素ガスを導入しな
がら３時間加熱しただけでも得られるし、１６０℃で温
度一定にし、反応系内の圧力を５００，３００，１００
，５０ｍｍＨｇと１〜２時間間隔で減圧してしていって
もよいが、常圧低温（例えば油浴温度１４５℃）で共存
水をゆっくり３時間前後かけてＬ−乳酸モノマー拾数％
になるまで溜去後、０．５〜１時間かけて１５０ｍｍＨ
ｇまで減圧して２．５〜３時間保ち、次いで１０ｍｍＨ
ｇ以下、１５０〜１６０℃で３時間保ち、最後に１８０
〜２００℃で１〜２時間反応させることにより、モノマ
ーの殆どない３，４，５…１４，１５と連続した縮合度
のオリゴマーが得られる。また、最後に１８０〜２００
℃に加熱させることによって低沸点物質の溜去も行われ
る（図１）。

【００１２】これらの反応物は室温では固化し、再溶解
が困難になるので、まだ流動性のあるうち一定量のメタ
ノールに溶解分散させるか、仕込量の１／５量のエタノ
ールを加え均一溶液とした後、メタノールを加え、溶解
分散させるか、または固化したものを冷却装置付きの破
砕器で破砕し、一定量のメタノール中において５０〜６
０℃で攪拌して溶解分散させ、一定温度（２５℃）雰囲
気中で平衡化させたのち瀘別し、減圧乾燥してアセトニ
トリル溶液とし、逆相系ＯＤＳカラムにかけて分画する
。即ち予めアセトニトリル−ｐＨ２〜３ＨＣＬ水溶液（
２５：７５）（以下２５％アセトニトリル（酸性）とい
う）で平衡化しておいたＯＤＳカラムに、アセトニトリ
ルに溶した反応物のメタノール溶解分をのせ、先ず１５
〜２５％アセトニトリル（酸性）、続いて４０〜５０％
アセトニトリル（酸性）で溶離後、８０〜１００％アセ
トニトリル（酸性）で溶離し、抑制効果を有する画分を
得る（図５）。

【００１３】一般に反応液は直鎖状縮合物と環状縮合物
（ラクチド）との混合物より成り、縮合度ｎは１７くら
いまであり、これらの完全な相互分離は現在のところ不
可能で、単一物質として特定出来ないが抑制効果に程度
の違いはあってもそれぞれ作用しあっているものと思わ
れる。又、縮合度ｎ≧４の環状縮合物（ラクチド）と直
鎖状縮合物とは大まかには分けられるが、ｎ＝２，３の
ラクチドは直鎖状縮合物と挙動を共にし分離することが
できない。このことは、親和力が強いためばかりでなく
、閉じ込められた系内で一種の可逆平衡が成立している
のではないかと思われる。ここで対照とする分子量約１
３００以下の縮合物に関しては、直鎖状物はメタノール
に、環状物はアセトニトリルに、それぞれよく溶けるが
、ＯＤＳカラムで４０％アセトニトリル（酸性）で溶離
する粘着性の強い画分はメタノールにもアセトニトリル
にも溶解しにくい性質を有する。

【００１４】また、反応液を中和して２５％アセトニト
リル水溶液でＯＤＳカラムより溶離すると、活性部分が
溶出してくるが環状縮合物（ラクチド）はアセトニトリ
ル成分の多い溶離液でないと溶離してこない（ラクチド
の分離）。

【００１５】なお、Ｌ−乳酸（α−ヒドロキシプロピオ
ン酸）低分子オリゴマーは、吸着性が強いためにＨＣＬ
以外の触媒を用いる製法は精製が困難なため、安全性の
面からもＨＣＬ触媒及び無触媒系反応を用いる。

【００１６】

【実施例】実験１ １．製法 （１）　　Ｌ−乳酸５００ｍｌを下降形接続管、攪拌棒
、窒素ガス導入管を備えたセパラブルフラスコに入れ、
マントルヒーターで１４５℃で３時間、続いて１４５℃
，１５０ｍｍＨｇで２時間加熱した。溜出水は保温した
下降形接続管を経て還流冷却器付フラスコに入り冷却さ
れフラスコに貯る。次に、３０分かけて数ｍｍＨｇまで
減圧し、１５５℃で３時間保った後、１８５℃で１．５
時間加熱して目的のオリゴマーを得た（図１）。そして
、まだ流動性のあるうちに２倍量のメタノール中に注入
攪拌し、２５℃の室で放冷平衡化した。

【００１７】（２）　　（１）と同様な装置を用い、１
５５℃で常圧、３時間加熱後、１６０℃、４０ｍｍＨｇ
で３時間、最後に１８５〜１９０℃、数ｍｍＨｇで１．
５時間加熱し同様なオリゴマーを得た。

【００１８】（３）　　（１）と同様な装置を用い、１
８５℃、常圧下で３時間加熱したところ、低沸点物質が
共存した（図２）。

【００１９】（４）　　同様に１６０℃に温度一定にし
て、真空度を５００→３００→１００→５０ｍｍＨｇと
変え、各１時間保った（図３）。

【００２０】（５）　　同様に１６０℃、常圧下で３時
間加熱後、減圧し、３．５ｍｍＨｇ、１８５℃で１．５
時間加熱した（図４）。

【００２１】２．精製 （１）　　メタノール分散液を瀘紙で瀘過（室温２５℃
）し、メタノール可溶分を取った後減圧乾燥し、アセト
ニトリル溶液とし、アセトニトリル−水（ＰＨ２．０　
　ＨＣＬ）＝（２５：７５）で平衡化しておいた逆相Ｏ
ＤＳ（ケムコＬＣ−ｓｏｒｂ　　ＳＰ−Ｃ−ＯＤＳ）カ
ラムにかけ、アセトニトリル−水（ＰＨ２．０　　ＨＣ
Ｌ）＝（２５：７５），（５０：５０），（１０：０）
の順にステップワイズ溶出し、アセトニトリル溶出分を
得た。 そして、中和後、数回エタノール置換を行い、減圧乾燥
後、プロピレングリコールに溶解し抑制剤とした。

【００２２】（２）　　反応液のメタノール溶液を濾別
後、中和乾燥し、アセトニトリル溶液とし、水で平衡化
しておいたＯＤＳカラムにかけ、水−２０〜２５％アセ
トニトリル−アセトニトリルの順にステップワイズ溶出
する時、２０〜２５％アセトニトリル水で溶出してくる
画分が活性部であった。

【００２３】実験２ 毒性実験 試験マウス数：各１０ 方法 （１）　　ヌードマウス雌４週令の背側部皮下に抑制剤
を一日一回連続３回投与した。その後１０日経過を見た
結果、死亡率は０であった。 投与量：５０ｍｇ／０．５ｍｌＨ２　Ｏ（約２．５ｇ／
ｋｇ相当）

【００２４】（２）　　マウスＣ５７Ｂｌａｃｋ　　（
８週令）の尾部の血管に抑制剤を一日一回連続１０回投
与（ＩＶ）した。その後１０日経過を見た結果、外観的
変化はなく死亡率は０であった。 投与量：５０ｍｇ／ｍｌ溶液０．２ｍｌ（４００ｍｇ／
ｋｇ）

【００２５】（３）　　ピーグル犬　　雌　　６ヶ月令
　　体重７ｋｇに抑制剤を一日一回連続静脈注射（ＩＶ
）し、１０日間観察した結果、外貌に特別の異常反応は
認められなかった（臨床的変化なし）。 投与量：０．７ｇ（１００ｍ　ｇ／ｋｇ）

【００２６】
実験３ 悪性腫瘍抑制試験 Ａ．ヌードマウスＩＣＲ　　ＮＵ／ＮＵ　雌４週令の背
側部皮下に、人の悪性腫瘍細胞（株細胞）としてＨｅｌ
ａ　　Ｃｅｌｌ　　（人子宮頸部癌株細胞）及びＫＢ（
人鼻咽頭癌株細胞）を移植し、移植後３日目より、実験
群には抑制剤を一日一回計１１回連続投与し、対照群に
は生理的食塩水を同様に投与した。その後投与を停止し
、移植後７週目に腫瘍を取りだし秤量した。ただし、抑
制率は次式で与えられる。

【００２７】 抑制率＝（１−実験群の腫瘍重量ｇ／対照群腫瘍重量ｇ
）×１００％ 以下に、その結果を表として示す。

【００２８】

【表１】 （ｉ）　　Ｈｅｌａ　　Ｃｅｌｌ　　（人子宮頸部癌株
細胞）移植数　　：　　１×１０７　ヶ 投与方法：皮下投与（ｓｃ） 投与量　　：３０ｍｇ　　０．３ｍｌ　　（３日目より
）結果　　　　：対照群と実験群ともに５例の腫瘍重量
を以下に示す。

【００２９】 抑制率　　５７．１％

【００３０】

【表２】 （ｉｉ）　　　ＫＢ（人鼻咽頭癌株細胞）移植数　　：
　　１×１０７　ヶ 投与量　　：２０ｍｇ／０．２ｍｌ 結果　　　　：対照群と実験群ともに５例の腫瘍重量を
以下に示す。

【００３１】 抑制率　　５９．８％

【００３２】Ｂ．

【表３】マウスＣ５７Ｂｌａｃｋ　　雄（８週令）にＬ
ＬＣ（マウス肺癌細胞）１．０×１０６　ヶを移植（Ｓ
Ｃ）し、Ａと同一方法で移植翌日より１１回投与した。 結果　　　　：対照群と実験群ともに５例の腫瘍重量を
以下に示す。

【００３３】 抑制率　　４９．８％

【００３４】臨床例 方法：抑制剤１００ｍｇをプロピレングリコール１ｍｌ
に溶かした溶液（以下抑制剤液という）を作成し、体重
１ｋｇ当たり抑制剤３０ｍｇ（抑制剤液０．３ｍｌ）換
算量をビタミン剤、ブドウ糖等の点滴液に加えて混合し
、点滴静注した。投与は１日１回５回連続投与後３日間
中止し、９日目より又連日５回投与し、以後患者の状態
を時間経過と共に観察した。

【００３５】例１：胃癌 鶏卵大の腫瘍をもち、出血していた患者（６０歳男）に
抑制剤液１５ｍｌをブドウ糖点滴液５００ｍｌに混合し
、前記方法で投与したところ、５日目で薬効が現れ、出
血が停止し、食欲が出て体調が回復してきた。更に、レ
ントゲン検査で薬効を追跡し、腫瘍の縮小化が認められ
た。これは、胃カメラによっても確認された。

【００３６】例２：甲状腺癌 肥大した浸潤性腫瘍をもち、血液が浸潤し、リンパ節転
移した患者（５０歳男）に抑制剤液１５ｍｌをブドウ糖
点滴液５００ｍｌに混合し、同様に点滴静注した。投与
後６日目より血液等の浸潤が止まり、日時の経過と共に
肥大化した腫瘍及びリンパ節が縮小してきた。同時に体
力も回復し薬効に対する充分な有意さを示した。

【００３７】例３：肺癌 やはり大きくなった気管支癌の患者（５５歳男）に抑制
剤液１５ｍｌをブドウ糖点滴液５００ｍｌに混合し、同
様な方法で投与した。投与後５日目には効果が現れ、喀
痰中の血液は消失し、癌細胞は著しく減少し、全身状態
の改善が見られるようになった。２ヶ月後のＸ線検査で
は腫瘤は縮小し、同時に体力の著しい回復が見られた。

【００３８】例４：子宮癌 出血を伴う子宮頸癌患者に抑制剤液１２ｍｌをブドウ糖
点滴液５００ｍｌに混合し、同様な方法で投与した。投
与後４〜５日で出血が止まり、症状の改善が見られ、１
ヶ月経っても出血していない。２ヶ月後ＣＴスキャンに
より腫瘤の縮小化を確認した。 抑制効果に対する評価 反応液を中和してからＯＤＳカラムで分画した活性部分
（ＯＤＳ−２）は縮合度ｎが４以下の環状物（ラクチド
）と縮合度ｎが８以下の直鎖状縮合物のナトリウム塩よ
り成り、人子宮頸部癌株細胞Ｈｅｌａ　　ｓ−３を移植
したヌードマウスに１日１回皮下投与すると２〜３回投
与で効果が現れ、数回の投与で著しい抑制効果を示すよ
うになり、腫瘍の縮小へと移行するが、これを維持する
には連続投与する必要がある。

【００３９】これに対し、反応液をそのままＯＤＳカラ
ムで分画した活性部分（ＯＤＳ−８０）は環状縮合体を
含み、直鎖状縮合体と共に縮合度ｎが大きい所まで連続
（実用上ｎ≦１７）しており、投与後数日して抑制効果
が現れ初め、１０回投与後投与を止めても腫瘍の増殖は
認められないほど長期間有効性を示す。従ってＯＤＳ−
８０の場合、初めの５日間、１日１回投与後は４〜５日
間隔の投与で充分と思われるが、マウスでは代謝サイク
ルの違いから確認出来ない。

【００４０】α−ヒドロキシ酸、特にＬ−乳酸の縮合物
は生体内で容易に分解され体外に排出されてしまうこと
は、多くの研究者によって確認されているし、また筋肉
組織には常に疲労によって生じた乳酸が存在している。 また、乳酸アジドーシスを起こすほど、分解速度が早い
わけでもなく、薬理的に毒性なく有効量を連続して投与
でき、また副作用を考慮する必要もない。さらに腫瘍の
種特異性は認められない。

【００４１】

【発明の効果】本発明の動物の悪性腫瘍抑制剤製造方法
によって得られた悪性腫瘍抑制剤は、実施例で述べたご
とく、生体系に用いる毒性実験では生体に特別の異常は
なく、マウスに移植した悪性腫瘍細胞の増殖抑制試験に
おいては、投与開始数日で増殖が停止し、その後投与を
停止したにもかかわらず腫瘍は有意に縮小化し、さらに
臨床例からも患者の体力が回復し、腫瘍の縮小化が確認
された。また、皮下投与によって安定的に有効性を示す
ことから、生態において安定な持続制をもつ物質であり
、有効かつ安心して使用可能な抗癌剤として適したもの
である。

【００４２】そして、本発明の悪性腫瘍抑制剤製造方法
は、生態系を利用することなく、化学的方法によるもの
で、従来の製造方法に比べ極度の簡略化と時間の短縮、
材料費の節減が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例に係る無触媒系反応液（中和）
のＦＡＢ−ＭＳスペクトル

【図２】本発明の実施例に係る１８５℃常温下３時間加
熱した場合の反応液のＦＡＢ−ＭＳスペクトル

【図３】
本発明の実施例に係る１６０℃温度一定にしておいて５
００→３００→１００→５０ｍｍＨｇと減圧した場合の
反応液のＦＡＢ−ＭＳスペクトル

【図４】本発明の実施
例に係る１６０℃常圧下３時間加熱後１８５℃，３．５
ｍｍＨｇ下１．５時間反応した場合の反応液のＦＡＢ−
ＭＳスペクトル

【図５】本発明の実施例に係るＯＤＳカラムで分画した
無触媒系反応液の活性部のＦＡＢ−ＭＳスペクトル

【図
６】中和後のＯＤＳカラムで分画した活性部ＯＤＳ−２
のＦＡＢ−ＭＳスペクトル

【符号の説明】

Ｌ　　環状縮合物ラクチド Ｓ０　　　直鎖状縮合物 Ｓ　　同上ナトリウム塩 ２Ｌ　　ｎ＝２のＬ ２Ｓ　　ｎ＝２のＳ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　常圧又は減圧下でＬ−乳酸を窒素ガス
   等の不活性ガスの雰囲気下で加熱し、先ずモノマー共存
   水、続いて縮合反応で生成した水分を反応系外に溜去し
   、得られたＬ−乳酸低縮合物をメタノールに溶解懸濁さ
   せ、一定温度の雰囲気中で平衡化後瀘別し、該メタノー
   ル溶液を減圧乾燥した後、アセトニトリルに溶し、予め
   ＰＨ２〜３の１０〜２５％アセトニトリル水で平衡化し
   ておいた逆相系ＯＤＳカラムにかけ、アセトニトリル濃
   度を順次上げてステップワイズ溶出を行い、ＰＨ２〜３
   の４０〜５０％アセトニトリル水溶出後、８０％以上の
   アセトニトリル濃度で溶出した分画を採取することを特
   徴とする動物の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の製造方法。
2. 【請求項２】　　常圧又は減圧下でＬ−乳酸を窒素ガス
   等の不活性ガスの雰囲気下で加熱し、先ずモノマー共存
   水、続いて初期縮合反応で生成した水分を反応系外に溜
   去し、得られたＬ−乳酸低縮合物をメタノールに溶解懸
   濁させ、一定温度の雰囲気中で平衡化後瀘別し、該メタ
   ノール溶液に１／４〜１／３量の水を加え、中和後減圧
   乾燥し、含水アセトニトリルに溶かし、予めアセトニト
   リル、次いで水で洗滌しておいたＯＤＳカラムにかけ、
   水−２０〜２５％アセトニトリル水−アセトニトリルと
   イソクラチックに溶出する時、２０〜２５％アセトニト
   リルで溶出した画分を採取することを特徴とする動物の
   悪性腫瘍抑制剤の製造方法。
3. 【請求項３】　　常圧下加熱が温度１５０℃以上で行な
   われることを特徴とする請求項１または２記載の動物の
   悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の製造方法。
4. 【請求項４】　　減圧下加熱が温度１２０℃以上で段階
   的に圧力を下げて行われることを特徴とする請求項１ま
   たは２記載の動物の悪性腫瘍抑制剤の製造方法。
5. 【請求項５】　　常圧下、低温で加熱し、モノマー共存
   水及び縮合反応で生成した水分を溜去後、減圧と昇温と
   を２〜３段階で行い２０ｍｍＨｇ以下，１５０〜１７０
   ℃まで進め、最後に１０ｍｍＨｇ以下，１８０〜２００
   ℃で１〜２時間加熱して残存モノマー及び低沸点物質を
   溜去することを特徴とする請求項１または２記載の動物
   の悪性腫瘍抑制剤の製造方法。