JPH043959B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はグルタチオンの製造法に関し、さらに
詳しくは、アデノシン・三燐酸（以下ATPとい
う）の存在下にＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイ
ン及び／又はＬ−シテチン、およびグリシンから
グルタチオンを生成する能力を有する細菌と、ア
デノシン・二燐酸（以下ADPという）をATPに
変換する能力を有する細菌を用いてＬ−グルタミ
ン酸、グリシン、Ｌ−システイン及び／又はＬ−
シスチンからグルタチオンを製造する方法に関す
る。 従来グルタチオンの製法として酵母菌体からの
抽出法、微生物の有する酵素活性を利用して前記
特定のアミノ酸から酵素反応によつて製造する方
法が知られている。この酵素反応における場合に
は、ATPの存在が必要であるが、ATPは高価で
ある。 ATP再生能を有する酵母を用いるグルタチオ
ンの製法は知られている（特開昭53−94090）。 ATP再生能を有する細菌を用いるグルタチオ
ンの製法について検討の結果、Ｌ−グルタミン
酸、グリシン、Ｌ−システイン及び／又はＬ−シ
スチンとATPからグルタチオンを生成しうる細
菌からグルタチオンを製造する場合において、
ATP源として、ADPからATPを生成する能力を
有する細菌を用いることによつて著量にグルタチ
オンを生成せしめうることが見い出された。 本発明によれば、下記イとロとをハ、ニ、ホ、
ヘ及びトを含有する水性培地中で接触せしめるこ
とによつてグルタチオンを収率よく得ることがで
きる。 イ：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及び／又
はＬ−シスチン、およびグリシンからグルタチ
オンを生成する能力を有する細菌の培養物、菌
体もしくはそれらの処理物 ロ：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及び／又
はＬ−シスチン、およびグリシン ハ：エネルギー供与体(E) ニ：燐酸イオン（Ｐ） ホ：マグネシウムイオン（Mg） ヘ：界面活性剤及び／又は有機溶剤 ト：Ｅ、Ｐ、Mgの存在下にADPからATPを生
成する能力を有する細菌の培養物、菌体もしく
はその処理物。 本発明で用いられるグルタチオン生成細菌とし
てはATPの存在下に前記特定アミノ酸からグル
タチオンを生成する細菌ならいずれも用いうる。 具体例としてエシユリヒア属、アルカリゲネス
属、アゾトバクター属の細菌があげられ、例えば
エシエリヒア・コリATCC11303、エシエリヒ
ア・コリFERM BP48、アルカリゲネス・ビス
コラクテイスATCC9036、アゾトバクター・ビン
ランデイATCC12518等があげられる。 これらの細菌の培養は通常の細菌の培養と同様
に行えばよい。 即ち、炭素源、窒素源、無機物その他の栄養物
等を程よく含有する培地ならば、合成培地又は有
機培地何れも使用可能である。炭素源としてはグ
クコース、グリセロール、フラクトース、シユー
クロース、マルトース、マンノース、マニトー
ル、キシロース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水
分解液、糖蜜等の種々の炭水化物原料が使用でき
る。またピルビン酸、酢酸、乳酸等の各種有機
酸、アスパラギン酸、アラニン等の各種アミノ酸
も使用可能である。 窒素源としてはアンモニア或いは塩化アンモニ
ウム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム等の各種の無機及び有機アンモニウム塩
類、或いは尿素及びその他の窒素含有化合物並び
にペプトン、NZアミン、肉エキス、酵母エキス、
コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、フ
イツシユミール或いはその消化物、脱脂大豆粕或
いはその消化物、蛹加水分解物等の窒素性有機物
質或いはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオ
ニン等種々のものが使用可能である。 更に無機物としては燐酸第１水素カリ、燐酸第
２水素カリ、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第１鉄、硫酸マンガン及び炭酸カルシウ
ム等を使用する。 発酵は振盪培養或いは通気撹拌深部培養等の好
気的条件下で行う。培養温度は20〜40℃である。
培養中の培地のPHは中性附近に調節することが望
ましい。中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナ
トリウム、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム等
が使用可能である。 培養液はそのまま、もしくはこれから菌体を分
離して用いられる。菌体の処理物としては洗浄、
乾燥、凍結、凍結乾燥、アセトン乾燥、有機溶剤
又は界面活性剤等との接触、リゾチーム処理、超
音波処理、機械的に摩砕などの処理を行つた菌体
処理物が使用できる。又、これらの菌体又は菌体
処理物から得られるＬ−グルタミン酸、Ｌ−シス
テイン、およびグリシンからグルタチオンを生成
せしめる酵素活性を有する酵素蛋白画分も使用で
きる。さらには、菌体の固定化物、菌体処理物の
不溶化物等も使用できる。 エネルギー供与体としては、グルコース、フラ
クトース、シユークロース、糖蜜、沈澱加水分解
物などの炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸、α
−ケトグルタール酸などの有機酸、グリシン、ア
ラニン、アスパラギン酸などのアミノ酸などが用
いられる。これらは通常およそ１〜200ｇ／の
濃度で用いられる。 燐酸イオンおよびマグネシウムイオンの濃度は
水溶液中において0.1〜70ｇ／の範囲にあるこ
とが望ましく、不足する場合にはこの濃度範囲に
はいるように補給する。燐酸イオンとしては、ナ
トリウム塩、カリウム塩等いずれでも使用でき
る。マグネシウムイオンとしては、無機塩でも有
機酸の塩でも使用できる。 ATP再生能を有する細菌菌体としては、エネ
ルギー供与体、燐酸イオン、マグネシウムイオ
ン、および界面活性剤および／又は有機溶剤を含
む水溶液中で、ADPからATPを生成する能力を
有するものならばいずれでも使用できるが、代表
的な細菌を例示すれば以下のものがあげられる。 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC21170 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC21171 菌体は、湿潤菌体濃度にて１〜500ｇ／好ま
しくは40〜300ｇ／で用いられる。 ATP再生菌の培養は前述のグルタチオン生成
菌の培養で用いられる培地を用いて同様に行えば
よい。 用いられる界面活性剤としては、ポリオキシエ
チレン・ステアリルアミン（例えばナイミーンＳ
−215、日本油脂K.K.製）、アルキルジメチルベ
ンジルアンモニウム・クロライド・アルキルイソ
キノリウム・ブロマイド等のカチオン系界面活性
剤、ジオクチル・スルホコハク酸ナトリウム等の
アニオン系界面活性剤、アルキル・アミン、アル
キルジメチルアミン等のアミン系界面活性剤が
0.1〜50ｇ／、好ましくは１〜20ｇ／の濃度
で用いられる。 有機溶剤は、キシレン、トルエン、ベンゼン等
が用いられ、その濃度は0.1〜50ml／、好まし
くは１〜20ml／である。 Ｌ−グルタミン酸、グリシン、およびＬ−シス
テインおよび／又はＬ−シスチンからグルタチオ
ンを生成せしめる反応は、水溶液中において適当
に撹拌を行いつつ、１〜48時間、通常は２〜24時
間にわたり行わしめる。温度、並びにPHをそれぞ
れ10〜70℃、PH４〜10の範囲に調節しつつ反応せ
しめると、より好ましい結果が得られる。必要な
らば反応中に原料アミノ酸を必要に応じて適宜追
加してもよい。 上記の条件で反応を行うことにより、反応液中
にグルタチオンが生成蓄積する。反応液からグル
タチオンを単利精製する方法としては、通常のレ
ジン法、銅塩法等が適用できる。 以下に本発明の態様を実施例によつて説明す
る。 実施例 １ １ グルタチオン生成菌の培養 エシエリヒア・コリFERM BP48を用いる。
グルコース10ｇ／、酵母エキス10ｇ／、ペ
プトン10ｇ／、肉エキス５ｇ／、
MgSO₄・7H₂O1ｇ／、KH₂PO₄5ｇ／を含
み、PH7.0に調節した培地を２−ヒダ付三角
フラスコに300ml入れて加熱殺菌する。これに
予めイースト・ブイヨン培地で前培養した該菌
を接種し、30℃にて一昼夜振盪培養する。得ら
れた培養液を遠心分離して菌体を集め、−20℃
の冷凍機にて凍結する。 ２ ATP再生菌体の培養 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ATCC21170を用いる。グルコース15％、尿素
0.5％（別殺菌）、KH₂PO₄、K₂HPO₄、
MgSO₄・7H₂O、各1.0％、CaCl₂・2H₂O0.01
％、ビオチン30μｇ／、酵母エキス0.5％、肉
エキス0.5％を含み、PH7.2に調節した培地を２
−ヒダ付三角フラスコに300ml入れて加熱殺
菌する。これに予めイースト・ブイヨン培地で
前培養した菌を接種し、30℃にて一昼夜振盪す
る。得られた培養液から遠心分離により菌体を
集め、−20℃の冷凍機にて凍結保存する。 ３ グルタチオン生成反応 第１表に示す組成の反応液20mlを200mlビー
カーに入れ、37℃およびPH7.4に保ちつつマグ
ネツクスターラーで950rpmにて撹拌し、６時
間反応を行う。その結果、水溶液中には9.8ｍ
Ｍのグルタチオンが生成する。 上記反応液からブレビバクテリウム菌体を除
いた場合のグルタチオン生成量は1.6ｍＭであ
る。

【表】 ※ 乾燥菌体重量
４ グルタチオンの単離精製 上記と同様に反応して得た反応液１の遠心
分離上清（グルタチオン10ｍＭ含有）を減圧下
で濃縮し、アンバーライトIR−120（H⁺型）カ
ラムに通塔し、グルタチオンを吸着させ、水洗
後0.1NH₂SO₄で溶出し、溶出液を濃縮後エタ
ノールを加えて結晶を得る。さらにエタノール
を用いて再結晶し、精製グルタチオン2.0ｇを
得る。 実施例 ２ グルタチオン生成菌株として、第２表に示す菌
を用いる他は実施例１と同様に培養して得られる
菌体を凍結する。この菌体を用い、実施例１と同
様に反応を行い結果を第２表に示す。

【表】 除いた場合のグルタチオン生
成量を示す。
実施例 ３ 実施例１と同じグルタチオン生成菌体および
ATP再生菌株を実施例１と同様に培養し、グル
タチオン生成菌は集菌し、その一部は凍結して、
また残部はそのままで、それぞれ反応に用い、
ATP再生菌はブロスをそのまま反応に用いる。 ATP再生菌の培養液〔菌体量300ｇ（湿潤菌体
重量）１〕14mlに、大腸菌の菌体、グルコー
ス、燐酸、硫酸マグネシウム、K₂SO₄、ナイミー
ン、キシレンを最終濃度が第１表の濃度となるよ
うに加え、液量を20mlに調整し、以下実施例１と
同様に反応を行つた結果を第３表に示す。

【表】 実施例 ４ ATP再生菌として、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムATCC21171を用いる他は、実施例と
同様に実施して3.52ｍＭのグルタチオンが生成す
る。なお、コリネバクテリウムを添加しなかつた
場合、グルタチオンの生成量は1.47ｍＭである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記イとロとをハ、ニ、ホ、ヘ及びトを含有
   する水性培地中で接触せしめることを特徴とする
   グルタチオンの製造法。 イ：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及び／又
   はＬ−シスチン、およびグリシンからグルタチ
   オンを生成する能力を有する細菌の培養物、菌
   体もしくはそれらの処理物 ロ：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及び／又
   はＬ−シスチン、およびグリシン ハ：エネルギー供与体(E) ニ：燐酸イオン（Ｐ） ホ：マグネシウムイオン（Mg） ヘ：界面活性剤及び／又は有機溶剤 ト：Ｅ、Ｐ、Mgの存在下にアデノシン・二燐酸
   からアデノシン・三燐酸を生成する能力を有す
   る細菌の培養物、菌体もしくはその処理物