JPH0443639B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、活性酵素変性剤の測定方法及びそ
のための組成物に関する。 （発明の背景） 酵素として知られる種類の蛋白質の最も有用な
性質はそれが特定の化学反応を触媒する能力を有
することである。きわめて少ない例外を除き、酵
素の存在及び比活性は、基質を反応生成物に転換
する特定の反応の存在により測定される。典型的
には、反応系に存在する活性酵素の量は、反応速
度が酵素の濃度により限定される条件下での反応
速度により測定される。反応速度の測定は、酵素
の種類及びその酵素を使用する特定の反応系のい
かんにかかわらず、分析的測定の最も重要な部分
をしめる。酵素反応速度の不正確な測定は常に測
定の正確さと精度の低下をもたらす。 分析的酵素測定においては、酵素の特定の活性
を変化せしめる活性変性剤を使用すること、最も
明確に言えば、基質の生成物への変化の速度すな
わち反応速度を変化せしめることが有用である。
このような活性酵素変性剤には、加速剤、すなわ
ち酵素反応の速度を上昇せしめることができる物
質、及び減速剤、すなわち反応速度を低下せしめ
る物質が含まれる。減速剤の範疇は非常に大き
く、これには酵素阻害剤が含まれ、これは可逆的
阻害剤、不可逆的阻害剤及びアロステリツク効果
剤に分けられる。特定の酵素阻害剤の量の測定は
当業界においてよく知られており、例えばブラウ
ン（Broun）、ジヨンソン（Johnson）、ウイツト
（Witte）及びフエルド（Feld）の「Enzymatie
Inhibition Assay For Methorexate With Ａ
Discrete Analyzer，the ABA−100」Clinical
Chemistry，26：355〜338（1980年）の発表があ
る。上記の種類のそれぞれの特異的酵素阻害剤
は、米国特許第4134792号、英国特許第1595101
号、並びに米国特許第4273866号及び第3935074号
に記載されている免疫測定法により例示されるご
とく、リガンド接合阻害剤の形で非常に複雑な分
析系にも使用されている。酵素反応速度の変化の
正確な測定に依存する他の商業的に使用し得る系
が、ローゼンタール（Rosenthal）等、Clinical
Chemistry，22：1899（1976年）に記載されてい
るように、EMIT方式により例示される。 酵素反応の動力学、等に反応速度の測定及び反
応速度に及ぼす種々の酵素活性変性剤の影響につ
いての理論と実際が、レーニンガー
（Lehninger），Biochemistry（第２版）Worth
Publishers社、1975年、並びにデイクソン
（Dixon）及びウエブ（Webb），Enzymes，
Academic Press，1979年に十分に記載されてい
る。この発明を十分且つ完全に理解するためには
酵素動力学の十分な理解が必要であるが従来技術
の状態を重複して記載することを避けるため、上
記の引用文献を引用によりこの明細書に組み入れ
る。上記の文献は、後述するこの発明の価値あ
る、そして重要な進歩を認識し、そして眺望する
ための基礎及び背景として役立つであろう。 すべての酵素反応の一般的な特徴は、基質が生
成物に転換される酵素反応速度が時間と共に低下
することである。この速度の低下は種々の理由に
よる。これらの理由には、反応生成物の蓄積によ
り触媒速度が低下すること、反応生成物濃度の上
昇に従つて逆反応がさらに重要になること、温度
又はPHの変化により酵素自体がなんらかの不活性
化を受けることが含まれる。しかしながら、酵素
反応速度の低下の最も可能性のある原因は、反応
が完結に近ずくに従つて基質濃度が低下するため
に基質による酵素の飽和の程度が低下することで
ある。これらの理由のため、通常の酵素濃度測定
法においては、酵素反応の出発速度のみを測定す
る。反応速度を変化せしめる上記の種々の原因が
反応速度に影響を及ぼさず、従つて反応速度が酵
素濃度のみによつて規定されるのは酵素反応中の
最初の期間のみである。さらに、酵素反応の初期
速度を測定するためには、反応の最初の段階にお
ける反応体又は生成物のいずれかの濃度変化を示
す実験データのみを得る必要がある。ある測定系
において種々の酵素濃度についての初期反応速度
を集め、そしてこれをグラフにプロツトして、測
定された速度と酵素濃度との関係を示す標準曲線
を求めれば、もし真に反応速度が酵素濃度に比例
するのであれば、直線が得られるであろう。しか
しながら、実際に、酵素反応自体により生ずる測
定媒体の組成の変化のため、すなわち酵素反応の
動力学のために、前記の直線性は、酵素濃度が低
い場合のみ、そして短時間においてのみ存在す
る。 従つて、一般に、厳格な時間が用いられ、そし
て基質限定がそれに伴う場合にのみ初速度に基く
標準曲線により酵素濃度の真の測定値を得ること
ができる。しかしながら、しばしば、阻害剤又は
阻害剤を接合したリガンドを用いる分析的酵素測
定及び免疫測定においては、これらの時間及び基
質限定のいずれもが無視され、そして超過してい
る。この結果、これらの多くの酵素測定は正確で
もなく精密でもない。しかしながら、時間をかけ
た酵素反応速度の測定における上記のような誤差
は、この発明により除去され、又は実質的に減少
する。 この発明により、活性酵素変性剤の存在により
活性が変化する酵素；該酵素により反応生成物に
転化されるのに適する基質；該酵素による該基質
の反応生成物への転換に必要なコ・フアクター；
及び酵素反応生成物から少なくとも１つの反応体
を再生するための手段を含んで成る未知試験試料
中の活性酵素変性剤の量を測定するための分析的
測定方式が提供される。再生される反応体は基質
であつてもよく、コ・フアクターであつてもよ
く、又その両者であつてもよい。さらに、この再
生手段により、再生の結果として反応体のほかに
少なくとも１種の他の生成物を生成せしめ、該他
の生成物を、試験試料中に存在する活性酵素変性
剤の定量的又は定性的測定に用いることができ
る。反応体を再生する手段により酵素反応速度が
安定化し、実質的な時間にわたつて反応速度が本
質上一定となる。 （構成の具体的な説明） この明細書においては下記の定義を用いる。 「酵素」は、反応体を生成物に転換するために
機能する触媒部位を少なくとも１つ有する任意の
蛋白質である。 「反応体」は、化学反応を受ける任意の化学種
である。 「生成物」は、酵素反応を介して生成する任意
の化学的存在である。 「基質」は、これに対して酵素が触媒作用を及
ぼす化学的存在である。 「コ・フアクター」は、触媒活性のために酵素
に必要な金属イオン又は有機分子から成る化学的
存在である。必要なコ・フアクターが酵素から除
去された場合、酵素は触媒的に不活性となる。 「補酵素」は、酵素の構造の特定の部位に結合す
る有機分子コ・フアクターである。補酵素は、全
酵素反応の過程で移動する官能基、特定の原子又
は電子の中間担体として機能する。 「リガンド」は、他の分子と反応して複合体を
形成する任意のイオン又は分子である。 「一次反応」は、１つの反応体の濃度に直接的
に比例する速度で進行する酵素反応である。 「二次反応」は、２つの反応体の濃度の積（又
は１つの反応体の濃度の２乗）に比例する速度で
進行する酵素反応である。 「零次反応」は、反応体の濃度以外の要因によ
り変化する速度で進行する酵素反応であり、この
反応は通常、酵素濃度に比例する。 「活性酵素」は、存在する酵素の全量の内、触
媒的に機能的であり、そして基質を生成物に転換
することができる部分である。 「活性酵素変性剤」は、酵素と結合して酵素活
性の強さと様式を変化せしめる任意の化学的存在
である。変性により、酵素反応速度の上昇もしく
は低下、基質特異性の変化、又は酵素活性の変化
もしくは酵素活性の様式の変化により検出し得る
特性の他の任意の変化が生ずる。活性酵素変性剤
の大きさは、小分子から巨大分子まで変化し得
る。活性酵素変性剤と酵素との相互作用は、中間
分子会合の強さに依存して可逆的である場合もあ
り不可逆的である場合もある。すなわち、中間分
子会合が弱い場合には急速に平衡に達するが、中
間分子会合が強い場合には平衡に達せず又は遅く
平衡に達する。 「酵素阻害剤」は、酵素との相互作用により酵
素の触媒活性を低下せしめる活性酵素変性剤であ
る。阻害剤の作用の様式は拮抗的、非拮抗的、不
拮抗的、アロステリツク、又はこれらの様式の種
種の組合わせである。 「再循環系」は、反応生成物に転換される基質
の量を最大にするために特異的酵素反応の完結を
駆動するためにのみ酵素反応にコ・フアクターを
供給する任意の化学反応又は化学反応系列であ
る。 「再生手段」は、酵素反応により生成された生
成物の少なくとも１種を、酵素により再び生成物
に転換されるのに適する反応体として再生するた
めに必要な反応体、酵素、触媒、及び化学反応又
は化学反応系列である。 この発明は、未知の組成を有する試験試料中の
酵素の存在及び濃度を測定するために酵素反応の
速度を測定する分析的測定方式の改良に関する。
典形的には、この分析的測定系は、基質、コ・フ
アクター及び活性酵素を含んで成り、この酵素に
よる基質の生成物への触媒的転換により、存在す
る活性酵素の量が測定される。酵素反応速度を正
確に測定した後、この速度を、酵素濃度に対して
速度をプロツトした標準曲線と組み合わせるこに
より、試験試料中に存在する活性酵素の量の正確
且つ高精度の測定値が得られる。ある場合には、
活性酵素の量は、活性酵素変性剤の存在及び影響
により変化せず、求められる唯一の情報である。
しかしながら、診断又は臨床のための分析的測定
系においては、未知量の活性酵素変性剤の存在下
で触媒的機能を維持する活性酵素の量の変化が、
変性剤の濃度の測定のために求められ、この変性
剤はしばしば酵素阻害剤である。 よく知られている活性酵素変性剤は、可逆的酵
素阻害剤、メソトレキセート（methotrexate）
である。このものは癌の治療に広く使用されるた
め、このものの存在の正確且つ定量的な監視が特
に必要になつた。メソトレキセート（又はその類
体であるアミノプチリン）は又、これがリガンド
（典型的には抗原、抗体又は療法剤）と接合する
場合、試験試料中の他の対応するリガンドの総濃
度を測定するのに有用である。これらの測定法は
すでに記載されており再度詳細に引用する必要は
ない。このため、この発明の好ましい具体的態様
においては、酵素ジヒドロフオレートレダクター
ゼ（dihydrofolate reductase）（DHFRと略す）
及び可逆的酵素阻害剤メソトレキセートを用いる
１つのモデルとしての分析的測定系を使用する。
この具体的態様においては、従来より長時間にわ
たるDHFRの反応速度が正確に測定でき、そし
て得られた実験データにより、特異的なリガンド
に結合し得る多くの異る種類の物質の存在及び量
が正確に測定される。 ジヒドロフオレートレダクターゼ（DHFR）
の分析的測定系は、DHFRを含有する水溶液、
ジヒドロフオレート（dihydrofolate）（FA₂と略
す）、還元型コ・フアクターであるニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフエート
（nicotinamide adenine dinuclectid phosphate
（NADPHと略す）並びにこの明細書に記載する
種々の塩及び緩衝剤を含んで成る。DHFRは
NADPHのニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフエート（NADPと略す）への酸化と
同時にFH₂のテトラヒドロフオレート
（tetrahydrofolate）（TH₄と略す）への還元を触
媒する。この反応を反応形式（）に示す。 FH₂及びNADPHのそれぞれはいずれも、他の
酵素的分析的測定法において一般に使用される
コ・フアクターとして当業者によく知られてい
る。しかしながら、この発明のDHFR測定モデ
ル系においては、これらの反応体のいずれか一方
を基質と称し、他方をコ・フアクターと称する。
DHFR分析モデル系において、各反応体は、他
方の反応体とは独立して再生することができる。
しかしながら、他の酵素的分析的測定において
は、これらの物質はその酸化型又は還元型におい
て、第一に、コ・フアクターとして機能するもの
と予想される。 反応形式（）に示されるDHFR反応が進行
する速度は、340ナノメートル（nmと略す）にお
ける反応溶液の光吸収の減少を観察し（そして記
録する）ことにより測定される。FH₂及び
NADPHの両者は、試験濃度において、340nmに
おいてほとんど同様に光を吸収する。反応生成物
であるFH₄及びNADPは、この波長において光
を吸収しない。 DHFR測定における反応速度は、測定系に存
在する触媒的に活性なDHFRの量により限定さ
れる。反応速度は、340nmにおける光吸収の経時
的減少により示される基質の転換の初速度を測定
することにより決定される。吸収の減少速度が、
測定における活性DHFR濃度に比例する。この
方法を用いて反応速度を正確に測定するために
は、FH₂及びNADPHの両者が最初から存在し、
そしてDHFRを飽和するのに十分高い濃度、す
なわち酵素に存在する触媒部位が反応のすべての
時点において基質により十分に支配されているの
に十分な濃度に連続的に維持されることが必要で
ある。しかしながら、基質及びコ・フアクターの
両者とも340nmにおいて光を吸収するので、測定
においてこれらの反応体をいかに多く使用するか
については実際上の限界がある。具体的には、反
応体が340nmにおいて高い吸収を示し、しかしな
がら測定中DHFRの量との関連において飽和濃
度を維持しなければならないという２つの要請の
ために、DHFRを狭い濃度範囲でのみ使用する
ことができそしてこの場合にのみ正確な測定がで
きる。 上記の要請が満されない場合の効果を示すた
め、測定にブラウン（Brown）等（Clin.Chem.
26：355，1980年）の試薬配合を用いた。試薬成
分の配合濃度を第１表に示す。 第１表 試薬成分 濃 度 FH₂ 0.085mM NHDPH 0.104mM Ｂ−メルカプトエタノール 14.3μM 燐酸ナトリウム 192mM トリス緩衝液 1.6mM 牛血清アルブミン 0.2％ PH 6.5 DHFRの濃度を変え、すべての試薬は一定に
し、酵素反応速度を種々の時点で測定した。具体
的には、１mlのブラウンの試薬を30℃にてインキ
ユベートし、そして種々の濃度のDHFR溶液20μ
を加えることにより酵素反応を開始した。
DHFRの活性単位を１分間に１マイクロモルの
FH₂の還元を触媒する酵素の量として定義する。
340nmにおける１分間当りの光吸収の変化を、１
分間間隔で10分間にわたり測定することにより反
応速度を監視した。この結果を第１図のグラフに
示す。 第１図の分析によれば、ブラウンの試薬配合に
おいては、DHFRの濃度が非常に低い場合にの
み時間に関して一定の酵素反応速度が得られる。
第１図はさらに、反応形式（）が、両反応体、
すなわち基質（FH₂）及びコ・フアクター
（NADPH）が制御因子となる二次反応であるこ
とを示している。従つて、名目上一定の反応速度
を得るためにさえ、基質及びコ・フアクターの濃
度を実質上高くしなければならず、又はPHFRの
量を低い濃度に稀釈しなければならない。 第１図に示したデータをさらにわかりやすく一
群の曲線として第２図にプロツトした。各曲線
は、異る時点、異る酵素濃度における反応速度を
ミリユニツト／ミリリツトル（mU／ml）として
示したものである。１本の実線は、10mU／ml未
満の酵素濃度において最初の１分間に得られた速
度データを外挿したものである。DHFRの観察
された反応速度は、酵素濃度の上昇に従つて実線
から劇的にかけはなれることが明らかである。さ
らに、反応速度を最初の１分間に測定した場合で
さえ、DHFR濃度が高くなるに従つて若干非直
線的になり、そしていずれのDHFR濃度におい
ても、直線性からの偏差は、反応時間が長くなる
に従つてだんだん大きくなることが明らかであ
る。 限界的なデータをグラフにプロツトし、これに
直線を適用することによつて見かけ上合理的な直
線が得られるため、ブラウンの試薬配合を用いる
DHFR測定における反応速度の非直線性は、不
注意な観察者にとつては明らかではない。反応の
初期速度を測定する条件下での直線性からの大き
な偏差は、通常、手法の差、基質の消費及び生成
物によるフイードバツク阻害のためであるとさ
れ、従つて無視されてしまう。しかしながら、第
１図及び第２図に示されたデータを注意深く観察
すれば、ブラウンの試薬による測定は、低い基質
濃度において実施した場合にのみ名目上直線的で
あることが明らかとなる。最も大きな誤差及び偏
差は、活性酵素変性剤、又は活性酵素変性剤のリ
ガンド接合物と結合し得る物質の存在を測定する
ための酵素測定において高濃度のDHFRが使用
されることに伴つて生ずる。 ブラウンの試薬を用いる測定系における欠点を
認識した上で、酵素測定において、観察される反
応速度の実質上改良された直線性を供するこの発
明の１つの態様を反応形式（）に示す。 この反応においては、DHFR測定系に酵素グ
ルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ
（G6PDH）を含む。成分の使用濃度を第２表に
示す。 第２表 試薬成分 濃 度 FH₂ 0.12mM NADPH 0.065mM Ｇ−６−Ｐ 3.3mM G6PDH 1U／ml トリス緩衝液 114mM MOPSO緩衝液 80mM ジチオエリスリトール 6mM PH 7.0 この追加の酵素のための基質はグルコース−６
−ホスフエート（G6P）であり、この基質はデル
タ−６−ホスホグルコノラクトン（δ−6PG）に
転換される。G6PDH及びＧ−６−Ｐは一緒にな
つて、DHFR酵素反応により先立つて生成した
NADPからのNADPHの再生手段を構造する。
このNADPH再生手段をさらに一般的にコ・フ
アクター再生手段と称する。 DHFR測定系に対するコ・フアクター再生手
段の効果をグラフにプロツトして第３図及び第４
図に示す。このデータは次のようにして得られ
た。１mlの試薬を37℃にてインキユベートし、そ
して0.0〜40mU／mlの種々の濃度に稀釈した
DHFR溶液20μを加えることにより酵素反応を
開始する。340nmにおける光吸収の１分間当たり
の変化を１分間間隔で10分間にわたり測定するこ
とにより反応速度を監視する。 第３図のデータから、NADPH再生手段は、
高いDHFR濃度においても10分間の試験時間に
わたつて実質上一定の酵素反応速度を供すること
が明らかである。第３図のデータが第４図に再プ
ロツトされており、この第４図により、40mU／
mlのDHFR濃度においてさえ、コ・フアクター
再生手段が直線性を顕著に改良することが示され
る。実線で示される直線は、反応の第２の１分間
の間に測定された速度データを外挿して得たもの
である。反応時間中の最初の４分間の後において
のみDHFR反応速度が最初の反応速度からずれ
始める。観察されるこれらの偏差の深刻さが、第
２図に示されるブラウンの試薬の場合のそれに比
べて相対的に小さいことは確実である。DHFR
測定系にコ・フアクター再生手段を含めることに
よる全体的効果は、DHFR二次反応が、
NADPHがもはや酸素反応速度を制御し又はそ
れに影響を与える要素ではない一次反応に変わる
点にある。 DHFR反応系にメソトレキセートのごとき活
性酵素変性剤を含める場合には追加の複雑さが生
ずる。第１に、メソトレキセートによるDHFR
の阻害は即時に生ずるのでなく、DHFR反応速
度の記録し得る阻害が生ずるのに先立つて観察し
得るラグ期間が生ずる。第２に、阻害剤によりラ
グ期間が誘導されるため、DHFR反応速度を延
長された期間にわたつて、しかも動力学的条件下
で測定する必要があり、これらの測定手段は、前
記のDHFR反応の初期段階におけるそれと非常
に異なる。このような変化した情況における全体
的な効果は、DHFR濃度を一定にし、阻害剤の
濃度をだんだん高くした場合のDHFR反応速度
の直線性を比較することにより示される。この比
較を、第３表に示す試薬成分を用い、反応形式
（）に示したコ・フアクター再生手段を使用し
て、又は使用しないで行つた。すべての場合にお
いてDHFRの量を固定し、そしてG6PDHは記載
した量だけ使用し又は全く使用しなかつた。比較
の結果を第５，６及び７図に示す。 第３表 試薬成分 濃 度 FH₂ 0.12mM NADPH 0.065mM Ｇ−６−Ｐ 3.3mM G6PDH 1U／ml又は無し トリス緩衝液 114mM MOPSO緩衝液 80mM ジチオエリスリトール 6mM PH 7.0 MTX−DPH ０〜10^-6Ｍ 第５図は、DHFR反応の観察された反応速度
を、種々の濃度の活性酵素阻害剤の存在下で、
コ・フアクター再生手段を伴つて又は伴わない
で、長時間にわたつて比較したものである。第３
表に示す試薬成分１mlを37℃にてインキユベート
し、そして1U／mlのDHFR溶液20μを加えるこ
とにより反応を開始した。340nmにおける光吸収
の１分間当りの変化を１分間間隔で10分間にわた
り測定することにより反応速度を監視した。デー
タを同一条件下で得た。但し、一組の測定におい
てはNADPH再生手段を用い（実線の曲線で示
す）、他の一組の測定においてはＧ−６−PDH成
分を用いなかつた（破線の曲線で示す）。すべて
の測定混合物には一定量のDHFRと種々異なる
濃度のDHFR阻害剤を含有せしめた。この研究
においては、阻害剤としてメソトレキセートのリ
ガンド接合体、すなわち抗痙攣剤であるジフエニ
ルヒダントインの免疫測定に使用されるγ−（５，
５−ジフエニルヒダントイン−３−アセトヒドラ
ジド）−メソトレキセート（MTX−DPH）を使
用した。MTX−DPHは、(a)０、(b)１×10^-8Ｍ、
(c)５×10^-8Ｍ、(d)１×10^-7Ｍ、(e)５×10^-7Ｍ及び
(f)１×10^-6Ｍの試験濃度で添加した。 一般に、第５図〜第７図から、阻害剤の濃度が
増加するに従つて測定し得るDHFR活性が低下
することがわかる。しかしながら、第５図のデー
タは、コ・フアクター再生手段を用いない
DHFR測定法においては、阻害剤であるMTX−
DPHの各試験濃度について反応速度が異なるが、
しかしその反応速度は連続的に低下することを示
している。 従つて、この阻害剤をある未知の濃度で含有す
る１つの試験試料から、広範囲に異なるDHFR
反応速度が実験的に求められ、このそれぞれの反
応速度により１つの試験試料について異なる
MTX−DPH濃度が示されることが明らかであ
る。これに対して、DHFR測定にコ・フアクタ
ー再生手段を組合わせた場合にのみ観察される反
応速度が一定となり、そして５分間にわたり勾配
が零になる。 DHFR活性は阻害剤の濃度に反比例すると予
想されるから、阻害剤の濃度の逆数に対して
DHFR反応速度をプロツトしたグラフは実質上
直線になることが予想される。第６図及び第７図
に、リガンドに接合した阻害剤の存在下で、
NADPHのためのコ・フアクター再生手段を用
い又は用いない場合におけるDHFR測定の直線
性に対する反応時間の影響を示す。第６図に示す
データは第５図の破線と同じであるが、速度が
MTX−DPH濃度の逆数の関数としてプロツトし
てある。各曲線は、図に示された時点で速度を測
定した場合の直線性に対応し、明瞭にするため２
分間間隔で示してある。用いたMTX−DPHの濃
度はそれぞれ５×10^-8Ｍ、１×10^-7Ｍ、５×10^-7
Ｍ、１×10^-6Ｍ、及び５×10^-6Ｍである。 第６図から、コ・フアクター再生手段を用いな
いDHFR測定においては、時間に従つて大きく
変化する一群の速度応答曲線が得られることが明
らかである。これに対して、DHFR測定にコ・
フアクター再生手段を用いる場合、第７図に示す
ように、DHFR阻害の程度は合理的に一定に維
持され、そして阻害剤の用いやすい濃度範囲にお
いて再現性がある。第７図のデータは第５図の実
線の曲線から取つたものであり、但し、速度を
MTX−DPH濃度の逆数の関数としてプロツトし
たものである。 DHFR測定系においてコ・フアクター再生手
段によつて供される最も劇的な改良は２つの領
域、すなわち阻害剤の濃度が比較的高く反応速度
が低い場合、及び長時間にわたつて阻害剤の濃度
が非常に低い場合である。活性酵素変性剤の存在
下での速度応答曲線の直線性がコ・フアクター再
生系により劇的に改良される理由は、コ・フアク
ター再生系により、二分子的な二次反応が一分子
的な一次反応に効果的に変化することである。こ
のことはNADPHの濃度が、NADPHについて
のDHFRのKm値より高い一定の値に維持される
ことにより達成される。 この発明の好ましい態様においては、テトラゾ
リウム色素３−（４，５−ジメチルチアゾール−
２−イル）−２，５−ジフエニル−2H−テトラゾ
リウムブロミド（MTT）がDHFRにより生成し
たFH₂のFH₂への再生と非酵素的に共役する
DHFR測定系のための基質再生手段を用いる。
この基質再生手段を反応形式（）に記載する。 基質再生手段はテトラゾリウム色素MTTから
成り、このものはFH₄をFH₂に転換するために
コ・フアクター再生手段及び前記のDHFR測定
に加えられる。動力学的には、DHFRにより
FH₄が生成するに従いMTTがFH₄と結合し、
FH₂が再生すると同時に副生物としてレツドホル
マザン色素が生成する。レツドホルマザン色素は
340nmではなく568nmにおいてのみ光を吸収す
る。従つて、FH₂の再生に伴つて、FH₄のFH₂へ
のモル−モル転換を示す568nmにおける光吸収の
増加が観察される。DHFR測定系においてこの
基質再生手段をコ・フアクター再生手段と組合わ
せて使用する場合、再生反応のこの組合わせによ
り、最初二次反応であつた反応が零次反応に変わ
る。これに伴つて、DHFR測定における酵素反
応速度の直線性がさらに実質的に増加する。 速度の直線性の追加の増加を第８図のグラフに
示す。このグラフにおいては、酵素阻害剤MTX
−DPHの存在下における基質再生手段のみを使
用するDHFR測定と基質再生手段とコ・フアク
ター再生手段を組合わせて使用するDHFR測定
とが比較されている。 反応成分を第４表に示す。 第４表 反応成分 濃 度 FH₂ 0.4mM NADPH 0.065mM MTT 0.12mM Ｇ−６−Ｐ …3.3mM G6PDH、 1U／mlｃ又は無し トリス 114mM MOPSO 80mM DTE ０ PH 7.0 MTX−DPH ０〜10^-6Ｍ 上記の阻害試薬１mlを37℃においてインキユベ
ートし、そして、DHFRのストツク溶液（1U／
ml）20μを加えることにより阻害反応を開始す
る。反応速度を568nmにおける光吸収の変化を１
分間間隔で10分間にわたり監視する。 この測定の結果を一連の曲線として第８図にグ
ラフとして示す。実線の曲線はNADPH再生手
段及びFH₂再生手段の両方の効果が重なつた場合
を示し、破線の曲線はG6PDHを用いないFH₂再
生手段のみの効果を示す。阻害剤MTX−DPHの
試験濃度は次の通りとした。すなわち(a)０、(b)１
×10^-8Ｍ、(c)５×10^-8Ｍ、(d)１×10^-7Ｍ、(e)５×
10^-7Ｍ，及び(f)１×10^-6Ｍである。第８図から、
基質再生手段及びコ・フアクター再成手段を組合
わせて使用するDHFR分析的測定において、阻
害剤の試験したほとんど全濃度範囲にわたり、そ
して10分間を超える全試験期間にわたり、
DHFR反応速度の直線性が得られることが容易
に理解できる。明らかに、直線性の追加の増加
は、コ・フアクター再生手段を伴う場合と
DHFR測定系のみを比較した第５図における場
合と同様に劇的である。 反応方式（）の基質再生手段の効果をさらに
明確に示すために、第８図のデータを第９図及び
第１０図においてグラフとして再プロツトした。 第９図は、MTX−DPHの存在下でFH₂のため
の基質再生手段のみを用いるDHFR測定の直線
性に及ぼす時間の影響を示す。このデータは第８
図における破線の曲線のデータと同じである。但
し、速度を阻害剤の濃度の逆数の関数としてプロ
ツトしてある。第９図中の各曲線は、グラフに表
示した時点で速度を測定した場合に得られた直線
性に対応する。実際に使用したMTX−DPHの濃
度は５×10^-8Ｍ、１×10^-7Ｍ、５×10^-7Ｍ、１×
10^-6Ｍ、及び５×10^-6Ｍである。 第１０図は、FH₂及びNADPHのための両再生
手段が存在する場合に得られるDHFR−阻害剤
測定のさらに改良された直線性を示す。データは
第８図の実線の曲線と同じである。但し、速度を
MTX−DPH濃度の逆数の関数としてプロツトし
てある。測定時間及び阻害剤の濃度は第９図の場
合のそれと同じである。 第９図と第１０図の比較から明らかな通り、基
質再生手段及びコ・フアクター再生手段の両方を
用いる場合、阻害されたDHFR測定系における
直線性のずれは非常に小さくなり、実験的測定の
精度が改良される。第９図におけるデータにより
示される直線性からの偏差は、基質であるFH₂の
飽和濃度での存在下でコ・フアクターである
NADPHが消費されることに起因すると信じら
れる。このデータは、同様の試験条件の下で、
コ・フアクターであるNADPHの飽和濃度での
存在下での基質であるFH₂の消費の効果を示す第
６図のデータと適切に対比される。速度の直線性
からの偏差の程度が同一でないことが明らかであ
る。このように効果が異るのは、酵素である
DHFRと基質であるFH₂との間のKmによつて測
定される結合親和性と、DHFRとコ・フアクタ
ーであるNADPHとの間の結合親和性との相異
によるものと信じられる。各結合親和性における
差異、並びに第６図及び第７図のデータは、測定
系において、酵素DHFRはNADPHとよりも
FH₂とより強く結合することを明らかに示してい
る。この観察は、研究者が反応速度の直線性を改
良するためにコ・フアクター再生手段又は基質再
生手段の１方のみの使用を選択しなければならな
い状況において特に有用になる。 この発明の好ましい態様を、DHFRを用いる
分析的測定系に関して説明したが、コ・フアクタ
ー及び／又は基質を再生するための手段を用いる
ことにより、一般的にあらゆる酵素測定系におい
て反応速度の直線性を実質的に改良することがで
きよう。このような再生手段を用いることによ
り、用いる酵素系のいかんにかかわらず、常に、
一層均一且つ一貫した酵素触媒の反応速度が得ら
れよう。再生に最適なものは常に必須成分と考え
られる比較的少数のコ・フアクターである。コ・
フアクタ再生手段が好ましい再生手段である。速
度の直線性の向上を伴つて他の多くの酵素系の一
部として再生することができるコ・フアクターを
第５表に列挙する。但し、これに限定されるもの
ではない。 【表】 【表】 又はホルミミノ
基
同様に、他の分析的酵素測定系において、再生
手段を使用することにより二次反応系が一次反応
系に変わり、これに対応して測定し得る速度の直
線性及び再現性が高められる。DHFR測定以外
の酵素系における反応体の再生のための特異的再
生手段を、単なる例として第６表に示す。 【表】 ミン
クレアチンキナーゼ

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素ジヒドロフオレートレダクターゼ
の濃度を変えた場合の酵素反応速度の低下を時間
の関数として示したグラフであり、第２図は、第
１図にプロツトした酵素的測定の直線性に与える
時間の影響を示すグラフであり、第３図は、測定
にコ・フアクター再生手段を導入した場合のジヒ
ドロフオレートレダクターゼの酵素反応速度を時
間の関数として示すグラフであり、第４図は、ジ
ヒドロフオレートレダクターゼ測定における改良
された直線性を第３図のデータを用いて示すグラ
フであり、第５図は、コ・フアクター再生手段の
存在下又は非存在下で阻害剤の濃度を変えた場合
の酵素反応速度を時間の関数として比較するグラ
フであり、第６図は、ジヒドロフオレートレダク
ターゼを用いる阻害剤の測定の直線性を第５図の
データを用いて示すグラフであり、第７図は、
コ・フアクター再生手段が存在する場合のジヒド
ロフオレートレダクターゼによる阻害剤の測定に
おける直線性の改良を第５図のデータを用いて示
すグラフであり、第８図は、ジヒドロフオレート
レダクターゼ測定において、コ・フアクター再生
手段を基質再生手段と組合わせた場合の効果を示
すグラフであり、第９図は、基質再生手段のみを
使用する場合のジヒドロフオレートレダクターゼ
測定の直線性に及ぼす時間の影響を第８図のデー
タを用いて示すグラフであり、そして、第１０図
は、コ・フアクター再生手段及び基質再生手段を
用いる酵素測定の直線性に及ぼす時間の影響を第
８図のデータを用いて示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 活性酵素変性剤の存在により活性が変化する
   所定量の酵素、該酵素により反応生成物に転換さ
   れるのに適する基質、該酵素による該基質の転換
   に必要なコ・フアクター及び該コ・フアクターを
   再生するための物質を含んで成り、該基質が所定
   量存在することを特徴とする、試料中の活性酵素
   変性剤の存否又は量を測定するための組成物。 ２ 活性酵素変性剤の存在により活性が変化する
   所定量の酵素、該酵素により反応生成物に転換さ
   れるのに適する基質、該酵素による該基質の転換
   に必要なコ・フアクター、及び該基質を再生する
   ための物質を含んで成り、該コ・フアクターが所
   定量存在することを特徴とする、試料中の活性酵
   素変性剤の存否又は量を測定するための組成物。 ３ 活性酵素変性剤の存在により活性が変化する
   所定量の酵素、該酵素により反応生成物に転換さ
   れるのに適する基質、該酵素による該基質の転換
   に必要なコ・フアクター、該基質を再生するため
   の物質、及び該コ・フアクターを再生するための
   物質を含んで成る、試料中の活性酵素変性剤の存
   否又は量を測定するための組成物。 ４ 活性酵素変性剤の存在により活性が変化する
   所定量の酵素、該酵素により転換されるのに適す
   る基質及び該酵素による該基質の反応生成物への
   転換に必要なコ・フアクターを一緒にし、該コ・
   フアクターを再生せしめ、並びに、試料中の活性
   酵素変性剤の存否又は量の関数である該酵素の活
   性を測定する段階を含んで成る該試料中の該活性
   酵素変性剤の存否又は量の測定方法。 ５ 前記酵素の活性を測定する段階が所定の初発
   基質濃度の変化の時間をかけた測定を含んで成る
   特許請求の範囲第４項記載の測定方法。 ６ 前記コ・フアクターを再生せしめる段階が、
   再生の結果として前記コ・フアクターのほかに他
   の測定可能な物質を生成せしめることを含んで成
   り、そして前記酵素の活性を測定する段階が、該
   他の測定可能な物質の濃度の変化の時間をかけた
   測定を含んで成る特許請求の範囲第４項記載の測
   定方法。 ７ 活性酵素変性剤の存在により活性が変化する
   所定量の酵素、該酵素により転換されるのに適す
   る基質、及び該酵素による該基質の反応生成物へ
   の転換に必要なコ・フアクターを一緒にし、該基
   質を再生せしめ、並びに、試料中の活性酵素変性
   剤の存否又は量の関数である該酵素の活性を測定
   する段階を含んで成る該試料中の該活性酵素変性
   剤の存否又は量の測定方法。 ８ 前記酵素の活性を測定する段階がコ・フアク
   ターの所定の初発濃度の変化の時間をかけた測定
   を含んで成る特許請求の範囲第７項記載の測定方
   法。 ９ 前記基質を再生せしめる段階が、再生の結果
   として前記基質のほかに他の測定可能な物質を生
   成せしめることを含んで成り、そして前記酵素の
   活性を測定する手段が、該他の測定可能な物質の
   濃度の変化の時間をかけた測定を含んで成る特許
   請求の範囲第７項記載の測定方法。 １０ 活性酵素変性剤の存在により活性が変化す
   る所定量の酵素、該酵素により転換されるのに適
   する基質、及び該酵素による該基質の反応生成物
   への転換に必要なコ・フアクターを一緒にし、該
   基質を再生せしめ、該コ・フアクターを再生せし
   め、並びに、試料中の活性酵素変性剤の存否又は
   量の関数である該酵素の活性を測定する段階を含
   んで成る該試料中の該活性酵素変性剤の存否又は
   量の測定方法。 １１ 前記コ・フアクターを再生せしめる段階
   が、再生の結果として前記コ・フアクターのほか
   に他の測定可能な物質を生成せしめることを含ん
   で成り、そして前記酵素の活性を測定する段階
   が、該他の測定可能な物質の濃度の変化の時間を
   かけた測定を含んで成る特許請求の範囲第１０項
   記載の測定方法。 １２ 前記基質を再生せしめる段階が、再生の結
   果として前記基質のほかに他の測定可能な物質を
   生成せしめることを含んで成り、そして前記酵素
   の活性を測定する手段が、該他の測定可能な物質
   の濃度の変化の時間をかけた測定を含んで成る特
   許請求の範囲第１０項記載の測定方法。 １３ 前記活性酵素変性剤がリガンドに結合して
   いる特許請求の範囲第１項に記載の組成物。 １４ 前記活性酵素変性剤がリガンドに結合して
   いる特許請求の範囲第２項に記載の組成物。 １５ 前記活性酵素変性剤がリガンドに結合して
   いる特許請求の範囲第３項に記載の組成物。 １６ 前記活性酵素変性剤がリガンドに結合して
   いる特許請求の範囲第４項に記載の測定方法。 １７ 前記活性酵素変性剤がリガンドに結合して
   いる特許請求の範囲第７項に記載の測定方法。 １８ 前記活性酵素変性剤がリガンドに結合して
   いる特許請求の範囲第１０項に記載の測定方法。