JPH0437382B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学における総ビリルビン、複
合（conjugated）又は非複合（unconjugated）
ビリルビンの比色分析に関する。本発明は、更
に、この分析に有用な乾式分析要素に関する。 〔従来の技術〕 ビリルビンは、ヘモグロビンの減成生成物であ
る。健康な個人において、体内の老化又は損傷さ
れた赤血球から放出されるビリルビンは、排泄さ
れるか又は他の誘導体に分解される。しかしなが
ら、若干の場合には、過剰の溶血又は肝臓障害の
場合のようにビリルビンの過剰生成により体内に
過剰量のビリルビンが生じる。ヒトの身体内での
過剰量のビリルビンの存在は、常に、血清中のビ
リルビン濃度が著しく増加することを特徴とする
黄疽である。血液中に過剰量のビリルビンが存在
すると、体細胞内にビリルビン濃度を不所望に増
加し、種々の細胞現象を妨害することを示す証拠
はますます多い。肝臓及びその他の関連臓器の機
能に関する試験でビリルビン測定の臨床的診断の
意義は、明らかである。 ヒトの体液、例えば胆汁及び血清中には、ビリ
ルビンが若干の異なる形で存在し、これらの形は
一般に従来、複合ビリルビン（B_c、モノ−及び
ジ複合形）、非複合ビリルビン（B_u、間接ビリル
ビンとしても知られている）及びデルタビリルビ
ン（ビリプロテインとしても知られている）と言
われている。総ビリルビン含有量B_Tは、すべて
の形のビリルビンの和を表す。 ビリルビンに関する種々の比色分析は、公知で
ある。かつて、最も広く使用された分析操作は、
検出可能な顔料を形成するためビリルビンとジア
ゾニウム塩とのカツプリング反応を使用するジア
ゾ方法であつた。この方法は、欠点を有し、多年
にわたつて多くの変形及び改良が行われてきた。 他の分析方法は、黄色顔料であるビリルビンの
直接測定を含む。しかしながら、この技法は、ヘ
モグロビン及び液体試料の他の成分から分光妨害
を受けやすい。この方法は、また、ビリルビンが
結合して吸収強度及びピーク波長を移動させうる
蛋白質、例えばアルブミンから妨害を受ける。 従来技術における著しい進歩は米国特許第
4069017号明細書に記載されている。この明細書
に記載されているビリルビンの分析法には、試薬
層にビリルビンに結合して検出可能な生成物を生
じる反応性（interactive）媒染剤（mordant）を
含む乾式多層分析要素を用いて実施される。その
分析には他の反応性組成物は使用されない。要素
は、更に、多孔性拡散層及び輻射線遮断層を含
む。反応性媒染剤は、結合剤物質、例えばゼラチ
ン又はその誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、
ポリ（ビニルピロリドン）及びアクリルアミドポ
リマー（即ち、アクリルアミドのホモポリマー）
（15欄、７〜39行参照）中に分散されている。前
記特許の実施例（23欄）はマトリツクス物質とし
てゼラチンの使用を教示している。実際、このよ
うな、結合剤物質としてゼラチンを含むビリルビ
ン測定用分析要素が多年月にわたり市販されてい
る。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従来の分析要素は従来技術における進歩を示す
が、ビリルビン分析のために改善が望まれてい
る。これらの要素は、通常、独立の分析要素を50
個まで含むカートリツジとして販売されている。
長時間貯蔵した場合に要素が環境条件に敏感であ
るため、要素の中に均一な結果がしばしば得られ
ないで、バツクグラウンドの色が変化するため偏
倚を生じることが観察されている。 〔問題点を解決するための手段〕 複合、非複合又は総ビリルビンを測定する分析
要素は、ビリルビンに対する結合部位を少なくと
も１個有する正に帯電した反応性媒染剤（この媒
染剤はゼラチン又はその誘導体以外の、２〜20
ｇ／m²の量で存在する親水性結合剤物質に分散さ
れている）を含む、実質的にゼラチンを含まない
媒染剤層を含み、媒染剤以外のビリルビン用比色
及び蛍光反応性組成物を含まない。 複合、非複合又は総ビリルビンの分析方法は、 Ａ 複合又は非複合ビリルビンを含むと思われる
液体試料を、ビリルビンに対する結合部位を少
なくとも１個有する正に帯電した反応性媒染剤
（該媒染剤はゼラチン又はその誘導体以外の、
２〜20ｇ／m²の量で存在する親水性結合剤物質
に分散されている）を含む、実質的にゼラチン
を含まない媒染剤層を含み、媒染剤以外のビリ
ルビン用比色及び蛍光反応性組成物を含まない
分析要素と接触させ、 Ｂ 反応性媒染剤に結合した複合、非複合又は総
ビリルビンの量を測定する 工程を含む。 実施態様 本発明は、水性液体中のビリルビン（複合形若
しくは非複合形又は両者の総和）の測定に関す
る。殊に、本発明は、動物又はヒト、好ましくは
ヒトの生物学的流体を分析するため使用すること
ができる。このような流体は、全血、血漿、血
清、リンパ液、胆汁、尿、髄液、痰、汗等並びに
排泄物を包含するが、これらに限定されない。本
発明はヒト又は動物の組織、例えば骨格筋、心
臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄又は皮膚の流体調整物
を分析することもできる。 本発明方法は、多数の別個の層をその上に有す
る支持体を含む乾式多層分析要素を用いて実施さ
れる。このような支持体は、任意の適当な寸法安
定性で、好ましくは非体孔性で、200〜900nmの
波長の電磁線を透過する、透明な（すなわち、輻
射線透過性）物質である。特定の要素のため選択
される支持体は、意図する検出方法（例えば、反
射分光分析）と認容性であるべきである。有用な
支持体は、紙、金属箔、ポリスチレン、ポリエス
テル、ポリカーボネート、セルロースエステル及
びその他、従来公知の物質から製造することがで
きる。 本発明の分析要素の最外層は、任意の適当な繊
維若しくは非繊維物質又はその一方若しくは両方
の混合物から製造される多孔性拡散層である。こ
の帯域の空隙率及び平均孔径は、試験すべき流体
に応じて変動しうる。 有用な拡散層は、米国特許第4292272号明細書
に記載されているように適当な結合剤物質と混合
されているか又は布に織られた繊維状物質、米国
特許第3992158号、同第4258001号及び同第
4430436号明細書及び特開昭57（1982）−101760号
公報に記載されているような、ポリマー組成物又
は粒状物質、例えば結合接着剤を用いて又はこれ
を用いずに結合したビーズを使用して製造するこ
とができる。拡散帯域は等方性に多孔性である、
すなわち、孔度が粒子、繊維、ポリマーストラン
ドの間の連続空間又は孔によつて生じるように帯
域のどの方向でも同一であるのが望ましい。 本発明に係る分析要素は、１個より多くの層を
有していてよく、各層は同一又は異なる物質から
製造され、同一又は異なる孔度を有していてよ
い。 本発明の分析要素は、更に、適当な親水性結合
剤物質中に分配された輻射線遮断性顔料、例えば
二酸化チタン又は硫酸バリウムを含む輻射線遮断
層を含む。このような親水性結合剤物質は、ゼラ
チン及びその誘導体、多糖類、セルロース誘導
体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピ
ロリドン）、アクリルアミドポリマー及びその他、
従来公知のものを包含する。この結合剤物質は好
ましくはゼラチンである。 ビリルビンと結合して検出可能な生成物を生じ
るため必要であつた反応性媒染剤は、輻射線遮断
層の下に位置する媒染剤層に存在する。反応性媒
染剤及びこれを分配する親水性結合剤物質を以下
に詳述する。 他の層、例えば下塗層又はフイルタ層を、必要
に応じて、本発明の分析要素に含めることができ
る。要素中のすべての層は、一般に、相互に流体
接触（流体及び非媒染試薬及び反応生成物が隣接
層の重なつた領域の間を通過又は移動しうること
を意味する）している。 本発明の要素は、下記の反応性媒染剤以外に
は、ビリルビンの存在で比色又は蛍光測定される
応答を生じる反応性組成物を含まない。殊に、本
発明の分析要素は、ジアゾニウム塩及びビリルビ
ン測定に関する文献、例えば米国特許第4069016
号及び同第4548905号明細書に公知の検出可能な
物質（species）を形成する検出可能なリガンド
を含まない。 本発明の実施に有用な反応性媒染剤は、米国特
許第4069017号明細書に記載されている媒染剤及
び英国特許第2085581号明細書に記載されている
疎水性アミン（正に帯電した媒染剤になると考え
られている）に対応する。一般に、これらの媒染
剤は、ビリルビンに対する結合部位を１個以上有
し、疎水性有機マトリツクス及び電荷保有陽イオ
ン基を有する少なくとも一個の基を含む。このよ
うな媒染剤は、モノマー又はポリマーであつてよ
いが、好ましい媒染剤は前記の性質を有するホモ
ポリマー及びコポリマーである。これらは複合形
及び非複合形のビリルビンを結合する。 特に有用な反応性媒染剤は、式： 〔式中Ａは有機基を表し、Ｑは化学結合又は結合
基を表し、M⁺は第四級アンモニウム又はホスホ
リニウム基を表し、X^-は酸アニオンを表す〕の
繰り返し単位を有するポリマーである。 詳述すれば、前記構造式中のＡは、ポリマー骨
格の一部を表す。Ａは、明らかなとおり、使用し
た特定のポリマー骨格に応じて変動しうる。しか
しながら、特に良好な結果は、Ａがアルキレン基
を表す場合に得られた、一般に、このようなアル
キレン基は２〜10個の炭素原子を含む。反応性媒
染剤として有用なコポリマーは、前記の繰り返し
単位10〜90重量％及び非妨害性の（すなわち、ビ
リルビン媒染を化学的又は物理的に妨害しない）
付加的繰り返し単位10〜90重量％を有するものを
包含する。非妨害性単位を提供し、生じるコポリ
マーに疎水性を付与するモノマーは、脂肪族及び
芳香族炭化水素（例えばオレフイン及び置換オレ
フイン、スチレン及び置換スチレン、アクリル酸
アルキル及びメタクリル酸アルキル並びにこれら
の誘導体、並びにその他、当業者に公知のもの）
を包含するが、これらに限定されない。２官能性
の架橋可能性単位は、必要に応じてコポリマーに
組み込むことができる。 前記の式において、Ｑは化学結合又は結合基を
表し、これは一般に２価の炭化水素基、例えばア
リーレン基、アリーレンアルキレン基、アルキレ
ンアリーレン基、アリーレンビスアルキレン基、
アルキレンビスアリーレン基及びその他、当業者
に公知のものである。Ｑは５〜10個の炭素原子を
有する基であるのが好ましい。 M⁺は、同一又は異なるアリール基、アラルキ
ル（aralkyl）基又はアルカリール（alkaryl）基
（それぞれ20個以下の炭素原子数を有する）を有
する第四級アンモニウム又はホスホニウム基を表
す。代表的な基は、当業質に良く知られている。
M⁺は、第四級アンモニウム基であるのが好まし
い。 X^-は酸アニオン、例えばハライドイオン（例
えば塩化物又は臭化物イオン）、硝酸塩イオン、
メト硫酸塩イオン、ｐ−トルエンスルホン酸塩イ
オン及びその他、当業者に公知のものを表す。 有用な代表的反応性媒染剤は、ポリ（Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチル−Ｎ−ビニル−ベンジルアンモニ
ウムクロリド）、ポリ〔スチレン−コ−ベンジル
（ジメチル）−ｐ−ビニル−ベンジルアンモニウム
クロリド〕、ポリ（スチレン−コ−Ｎ−ビニルベ
ンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリ
ド−コ−ジビニルベンゼン）、ポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ
−トリメチル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウム
クロリド−コ−スチレン）、ポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ−
トリオクチル−Ｎ−ビニルベンジルホスホニウム
クロリド）及びポリ（スチレン−コ−（ビニルベ
ンジル）−（トリヘキシル）アンモニウムクロリ
ド〕である。 このような物質の製造方法を含めて、このよう
な反応性媒染剤の説明は、米国特許第4069017号
明細書に更になされている。 媒染剤層は、更に、ビリルビンに対して透過性
の親水性結合剤物質を含む。前記のように、本発
明の実施には、この結合剤物質がゼラチン又はゼ
ラチンの誘導体でないことが必須である。この結
合剤物質は、非妨害性でなければならない。すな
わち、前記の媒染剤にビリルビンを媒染するのを
妨害してはならない。換言すれば、結合剤物質は
ビリルビンに結合又は媒染しうるものであつては
ならない。 有用な結合剤物質は、簡単な試験で容易に確認
することができる：結合剤及び媒染剤の皮膜を２
個の15ワツトの冷却白色蛍光管に0.3mの距離で
30分さらし、次いで、400nm及び460nmで分光光
度計で測定する。これらの測定値を管に曝す前に
行つた同様の測定に比べる。0.01又はそれ以上の
濃度差は、不合格である。測定は、すべて環境温
度及び湿度で行う。結合剤としてこの試験に合格
する物質は、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ
（Ｎ−ビニル２−ピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル
４−ピロリドン）、アクリルアミドホモポリマー、
アクリルアミド又はメタクリルアミドとＮ−ビニ
ルピロリドンのコポリマー、カルボキシメチルセ
ルロース並びにＮ−ビニルピロリドン、カルボキ
シ含有ビニルモノマー及びアクリルアミドのター
ポリマーを包含する。 特に有用な結合剤物質は、アクリルアミド又は
メタクリルアミド（例えばアクリルアミド、メタ
クリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
及びその他の当業界で公知のもの）並びにＮ−ビ
ニルピロリドン（例えばＮ−ビニル２−ピロリド
ン及びＮ−ビニル４−ピロリドン）のコポリマ
ー、並びにＮ−ビニルピロリドン（前記の通り）、
カルボキシ含有ビニルモノマー（例えばアクリル
酸、メタクリル酸、イタコン酸及びその他の当業
界で公知のもの並びに、それらの無水物及びエス
テルのような官能性均等物質）及びアクリルアミ
ド又はメタクリルアミド（前記の通り）のターポ
リマーである。これらのポリマーを製造するのに
使用するモノマーの適当なモル比は当業者の常識
の範囲内である。ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ
−ビニル−２−ピロリドン）は、本発明の実施に
当たり媒染剤層に使用するのに好適な親水性結合
剤物質である。 本発明の分析要素に使用される反応性媒染剤の
量は、特定のビリルビン分析が有用であるように
設計されたビリルビン含有量の特定範囲に応じて
変動することができる。有用な量に関する詳細
は、米国特許第4069017号明細書に記載されてい
る。 媒染剤層における親水性結合剤物質の量は、媒
染剤を適切に分散し、適当なフイルムを形成する
のに充分な量でなければならない。この量は、モ
ノマー媒染剤を使用するか又はポリマー媒染剤を
使用するかによつても左右される。媒染剤がフイ
ルム形成性ポリマーである場合には、必要な結合
剤物質は少なくてよい。一般には結合剤物質の量
は２〜20ｇ／m²、好ましくは５〜20ｇ／m²であ
る。 他の任意の添加剤（緩衝剤又は表面活性剤）を
必要に応じて本発明の分析要素の１層以上の層に
添加することができる。従来公知のとおり、１種
以上のビリルビンエフエクター又はプロモーター
も要素に有用である。このような物質は、安息香
酸ナトリウム、カフエイン、アラビアゴム、サリ
チル酸塩、胆汁酸塩及びこれらの混合物を包含す
る。このような物質は本発明の分析要素の多孔性
拡散層に含まれるのが好ましい。 本発明により、分析方法に応じて異なる種々の
要素を製造することができる。任意の所望の幅の
長いテープ、シート、スライド又はチツプを含め
て種々の形で要素を構成することができる。一般
に、要素は、自動分析装置に使用するためカート
リツジに一緒に包装されている個々のスライドで
ある。 本発明の分析は、手操作で又は自動的にするこ
とができる。一般に、乾式要素を使用する場合、
要素を供給ロール、チツプ包装物又は他の供給源
から採取し、試験すべき液体の試料（例えば
200μ以下）と、試料と試薬（すなわち、反応
性媒染剤）が要素内で混合されるように物理的に
接触させることによつて総ビリルビン（すなわ
ち、すべての形のもの）を測定する。このような
接触は、任意の適当な方法で、例えば要素を試料
中に浸漬するか、又は好ましくは適当な分配手段
を用いて一滴の試料を手で又は機械で要素に落と
すことによつて達成される。 試料を施した後、要素をコンデイシヨニング、
例えばインキユベーシヨン、加熱等、任意の試験
結果を得るのを促進又は容易にするのに望ましい
処理に付す。 媒染剤がビリルビンに結合する場合、生じる検
出可能な変化が生じ、これは、反射分光光度測定
用の適当な装置を用いて容易に測定される。この
ような装置は、従来良く知られている。このよう
に測定される検出可能な物質からの信号は、試験
される流体中の総ビリルビンの量を示す。 また、本発明の方法及び要素は、米国特許第
4338095号明細書の教示により複合形又は非複合
形のビリルビンの測定に使用することができる。
一般に、一方又は両方の形のビリルビンの選択的
測定は、前記のような試料及び要素の接触によつ
て、及び２又はそれ以上の波長での吸収又は発光
スペクトルを測定し、適切な計算を行うことによ
つて達成される。 〔実施例〕 以下、実施例に従つて本発明を更に詳しく説明
するが、本発明の範囲をこれらの実施例に限定す
るものでないことはいうまでもない。 例 媒染剤層に異なる結合剤物質を含む要素の比較 この例は、本発明の要素と米国特許第4069017
号明細書に記載されているのと同様の、かつて市
販されていた対照要素とを比較するものである。 本発明の要素は、下記のような構造及び成分を
有する：

【表】

【表】 本発明の要素は、媒染剤層に結合剤物質として
ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル２−ピロ
リドン）を含む。対照要素は、媒染剤層の結合剤
物質としてゼラチンを含む以外は、同様に構成さ
れていた。 両方の要素を下記の方法で試験した。対照及び
本発明の要素のそれぞれのカートリツジ（各カー
トリツジに50個の要素）を製造後10日までの種々
の期間、21℃で相対湿度50％に曝した。各種の要
素の１個のカートリツジを製造直後に試験した。
次に、各カートリツジの50個すべての要素を、中
程度の量のビリルビン（複合及び非複合形）を含
む試験液及びエクタケム（EKTACHEM）700臨
床化学分析装置を用いてビリルビン測定について
試験した。 第１図は、これらの試験結果、すなわち、貯蔵
期間の関数として検量線より求めた測定濃度を示
す。プロツトした数値は、所定のカートリツジ中
の50個すべての要素の平均測定値である。本発明
の要素は、21℃で相対湿度50％に10日間までさら
したときの、測定複合及び非複合ビリルビン
（B_c及びB_u）濃度において殆んど変化しなかつ
た。しかし、対照要素は、これらの条件下に著し
い変動を示した。従つて、本発明は、米国特許第
4069017号明細書に教示されている対照要素より
予想し得ない驚くべき改良を示す。 下記の第１表は、第１図に示したデータをまと
めたものであり、更に、B_u及びB_cの和の数値を
示す。

【表】 ＊ 製造直後に試験
〔発明の効果〕 本発明の要素は、複合ビリルビン、非複合ビリ
ルビン又は総ビリルビンの分析に使用することが
でき、環境条件（例えば、高湿度及び光）から生
じる変化にあまり敏感でない。従つて、多数の要
素を含む所定のカートリツジにおいて、製造直後
及び一定時間貯蔵したときに要素間での変動が少
ない。意外にもゼラチンがこの問題の原因である
ことが分かつた。このことは、ゼラチンが多数の
市販の分析要素の層に結合剤として使用され、こ
のような不所望な作用を起こすことは従来知られ
ていなかつたから全く予想外のことであつた。 この問題の原因の発見により、媒染剤層中のゼ
ラチンをこの問題を起こさない別の親水性結合剤
物質２〜20ｇ／m²で実質的に置き換えた。多数の
有用な代替結合剤物質は上述した通りである。得
られる改良された要素は、著しく少ない経時濃度
変化を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ある保存条件下に数日間にわたつて
対照要素及び本発明の要素を用いて測定したビリ
ルビン（複合及び非複合）の測定濃度をプロツト
した図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 複合、非複合又は総ビリルビンを測定する分
   析要素において、ビリルビンに対する結合部位を
   少なくとも１個有する正に帯電した反応性媒染剤
   （該媒染剤はゼラチン又はその誘導体以外の、２
   〜20ｇ／m²の量で存在する親水性結合剤物質に分
   散されている）を含む、実質的にゼラチンを含ま
   ない媒染剤層を含み、媒染剤以外のビリルビン用
   比色及び蛍光反応性組成物を含まない分析要素。 ２ 複合、非複合又は総ビリルビンを分析するに
   当たり、 Ａ 複合又は非複合ビリルビンを含むと思われる
   液体試料を、ビリルビンに対する結合部位を少
   なくとも１個有する正に帯電した反応性媒染剤
   （該媒染剤はゼラチン又はその誘導体以外の、
   ２〜20ｇ／m²の量で存在する親水性結合剤物質
   に分散されている）を含む、実質的にゼラチン
   を含まない媒染剤層を含み、媒染剤以外のビリ
   ルビン用比色及び蛍光反応性組成物を含まない
   分析要素と接触させ、 Ｂ 反応性媒染剤に結合した複合、非複合又は総
   ビリルビンの量を測定する 工程を含むビリルビンの分析方法。