JPH0440839A - 不定胚の大量培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物組織培養による双子葉植物の大量増殖方法
に関する。

〔従来の技術〕

双子葉植物の不定胚に関して最も知見が多く、研究の進
んでいるニンジンを例にとると、培養細胞（カルス）誘
導用の培地、すなわち植物ホルモンとしてオーキシンの
１つである２、４Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
）を含む培地で誘導、増殖した培養細胞を不定胚分化用
の培地、すなわち植物ホルモンを含まない培地で培養す
ることにより誘導できることはよく知られていることで
ある。

このとき不定胚分化の最終段階である魚雷型胚への分化
率、すなわち用いた培養細胞に対して得られる魚雷型胚
数は他の双子葉植物に比べ分化し易いとされているニン
ジンでも約半数で残りの不定胚は魚雷型胚への発達途中
である球状型胚や心臓型胚の状態にある。また、魚雷型
胚への分化にはニンジンでおよそ２週間を要し、ニンジ
ン以外の双子葉植物では分化に要する期間も最短でも２
週間もしくはこれ以上である。

〔発明が解決しようとする課題〕

双子葉植物から不定胚を誘導する方法は先に示したよう
に公知であるが、この方法では（１）魚雷型胚にまで分
化する割合は分化開始時に用いた培養細胞のうちの約半
数以下であるため、魚雷型胚への分化効率が低かった。

（２）培養を開始してから一定の時期に魚雷型胚のみを
集めようとすると不定胚への分化が非同調的に起こるた
め、種々の発達段階の不定胚が混在した中から（＝球状
型胚や心臓型胚が混在した中から）魚雷型胚をメツシュ
（網）などでふるい分ける等の手段により選別する必要
があった。

不定胚は産業上、種苗生産などとくに人工種子の作製に
利用されるが、このとき上記のような不定胚発達の制御
、すなわち均一な不定胚を一定の時期にし功も大量に得
ることや不定胚の成長度を揃えるなどの技術は極めて重
要であるにもかかわらず、殆ど知られていないのが現状
である。

上述した人工種子とは茎頂や胚のよう植物体へ再生し得
る組織をアルギン酸等のゲル化剤でカプセル状に埋包し
たもので、用いる組織としては再生能力の点から不定胚
が最も有力とされている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は双子葉植物の不定胚分化にはその発達に培地
量当りの培養細胞数又は不定胚数、すなわち培養密度が
極めて大きく影響することを以下に示すことから確認し
た。

〔１〕不定胚分化の同調化を図るに当っては、まず成長
度に差が生ずる原因を考察した。培養細胞から魚雷型胚
へ至る分化の培養においてその変化を経時的に観察、把
握し、下記のことが明らかになっかだ。

（１）培養細胞から球状型胚への発達までは用いた培養
細胞の約９０％が分化し、しかも成長度が揃っているこ
と。

（２）不定胚分化の後期すなわち球状型胚から魚雷型胚
への発達の段階ではｐＨが培養開始時の５．７０から６
．７１にまで上昇していること。

これらの結果から成長度に差が生ずる原因として次のこ
とを予想した。

■　培養終了後に球状型胚或いは心臓型胚の状態にある
不定胚は分化能が低下もしくは死滅している。

■　用いる培地中の栄饗が不足し、全ての不定胚が魚雷
型胚にまで発達できない。

■　培養中ｐＨの上昇が不定胚の分化を阻害する。

■　発達の速い不定胚が成長を阻害する物質を培地中に
放出する。

〔２〕予想した各項目が原因であるか否かを確認・する
ため各実験を実施し、下記のことが分かった。

■　不定胚分化のため培養の終了後、球状型胚の状態に
ある不定胚を集め新しい培地で培養したところ、約３割
が心臓型胚に残りの約７割が魚雷型胚へ分化した。従っ
て培養終了後に球状型胚や心臓型胚の状態にある不定胚
は分化能を消失したり、死滅したりしたわけではないこ
と。

■　不定胚分化のための培養の中間、すなわち球状型胚
が得られた時点で、これを新しい培地に移し換えて培養
した。その結果、魚雷型胚への分化率は僅かに７％上が
っただけであり、ｐＨの変化も開始時５．７０に対し５
．８８であった。従って上記〔１〕の■■■の予想が直
接の原因とは考え難いと判断した。

［３］　　［２）ｌまでは不定胚分化のための培養のう
ち培地中の栄養源、ＰＨなど化学的な要因について検討
したが、次にこれ以外に考えられる要因として物理的な
要因を検討することにより原因を考察した。

現状の方法では不定胚分化のための培養において培養細
胞の密度は、培養細胞の体積１に対して体積４００〜１
０００倍の体積の培地、もしくは培地１艷に対し培養細
胞５００個である。しかし、これら密度が不定胚分化に
与える影響についての知見はこれまで知られておらず、
そこで密度が与える影響について検討した。

不定胚分化のための培養において高い培養密度、例えば
１０００〜２０００個／ｄで培養すると用いた培養細胞
の約９０％が球状型胚、心臓型胚へ分化した。このとき
球状型胚と心臓型胚が混在した状態でそのまま培養を続
けたが、これ以上分化しなかった。この結果から培養細
胞から魚雷型胚への発達においては培養密度が極めて大
きく影響することを知った。

さらに培養開始時の培養細胞の大きさ及び魚雷型胚の大
きさから、それぞれ両者の体積を比較したところ、魚雷
型胚のそれは培養細胞のおよそ２０倍であることを知っ
た。従って不定胚が分化するにつれて培地中に占める組
織体の体積が大きくなることからも不定胚分化のための
培養において培養密度が重要であることをさらに認識し
た。

本発明は以上の知見に基いて完成されたもので、双子葉
植物の一部から培養細胞を誘導し、この誘導細胞を培養
して球状型胚、心臓型胚、魚雷型胚を発達させて不定胚
を分化させる不定胚の大量培養方法において、上記誘導
細胞を高密度状態で培養して球状型胚と心臓型胚を混在
した状態で得た後、同球状胚と心臓型胚の混在物を低密
度状態で培養して魚雷型胚へと発達させることを特徴と
する不定胚の大量培養方法である。

本発明は双子葉植物の培養細胞を不定胚分化用の培地で
高い培養密度、例えば２０００個／ｉで培養し約９０％
の分化率で球状型胚、心臓型胚を得た後、これらを低い
培養密度、例えば以下の実施例で示すように１５０個／
ａ１！以下で培養すにようにした双子葉植物の不定胚の
大量培養方法である。

〔作用〕

本発明は不定胚誘導用の培地で培養細胞を誘導・増殖し
、これを例えば２０００個１ｍもの高密度で不定胚分化
用の培地を用いて不定胚を分化させる技術は従来方法に
よるが、不定胚が球状型胚、心臓型胚へ発達した時点で
これらを回収し、低密度例えば１５０個／ｍｌで培養す
ることにより、これ以降魚雷型胚への発達を同調化でき
る。

分化の初期過程すなわち培養細胞から球状型胚付近まで
は従来の技術によって高頻度に分化させることは可能で
あるが、本発明方法を用いることにより分化の後期すな
わち魚雷型胚まで同調化を図ることができ、しかも用い
た培養細胞のおよそ８０％近い高頻度で分化できる。さ
らに培養期間すなわち分化に要する日数は従来に比べ短
縮できる。なお、得られた魚雷型胚を光照射下で培養す
ると幼植物体を得ることができる。

〔実施例〕

以下双子葉植物の１つであるニンジンを例にとり実施例
を説明する。用いたニンジンの品種は黒田五寸であり、
この種子を０．８％の寒天を含む培地で発芽させ、約１
週間後に得られた幼植物体の下胚軸を約１　ｃｍの大き
さに切断した。

この下胚軸を第１表に示すような５Ｘ１０（Ｍ）の２．
４−　Ｄを含むＬｉｎ　＆　５ｔａｂａの改変培地（以
下ＬＳ培地）で培養し、培養細胞を誘導した。なお、培
養は暗黒下で温度２５℃とした（以下同じ）。

得られた培養細胞のうち３０〜５０μｍの大きさの培養
細胞を２０００個／ｒｎｌの培養密度で植物ホルモンを
含まないＬＳ培地で培養した。

なお、培養は３００ｍ１容フラスコに培養液８〇−であ
った。培養を開始して７日後、培地１ｍｌ当り球状型胚
、心臓型胚がそれぞれ１０７４個、７１８個得られた。

このときの分化率は９０％であった。

得られた球状型胚及び心臓型胚を５０〜５００個／ｒｎ
ｌの培養密度でＬＳ培地で培養した。その結果、第２表
に示すように培養密度１５０個／ｄ以下では用いた球状
型胚、心臓型胚は魚雷型胚へ９０％という高頻度で分化
した（第２表二分化率４）の欄参照）。しかもこの結果
は、例えば５日後、６日後にそれぞれ分化した魚雷型胚
を合わせて９０％というのではなく、培養開始から５日
後という一定時期に得られた分化率であり同調的に分化
させることができた。

次に最初に用いた単位培地量＜＝　ｉ　ｙｔｅ＞当りの
培養細胞数に対して得られた魚雷型杯数及び分化率も各
培養密度について第２表に併せて示した（それぞれ全魚
雷型杯数５）、培養細胞に対する分化率６）の欄参照）
　　１５０個／ｍ７！以下では用いた培養細胞をおよそ
８０％近い高頻度で目的とする魚雷型胚へ分化させるこ
とができた。

なお、得られた魚雷型胚を不定胚の分化に用いたものと
同じ培地を用いて光照射下で培養すると幼植物体が得ら
れた。

表−１ ｉｎ ｔａｂａ の改変培地 〔発明の効果〕 双子葉植物の不定胚、ここでは不定胚分化の最終段階で
ある魚雷型胚を大量に得るに当たって （１）用いる培養細胞を魚雷型胚へ高頻度で分化できる
ため、増殖した培養細胞を無駄なく有効に利用できる。

（２）成長度の揃った魚雷型胚を得ることができるた杓
、とくにこれのみを回収することなしにそのまま利用で
きる。例えば人工種子の生産においてはとくに魚雷型胚
のみを選別する工程が省け、直接カプセル化の工程へ移
ることができる。

（３）分化に要する期間が従来よりも短く、培養期間が
短縮できるため不定胚の生産効率を上げられる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 双子葉植物の一部から培養細胞を誘導し、この誘導細胞
   を培養して球状型胚、心臓型胚、魚雷型胚を発達させて
   不定胚を分化させる不定胚の大量培養方法において、上
   記誘導細胞を高密度状態で培養して球状型胚と心臓型胚
   を混在した状態で得た後、同球状胚と心臓型胚の混在物
   を低密度状態で培養して魚雷型胚へと発達させることを
   特徴とする不定胚の大量培養方法。