JPH0441000B2 - - Google Patents
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- JPH0441000B2 JPH0441000B2 JP60229763A JP22976385A JPH0441000B2 JP H0441000 B2 JPH0441000 B2 JP H0441000B2 JP 60229763 A JP60229763 A JP 60229763A JP 22976385 A JP22976385 A JP 22976385A JP H0441000 B2 JPH0441000 B2 JP H0441000B2
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Description
プロトロンビンはかなり以前から知られている
ように血液凝固の最終段階に関与するビタミンＫ
依存性血漿蛋白質である。これは約72000の分子
量をもち、約12％の炭水化物を含有する。プロト
ロンビンは既知のとおりカルシウムの存在下で立
体配座が変化するカルシウム結合性蛋白質であ
る。プロトロンビンからトロンビンへの蛋白分解
を伴う活性化は正常な止血における重要な工程で
ある。プロトロンビンは肝臓で合成される。ここ
でプロトロンビン前駆物質が翻訳後修飾を受け
て、プロトロンビンの機能形になる。これは“天
然プロトロンビン”として知られ、γ−カルボキ
シグルタミン酸を含有する。ビタミンＫ拮抗薬、
たとえばワルフアリンナトリウム（デラウエア州
ウイルミントンのデユポン社エンド・ラボラトリ
ーズ部門の商標クマジン（Coumadin）を有する
製品としても知られている）の存在下で、または
ビタミンＫの不在下で、血中のプロトロンビン活
性は有意に低下する可能性がある。これはプロト
ロンビン時間（一段凝血アツセイ法）により間接
的に、またはプロトロンビン欠損基質血漿を用い
るプロトロンビン凝血活性の直接測定により測定
することができる。血漿プロトロンビン活性が低
い場合、重症の肝疾患を伴う可能性もある。たと
えば蛋白質合成障害（肝疾患）、不適当なビタミ
ンＫ供給（ビタミンＫ欠乏症）、またはビタミン
Ｋの作用を抑止する薬物（ワルフアリンナトリウ
ム）はヒトその他の哺乳類における血漿プロトロ
ンビン活性を低下させる。 クマジンはワルフアリンの商品名である。クマ
ジンを血栓性疾患の治療または予防に際し広く行
われているように経口抗凝血薬として用いると、
これはビタミンＫ依存性血液凝固蛋白質、たとえ
ばプロトロンビンの活性を低下させる。適切なク
マジン用量はプロトロンビン時間の監視により確
立される。プロトロンビン時間は正常な血漿に関
して得られる時間の１1/2〜２／1/2倍に維持され
る。 1968年に、ワルフアリンナトリウムで治療した
患者の血漿中に、ヒト天然プロトロンビンに対比
して“異常プロトロンビン”および“ヒト異常プ
ロトロンビン”として知られるプロトロンビンの
変形が発見された。異常プロトロンビンがもつプ
ロトロンビン活性は低いが、多数のプロトロンビ
ン抗血清と交叉反応する。ウシ血液から異常プロ
トロンビンが1972年に初めて単離された。この種
の異常プロトロンビンは等量の天然プロトロンビ
ンの約３％の凝血活性をもつことが認められた。
そのほか分子量、酸加水分解の炭水化物組成およ
びアミノ酸組成は実質的に実験誤差の範囲内で等
しかつた。1970年代初期にウシ異常プロトロンビ
ンはプロトロンビンと異なりバリウム塩に結合せ
ず、カルシウムイオンに結合しないことが見出さ
れた。その後、異常プロトロンビンと天然プロト
ロンビンとの機能上の相違はこれらの蛋白質間の
構造上の相違に関係があり、完全なプロトロンビ
ン機能には無傷のカルシウ結合部位を必要とする
ことが示された。1970年代中期に、それまで知ら
れていなかつたアミノ酸であるγ−カルボキシグ
ルタミン酸がウシプロトロンビン中に存在し、こ
れが異常ウシプロトロンビンには欠如しているこ
とが見出された。このアミノ酸はプロトロンビン
の凝血活性を完全に発現するために必要であると
思われる。異常プロトロンビンは凝血活性をもた
ないことが知られており、金属イオンを結合せ
ず、γ−カルボキシグルタミン酸を含まない。他
の研究者らは、プロトロンビンが肝臓内でγ−カ
ルボキシグルタミン酸の代わりにグルタミン酸を
含有する前駆物質の形で合成されること理論づけ
た。肝臓内でのカルボキシル化過程でグルタミン
酸が修飾されてγ−カルボキシグルタミン酸が形
成される。この酵素系はビタミンＫを必要とし、
ビタミンＫ拮抗薬により抑制される。 体液、たとえば血漿中のプロトロンビンおよび
異常プロトロンビンの水準を測定するための定量
的アツセイ法を開発するために、これまで多くの
努力がなされてきた。これらの方法にはこれまで
著しい制限があつた。ヒト異常プロトロンビンお
よびヒト天然プロトロンビンは共に584個のアミ
ノ酸を含み、それらのうち574個はこれら２形態
において等しく、残りの10個はカルボキシル基に
おいて異なるにすぎないという点で、アツセイ法
を考案することは困難であつた。これらの蛋白質
は、構造上はほぼ等しいが機能的関与においては
きわめて異なつており、血液凝固に関して異なる
役割をもつ。 血液凝固の外因性経路におけるプロトロンビン
および他の蛋白質を評価するための既存の方法に
は、一般的なプロトロンビン時間測定法が含まれ
る。これは異常プロトロンビン水準を検出するも
のではない。プロトロンビンの凝血活性の直接ア
ツセイは、被験血漿を種々の割合のプロトロンビ
ン欠損血漿と混合し、次いで凝血させ、標準曲線
と比較することにより行われる。天然型の機能性
プロトロンビンのみが測定される。交叉免疫電気
泳動法は異常プロトロンビンおよび天然プロトロ
ンビンの双方を準定量的に測定するが、供与種が
他方を隠蔽するのを防ぐためには同様な濃度であ
ることが必要であり、従つて用途が限定される。
他の因難なかつ技術を要する試験法はローレル
（Laurell）のロケツト免疫電気泳動法である。こ
れは上記２種のプロトロンビンを区別できない。
プロトロンビンのラジオイムノアツセイも行われ
たが、これまでに用いられた抗体は異常プロトロ
ンビンにも正常プロトロンビンにも同等に（また
はほとんど同等に）結合し、従つて総プロトロン
ビン水準が測定されるにすぎず、臨床診断用とし
ては不十分である。蛇毒を用いるエキス・カリナ
ータス（毒蛇の一種、Echis carinatus）アツセ
イ法は総プロトロンビンの測定に用いられる。二
段プロトロンビンアツセイ法と組合せてこれらの
アツセイを間接的に異常プロトロンビン水準の推
定に用いることができる。 上記アツセイ法のいずれも、特にヒトにおいて
異常プロトロンビンの存在下でのプロトロンビ
ン、あるいは正常プロトロンビンの存在下での異
常プロトロンビンに関する直接的、定量的な、容
易に実施される感度の高い特異的アツセイ法を提
供しない。本発明においては蛋白質表面の特定領
域に対する立体配座特異性抗体を用いる研究を行
い、その結果異常プロトロンビンに対して、およ
び天然プロトロンビンに対して特異的な免疫化学
的試薬が開発された。異常プロトロンビンおよび
天然プロトロンビンが被験哺乳動物から得られる
血清検体のものである方法が記述され、これによ
り哺乳動物血漿中の異常プロトロンビンまたは天
然プロトロンビンの水準が測定され、ヒトにおい
ては異常プロトロンビンの存在は身体の障害を示
す。好ましい形態においては、ヒトの異常プロト
ロンビンおよび正常プロトロンビンの測定は他方
の存在下でそれぞれに対し特異的な抗体の使用に
よつて行われる。身体の障害がビタミンＫ欠乏症
である場合、異常プロトロンビンの水準が監視さ
れ、あらかじめ定められた水準に維持される。好
ましくは抗凝血薬の投与、たとえばワルフアリン
の投与が要求される場合、投与するワルフアリン
の目的水準ないしは目的量を指示するものとして
天然プロトロンビンを監視する。天然プロトロン
ビンの水準をその方法で定量的に測定することも
できる。ヒトのビタミンＫ拮抗薬（たとえばワル
フアリン）による抗凝血療法期間中、これらの水
準を定量的に測定したのち12〜24μｇ／mlの天然
プロトロンビン水準が、使用中の薬物（たとえば
ワルフアリンナトリウム）をさらに投与すること
により維持される。好ましくは天然プロトロンビ
ンは10〜24μｇ／mlの体液内水準に維持される。 本発明によればヒト天然プロトロンビンおよび
カルシウムの存在下デス−γ−カルボキシヒト
（すなわち異常）プロトロンビンと反応性であり、
カルシウムイオンの存在下でヒト天然プロトロン
ビンとは実質的に非反応性であるモノクロ−ナル
抗体が提供される。 異常ヒトプロトロンビンに対するポリクローナ
ル抗体と異なり本発明のモノクローナル抗体はカ
ルシウムイオンの不在下でヒト天然プロトロンビ
ンと複合体を形成しうる利点をもつ。本発明のモ
ノクローナル抗体は、インビトロ試験用体液中で
標準的な実験室条件下、たとえば室温、標準的大
気圧、およびそれらの普通の変動において反応性
であり、複合体を形成する点で好ましい。 定量的および定性的測定値を得るためのイムノ
アツセイを行う方法においては、一般的なイムノ
アツセイ操作法を採用することができ、これには
酵素結合アツセイ法およびラジオイムノアツセイ
法が含まれる。 ヒト異常プロトロンビンの存否は、血漿または
血清試料について前記の適宜なモノクローナル抗
体との免疫反応を行ない、そして抗体−抗原複合
体の存否を常法により定性的または定量的に測定
することによつて測定される。 人体内におけるヒト異常プロトロンビンの存在
は、肝疾患状態にある場合、個体をビタミンＫ拮
抗薬などの物質で処理した場合、ビタミンＫ欠乏
の場合、またはカルボキシル化障害をもたらす代
謝欠陥の結果以外は、血漿、血清または他の体液
１ml当たり0.03μｇを越えることはない。実際に
は液体１ml当たり0.03μｇ以下の水準もこの種の
疾患を示すものと考えられるが、このように低い
水準を本発明方法により探知することはできな
い。異常プロトロンビンの存在はいずれも上記の
疾患および障害を示唆するものと考えられる。従
つてイムノアツセイ法を用いて特定の肝疾患の存
否を判定し、肝疾患を異常プロトロンビンが正常
な状態から変動している特定の他の身体機能不全
と区別し、また患者に投与するワルフアリンナト
リウムの量を決定して血栓症または出血の危険性
を最小限に抑えることができる。 第１図は、数種の医学的障害を伴う患者におけ
る天然プロトロンビンおよび異常プロトロンビン
の血清濃度を示すグラフである。 第２図は、ビタミンＫ欠乏症を伴う患者におい
てビタミンＫ療法が天然プロトロンビンおよび異
常プロトロンビンに与える影響を示すグラフであ
る。 第３図は、肝細胞性癌を伴う患者における異常
プロトロンビンおよび天然プロトロンビンの血清
濃度を示すグラフである。 第４図は、肝癌患者３人における異常プロトロ
ンビンおよびα−フエトプロテインの血清濃度を
示すグラフである。 第５図は、３種の異なる肝臓障害を伴う各患者
における異常プロトロンビンの血清濃度を示すグ
ラフである。 第６図は、肝癌患者における異常プロトロンビ
ンおよびα−フエトプロテインの血清濃度を示す
グラフである。 第７図は、各種の医学的障害を伴う各患者の血
清中における異常プロトロンビン水準を示すグラ
フである。 プロトロンビン生合成障害の検出および診断は
ヒトにおいて血漿または血清の異常プロトロンビ
ンの測定により行うことができる。異常プロトロ
ンビンの特異的アツセイをヒト血漿または血清に
おいて採用し、プロトロンビン生合成の状態を判
定する。この情報は特定の疾患の状態とし相関し
ている可能性がある。 生常血漿：正常な個体から得られる血漿および
血清は検出可能な異常プロトロンビンを含まな
い。このアツセイ法の感度および特異性は、異常
プロトロンビンが0.03μｇ／ml以上となり得ない
ことを示している。正常水準の天然プロトロンビ
ンは約108μｇ／mlである。 急性肝炎：急性肝炎を伴う患者から得た血漿お
よび血清は0.1〜6μｇ／mlまたはそれ以上に変動
する大量の異常プロトロンビンを含有する。天然
プロトロンビンの水準は通常は正常であるが、正
常なプロトロンビンの範囲よりも高くまたは低く
なる可能性がある。 硬変：アルコール肝硬変を伴う患者から得た血
漿および血清は高い異常プロトロンビンを含む。
プロトロンビン水準は通常は準正常である。 慢性活動性肝炎：慢性活動性肝炎を伴う患者か
ら得た血漿および血清は検出可能な異常プロトロ
ンビンを含まない。 ビタミンＫ欠乏症：腸におけるビタミンＫ吸収
不全、腸肝循環障害、栄養欠乏、または抗性物質
による腸内細菌の妨害に基づくビタミンＫ欠乏症
は異常プロトロンビンおよびこれに相当するプロ
トロンビン低下を伴う。これらの患者はビタミン
Ｋに応答する。 肝臓を含む転移性癌：肝臓の破壊を含む癌を伴
う患者においては異常プロトロンビン水準が高
い。 肝細胞性癌：異常プロトロンビンが一様に存在
する。水準は低い水準からきわめて高い水準にま
で変動する。天然プロトロンビンの水準は正常で
あるが、変化しやすい。 診断の補佐には下記のものが含まれる。 (a) 異常肝機能研究によりプロトロンビン時間の
延長を伴う患者は、肝疾患またはビタミンＫ欠
乏症を有する可能性がある。高水準の異常プロ
トロンビンおよび中程度に低い水準のプロトロ
ンビンはビタミンＫ欠乏症を示唆する。低い水
準の異常プロトロンビンおよび正常な水準のプ
ロトロンビンは肝疾患を示す。 (b) 患者は気分が悪い。血液学的検査および腎ス
クリーニングテストはすべて正常である。異常
プロトロンビン水準の上昇は潜在性肝疾患を示
す。 (c) 黄疸および著しい凝血障害を伴う出血性患者
は異常プロトロンビンの増加を示すことが認め
られる。これは肝疾患の診断を示すものであ
り、血管内凝血を示すものではない。 (d) ある“正常な”個体が著しい出血を生じる。
プロトロンビン時間が延長している。きわめて
高い異常プロトロンビンおよび低いプロトロン
ビンは、ワルフアリンの過剰投与、すなわち不
自然なワルフアリン摂取を示唆する。 (e) ２年前に原発性黒色腫を伴つた患者が全身型
の症状を発現している。異常プロトロンビンの
増加は癌の肝浸潤を示唆する。 (f) ある患者が再発性血栓症の抑制のためワルフ
アリンで治療される。天然プロトロンビン時間
は治療範囲にあるにもかかわらず、天然プロト
ロンビンは36μｇ／mlであると測定される。こ
の患者は血栓症の恐れがあると診断される。ワ
ルフアリンの１日量を高め、天然プロトロンビ
ンを定期的に監視する。 アツセイ法に用いるための本発明の抗体のバイ
アルを含むイムノアツセイキツトを用意すること
ができる。たとえばヒト異常プロトロンビンに特
異的な標識された、または標識されていない抗体
のバイアルを用意し、RIAその他のイムノアツセ
イキツトに用いる他の材料と共に包装することが
できる。この種のキツトにおける材料の容積およ
びキツトの構成部品の数は大幅に変えられる。こ
の種のキツトはキツトの抗体と抗原−抗体複合体
を形成する抗原の存否および量を測定するイムノ
アツセイ法を実施するための指示し共に配布され
る場合が多い。 これらの免疫化学物質を試薬として用いて、ヒ
ト血漿または血清中の異常プロトロンビンに関す
る特異的ラジオイムノアツセイ法が開発された。
これらのラジオイムノアツセイ法は標準的な二重
抗体沈殿法および放射性ヨウ素化した抗原を伴
う。異常プロトロンビンに関するアツセイ法は
2nｇ／mlに及ぶ感度を示す。プロトロンビン
150μｇの存在下での異常プロトロンビン検出限
界は0.03μｇ／mlである。正常な血漿は異常プロ
トロンビンを含まない。低水準（0.2〜8μｇ／ml）
の異常プロトロンビンは種々の肝疾患に特徴的で
ある（肝炎、硬変、転移性悪性癌、原発性肝細胞
性癌）。対応する低いプロトロンビンを伴う低水
準ないしは高水準の異常プロトロンビン（１〜
100μｇ／ml）はビタミンＫ欠乏の程度と関連す
る。ワルフアリンナトリウを摂取している患者は
35μｇ／mlの範囲の異常プロトロンビン水準、お
よび10〜30μｇ／mlのプロトロンビン水準をも
つ。この異常プロトロンビンおよびプロトロンビ
ンの測定により、ビタミンＫ依存性カルボキシル
化の障害を特色とする疾患を伴う患者を確認し
（スクリーニングし）、診断することができる。こ
れらの測定を経口抗凝血薬療法の監視および制御
に用いることもできる。最後にこれらを用いてて
プロトロンビン合成の障害とプロトロンビン異化
加速／クリアランスの障害を区別することができ
る。 試験は普通は血清または血漿中で行われるが、
これを全血中で行つて相当する結果を得ることも
できる。 ワルフアリン監視について記述したが、他のビ
タミンＫ拮抗薬および抗凝血薬を、ワルフアリン
の経口使用の監視に関する本発明方法に従つて監
視した場合も同様な結果が得られる。数種の医学
的障害を伴う各患者の血清中における異常プロト
ロンビン水準を第７図に示す。 異常プロトロンビンに対するモノクロナル抗体の
調製 バルブ／ｃ系マウスを、完全型フロイントのア
ジユバンド中に25μｇのヒト異常プロトロンビン
を混和したものを皮下注射して免疫した。30日お
よび37日後に、10μｇの異常プロトロンビンを、
食塩水中に注入した。免疫されたマウスの脾臓細
胞（５×107）とSp2／０血漿細胞系（５×106）
との融合は、28％ポリエチレングリコール2000を
用いて0.5ml中で６分間行つた。融合した細胞を、
ヒポキサン−アミノプリテン−チミジンを含む
（最終濃度はそれぞれ、1.36，0.176，および0.38
mg／ml）RPMI 1640／20％仔ウシ血清に懸濁し、
ウエルあたり１−３×105の細胞濃度で接種した。
接種した540のウエルの43％に細胞の生育が観察
された。細胞を数週間培養後、コロニーを含むウ
エルから上清を吸引し、該上清について抗デス−
γ−カルボキ トロンビン抗体活性をアツセイし
た。陽極のウエルの細胞を選択して制限希釈法に
よりクローン化し、そして同じ方法により再クロ
ーン化した。 抗異常プロトロンビン抗体を分泌する細胞は、
異常プロトロンビンと天然プロトロンビン（以
下、原プロトロンビン）を用いる２個の固相イー
ライザ（ELISA）法で同定した。プロトロンビ
ンとよりも異常原プロトロンビンとずつと大きな
反応性を示す孔は、限定希釈によつてクローン化
した。JO1−１と命名されたクローンは、異常プ
ロトロンビンには結合するが原プロトロンビンと
は極僅が反応するだけの抗体を生成した。モノク
ロナル抗体は、型特異性血清を用いるオクタロニ
ーの免疫拡散法によりIgG1として定義された。 クローンJO1−１はATCCに寄託され、HB
8638という受入番号を付けられた。 出願人の譲受人であるニユーイングランドメデ
イカルセンターは、この培養物を発行された特許
の存続期間の終了前に元に戻し、死ぬようにする
義務を負い、且つかかる特許の発行をATCCに届
けてその時点で寄託物が寄託日から少なくとも30
年間は公衆の用に供し得るようにする義務を負
う。上記時点までは、寄託物は、37 CFR1.14節
および米国特許法112節の条件の下に特許局長官
へ提供される。 JO1−１抗体の精製 カルシウ無しの異常プロトロンビンに特異的な
JO1−１は、次のように行つた。プロトロンビン
を、臭化シアンで活性化したセフアロース
（Sepharose）4Bにタンパク質／樹脂量が２mg／
mlでカツプリングさせた。２本のアフイニテイカ
ラムを用意して、６ミリモルのEDTAの存在ま
たは不在でプロトロンビンをカツプリングさせ
た。 JO1−１培養物上清液をアミコン（Amicon）
PM30膜で40倍に濃縮し、TBS／EDTA（３ミリ
モル）中に透析した。この物質（1.5ml）を
TBS／EDTM（３ml）と平衡にした後、それぞれ
プロトロンビン−セフアロース カラム（1.0×
2.3cm）に加えた。結合した抗体は、同じ緩衝液
で１時間培養した後、TBS／Ca++（15ミリモル）
で溶出した。 プロトロンビン結合活性を、直接結合イーライ
ザ（ELISA）法によつて測定した。抗体調製物
の連続希釈液から、標準曲線を作成した。精製し
たモノクロナル抗体を乾燥スクロースを用いて、
透析管中で濃縮し、8.75％SDS ポリアクリルア
ミドゲル上で純度を測定した。単離されたJO1−
１抗体は、SDSおよびデービス（Davis）ゲル電
気泳動法では単一バンドとして移動した。 抗体−プロトロンビン相互作用に対する２価陽イ
オンの効果 直接結合イーライザ法を用いて、抗体−抗原錯
体の解離に対するCa++、Mg++およびMn++の効
果を検討した。プロトロンビンを含むイムロン
（Immulon）プレートをTBSで２回洗浄した
後、23℃で２％BSA／TBS／７ミリモルEDTA
で30分間洗浄した。ケレツクス（Chelex）100
〔バイオラツド（BioRad）〕を含むカラムを用い
て金属を除いてしまつた水を用いて作成した
TBSで徹底的に洗浄することによつて、EDTA
と混入している金属を孔から除去した。精製され
た特別な抗体を、0.1モル グリシン、PH2.5で溶
出した。既定の条件下で、JO1−１抗体の総てが
組織培養物上清液から除去された。 結果は、Ca++濃度が増加すると、抗体−抗原
相互作用が減少するようになることを示した。
0.9ミリモルCaCl2で、半最大結合が観測された。
対照的に、４ミリモルMnCl2で半最大結合が観測
された。高濃度のMg++は、抗体−抗原変位に限
定的な効果を有した。 抗体−プロトロンビン相互作用に対するカルシウ
ムイオンの効果 ５ミリモルCaCl2の存在または不在における、
組織培養物上清液中のJO1−１抗体とプロトロン
ビンおよび異常プロトロンビンとの相互作用を、
固相サンドウイツチイーライザ法を用いて評価し
た。JO1−１抗体は、カルシウムイオンの存在ま
たは不在において、異常プロトロンビンに結合し
た。。γ−カルボキシグルタミン酸を欠いた異常
プロトロンビンは、金属結合性を損なわれてしま
つており、金属によつて誘起される構造物遷移を
行わない。対照的に、JO1−１抗体は、EDTAの
存在においてのみプロトロンビンに結合した。５
ミリモルのCaCl2の存在では、抗体のプロトロン
ビンへの結合は見られなかつた。これらの結果
は、異常プロトロンビンに特異的なこのモノクロ
ナル抗体がプロトロンビンの無カルシウムコンフ
オーマーに対してコンフオメーシヨン特異性でも
あることを示した。 プロトロンビンに対する抗原性決定基 JO1−１抗体と固相に結合した異常プロトロン
ビンとの相互作用を抑制するプロトロンビンおよ
びプロトロンビンのポリペプチドフラグメントの
能力を、競合イーライザ（ELISA）法を用いて
評価した。７ミリモルEDTAの存在では、異常
プロトロンビンフラグメント（１−39）フラグメ
ント１およびフロトロンビンは、JO1−１抗体に
効果的に結合した。実験誤差の範囲内で、JO1−
１抗体は、これらのポリペプチド上に現れた抗原
性決定基に当量的に結合するように思われた。反
対に、15ミリモルのCaCl2の存在におけるデス−
（１−44）プロトロンビンは、抗体に結合しなか
つた。これらの結果は、プロトロンビンおよび異
常プロトロンビン上でJO1−１抗体が向けられて
いる抗原性決定基がプロトロンビンのNH2−末
満１−39アミノ酸残基内に含まれ、フラグメント
（１−39）上に完全に表される。 原発性肝細胞癌を検出するための異常プロトロン
ビンに対する抗体の使用 上述のように、ヒト異常プロトロンビンに反応
し且つ原ヒトプロトロンビンとは殆んど反応しな
い（ポリクロナルまたはモノクロナル）抗体は、
ヒト患者の血液または他の生物学的試料における
異常プロトロンビンの存在を検出するため免疫同
定法に用いることができ、また異常プロトロンビ
ンの検出によつて、肝機能不全の針断を行うこと
ができる。本出願人等は、生成学的試料中の異常
プロトロンビンを定量することによつて、原発性
肝細胞癌の診断を行うこともできることを見い出
した。 原発性肝細胞癌は、α−フエトタンパク質、異
常ビタミンB12結合剤、エリトロポエチンおよび
異常フイブリノーゲンのような迷走性および異所
性タンパク質の合成に関連していることが知られ
ている腫瘍である。このらのタンパク質の幾つか
は、特にα−フエトタンパク質は、処理および管
理を適切にする上で早期の且つ正確な診断が重要
な病気の診断マーカーとして使用されてきた。高
レベルの異常プロトロンビンの存在は、次に詳細
に説明するように、或る点では上記タンパク質の
或るものよりもすぐれた原発性肝細胞癌診断マー
カーである。 生検によつて肝細胞癌であることが確かめられ
た40人の台湾人患者と26人の米国人患者について
検討した。治療前に、これらの患者から血清試料
を採取した。生検でＢ型表面抗原陽性の慢性活動
性肝炎と診断された28人の患者および17人の肝臓
を含む転移性癌患者についても検討した。肝細胞
癌患者の平均年令は、54才であつあつた。これら
の患者の64％は、Ｂ型肝炎表面抗体に陽性であつ
た。Ｂ型肝炎感染の他の血清マーカー（Ｂ型肝炎
表面抗体、肝炎コア抗体、Be型肝炎抗原および
Be型肝炎抗体）を台湾人患者について測定した
ところ、50人中41人（82％）がＢ型肝炎に感染し
ていることが明らかになつた。 原プロトロンビンおよび異常プロトロンビン
を、上述の競合的放射免疫同定法でポリクロナル
抗体を用いて患者の血清で測定した。同定間の変
動は、10％以下であつた。α−フエトタンパク質
抗原およびＢ型肝炎表面抗原を、競合的放射免疫
同定法（α−フエト−RIAキツト（ａ−Feto−
RIAKit）〔ダイナボツト（Dainabot）、東京〕お
よびアウスリアキツド（AUSRIA Kit）〔アボツ
ト ラボラトリーズ（Abbott Laboratories）シ
カゴ〕によつて血清中で測定した。プロトロンビ
ン時間を標準法によつてクエン酸塩加血漿中で測
定した。データをまとめて、クリンフオ
（CLINFO）システム（バツクス（VAX）
／730コンピユター）によつて分析した。 異常プロトロンビンに対する値は、正規分布に
従わなかつたので、統計分析に幾何平均の計算を
取り入れた。 76人の肝細胞癌患者における異常プロトロンビ
ン抗原および原プロトロンビン抗原の分布を、第
３図に示す（異常プロトロンビンの大きさは５桁
に亘つて変動するので、対数目盛りで示してい
る）。これらの患者の91％（76人中69人）に、異
常プロトロンビンが検出された。総ての患者での
平均は、900nｇ／ml（範囲、０−67.000）であつ
た。異常プロトロンビン抗原と原プロトロンビン
抗原との間には、相関はなかつた。原プロトロン
ビン抗原の平均値は、90000±28000nｇ／mlであ
り、これは正常被験者について測定した値
（108000±19000nｇ／ml）（ｐ−0.34、スチユーデ
ントのｔ−検定）と有意差はなかつた。 肝細胞癌患者は、上述のようにビタミンＫ欠乏
症患者が原プロトロンビン抗原の値が低いのに比
べて、正常の原プロトロンビン抗原の値を有し
た。プロトロンビン時間指標も、ビタミンＫ欠乏
患者では低下したのに、66人の患者中46人が正常
であつた。 これらの患者での異常プロトロンビンの上昇が
潜在的ビタミンＫ欠乏症を反映しているという可
能性を除くため、５人の患者にビタミンＫ（20mg）
を連続２日間非経口的に分割投与し、７日間異常
プロトロンビン抗原の値を測定し、ビタミンＫ欠
乏症４人の患者の値（第２表）と比較した。血清
異常プロトロンビン抗原の値はヘパトーマ患者で
は有意には変化しなかつたが、ビタミンＫ欠乏患
者では予期したように減少した。
ように血液凝固の最終段階に関与するビタミンＫ
依存性血漿蛋白質である。これは約72000の分子
量をもち、約12％の炭水化物を含有する。プロト
ロンビンは既知のとおりカルシウムの存在下で立
体配座が変化するカルシウム結合性蛋白質であ
る。プロトロンビンからトロンビンへの蛋白分解
を伴う活性化は正常な止血における重要な工程で
ある。プロトロンビンは肝臓で合成される。ここ
でプロトロンビン前駆物質が翻訳後修飾を受け
て、プロトロンビンの機能形になる。これは“天
然プロトロンビン”として知られ、γ−カルボキ
シグルタミン酸を含有する。ビタミンＫ拮抗薬、
たとえばワルフアリンナトリウム（デラウエア州
ウイルミントンのデユポン社エンド・ラボラトリ
ーズ部門の商標クマジン（Coumadin）を有する
製品としても知られている）の存在下で、または
ビタミンＫの不在下で、血中のプロトロンビン活
性は有意に低下する可能性がある。これはプロト
ロンビン時間（一段凝血アツセイ法）により間接
的に、またはプロトロンビン欠損基質血漿を用い
るプロトロンビン凝血活性の直接測定により測定
することができる。血漿プロトロンビン活性が低
い場合、重症の肝疾患を伴う可能性もある。たと
えば蛋白質合成障害（肝疾患）、不適当なビタミ
ンＫ供給（ビタミンＫ欠乏症）、またはビタミン
Ｋの作用を抑止する薬物（ワルフアリンナトリウ
ム）はヒトその他の哺乳類における血漿プロトロ
ンビン活性を低下させる。 クマジンはワルフアリンの商品名である。クマ
ジンを血栓性疾患の治療または予防に際し広く行
われているように経口抗凝血薬として用いると、
これはビタミンＫ依存性血液凝固蛋白質、たとえ
ばプロトロンビンの活性を低下させる。適切なク
マジン用量はプロトロンビン時間の監視により確
立される。プロトロンビン時間は正常な血漿に関
して得られる時間の１1/2〜２／1/2倍に維持され
る。 1968年に、ワルフアリンナトリウムで治療した
患者の血漿中に、ヒト天然プロトロンビンに対比
して“異常プロトロンビン”および“ヒト異常プ
ロトロンビン”として知られるプロトロンビンの
変形が発見された。異常プロトロンビンがもつプ
ロトロンビン活性は低いが、多数のプロトロンビ
ン抗血清と交叉反応する。ウシ血液から異常プロ
トロンビンが1972年に初めて単離された。この種
の異常プロトロンビンは等量の天然プロトロンビ
ンの約３％の凝血活性をもつことが認められた。
そのほか分子量、酸加水分解の炭水化物組成およ
びアミノ酸組成は実質的に実験誤差の範囲内で等
しかつた。1970年代初期にウシ異常プロトロンビ
ンはプロトロンビンと異なりバリウム塩に結合せ
ず、カルシウムイオンに結合しないことが見出さ
れた。その後、異常プロトロンビンと天然プロト
ロンビンとの機能上の相違はこれらの蛋白質間の
構造上の相違に関係があり、完全なプロトロンビ
ン機能には無傷のカルシウ結合部位を必要とする
ことが示された。1970年代中期に、それまで知ら
れていなかつたアミノ酸であるγ−カルボキシグ
ルタミン酸がウシプロトロンビン中に存在し、こ
れが異常ウシプロトロンビンには欠如しているこ
とが見出された。このアミノ酸はプロトロンビン
の凝血活性を完全に発現するために必要であると
思われる。異常プロトロンビンは凝血活性をもた
ないことが知られており、金属イオンを結合せ
ず、γ−カルボキシグルタミン酸を含まない。他
の研究者らは、プロトロンビンが肝臓内でγ−カ
ルボキシグルタミン酸の代わりにグルタミン酸を
含有する前駆物質の形で合成されること理論づけ
た。肝臓内でのカルボキシル化過程でグルタミン
酸が修飾されてγ−カルボキシグルタミン酸が形
成される。この酵素系はビタミンＫを必要とし、
ビタミンＫ拮抗薬により抑制される。 体液、たとえば血漿中のプロトロンビンおよび
異常プロトロンビンの水準を測定するための定量
的アツセイ法を開発するために、これまで多くの
努力がなされてきた。これらの方法にはこれまで
著しい制限があつた。ヒト異常プロトロンビンお
よびヒト天然プロトロンビンは共に584個のアミ
ノ酸を含み、それらのうち574個はこれら２形態
において等しく、残りの10個はカルボキシル基に
おいて異なるにすぎないという点で、アツセイ法
を考案することは困難であつた。これらの蛋白質
は、構造上はほぼ等しいが機能的関与においては
きわめて異なつており、血液凝固に関して異なる
役割をもつ。 血液凝固の外因性経路におけるプロトロンビン
および他の蛋白質を評価するための既存の方法に
は、一般的なプロトロンビン時間測定法が含まれ
る。これは異常プロトロンビン水準を検出するも
のではない。プロトロンビンの凝血活性の直接ア
ツセイは、被験血漿を種々の割合のプロトロンビ
ン欠損血漿と混合し、次いで凝血させ、標準曲線
と比較することにより行われる。天然型の機能性
プロトロンビンのみが測定される。交叉免疫電気
泳動法は異常プロトロンビンおよび天然プロトロ
ンビンの双方を準定量的に測定するが、供与種が
他方を隠蔽するのを防ぐためには同様な濃度であ
ることが必要であり、従つて用途が限定される。
他の因難なかつ技術を要する試験法はローレル
（Laurell）のロケツト免疫電気泳動法である。こ
れは上記２種のプロトロンビンを区別できない。
プロトロンビンのラジオイムノアツセイも行われ
たが、これまでに用いられた抗体は異常プロトロ
ンビンにも正常プロトロンビンにも同等に（また
はほとんど同等に）結合し、従つて総プロトロン
ビン水準が測定されるにすぎず、臨床診断用とし
ては不十分である。蛇毒を用いるエキス・カリナ
ータス（毒蛇の一種、Echis carinatus）アツセ
イ法は総プロトロンビンの測定に用いられる。二
段プロトロンビンアツセイ法と組合せてこれらの
アツセイを間接的に異常プロトロンビン水準の推
定に用いることができる。 上記アツセイ法のいずれも、特にヒトにおいて
異常プロトロンビンの存在下でのプロトロンビ
ン、あるいは正常プロトロンビンの存在下での異
常プロトロンビンに関する直接的、定量的な、容
易に実施される感度の高い特異的アツセイ法を提
供しない。本発明においては蛋白質表面の特定領
域に対する立体配座特異性抗体を用いる研究を行
い、その結果異常プロトロンビンに対して、およ
び天然プロトロンビンに対して特異的な免疫化学
的試薬が開発された。異常プロトロンビンおよび
天然プロトロンビンが被験哺乳動物から得られる
血清検体のものである方法が記述され、これによ
り哺乳動物血漿中の異常プロトロンビンまたは天
然プロトロンビンの水準が測定され、ヒトにおい
ては異常プロトロンビンの存在は身体の障害を示
す。好ましい形態においては、ヒトの異常プロト
ロンビンおよび正常プロトロンビンの測定は他方
の存在下でそれぞれに対し特異的な抗体の使用に
よつて行われる。身体の障害がビタミンＫ欠乏症
である場合、異常プロトロンビンの水準が監視さ
れ、あらかじめ定められた水準に維持される。好
ましくは抗凝血薬の投与、たとえばワルフアリン
の投与が要求される場合、投与するワルフアリン
の目的水準ないしは目的量を指示するものとして
天然プロトロンビンを監視する。天然プロトロン
ビンの水準をその方法で定量的に測定することも
できる。ヒトのビタミンＫ拮抗薬（たとえばワル
フアリン）による抗凝血療法期間中、これらの水
準を定量的に測定したのち12〜24μｇ／mlの天然
プロトロンビン水準が、使用中の薬物（たとえば
ワルフアリンナトリウム）をさらに投与すること
により維持される。好ましくは天然プロトロンビ
ンは10〜24μｇ／mlの体液内水準に維持される。 本発明によればヒト天然プロトロンビンおよび
カルシウムの存在下デス−γ−カルボキシヒト
（すなわち異常）プロトロンビンと反応性であり、
カルシウムイオンの存在下でヒト天然プロトロン
ビンとは実質的に非反応性であるモノクロ−ナル
抗体が提供される。 異常ヒトプロトロンビンに対するポリクローナ
ル抗体と異なり本発明のモノクローナル抗体はカ
ルシウムイオンの不在下でヒト天然プロトロンビ
ンと複合体を形成しうる利点をもつ。本発明のモ
ノクローナル抗体は、インビトロ試験用体液中で
標準的な実験室条件下、たとえば室温、標準的大
気圧、およびそれらの普通の変動において反応性
であり、複合体を形成する点で好ましい。 定量的および定性的測定値を得るためのイムノ
アツセイを行う方法においては、一般的なイムノ
アツセイ操作法を採用することができ、これには
酵素結合アツセイ法およびラジオイムノアツセイ
法が含まれる。 ヒト異常プロトロンビンの存否は、血漿または
血清試料について前記の適宜なモノクローナル抗
体との免疫反応を行ない、そして抗体−抗原複合
体の存否を常法により定性的または定量的に測定
することによつて測定される。 人体内におけるヒト異常プロトロンビンの存在
は、肝疾患状態にある場合、個体をビタミンＫ拮
抗薬などの物質で処理した場合、ビタミンＫ欠乏
の場合、またはカルボキシル化障害をもたらす代
謝欠陥の結果以外は、血漿、血清または他の体液
１ml当たり0.03μｇを越えることはない。実際に
は液体１ml当たり0.03μｇ以下の水準もこの種の
疾患を示すものと考えられるが、このように低い
水準を本発明方法により探知することはできな
い。異常プロトロンビンの存在はいずれも上記の
疾患および障害を示唆するものと考えられる。従
つてイムノアツセイ法を用いて特定の肝疾患の存
否を判定し、肝疾患を異常プロトロンビンが正常
な状態から変動している特定の他の身体機能不全
と区別し、また患者に投与するワルフアリンナト
リウムの量を決定して血栓症または出血の危険性
を最小限に抑えることができる。 第１図は、数種の医学的障害を伴う患者におけ
る天然プロトロンビンおよび異常プロトロンビン
の血清濃度を示すグラフである。 第２図は、ビタミンＫ欠乏症を伴う患者におい
てビタミンＫ療法が天然プロトロンビンおよび異
常プロトロンビンに与える影響を示すグラフであ
る。 第３図は、肝細胞性癌を伴う患者における異常
プロトロンビンおよび天然プロトロンビンの血清
濃度を示すグラフである。 第４図は、肝癌患者３人における異常プロトロ
ンビンおよびα−フエトプロテインの血清濃度を
示すグラフである。 第５図は、３種の異なる肝臓障害を伴う各患者
における異常プロトロンビンの血清濃度を示すグ
ラフである。 第６図は、肝癌患者における異常プロトロンビ
ンおよびα−フエトプロテインの血清濃度を示す
グラフである。 第７図は、各種の医学的障害を伴う各患者の血
清中における異常プロトロンビン水準を示すグラ
フである。 プロトロンビン生合成障害の検出および診断は
ヒトにおいて血漿または血清の異常プロトロンビ
ンの測定により行うことができる。異常プロトロ
ンビンの特異的アツセイをヒト血漿または血清に
おいて採用し、プロトロンビン生合成の状態を判
定する。この情報は特定の疾患の状態とし相関し
ている可能性がある。 生常血漿：正常な個体から得られる血漿および
血清は検出可能な異常プロトロンビンを含まな
い。このアツセイ法の感度および特異性は、異常
プロトロンビンが0.03μｇ／ml以上となり得ない
ことを示している。正常水準の天然プロトロンビ
ンは約108μｇ／mlである。 急性肝炎：急性肝炎を伴う患者から得た血漿お
よび血清は0.1〜6μｇ／mlまたはそれ以上に変動
する大量の異常プロトロンビンを含有する。天然
プロトロンビンの水準は通常は正常であるが、正
常なプロトロンビンの範囲よりも高くまたは低く
なる可能性がある。 硬変：アルコール肝硬変を伴う患者から得た血
漿および血清は高い異常プロトロンビンを含む。
プロトロンビン水準は通常は準正常である。 慢性活動性肝炎：慢性活動性肝炎を伴う患者か
ら得た血漿および血清は検出可能な異常プロトロ
ンビンを含まない。 ビタミンＫ欠乏症：腸におけるビタミンＫ吸収
不全、腸肝循環障害、栄養欠乏、または抗性物質
による腸内細菌の妨害に基づくビタミンＫ欠乏症
は異常プロトロンビンおよびこれに相当するプロ
トロンビン低下を伴う。これらの患者はビタミン
Ｋに応答する。 肝臓を含む転移性癌：肝臓の破壊を含む癌を伴
う患者においては異常プロトロンビン水準が高
い。 肝細胞性癌：異常プロトロンビンが一様に存在
する。水準は低い水準からきわめて高い水準にま
で変動する。天然プロトロンビンの水準は正常で
あるが、変化しやすい。 診断の補佐には下記のものが含まれる。 (a) 異常肝機能研究によりプロトロンビン時間の
延長を伴う患者は、肝疾患またはビタミンＫ欠
乏症を有する可能性がある。高水準の異常プロ
トロンビンおよび中程度に低い水準のプロトロ
ンビンはビタミンＫ欠乏症を示唆する。低い水
準の異常プロトロンビンおよび正常な水準のプ
ロトロンビンは肝疾患を示す。 (b) 患者は気分が悪い。血液学的検査および腎ス
クリーニングテストはすべて正常である。異常
プロトロンビン水準の上昇は潜在性肝疾患を示
す。 (c) 黄疸および著しい凝血障害を伴う出血性患者
は異常プロトロンビンの増加を示すことが認め
られる。これは肝疾患の診断を示すものであ
り、血管内凝血を示すものではない。 (d) ある“正常な”個体が著しい出血を生じる。
プロトロンビン時間が延長している。きわめて
高い異常プロトロンビンおよび低いプロトロン
ビンは、ワルフアリンの過剰投与、すなわち不
自然なワルフアリン摂取を示唆する。 (e) ２年前に原発性黒色腫を伴つた患者が全身型
の症状を発現している。異常プロトロンビンの
増加は癌の肝浸潤を示唆する。 (f) ある患者が再発性血栓症の抑制のためワルフ
アリンで治療される。天然プロトロンビン時間
は治療範囲にあるにもかかわらず、天然プロト
ロンビンは36μｇ／mlであると測定される。こ
の患者は血栓症の恐れがあると診断される。ワ
ルフアリンの１日量を高め、天然プロトロンビ
ンを定期的に監視する。 アツセイ法に用いるための本発明の抗体のバイ
アルを含むイムノアツセイキツトを用意すること
ができる。たとえばヒト異常プロトロンビンに特
異的な標識された、または標識されていない抗体
のバイアルを用意し、RIAその他のイムノアツセ
イキツトに用いる他の材料と共に包装することが
できる。この種のキツトにおける材料の容積およ
びキツトの構成部品の数は大幅に変えられる。こ
の種のキツトはキツトの抗体と抗原−抗体複合体
を形成する抗原の存否および量を測定するイムノ
アツセイ法を実施するための指示し共に配布され
る場合が多い。 これらの免疫化学物質を試薬として用いて、ヒ
ト血漿または血清中の異常プロトロンビンに関す
る特異的ラジオイムノアツセイ法が開発された。
これらのラジオイムノアツセイ法は標準的な二重
抗体沈殿法および放射性ヨウ素化した抗原を伴
う。異常プロトロンビンに関するアツセイ法は
2nｇ／mlに及ぶ感度を示す。プロトロンビン
150μｇの存在下での異常プロトロンビン検出限
界は0.03μｇ／mlである。正常な血漿は異常プロ
トロンビンを含まない。低水準（0.2〜8μｇ／ml）
の異常プロトロンビンは種々の肝疾患に特徴的で
ある（肝炎、硬変、転移性悪性癌、原発性肝細胞
性癌）。対応する低いプロトロンビンを伴う低水
準ないしは高水準の異常プロトロンビン（１〜
100μｇ／ml）はビタミンＫ欠乏の程度と関連す
る。ワルフアリンナトリウを摂取している患者は
35μｇ／mlの範囲の異常プロトロンビン水準、お
よび10〜30μｇ／mlのプロトロンビン水準をも
つ。この異常プロトロンビンおよびプロトロンビ
ンの測定により、ビタミンＫ依存性カルボキシル
化の障害を特色とする疾患を伴う患者を確認し
（スクリーニングし）、診断することができる。こ
れらの測定を経口抗凝血薬療法の監視および制御
に用いることもできる。最後にこれらを用いてて
プロトロンビン合成の障害とプロトロンビン異化
加速／クリアランスの障害を区別することができ
る。 試験は普通は血清または血漿中で行われるが、
これを全血中で行つて相当する結果を得ることも
できる。 ワルフアリン監視について記述したが、他のビ
タミンＫ拮抗薬および抗凝血薬を、ワルフアリン
の経口使用の監視に関する本発明方法に従つて監
視した場合も同様な結果が得られる。数種の医学
的障害を伴う各患者の血清中における異常プロト
ロンビン水準を第７図に示す。 異常プロトロンビンに対するモノクロナル抗体の
調製 バルブ／ｃ系マウスを、完全型フロイントのア
ジユバンド中に25μｇのヒト異常プロトロンビン
を混和したものを皮下注射して免疫した。30日お
よび37日後に、10μｇの異常プロトロンビンを、
食塩水中に注入した。免疫されたマウスの脾臓細
胞（５×107）とSp2／０血漿細胞系（５×106）
との融合は、28％ポリエチレングリコール2000を
用いて0.5ml中で６分間行つた。融合した細胞を、
ヒポキサン−アミノプリテン−チミジンを含む
（最終濃度はそれぞれ、1.36，0.176，および0.38
mg／ml）RPMI 1640／20％仔ウシ血清に懸濁し、
ウエルあたり１−３×105の細胞濃度で接種した。
接種した540のウエルの43％に細胞の生育が観察
された。細胞を数週間培養後、コロニーを含むウ
エルから上清を吸引し、該上清について抗デス−
γ−カルボキ トロンビン抗体活性をアツセイし
た。陽極のウエルの細胞を選択して制限希釈法に
よりクローン化し、そして同じ方法により再クロ
ーン化した。 抗異常プロトロンビン抗体を分泌する細胞は、
異常プロトロンビンと天然プロトロンビン（以
下、原プロトロンビン）を用いる２個の固相イー
ライザ（ELISA）法で同定した。プロトロンビ
ンとよりも異常原プロトロンビンとずつと大きな
反応性を示す孔は、限定希釈によつてクローン化
した。JO1−１と命名されたクローンは、異常プ
ロトロンビンには結合するが原プロトロンビンと
は極僅が反応するだけの抗体を生成した。モノク
ロナル抗体は、型特異性血清を用いるオクタロニ
ーの免疫拡散法によりIgG1として定義された。 クローンJO1−１はATCCに寄託され、HB
8638という受入番号を付けられた。 出願人の譲受人であるニユーイングランドメデ
イカルセンターは、この培養物を発行された特許
の存続期間の終了前に元に戻し、死ぬようにする
義務を負い、且つかかる特許の発行をATCCに届
けてその時点で寄託物が寄託日から少なくとも30
年間は公衆の用に供し得るようにする義務を負
う。上記時点までは、寄託物は、37 CFR1.14節
および米国特許法112節の条件の下に特許局長官
へ提供される。 JO1−１抗体の精製 カルシウ無しの異常プロトロンビンに特異的な
JO1−１は、次のように行つた。プロトロンビン
を、臭化シアンで活性化したセフアロース
（Sepharose）4Bにタンパク質／樹脂量が２mg／
mlでカツプリングさせた。２本のアフイニテイカ
ラムを用意して、６ミリモルのEDTAの存在ま
たは不在でプロトロンビンをカツプリングさせ
た。 JO1−１培養物上清液をアミコン（Amicon）
PM30膜で40倍に濃縮し、TBS／EDTA（３ミリ
モル）中に透析した。この物質（1.5ml）を
TBS／EDTM（３ml）と平衡にした後、それぞれ
プロトロンビン−セフアロース カラム（1.0×
2.3cm）に加えた。結合した抗体は、同じ緩衝液
で１時間培養した後、TBS／Ca++（15ミリモル）
で溶出した。 プロトロンビン結合活性を、直接結合イーライ
ザ（ELISA）法によつて測定した。抗体調製物
の連続希釈液から、標準曲線を作成した。精製し
たモノクロナル抗体を乾燥スクロースを用いて、
透析管中で濃縮し、8.75％SDS ポリアクリルア
ミドゲル上で純度を測定した。単離されたJO1−
１抗体は、SDSおよびデービス（Davis）ゲル電
気泳動法では単一バンドとして移動した。 抗体−プロトロンビン相互作用に対する２価陽イ
オンの効果 直接結合イーライザ法を用いて、抗体−抗原錯
体の解離に対するCa++、Mg++およびMn++の効
果を検討した。プロトロンビンを含むイムロン
（Immulon）プレートをTBSで２回洗浄した
後、23℃で２％BSA／TBS／７ミリモルEDTA
で30分間洗浄した。ケレツクス（Chelex）100
〔バイオラツド（BioRad）〕を含むカラムを用い
て金属を除いてしまつた水を用いて作成した
TBSで徹底的に洗浄することによつて、EDTA
と混入している金属を孔から除去した。精製され
た特別な抗体を、0.1モル グリシン、PH2.5で溶
出した。既定の条件下で、JO1−１抗体の総てが
組織培養物上清液から除去された。 結果は、Ca++濃度が増加すると、抗体−抗原
相互作用が減少するようになることを示した。
0.9ミリモルCaCl2で、半最大結合が観測された。
対照的に、４ミリモルMnCl2で半最大結合が観測
された。高濃度のMg++は、抗体−抗原変位に限
定的な効果を有した。 抗体−プロトロンビン相互作用に対するカルシウ
ムイオンの効果 ５ミリモルCaCl2の存在または不在における、
組織培養物上清液中のJO1−１抗体とプロトロン
ビンおよび異常プロトロンビンとの相互作用を、
固相サンドウイツチイーライザ法を用いて評価し
た。JO1−１抗体は、カルシウムイオンの存在ま
たは不在において、異常プロトロンビンに結合し
た。。γ−カルボキシグルタミン酸を欠いた異常
プロトロンビンは、金属結合性を損なわれてしま
つており、金属によつて誘起される構造物遷移を
行わない。対照的に、JO1−１抗体は、EDTAの
存在においてのみプロトロンビンに結合した。５
ミリモルのCaCl2の存在では、抗体のプロトロン
ビンへの結合は見られなかつた。これらの結果
は、異常プロトロンビンに特異的なこのモノクロ
ナル抗体がプロトロンビンの無カルシウムコンフ
オーマーに対してコンフオメーシヨン特異性でも
あることを示した。 プロトロンビンに対する抗原性決定基 JO1−１抗体と固相に結合した異常プロトロン
ビンとの相互作用を抑制するプロトロンビンおよ
びプロトロンビンのポリペプチドフラグメントの
能力を、競合イーライザ（ELISA）法を用いて
評価した。７ミリモルEDTAの存在では、異常
プロトロンビンフラグメント（１−39）フラグメ
ント１およびフロトロンビンは、JO1−１抗体に
効果的に結合した。実験誤差の範囲内で、JO1−
１抗体は、これらのポリペプチド上に現れた抗原
性決定基に当量的に結合するように思われた。反
対に、15ミリモルのCaCl2の存在におけるデス−
（１−44）プロトロンビンは、抗体に結合しなか
つた。これらの結果は、プロトロンビンおよび異
常プロトロンビン上でJO1−１抗体が向けられて
いる抗原性決定基がプロトロンビンのNH2−末
満１−39アミノ酸残基内に含まれ、フラグメント
（１−39）上に完全に表される。 原発性肝細胞癌を検出するための異常プロトロン
ビンに対する抗体の使用 上述のように、ヒト異常プロトロンビンに反応
し且つ原ヒトプロトロンビンとは殆んど反応しな
い（ポリクロナルまたはモノクロナル）抗体は、
ヒト患者の血液または他の生物学的試料における
異常プロトロンビンの存在を検出するため免疫同
定法に用いることができ、また異常プロトロンビ
ンの検出によつて、肝機能不全の針断を行うこと
ができる。本出願人等は、生成学的試料中の異常
プロトロンビンを定量することによつて、原発性
肝細胞癌の診断を行うこともできることを見い出
した。 原発性肝細胞癌は、α−フエトタンパク質、異
常ビタミンB12結合剤、エリトロポエチンおよび
異常フイブリノーゲンのような迷走性および異所
性タンパク質の合成に関連していることが知られ
ている腫瘍である。このらのタンパク質の幾つか
は、特にα−フエトタンパク質は、処理および管
理を適切にする上で早期の且つ正確な診断が重要
な病気の診断マーカーとして使用されてきた。高
レベルの異常プロトロンビンの存在は、次に詳細
に説明するように、或る点では上記タンパク質の
或るものよりもすぐれた原発性肝細胞癌診断マー
カーである。 生検によつて肝細胞癌であることが確かめられ
た40人の台湾人患者と26人の米国人患者について
検討した。治療前に、これらの患者から血清試料
を採取した。生検でＢ型表面抗原陽性の慢性活動
性肝炎と診断された28人の患者および17人の肝臓
を含む転移性癌患者についても検討した。肝細胞
癌患者の平均年令は、54才であつあつた。これら
の患者の64％は、Ｂ型肝炎表面抗体に陽性であつ
た。Ｂ型肝炎感染の他の血清マーカー（Ｂ型肝炎
表面抗体、肝炎コア抗体、Be型肝炎抗原および
Be型肝炎抗体）を台湾人患者について測定した
ところ、50人中41人（82％）がＢ型肝炎に感染し
ていることが明らかになつた。 原プロトロンビンおよび異常プロトロンビン
を、上述の競合的放射免疫同定法でポリクロナル
抗体を用いて患者の血清で測定した。同定間の変
動は、10％以下であつた。α−フエトタンパク質
抗原およびＢ型肝炎表面抗原を、競合的放射免疫
同定法（α−フエト−RIAキツト（ａ−Feto−
RIAKit）〔ダイナボツト（Dainabot）、東京〕お
よびアウスリアキツド（AUSRIA Kit）〔アボツ
ト ラボラトリーズ（Abbott Laboratories）シ
カゴ〕によつて血清中で測定した。プロトロンビ
ン時間を標準法によつてクエン酸塩加血漿中で測
定した。データをまとめて、クリンフオ
（CLINFO）システム（バツクス（VAX）
／730コンピユター）によつて分析した。 異常プロトロンビンに対する値は、正規分布に
従わなかつたので、統計分析に幾何平均の計算を
取り入れた。 76人の肝細胞癌患者における異常プロトロンビ
ン抗原および原プロトロンビン抗原の分布を、第
３図に示す（異常プロトロンビンの大きさは５桁
に亘つて変動するので、対数目盛りで示してい
る）。これらの患者の91％（76人中69人）に、異
常プロトロンビンが検出された。総ての患者での
平均は、900nｇ／ml（範囲、０−67.000）であつ
た。異常プロトロンビン抗原と原プロトロンビン
抗原との間には、相関はなかつた。原プロトロン
ビン抗原の平均値は、90000±28000nｇ／mlであ
り、これは正常被験者について測定した値
（108000±19000nｇ／ml）（ｐ−0.34、スチユーデ
ントのｔ−検定）と有意差はなかつた。 肝細胞癌患者は、上述のようにビタミンＫ欠乏
症患者が原プロトロンビン抗原の値が低いのに比
べて、正常の原プロトロンビン抗原の値を有し
た。プロトロンビン時間指標も、ビタミンＫ欠乏
患者では低下したのに、66人の患者中46人が正常
であつた。 これらの患者での異常プロトロンビンの上昇が
潜在的ビタミンＫ欠乏症を反映しているという可
能性を除くため、５人の患者にビタミンＫ（20mg）
を連続２日間非経口的に分割投与し、７日間異常
プロトロンビン抗原の値を測定し、ビタミンＫ欠
乏症４人の患者の値（第２表）と比較した。血清
異常プロトロンビン抗原の値はヘパトーマ患者で
は有意には変化しなかつたが、ビタミンＫ欠乏患
者では予期したように減少した。
【表】
総ての患者にビタミンＫを非経口投与し、異常プ
ロトロンビン抗原の値を７日後に測定した。ヘパ
トーマ患者には10mgずつ連続２日間投与し、ビタ
ミンＫ欠乏症患者には10mgを１回だけ投与した。 外科的に癌の切除を受けた２名の患者におい
て、異常プロトロンビンおよびα−フエトタンパ
ク質を測定した。切除前は、１名の患者は、血清
の異常プロトロンビン値は11000nｇ／mlであつ
たが、切除１ケ月後までに15nｇ／mlに減少した
（第４図）。14月後には、患者は臨床的および放射
線学的に再発の兆候はなく異常プロトロンビン抗
原は検出されないままであつた。切除から17月
後、異常プロトロンビン抗原の濃度が150nｇ／
mlに増加し、シーテイー（CT）スキヤンの結果
ヘパトーマの再発が見られた。 α−フエトタンパク質の値は、臨床的経過と極
僅かしか相関しなかつた。切除後、α−フエトタ
ンパク質値は230から108nｇ／mlに減少し、14月
後には突然1147n(エ)／mlに増加し、17月後には癌
が再発したにも拘わらず408nｇ／mlへと二度目
の減少を示した。 もう一人の患者では、切除後１週間で、異常プ
ロトロンビンは6000から150nｇ／mlへ減少した
（第４図）。この患者は再調査しなかつたが、10月
後に臨床的に再発の兆候があり且つ異常プロトロ
ンビン抗原の濃度が4200nｇ／mlとなつて再入院
した。この患者のα−フエトタンパク質濃度は、
臨床的経過を反映した。 異常プロトロンビン抗原は、生検でα−フエト
タンパク質陰性肝細胞癌と診断され、組織的化学
療法を受けた23才の女性についても測定した（第
４図）。この患者では、腹水の減少、肝の大きさ
の減少、食欲の向上および体重の増加などの臨床
的応答を有した。異常プロトロンビン濃度は、治
療前の5500nｇ／mlから320nｇ／mlへと減少し
た。 異常プロトロンビン抗原を、28名のＢ型肝炎表
面抗原陽性慢性の活動性肝炎、原発性肝細胞癌の
発生による障害と生検で診断された患者について
測定した（第５図）。これらの28名の患者では、
異常プロトロンビン抗原濃度は、無視し得る程度
であつた（平均値、10nｇ／ml）。異常プロトロ
ンビン抗原を、肝を含む転移癌を有する17名の患
者（乳癌 ６名、結腸癌 ３名、スイ臓癌 ２
名、肺癌 ３名、リンパ腫 ２名、起点不明の腺
癌 １名）についても測定したところ、抗原の血
清濃度が42nｇ／mlの平均値で増加した。 原発性肝細胞癌患者の67％が、300nｇ／ml以
上の異常プロトロンビン濃度を有した。これは、
慢性の活動性肝炎の総ての患者、一人を除く転移
癌患者および以前検討した急性肝炎と肝硬変の患
者の90％において測定した異常プロトロンビンの
濃度を越えている。（ブランチヤード
（Blanchard）等、1981年、ニユー イングラン
ド ジヤーナル オブ メデイシン（New
England JOurnal of Medicine）、第305巻、242
頁）。 α−フエトタンパク質抗原を、肝細胞癌患者で
測定して、異常プロトロンビン抗原に対してプロ
ツトした（第５図）。２個の抗原の間には、殆ど
相関がなかつた（ｒ＝0.3）。400nｇ／ml以上のα
−フエトタンパク質抗原濃度は、他の殆どの悪性
および非悪性疾患において上昇することが報告さ
れているので、肝細胞癌を強く示唆暗示するもの
であると報告された。上記76名の患者のうち48名
（63％）では、α−フエトタンパク質抗原濃度は
400nｇ／ml以上であり、また28名は低濃度であ
り、その16名（57％）は異常プロトロンビン濃度
は300nｇ／ml以上であつた。両分析結果をまと
めると、64名（84％）の患者で血清抗原の一方ま
たは両方の濃度が高く、原発性肝細胞癌を強く暗
示した。 α−フエトタンパク質および異常プロトロンビ
ン抗原濃度は、肝炎表面抗原の存在または不在に
は関係しなかつた。表面抗原陽性の患者では、血
清の異常プロトロンビンの平均値は（974nｇ／
ml（範囲、０−67000）であり、表面抗原陰性の
患者では、805nｇ／ml（範囲、０−23000）であ
つた。 上記結果は、異常プロトロンビン原発性肝細胞
癌に対する血清腫瘍マーカーであることを示して
いる。この抗原は、ヘパトーマ患者の大部分に存
在し、ビタミンＫの非経口投与によつても消失し
ない。それ故、これらの患者はビタミンＫ欠乏症
ではない。更に、異常プロトロンビン抗原は、腫
瘍を切除したり化学療法によつて消失または減少
する。この証拠は異常プロトロンビンがビタミン
Ｋ依存カルボキシル化におけるヘパトーマ誘発欠
損から生じていることを支持する。 上記結果は、異常プロトロンビンの大上昇が、
原発性肝細胞癌と肝臓癌を含む他の肝障害とを区
別するのに役立つことを示している。これはプロ
トロンビン合成について知られていることと適合
し、肝細胞がプロトロンビンを合成してカルボキ
シル化するだけであり、異常プロトロンビン抗原
の大上昇が肝細胞の悪性変換にだけ起こる。急性
肝炎、慢性活動性肝炎および肝硬変のような非悪
性肝細胞疾患に見られる低濃度の異常プロトロン
ビンは、時にはこれらの疾患と肝細胞癌を区別す
ることを困難にするので、血清１ml当たり約
300nｇ（または希釈を用いる場合には、当量）
のいき値をヘパトーマを強く暗示するものとして
示される。しばしば肝細胞癌の前駆体としての慢
性活動性肝炎を特徴づける非常に低濃度の異常プ
ロトロンビンは、異常プロトロンビン抗原を観察
している慢性活動性肝炎患者での悪性変換を検出
することができる。 α−フエタンパク質抗原および異常プロトロン
ビン抗原は、それぞれ肝細胞癌患者を約３分の２
の高確率で同定することができる。これらの抗原
は、悪性肝細胞における異なる生化学的経路の変
更を測定する。一緒に用いる場合には、両試験は
単一の腫瘍マーカーで得られるよりも多くの情報
を提供する。ビタミンＫ欠乏症を診断的考察とし
て除外することができる場合には、これら２つの
試験は、原発性肝細胞癌患者の84％を同定するこ
とができ、この疾患の補助的腫瘍マーカーであ
る。
ロトロンビン抗原の値を７日後に測定した。ヘパ
トーマ患者には10mgずつ連続２日間投与し、ビタ
ミンＫ欠乏症患者には10mgを１回だけ投与した。 外科的に癌の切除を受けた２名の患者におい
て、異常プロトロンビンおよびα−フエトタンパ
ク質を測定した。切除前は、１名の患者は、血清
の異常プロトロンビン値は11000nｇ／mlであつ
たが、切除１ケ月後までに15nｇ／mlに減少した
（第４図）。14月後には、患者は臨床的および放射
線学的に再発の兆候はなく異常プロトロンビン抗
原は検出されないままであつた。切除から17月
後、異常プロトロンビン抗原の濃度が150nｇ／
mlに増加し、シーテイー（CT）スキヤンの結果
ヘパトーマの再発が見られた。 α−フエトタンパク質の値は、臨床的経過と極
僅かしか相関しなかつた。切除後、α−フエトタ
ンパク質値は230から108nｇ／mlに減少し、14月
後には突然1147n(エ)／mlに増加し、17月後には癌
が再発したにも拘わらず408nｇ／mlへと二度目
の減少を示した。 もう一人の患者では、切除後１週間で、異常プ
ロトロンビンは6000から150nｇ／mlへ減少した
（第４図）。この患者は再調査しなかつたが、10月
後に臨床的に再発の兆候があり且つ異常プロトロ
ンビン抗原の濃度が4200nｇ／mlとなつて再入院
した。この患者のα−フエトタンパク質濃度は、
臨床的経過を反映した。 異常プロトロンビン抗原は、生検でα−フエト
タンパク質陰性肝細胞癌と診断され、組織的化学
療法を受けた23才の女性についても測定した（第
４図）。この患者では、腹水の減少、肝の大きさ
の減少、食欲の向上および体重の増加などの臨床
的応答を有した。異常プロトロンビン濃度は、治
療前の5500nｇ／mlから320nｇ／mlへと減少し
た。 異常プロトロンビン抗原を、28名のＢ型肝炎表
面抗原陽性慢性の活動性肝炎、原発性肝細胞癌の
発生による障害と生検で診断された患者について
測定した（第５図）。これらの28名の患者では、
異常プロトロンビン抗原濃度は、無視し得る程度
であつた（平均値、10nｇ／ml）。異常プロトロ
ンビン抗原を、肝を含む転移癌を有する17名の患
者（乳癌 ６名、結腸癌 ３名、スイ臓癌 ２
名、肺癌 ３名、リンパ腫 ２名、起点不明の腺
癌 １名）についても測定したところ、抗原の血
清濃度が42nｇ／mlの平均値で増加した。 原発性肝細胞癌患者の67％が、300nｇ／ml以
上の異常プロトロンビン濃度を有した。これは、
慢性の活動性肝炎の総ての患者、一人を除く転移
癌患者および以前検討した急性肝炎と肝硬変の患
者の90％において測定した異常プロトロンビンの
濃度を越えている。（ブランチヤード
（Blanchard）等、1981年、ニユー イングラン
ド ジヤーナル オブ メデイシン（New
England JOurnal of Medicine）、第305巻、242
頁）。 α−フエトタンパク質抗原を、肝細胞癌患者で
測定して、異常プロトロンビン抗原に対してプロ
ツトした（第５図）。２個の抗原の間には、殆ど
相関がなかつた（ｒ＝0.3）。400nｇ／ml以上のα
−フエトタンパク質抗原濃度は、他の殆どの悪性
および非悪性疾患において上昇することが報告さ
れているので、肝細胞癌を強く示唆暗示するもの
であると報告された。上記76名の患者のうち48名
（63％）では、α−フエトタンパク質抗原濃度は
400nｇ／ml以上であり、また28名は低濃度であ
り、その16名（57％）は異常プロトロンビン濃度
は300nｇ／ml以上であつた。両分析結果をまと
めると、64名（84％）の患者で血清抗原の一方ま
たは両方の濃度が高く、原発性肝細胞癌を強く暗
示した。 α−フエトタンパク質および異常プロトロンビ
ン抗原濃度は、肝炎表面抗原の存在または不在に
は関係しなかつた。表面抗原陽性の患者では、血
清の異常プロトロンビンの平均値は（974nｇ／
ml（範囲、０−67000）であり、表面抗原陰性の
患者では、805nｇ／ml（範囲、０−23000）であ
つた。 上記結果は、異常プロトロンビン原発性肝細胞
癌に対する血清腫瘍マーカーであることを示して
いる。この抗原は、ヘパトーマ患者の大部分に存
在し、ビタミンＫの非経口投与によつても消失し
ない。それ故、これらの患者はビタミンＫ欠乏症
ではない。更に、異常プロトロンビン抗原は、腫
瘍を切除したり化学療法によつて消失または減少
する。この証拠は異常プロトロンビンがビタミン
Ｋ依存カルボキシル化におけるヘパトーマ誘発欠
損から生じていることを支持する。 上記結果は、異常プロトロンビンの大上昇が、
原発性肝細胞癌と肝臓癌を含む他の肝障害とを区
別するのに役立つことを示している。これはプロ
トロンビン合成について知られていることと適合
し、肝細胞がプロトロンビンを合成してカルボキ
シル化するだけであり、異常プロトロンビン抗原
の大上昇が肝細胞の悪性変換にだけ起こる。急性
肝炎、慢性活動性肝炎および肝硬変のような非悪
性肝細胞疾患に見られる低濃度の異常プロトロン
ビンは、時にはこれらの疾患と肝細胞癌を区別す
ることを困難にするので、血清１ml当たり約
300nｇ（または希釈を用いる場合には、当量）
のいき値をヘパトーマを強く暗示するものとして
示される。しばしば肝細胞癌の前駆体としての慢
性活動性肝炎を特徴づける非常に低濃度の異常プ
ロトロンビンは、異常プロトロンビン抗原を観察
している慢性活動性肝炎患者での悪性変換を検出
することができる。 α−フエタンパク質抗原および異常プロトロン
ビン抗原は、それぞれ肝細胞癌患者を約３分の２
の高確率で同定することができる。これらの抗原
は、悪性肝細胞における異なる生化学的経路の変
更を測定する。一緒に用いる場合には、両試験は
単一の腫瘍マーカーで得られるよりも多くの情報
を提供する。ビタミンＫ欠乏症を診断的考察とし
て除外することができる場合には、これら２つの
試験は、原発性肝細胞癌患者の84％を同定するこ
とができ、この疾患の補助的腫瘍マーカーであ
る。
第１図は、数種の医学的障害を伴う患者におけ
る天然プロトロンビンおよび異常プロトロンビン
の血清濃度を示すグラフである。 第２図は、ビタミンＫ欠乏症を伴う患者におい
てビタミンＫ療法が天然プロトロンビンおよび異
常プロトロンビンに与える影響を示すグラフであ
る。第３図は、原発性肝細胞癌を伴う76人の患者
における異常プロトロンビンおよび天然プロトロ
ンビンの血清濃度を示すグラフである。第４図
は、肝癌患者３人における異常プロトロンビン
（黒マル）およびα−フエトプロテインの血清濃
度（白丸）を示すグラフである。患者Ａ及びＢは
外科的に腫瘍を切除した患者である。患者Ｃは混
合化学療法を受けている者であり、一貫して10n
ｇ／mlより低レベルのα−フエトプロテインを有
した。第５図は、３種の異なる肝臓障害を伴う各
患者における異常プロトロンビンの血清濃度を示
すグラフである。第６図は、肝癌患者76人におけ
る異常プロトロンビンおよびα−フエトプロテイ
ンの血清濃度を示すグラフである。両抗原の値は
対数で示した。両抗原の値の相関性は小であつ
た。第７図は、各種の医学的障害を伴う各患者の
血清中における異常プロトロンビン水準を示すグ
ラフである。
る天然プロトロンビンおよび異常プロトロンビン
の血清濃度を示すグラフである。 第２図は、ビタミンＫ欠乏症を伴う患者におい
てビタミンＫ療法が天然プロトロンビンおよび異
常プロトロンビンに与える影響を示すグラフであ
る。第３図は、原発性肝細胞癌を伴う76人の患者
における異常プロトロンビンおよび天然プロトロ
ンビンの血清濃度を示すグラフである。第４図
は、肝癌患者３人における異常プロトロンビン
（黒マル）およびα−フエトプロテインの血清濃
度（白丸）を示すグラフである。患者Ａ及びＢは
外科的に腫瘍を切除した患者である。患者Ｃは混
合化学療法を受けている者であり、一貫して10n
ｇ／mlより低レベルのα−フエトプロテインを有
した。第５図は、３種の異なる肝臓障害を伴う各
患者における異常プロトロンビンの血清濃度を示
すグラフである。第６図は、肝癌患者76人におけ
る異常プロトロンビンおよびα−フエトプロテイ
ンの血清濃度を示すグラフである。両抗原の値は
対数で示した。両抗原の値の相関性は小であつ
た。第７図は、各種の医学的障害を伴う各患者の
血清中における異常プロトロンビン水準を示すグ
ラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ デス−γ−カルボキシ ヒトプロトロンビン
と反応し且つカルシウムイオンの存在でヒト天然
プロトロンビンと実質的に不反応性であることを
特徴とする、モノクロナル抗体。 ２ カルシウムイオンの存在において、前記デス
−γ−カルボキシ ヒトプロトロンビンと反応す
る、特許請求の範囲第１項記載のモノクロナル抗
体。 ３ カルシウムイオンの不在において、ヒト天然
プロトロンビンと反応する、特許請求の範囲第１
項記載のモノクロナル抗体。 ４ 生物学的試料において、ヒト デス−γ−カ
ルボキシ プロトロンビンの存在を検出する方法
において、前記試料をデス−γ−カルボキシ ヒ
トプロトロンビンと反応し且つカルシウムイオン
の存在でヒト天然プロトロンビンと実質的に不反
応性であることを特徴とする、モノクロル抗体と
接触させ、前記デス−γ−カルボキシ プロトロ
ンビンと前記モノクロナル抗体との複合体を、前
記試料中における前記デス−γ−カルボキシ プ
ロトロンビンの存在の指標として検出することを
特徴とする方法。 ５ 前記複合体を、前記試料中における前記デス
−γ−カルボキシ プロトロンビンの定量的尺度
として測定する、特許請求の範囲第４項記載の方
法。 ６ 前記抗体を検出可能な標識で標識する、特許
請求の範囲第４項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/661,187 US4769320A (en) | 1982-07-27 | 1984-10-15 | Immunoassay means and methods useful in human native prothrombin and human abnormal prothorombin determinations |
| US661187 | 1984-10-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61117457A JPS61117457A (ja) | 1986-06-04 |
| JPH0441000B2 true JPH0441000B2 (ja) | 1992-07-06 |
Family
ID=24652562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60229763A Granted JPS61117457A (ja) | 1984-10-15 | 1985-10-15 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4769320A (ja) |
| EP (1) | EP0182495B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61117457A (ja) |
| AT (1) | ATE52141T1 (ja) |
| DE (1) | DE3577233D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11359009B2 (en) | 2015-12-25 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies and methods of use |
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