JPH0441159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ソフトスタチンは次構造式： Ala−Gly−Cys−Lys−Asn−Phe−Phe−Trp−
Lys−Thr−Phe−Thr−Ser−Cys−OH １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 10 11 12
13 14 を有し、環状ドデカペプチド構造を含むテトラデ
カペプチドであり、成長ホルモンの放出を阻止し
たりインシユリン及びグルカゴンの放出を阻止し
たり胃液の分泌を抑制したりする性質を有する。 ソマトスタチンは不活性化、とりわけ生体内に
存在するアミノペプチダーゼ類及びカルボキシペ
プチダーゼ類により不活性化されるため、この物
質自身は短期間の作用しかない。この作用の短期
性という問題は先行技術において低溶解性を有
し、従つて皮下注射において徐々に放出されるソ
マトスタチンの誘導体を製造することにより部分
的に解決されていた。しかしながら、一旦溶解し
てしまうと、誘導体はアミノペプチダーゼ類及び
カルボキシペプチダーゼ類による不活性化に対し
ソマトスタチン自身よりも安定ではない。 本発明はソマトスタチンの誘導体、とりわけ環
を構成しているアミノ酸８個をCys−Cys基によ
り置換し環外のアミノ酸を２個とも除いた、架橋
−、好適にはジスルフイド架橋環状ヘキサペプチ
ドを与えるものである。さらに残つているアミノ
酸の置換及び反応についても記載する。二環性ヘ
キサペプチドはグルカゴン、成長ホルモン、イン
シユリンの放出を阻害し、胃酸分泌を抑制する。
特に本化合物は胃酸の分泌の濃度に対する影響を
与えることなくまたは胃酸の分泌、インシユリ
ン、グロカゴンの濃度に影響を与えることなく成
長ホルモンの放出を優先的に抑制する；または本
化合物は胃酸の分泌を抑制する。故に本化合物は
ソマトスタチンよりもより選択的生物活性を有す
る。本発明の架橋環状ヘキサペプチド化合物はま
たソマトスタチンよりもより長期間活性が持続す
る。本発明の環状ヘキサペプチド類自体が先端巨
大症、糖尿病、糖尿病性網膜症、消化性潰瘍の治
療に有用である。 従つて、本発明の目的は架橋環状ヘキサペプチ
ドソマトスタチン類縁体、特にジスルフイド架橋
化合物について記載することである。さらなる目
的は該架橋環状ヘキサペプチド類の製造方法につ
いて記載することである。またさらなる目的は先
端巨大症、糖尿病性網膜症、消化性潰瘍の治療に
おける該化合物の使用について記載することであ
る。他の目的は以下の記載を読むことから明らか
になるだろう。 本発明の化合物は次の構造式： に最もよく示される。 本出願において使用する“低級アルキル”なる
用語を直鎖もしくは分岐鎖で、１−５個の炭素原
子を有するアルキル基を示すことを意図してい
る。そのようなアルキル基の例はメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第二ブチ
ル、ペンチルなどである。 “低級アルコキシ”なる用語は直鎖もしくは分
岐鎖で炭素数１−５個のアルコキシ基を含むこと
を意図する。該アルコキシ基の例はメトキシ、エ
トキシ、プルポキシ、イソプロポキシ、ブトキ
シ、第三ブトキシ、ペントキシなどである。 “ハロゲン”もしくは“ハロ”なる用語はフツ
素、塩素、臭素およびヨウ素を含むことを意図す
る。 “５−もしくは６−員の複素環”なる用語は酸
素、窒素および硫黄から選択した１個または２個
の複素原子を有する５−及び６−員の複素環を含
むことを意図する。該複素環の例はイミダゾー
ル、フラン、チアゾール、ピラゾール、ピリジン
などである。 本化合物類にはいくつかの不斉中心があり、該
化合物に対する光学異性体の存在を導く。本発明
において、この環状ヘキサペプチドを構成してい
るＤ−トリブトフアン以外の種々のアミノ酸の
各々を不斉中心に対してＤとＬ両配置が含まれる
ことを意味する。 本発明化合物中の−ベンジル−インドリルメチ
ル−メチレン−１−ヒドロキシエチル−部分は、
ソマトスタチンの第７，８，９及び10アミノ酸
（−Phe−Trp−Lys−Thr）を示しており、架橋
結合をしているCys−Cys基がソマトスタチン構
成アミノ酸の残りの代りをすることは当業者によ
り認められることだろう。すなわち、本発明化合
物はソマトスタチンの典型的な環状ヘキサペプチ
ド類縁体として次の構造式と表現できる。； 本発明において、いくつかの略号をアミノ酸成
分、ある種の好適な保護基、試薬、溶媒に対して
使用している。該略号の意味を表に示す。 表 略号 アミノ酸 Lys Ｌ−リジン Phe Ｌ−フエニルアラニン Trp Ｌ−トリプトフアン Ｄ−Trp Ｄ−トリプトフアン Thr Ｌ−トレオニン Aha ７−アミノヘプタン酸 Tyr Ｌ−チロシン Val Ｌ−バリン Abu Ｌ−α−アミノ酪酸 Ser Ｌ−セリン Asn Ｌ−アスパラギン Pro Ｌ−プロリン Asu Ｄ−またはＬ−アミノスベリン酸 Cys Ｌ−システイン 略号 保護基 INOC イソニコチニルオキシカルボニル BOC 第三ブチルオキシカルボニル OMe メチルエステル Bu 第三ブチル CBZ ベンジルオキシカルボニル Bzl ベンジル ２−Cl−CBZ
２−クロロベンジルオキシカルボニル Acm アセトアミドメチル Me メチル 略号 活性基 ONp ｐ−ニトロフエニルエステル HSE Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル HBT １−ヒドロキシベンゾトリアゾール 略号 縮合剤 DCCI ジシクロヘキシルカルボジイミド 略号 試 薬 TFA トリフルオロ酢酸 TEA トリエチルアミン DIPEA ジイソプロピルエチルアミン 略号 溶 媒 EPAW 酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 BAW ブタノール−酢酸−水 CMW クロロホルム−メタノール−水 DMF ジメチルホルムアミド THF テトラヒドロフラン 本発明に従つて、新規ジスルフイド架橋環状ヘ
キサペプチドソマトスタチン類縁体は対応する直
鎖ペプチドの環化により製造される。直鎖ペプチ
ドは固相逐次合成法を用いて製造される。従つ
て、本発明のジスルフイド架橋環状ヘキサペプチ
ドソマトスタチン類縁体の製造方法は(a)固相樹脂
に結合した対応するブロツク化（blocked）直鎖
ペプチドを製造し；(b)Ｎ−末端アミノ基を選択的
に脱保護（deblocking）し；(c)直鎖ペプチドを
樹脂から脱離し；(d)環化剤で直鎖ペプチドを処理
しアミド結合形成により環状ヘキサペプチドを
得；(e)あらゆる側鎖ブロツク基を除去し；そして
(f)システインの硫黄の保護を除去し環化を行わせ
しむる試薬で環状ペプチドとを処理し２環性最終
生成物を得る；ことを特徴とする。 直鎖ペプチドが樹脂上で製造される際、もし直
鎖ペプチドのアミノ酸配列が目的とするソマトス
タチン類縁体のアミノ酸配列と対応しているなら
ば一般にＣ末端に位置するアミノ酸の選択は重要
ではない。一旦直鎖ペプチドが環化されてしまう
ともはやどのアミノ酸が直鎖ペプチドのＣ−末端
であつたかを決定することはできない。 一方、直鎖ペプチドは環化するのでペプチド鎖
の合成を行なう最初のアミノ酸の選択は一般に重
要ではないが、ある出発アミノ酸が他のアミノ酸
よりも好適であるとする他の因子がある。例え
ば、Ｄ−TrpはBOC基を除去する場合生ずる第
三ブチルカルボニウムイオンと反応することがで
きる。従つて、Ｄ−Trpを直鎖ペプチドのＮ−末
端に持つてくる反応順序の選択はＤ−Trpを最後
に加えることになり、これにより第三ブチルカル
ボニウムイオンにさらされることが最小限にな
る。一般にペプチド中に２つのインドール含有部
分が存在するような場合、この型の選択は必ずし
も可能ではない。しかし、このような反応性はペ
プチドの反応順序を計画する際に考慮されるべき
である。 固相法による直鎖ペプチドの合成はクロロメチ
ル化された樹脂上で逐次的な方法により行われ
る。樹脂はスチレンと１〜２％のシビニルベンゼ
ンとの共重合により製造された合成樹脂の細かい
ビーズ（直径20〜70ミクロン）から成る。樹脂中
のベンゼン環はクロロメチルメチルエーテルと塩
化第２スズとのフリーデルクラフツ反応によりク
ロロメチル化されている。フリーデルクラフツ反
応は、樹脂１ｇあたり0.5乃至５ミリモルの塩素
を含むまで続ける。 直鎖ペプチドのＣ−末端アミノ酸に選択された
アミノ酸は、そのアミノ基を保護した誘導体に変
換する。選択したＣ−末端アミノ酸のカルボキシ
ル基は、例えばクロロメチル置換ポリスチレン−
ジビニルベンゼン樹脂中にある、樹脂に結合した
塩化ベンジルのカルボン酸エステルのように、不
溶性重合体樹脂担体に共有結合させる。アミノ保
護基を除去した後、配列の次のアミノ酸のアミノ
基保護誘導体をジシクロヘキシルカルボジイミド
のような結合剤と共に加える。反応成分であるア
ミノ酸はONp、エステル、アミノ酸アジドなど
のようなカルボキシル基活性化アミノ酸の形で用
いる。脱保護及び連続するアミノ酸の添加は目的
の直鎖ペプチドが形成されるまで行われる。 保護基の選択は一部分は特定の結合条件によ
り、一部分は反応に含まれるアミノ酸及びペプチ
ド成分により決定される。 通常使用されるアミノ保護基は当業界によく知
られているもの、例えば、ベンジルオキシカルボ
ニル（カルボベンゾキシ）、ｐ−メトキシカルボ
ベンゾキシ、ｐ−ニトロカルボベンゾキシ、第三
ブチルオキシカルボニルなどのようなウレタン保
護置換基が含まれる。アミノ酸がカルボキシル末
端で反応を行う場合の該アミノ酸のα−アミノ基
の保護に関しては第三ブチルオキシカルボニル
（BOC）を使用することが好適である。BOC保護
基は、その結合反応に続いて次工程の前に酸（例
えば、酢酸エチル中トリフルオロ酢酸または塩化
水素）による比較的穏和な反応で容易に除去され
る。 システインの硫黄はアセトアミドメチル
（Acm）で保護することができる。Acm基の特に
有利な点は最後から２番目の工程において硫黄を
保護した形態で環状ヘキサペプチドを単離するた
めにHFの処理で除去されず元のままに残つてい
ることである。Acm基はジスルフイド架橋２環
性最終生成物へ導く方法の一部とて除去される。
架橋構造を作る２番目の環化はＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド中ヨウ素、もしくは別法として水銀
イオンにより続いて空気酸化を行なうことにより
行われる。 ThrのOHの基はBzl基により、Lysのε−アミ
ノ基はINOC基またはα−クロロオキシカルボニ
ル（２−Cl−CBZ）基により保護することがで
きる。Lysの場合には、直鎖ペプチドを環化させ
た後α−Cl−CBZ基がHFと処理することにより
Bzl基と同時に除去されることからε−アミノ基
をこの残基で保護することが好適である。INOC
基はHFにより除けず、さらにZnで処理すること
が必要となる。いずれの保護基もBOC保護基を
除去するために用いるTFAによつて影響を受け
ない。直鎖ペプチドを環化させた後、２−Cl−
Bzl及びBzlのような保護基はHFによる処理で除
去される。 直鎖ペプチドが固相樹脂上で形成された後、当
業界でよく知られている種々の方法により樹脂か
ら除去される。例えば、ペプチドはヒドラジドに
より樹脂からきりはなし次にアジドを経由して目
的の環状ペプチドに環化することができる。ヒド
ラジドは反応系で亜硝酸を与えるような試薬と反
応させることにより対応するアジドに変換され
る。この目的に適した試薬類には塩酸、リン酸な
どのような強酸存在下亜硝酸低級アルキル（例え
ば硝酸第三ブチル、硝酸イソアシル）または亜硝
酸アルカリ金属（例えば、亜硝酸ナトリウム、亜
硝酸カリウム）が含まれる。この反応はおよそ−
40℃〜＋20℃の間の温度で水及び／またはジメチ
ルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサ
ン、クロロホルム、塩化メチレンなどのような非
水溶媒存在下に行う。別法として、ペプチドはト
リエチルアミンのような有機塩基存在下メタノー
ルのような低級アルコールと処理することにより
樹脂から脱離することができ、直鎖ペプチドの対
応する低級アルコールエステルの形成をもたら
す。得られたエステルはヒドラジドに変換し、ア
ジドを経由して環化させ目的の環状ペプチドとす
る。本発明におけるペプチドの樹脂から脱離に関
する好適な方法はヒドラジンを使用するものであ
る。 このようにして得られたアミノ酸は固相合成法
を用いて、−Cys（Acm）−Cys（Acm）−の代りに
直鎖ヘキサペプチド配列の中へ導入するためアミ
ノ基を、好適には第三BOCにより保護する。固
体担体からのヒドラジン分解による脱離、環化及
びブロツク基の除去により直接目的の２環性生成
物を与える。 参考の表で示すように、本発明の目的のジス
ルフイド架橋環状ヘキサペプチドの合成に関する
１つの好適な全反応は固相樹脂上で直鎖ペプチド
の逐次合成を含む。より具体的に、化合物： の合成法において、Ｎ−ブロツク化アミノ酸フエ
ニルアラニンのカルボキシル末端を不溶性重合樹
脂担体に、樹脂に結合した塩化ベンジルのカルボ
ン酸エステルとして共有結合させる。Pheのアミ
ノ基はBOC基により保護する。Pheの樹脂上への
結合が完了した後、保護基BOCはCH₂Cl₂中TFA
の処理により除去する。次のアミノ酸を、縮合剤
としてDCCIを使用するかまたはONpのような活
性エステルを使用してBOC−アミノ酸の形で結
合させる。目的の直鎖ペプチドを製造した後、Ｎ
−末端アミノ基を選択的に脱ブロツクし、ヒドラ
ジンで処理することによりペプチドを樹脂から脱
離される。 以下のアミノ酸配列を有しＮ−末端アミノ基が
脱ブロツクされた得られる直鎖ペプチドヒドラジ
ド： を酸性PHにして亜硝酸イソアミルで処理すること
により対応するアジドが生ずる。アジド溶液を溶
媒で希釈し有機塩基で中和する。直鎖ペプチドは
環化し： を生ずる。 環化反応中PHを検査し有機塩基の添加により中
性に維持する。有機溶媒中でのPHは溶液の一部
を、湿らせた狭い範囲を表示するPH試験紙に塗布
して決定する。 直鎖ペプチドを環化させた後、保護基、２−Cl
−CBZ及びOBzl、をアニソール存在下HFで処理
することにより除去し、Acm−保護環状ヘキサ
ペプチドをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中ヨウ
素と反応させることによりAcm基を除去し、同
時にジスルフイド架橋を形成させる。得られた未
精製のジスルフイド架橋環状ペプチドはクロマト
グラフ的に、好適にはゲル過により精製する。
該ゲル過の１例としては精製する溶液をセフア
デツクス（Sephadex）（架橋デキストランゲル）
のカラムに通し50％酢酸もしくは2N−酢酸によ
り溶出するものである。目的の生成物の溶出は薄
層クロマトグラフを使用して物質の一部を分析す
ることにより決定される。

【表】 ↓

【表】 以下の実施例は本発明を行なうために使用する
方法を例示するものである。これらの実施例は例
示をすることが目的で限定するものではないこと
が理解される。 実施例 １ Ｈ−Ｄ−Trp（ε−２−Cl−CBZ）Lys−
（OBzl）Thr−Cys（Acm）−Cys（Acm）−Phe−
OCH₂φ−樹脂の製造 塩素2.75ミリ当量／ｇを含むクロロメチル樹脂
（架橋度２％のメリフイールド（Merrifield）樹
脂）862.0ｇ（2.37モル）と当量のBOC−Phe−
OH607.0ｇ（2.37モル）を過酸化物を除いたテト
ラヒドロフラン4320mlに加えた。混合物は80℃の
油浴中で45分攪拌した。トリエチルアミン310.0
mlを加え、反応混合物は浴温80℃で70時間攪拌し
た後、25℃に冷却し攪拌している固相反応カラム
にテトラヒドロフラン2000mlを用いて移した。溶
媒を除去した後、樹脂を以下の溶媒を用いて攪拌
しているカラムにより洗浄した： テトラヒドロフラン 2000ml×３ エタノール 5170ml×４ 酢酸 5170ml×１ 水 5170ml×３ メタノール 5170ml×３ クロロホルム 5170ml×３ BOC−Phe−Ｏ−CH₂φ−樹脂は減圧下25℃で
16時間乾燥し、フエニルアラニン1.2ミリモル／
樹脂１ｇを含むBOC−Phe−Ｏ−CH₂φ−樹脂
1203ｇを得た。 BOC−Phe−Ｏ−CH₂φ−樹脂（1.65ｇ、2.0ミ
リモル）は、目的とするBOC−ヘキサペプチド
−Ｏ−CH₂φ−樹脂が得られるまで、25％の
TFAを含む塩化メチレンで２回の脱ブロツク
（２分及び25分）と必要とする配列のBOC−アミ
ノ酸2.5当量を用いた表及びの方法に従つて
操作を行つた。 DCCをいずれの結合工程においても唯一の
結合剤として使用した。各アミノ酸の結合は円滑
に進行した。結合は各工程を繰り返した場合に最
高の収率が得られた。結合を繰り返す場合、最初
の２回のクロロホルム洗浄はすべて省略し、１回
のクロロホルム洗浄に置き換えた。 結合反応は塩化メチレン、新たに脱気した
DMFもしくはこれら両者混合溶媒で行つた。Ｎ
−末端アミノ基は毎回BOC基で保護し：Thrの
水素基はBzlで、そしてLysのε−アミノ基は２
−Cl−CBZでブロツクした。 目的とするBOC−ヘキサペプチド−Ｏ−CH₂
φ−樹脂が得られたら、Ｎ−末端BOC基は表
に示した最終脱ブロツク操作により除去した。

【表】

【表】

【表】

【表】 表，及びの操作を終了後、ブロツク化ヘ
キサペプチド−OCH₂φ−樹脂は一晩乾燥すると
4.00ｇの重量であつた。 実施例 ２ Ｄ−Trp−（ε−２−Cl−CBZ）Lys−（OBzl）
Thr−Cys（Acm）−Cys（Acm）−Phe−NHNH₂
の製造 実施例１で得た樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルム
アミドとヒドラジンの９：１の混合物36mlと混合
し、室温で１時間攪拌した。不溶性樹脂は過に
よつて除去し、液は減圧濃縮しＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドを除いた。50mlの水を加えること
により固形物を得る。固形物は過により単離
し、水で完全に洗浄した。固形物は減圧下で乾燥
し、重量は2.46ｇであつた。 実施例 ３ Ｈ−Ｄ−Trp−（ε−２−Cl−CBZ）Lys−
（OBzl）Thr−Cys（Acm）−Cys（Acm）−Phe−
N₃の製造 実施例２で得た生成物2.41ｇを窒素雰囲気下脱
気したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド40mlと混合
し、−10℃に冷却した後、5.9M塩化水素の５当量
を含むテトラヒドロフラン2.0mlを加えた。溶液
は−025℃に冷却し、亜硝酸イソアミル0.31mlを
澱粉−ヨウ化カリウム反応が陽性になるまで少し
ずつ加えた。反応の終了は薄層クロマトグラフを
用いヒドラジド出発物質の消失によつて決定し
た。 実施例 ４ シクロ（Ｄ−Trp−（ε−２−Cl−CBZ）Lys
−（OBzl）Thr−Cys（Acm）−Cys（Acm）−Phe）
の製造 実施例３のアジド化合物の溶媒に脱気したＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド1.2を加え、−25℃ま
で予備冷却し、ジイソプロピルエチルアミンでPH
を８とした後、反応混合物を冷凍庫（−25℃）に
一晩放置した。約14時間後必要ならばPHを８に再
調整し、混合物は−20℃で16時間、さらに５℃で
16時間貯蔵した。反応の終了を薄層クロマトグラ
フにより確認した。混合物は濃縮乾固し残渣を水
50mlを加えこねることにより白色の固体を得た。
固体は過によつて単離し、水で洗浄した後、減
圧下で乾燥した。生成物は2.30ｇであつた。 実施例 ５ シクロ（Ｄ−Trp−Lys−Thr−Cys（Acm）−
Cys（Acm）−Phe）の製造 実施例４の保護環状ヘキサペプチド2.03ｇ
（1.7ミルモル）をテフロンチユーブを備えた反応
容器中でアニソール２mlと混合した。次に反応器
を真空にし、ドライアイス／アセトン浴の温度で
液体フツ化水素20mlを満たした。温度を０℃まで
上げ１時間攪拌を行つた。フツ化水素は減圧濃縮
し、残渣をスラリーが形成されるまで減圧下にお
いた。スラリーを酢酸エチル50mlと処理し過す
ることにより細粉末1.87ｇを得た。粗生成物を50
％酢酸に溶解しセフアデツクス（Sephadex）Ｇ
−25ゲル（極細粉supertine）のカラムにかけ同
一溶媒で溶出した。溶出液中の生成物の存在は薄
層クロマトグラフイーによる分析で決定した。集
めた分画を減圧濃縮、凍結乾燥した残渣は、1.17
ｇの生成物であつた。 実施例 ６ シクロ の製造 ヨウ素254ml（1.0ミルモル）を新たに脱気した
DMF90mlに溶解し、この溶液を新たに脱気した
DMF90mlに溶解した実施例５の生成物182mg
（0.2ミリモル）の溶液に加えた。反応混合液は３
−１／２分間攪拌後亜鉛末600mlと50％酢酸水溶
液40mlを０℃で攪拌しながら加えた。温度は自然
に30℃まで上昇した。反応液は炭末で脱色し、
過を行い、過残渣は２回DMFで洗浄した。
液は減圧濃縮乾固し、50％酢酸水溶液に溶解し、
セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−25ゲル（極細
粉、Superfine）のカラムにかけ同一溶媒で溶出
すると生成物66.9mgを得た。 このようにして得た生成物はある種の溶媒また
は長期間の貯蔵において重合に関し不安定である
ことがわかつた。このような分解に対して化合物
を安定化するために、ジスルフイド変換を触媒で
き、遊離スルフヒドリル基と反応する試薬である
10−40モル％のＮ−エチルマレイミド水溶液と処
理した。過剰のＮ−エチルマレイミドはセフアデ
ツクス（Sephadex）Ｇ−25ゲル（極細粉、
superfine）のカラムに通し50％酢酸で溶出する
ことにより分離した。ペプチドは減圧濃縮した後
集めたカラム溶出分画部分の凍結乾燥によつて再
単離し完全に安定であることを示した。 標題化合物シクロ のアミノ酸分析結果、質量スペクトル測定結果、
及びNMR結果を以下に示す。 アミノ酸分析（bN HCl、標準化された値） Lys 0.90 Thr 1.00 Phe 1.00 Cys（SO₃Ｈ） 1.97（過蟻酸） Trp 0.99 質量スペクトル：
FAB−MSm／e767（Ｍ＋Ｈ） 核磁気共鳴（300MHz，D₂）：
与えられた構造と矛盾しない。 実施例 ７ 本発明のソマトスタチン環状ヘキサペプチド類
縁体につき成長ホルモンの阻害に関する生体外で
の試験で検査を行いソマトスタチンの効果と比較
した。試験は以下に示す： ラツトの下垂体はベイル（Vale）とグラント
（Grant）の「下垂体分泌性物質の生体外での下
垂体ホルモンの分泌試験」、「酵素学における方
法」（Methods in Enzymology）、第37巻、ビ
ー・ダブリユ・オマリー（B.W.O′Malley）及び
ジエー・ジー・ハードマン（J.G.Hardman）編、
（アカデミツクプレス、Academic Press，Inc.，
ニユーヨーク）、５−93頁（1975年）の方法に従
つて単離した。 培養４日後、細胞を洗浄、分量を変化させた薬
量のソマトスタチンまたはその類縁体の存在下ま
たは無添加の条件でダルベツコ（Dulbecco）の
改良イーグル（Eagle）培地で４時間培養した。
培地をあつめラツト成長ホルモンのための二重抗
原ラジオソムノアツセイにより成長ホルモン量を
決定した。 またソマトスタチン類縁体につき麻酔したラツ
トの門脈中のグルカゴン及びインシユリンの濃度
を減少させる能力に関してソマトスタチンと比較
した。体重160−200ｇの雄スプラーグ−ドーレイ
（Sprague−Dawley）ラツト（チヤールズリバー
Charles River CD）をウレタン（体重100ｇ
当たり150mg；アルドリツチAldrich製）で麻酔
した。食塩水またはペプチドを外部頸動脈を経由
して投与した。５分後、門脈を露出させ、血液を
EDTA3mgを含む注射器により採取し、次のホル
モン分析のためトラシルロール（Trasylol）
（FBA Pharnaceuticals）100μを含む冷却した
試験管に入れた。グルカゴンの血漿中の濃度はア
ール・ウンガー（R.Unger）（ダラス，テキサス
州）（Dallas，TX）より入手したグルカゴン抗
血清30Kを用い、フアルーナ及びウンガー
（Foloona and Unger）の方法、「ホルモンラジ
オイムノアツセイの方法」（Methods of
Hormore Radioimmunossay）、ジヤフエ及びベ
ールマン（Jaffe and Behrman）編、アカデミ
ツクプレス、ニユーヨーク、第２巻257−527頁
（1976年）により決定した。インシユリンの血漿
中の濃度はハーバート（Herbert）、J.Clin.
Endocrinol.Metab.，25巻、1375−1384頁（1965
年）の方法の改良法により決定した。 本発明の化合物の試験結果を以下に記す。最初
にソマトスタチンについての結果を示し、これに
任意の数１を与えてある 本発明の化合物の結果はソマトスタチンの効果
の倍数または分数として示す。括弧内の数字は直
前の数の信頼限界である。示した本発明の化合物
は実施例１〜５により製造された化合物である。
しかし、化合物欄における本発明化合物の表記
は、ソマトスタチンに見られるアミノ酸の順序に
合わせるためわずかに異なつた表記となつてい
る。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シクロ である化合物。 ２ａ 固相樹脂に結合した対応するブロツク化直
   鎖状ペプチドを製造し； ｂ Ｎ−末端アミノ酸を選択的に脱ブロツクし； ｃ 樹脂から直鎖状ペプチドを脱離し； ｄ 直鎖状ペプチドを環化剤で処理して目的の環
   状ヘキサペプチドのアミド結合を形成させ； ｅ 側鎖の保護基を除去し； ｆ システインの保護基を除去し、ジスルフイド
   結合を形成することを特徴とするジスルフイド架
   橋環状ヘキサペプチド化合物 cyclo の製造方法。 ３ 工程ｃにおいて直鎖状ペプチド樹脂をヒドラ
   ジンと処理しヒドラジドを形成させることを特徴
   とする特許請求の範囲第２項記載の方法。