JPH0443640B2 - - Google Patents
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- JPH0443640B2 JPH0443640B2 JP58055188A JP5518883A JPH0443640B2 JP H0443640 B2 JPH0443640 B2 JP H0443640B2 JP 58055188 A JP58055188 A JP 58055188A JP 5518883 A JP5518883 A JP 5518883A JP H0443640 B2 JPH0443640 B2 JP H0443640B2
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- JP
- Japan
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- cholesterol
- stable
- solution
- present
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、経時安定性液状のコレステロール検
定用組成物にかかわる。 発明の背景 今日微生物を給源とするコレステロールオキシ
ダーゼを基剤とした検定用組成物の使用により血
清中のコレステロールを測定することが知られて
いる。この検定に伴なう反応は下記の如くであ
る： コレステロール＋O2コレステロール オキシダーゼ ―――――――――――――――――→ コレスタ−４−エン−３−オン＋H2O2 (1) 全コレステロール測定の場合、下記反応： コレステロールエステル＋H2Ｏコレステロール エステラーゼ ―――――――――――――――――→ コレステロール＋RCOOH (2) によつてコレステロールを生成するコレステロー
ルエステラーゼを包含させることにより、結合コ
レステロールを解放させることができる。 而して、コレステロールの量は、酸素消費量、
コレスタ−４−エン−３−オン形成量又は過酸化
水素形成量を調べることによつて検定されうる。
好ましい方法は、色原体系の使用により形成され
る過酸化水素の量を調べることである。好適な色
原体系は、セイヨウワサビからのペルオキシダー
ゼ、フエノールおよびアンチピリンを基剤とした
もので、下記反応を示す： 2H2O2＋アミノアンチピリン＋フエノールペルオキシダ
ーゼ ――――――――――→ キノンイミン染料 ＋4H2Ｏ (3) コレステロールオキシダーゼを基剤とする検定
系のほとんどは調製時機能的にされうるが、しか
しそれらは迅速劣化をきたしやすい。そのため、
斯界では早くから、組成物を、使用時の再組成に
備えるべく凍結乾燥していた。しかしながら、こ
の凍結乾燥はコスト高であり、しかも精度上問題
があつた。 而して、組成が制御されていて販売目的に適度
な保存寿命を有する液状検定系の出現が要望され
ていた。本発明者のひとりは、1980年８月１日付
けのEPC出願801045683に開示しているようにグ
リセロールの如きポリヒドロキシ化合物を例えば
50容量％まで存在させることによつて、液状の検
定用組成物が保存寿命を延長せしめられることを
発見した。この発明は、系の組成に対する精度の
高い量管理を実施可能なものとし、また手段とし
ての検定系への総信頼性を高めることができた。
系は濃厚物として処方した。この濃厚物の保存寿
命は工業用途に適する以上のものであり、それま
で斯界で知られていなかつたレベルの安定性を示
した。 ポリヒドロキシ化合物は、系を劣化せぬよう安
定化するのに機能的であるがコスト高であり、ま
た適当な管理維持のなされない場合装置を汚染
し、特にトリグリセリド分析の如き他の試験に影
響する。 それ故、機能上低下せずしかも、希釈なしで用
いられる単一処方物として市販され得、なお且つ
市場要件を満たす十分な保存寿命を示すような液
状検定系の開発が待たれていた。 本発明の概要 然るに、コレステロール検定系内に標準的に存
在する基本成分を利用し、しかし胆汁酸ないしそ
の塩、非イオン界面活性剤および緩衝剤の濃度並
びにPHに対する厳格な制御を実施するとき、ポリ
ヒドロキシ化合物を必要とせずにしかも４℃では
18ケ月ないしそれ以上の企図した保存寿命を示
し、また色原体系使用時には迅速完了時間をも示
す安定なコレステロール検定用組成物を処方しう
ることがわかつた。 使用ベース液は、約5mMまでの正の量好まし
くは約0.2〜5mM濃度で存在する胆汁酸ないしそ
の塩である少くとも１種の酸化合物約0.15〜1.5
％（ｖ／ｖ）好ましくは約0.2〜0.6％（ｖ／ｖ）
濃度で存在する非イオン界面活性剤好適にはプロ
ピレングリコールｐ−イソオクチルフエニルエー
テル、０〜65mM好ましくは0.5〜50mM、より
好ましくは0.5〜30mMの緩衝剤好適にはりん酸
二水素カリウム（KH2PO2）、少くとも
0.02KIU／好ましくは少くとも0.05KIU／濃
度のコレステロールオキシダーゼよりなる、PH約
5.5〜7.5好ましくは約６〜7.5の水溶液である。 全コレステロールに関し検定することが望まし
い場合、組成物は、少くとも0.07KIU／好まし
くは少くとも約0.1KIU／濃度の微生物コレス
テロールエステラーゼを含む。 好適な組成物は、過酸化水素測定用色原体系を
含む組成物である。色原体系は好ましくは、約８
〜35mM濃度のフエノールと、形成せる過酸化水
素に対し定量的な強度にピンクのキノンイミン染
料を生ぜしめる色原体反応の完了を可能にするの
に十分な濃度の４−アミノアンチピリンおよびペ
ルオキシダーゼとを含む。工業的実用化では、こ
れら両成分は、反応の完了を37℃で10分以内とす
るのに十分な量で供与される。好ましくは、ペル
オキシダーゼは少くとも30KIU／の濃度、４
−アミノアンチピリンは約0.3mMの濃度で供給
される。 組成物に約1mMまでの濃度好ましくは約0.4〜
0.6mM濃度で殺バクテリア剤好適には２，４−
ジクロルフエノールを含ませることが好ましい。 本発明に従つて製せられる組成物は41℃で少く
とも３日間安定である。これは、４℃における18
ケ月間或いは周囲温度（25℃）における約６ケ月
間の保存寿命に相当する。 色原体系を用いるとき、好ましくは、反応は37
℃で10min以内に完了し、少くとも更に30min以
上の色安定性がもたらされる。 製品は、先ず、水溶液を形成しこれに緩衝剤、
胆汁酸ないしその塩および界面活性剤を加えるこ
とによつて製せられる。また、フエノール、ジク
ロルフエノールおよび４−アミノアンチピリンが
必要に応じて加えられる。このベース組成物は所
要時、適当な酸又は塩基を加えることによつて受
容されるPH範囲に調節される。 これとは別個に、非イオン界面活性剤と酵素を
含んだ水溶液を形成する。次いで、この酵素液を
上記のベース液と一緒にして正味溶液（net
solution）を形成する。 好ましい実施態様 本発明に従えば、血清を含む液状コレステロー
ル測定用検定液にして４℃（冷凍状態）では約18
ケ月以上の長い保存寿命を示す検定液が供与され
る。長い保存寿命は主に、用いられる緩衝剤の濃
度が制御された結果である。 本発明の安定なコレステロール検定用組成物
は、胆汁酸および（又は）胆汁酸塩である少くと
も１種の酸化合物（その全体濃度は約5mMまで
の正の量好ましくは約0.2〜5mMである）、約0.15
〜1.5％（ｖ／ｖ）好ましくは約0.2〜0.6％（ｖ／
ｖ）濃度で存在する非イオン界面活性剤、０〜約
65mM好ましくは約0.5〜50mM濃度の緩衝剤、
少くとも約0.02KIU／好ましくは少くとも
0.05KIU／濃度のコレステロールオキシダーゼ
を含む、PH約5.5〜8.5の水溶液よりなる。 全コレステロールの検定の場合、微生物コレス
テロールエステラーゼは少くとも約0.07KIU／
好ましくは少くとも約0.1KIU／の濃度で包含
せしめられる。 好適なコレステロール検定用組成物は、過酸化
水素測定用色原体系を含む。 更に特定するに、本発明の好ましい色原体コレ
ステロール検定液は、その１容量当り約８〜
35mM好ましくは約15〜20mM濃度のフエノー
ル、総量が約5.0mMまでの正の量好ましくは約
0.2〜5mMの胆汁酸および（又は）胆汁酸塩、約
0.15〜1.5（ｖ／ｖ）好ましくは約0.2〜0.6％
（ｖ／ｖ）濃度の非イオン界面活性剤好ましくは
ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフエニ
ルエーテル〔トリトン（TRITON）Ｘ−100）、
０〜65mM好ましくは約0.5〜50mM濃度の緩衝
剤、少くとも0.02KIU／濃度のコレステロール
オキシダーゼ、好ましくは少くとも約30KIU／
濃度のペルオキシダーゼおよび、存在時少くと
も0.07KIU／好ましくは少くとも約0.1KIU／
濃度のコレステロールエステラーゼを含有す
る。ペルオキシダーゼおよび４−アミノアンチピ
リンは、コレステロールの酸化によつて形成され
る過酸化水素の定量的色度測定を可能にするのに
十分な量で存在する。この反応は37℃で10min以
内に完了する。該反応の完了時、好ましくは、４
−アミノアンチピリンが約0.3mMの濃度で存在
することが好ましい。この受容しうる範囲は約
0.2mM〜0.35mMである。而して、４−アミノア
ンチピリンの存在量が多すぎたり少なすぎたりす
るとき、反応は、少くとも所期時間内での完了を
達成しない。 系中に殺バクテリア剤を含ませることは好まし
い。好適な殺バクテリア剤はジクロルフエノール
であり、このものは0.75mMまでの濃度好ましく
は約0.4〜0.5mMの濃度で存在しうる。 緩衝剤は必要に応じ含有せしめられ、而してそ
れは無機のものでも有機のものでもよいが、りん
酸塩が好ましい。現在好適とされる緩衝剤はりん
酸二水素カリウム（KH2PO2）である。 好ましい酸化合物はコール酸又はその金属塩で
ある。現在好適とされる化合物はコール酸ナトリ
ウムである。 本発明の色原体コレステロール検定用組成物は
コレステロールの回収能力すなわち検出能力を示
し、また、ピンク色を呈するまでの検定終了時間
が37℃で10min以内である。しかも、ピンク色の
展開強度は少くとも更に30min間安定である。本
組成物は41℃で少なくとも３日間は安定である。
これは、４℃における少くとも18ケ月或いは室温
における約６ケ月の企図した安定性ないし保存寿
命に相当する。本発明の色原体検定系はそのまま
用いられ、希釈を必要としない。 本発明の色原体コレステロール検定用組成物に
おいて、フエノールの下限濃度は、系が安定性を
損うか否かの境界を画成し、また上限濃度は、フ
エノールが、色に悪影響のある濃度に達するか否
かの境界を画成する。 ジクロルフエノールは、殺バクテリア剤として機
能することに加え、発色を促進するので、その殺
バクテリア機能を別にしても非常に望ましい成分
である。 緩衝剤の上限濃度は臨界的である。もし、その
濃度が高すぎるなら、終了時間が遅すぎて信頼で
きない結果を生じ、しかも全く予想外なことに、
保存寿命にも悪影響がある。 胆汁酸又は胆汁酸塩は不可欠である。これらが
不在なとき、系はコレステロールを回収すること
ができない。また、約5mMを上回る濃度では、
終了時間が長すぎて工業的に利用できなくなる。 非イオン界面活性剤は酵素特にコレステロール
エステラーゼを賦活することが観察された。この
ものが存在せぬとき、反応時間は長すぎ、また余
りに高い濃度で存在するとき、発泡があり、粘度
に悪影響を及ぼし得る。 本発明を実施するのに現在用いられているコレ
ステロールオキシダーゼは微生物質のものであ
る。而して、それは、英国のワツトマン・バイオ
ケミカルズ社で製造販売されている。ブレビ
（Brevi）・バクテリア属のコレステロールオキシ
ダーゼは機能しないことが観察された。コレステ
ロールエステラーゼは任意の微生物源から得られ
るが、使用コレステロールエステラーゼは協和発
酵で製造販売されているものである。これは微生
物プセウドモナス・フルオレツセンスATCC1126
より産生されたものと認められる。使用ペルオキ
シダーゼは簡便にはセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼである。 本製品は、先ず、水溶液を形成しこれに緩衝
剤、胆汁酸ないしその塩および界面活性剤を加え
ることによつて製せられる。また、フエノール、
ジクロルフエノールおよび４−アミノアンチピリ
ンが必要に応じて加えられる。このベース組成物
は所要時、適当な酸又は塩基を加えることによつ
て受容されるPH範囲に調節される。 これとは別個に、非イオン界面活性剤と酵素を
含んだ水溶液を形成する。次いで、この酵素液を
上記のベース液と一緒にして正味溶液を形成す
る。 現在好ましい色原体組成物は、下記組成（全容
量１当りの量）である： 成 分 濃 度 フエノール 17mM KH2PO4 12.5mM ２，４−ジクロルフエノール 0.49mM ４−アミノアンチピリン 0.295mM コール酸 2.3mM コレステロールオキシダーゼ 0.05KIU／ コレステロールエステラーゼ 0.1KIU／ ペルオキシダーゼ 30KIU／ トリトンＸ−100 0.4±0.2V／Ｖ 下記例および対照は、本発明の組成物に関連し
た種々のパラメーターを例示するが、それによつ
て本発明を限定するつもりはない。 例 １ 下記組成の透明なベース溶液を形成することに
よつて、コレステロール検定系を処方した： 成 分 濃 度 水（３回蒸留した脱イオン水） 0.955 トリトンＸ−100（10％ｖ／ｖ溶液） 32.0ml KH2PO4 12.5mM ２，４−ジクロルフエノール 0.49mM ４−アミノアンチピリン 0.3mM フエノール 17.0mM コール酸ナトリウム 2.3mM PH 7.0 トリトンＸ−100を含有する水溶液10mlに、正
味溶液中0.1KIU／濃度となるような十分量の
コレステロールオキシダーゼと、正味溶液中
0.2KIU／濃度となるような十分量のコレステ
ロールエステラーゼと、そして正味溶液中
30KIU／濃度となるような十分量のペルオキ
シダーゼを加えることによつて、透明な酵素液を
形成した。 この酵素液を上記のベース溶液と一緒にした。
該混液は37℃で10min以内の完了時間を以て被検
コレステロールを回収検出した。生じた色は
30min以上の安定性を示し、41℃では３日を越え
る寿命を有した。これは、４℃での18ケ月間或い
は室温での約６ケ月間という保存寿命に相当す
る。 例１に従つて調製した検定用組成物の変種につ
いて詳しく調べた。而して、変更したパラメータ
ーは、緩衝剤の濃度、PH、コール酸の濃度および
非イオン洗浄の濃度であつた。例および対照で用
いた略号ないしコードは下記意味を有する： １＝変化なし A′＝37℃、500nmでの初期吸収は、一回通し
の場合0.15以下でなければならない。 ２＝ベツクマン・インスツルメンツ社で製造販売
されている、コレステロールに特異な対照
物。 ３＝制御時間１又は示される要素に帰せられる平
均ないし主要値（PAV）。 ４＝対照物のロツト番号。 ５＝ベツクマン・インスツルメンツ社で製造販売
されている、コレステロールを含んだ多数検
定用対照物。 ６＝ニユーイングランド・リーエイジエント・ラ
ボラトリーズで製造販売されている対照コレ
ステロール。コレステロールの濃度は200
mg／dlであつた。 Ｔ＝トリトンＸ−100。イーストマン・ケミカル
ズで製造販売されている平均式C34H62O11
（MW＝646）のポリエチレングリコールｐ−
イソオクチルフエニルエーテル。 完了時間は、コレステロール濃度600mg／dlにお
けるベツクマン基準に関する。 色安定性は、コレステロール濃度50mg／dl（低）
および（又は）500mg／dl（高）に関する。示し
た数値は記述時間での変化％である。 下記事項のうち１つ又は２つ以上が生じたとき
は不首尾とした： ａ コレステロールが回収ないし検出されない。 ｂ 37℃での完了時間が10minを越える。これ
は、長い完了時間が工業上受容されないことの
ため不首尾である。 ｃ 色安定性が完了時間後30minに満たない。 ｄ 安定性が41℃で３日に満たない。 また、初期吸収A′1が0.15より大きく或いはコ
レステロールの回収（検出量）が試料の±５％以
内にとどまらないときにも不首尾と認められる。 例２〜７および対照Ａ〜Ｃ 緩衝剤濃度 例１に従つて処方される溶液をKH2PO4濃度に
関し修正した。而して、他の全成分は一定に保持
した。 表から、処方時（フレツシユ）の性能と、表
中に記載の期間41℃に加熱（ストレス）したあと
の性能とを比較することができる。対照Ａ，Ｂお
よびＣは、41℃に加熱したあとの長い完了時間故
に不首尾であつた。 なお、例１〜７の組成物において、りん酸水素
カリウムを65mM濃度で用いた結果、その処方物
は検定完了時間が「フレツシユ」で5.5min、「41
℃、82時間」で8.5min、そして「A′」が「フ
レツシユ」で0.0032、「41℃、82時間」で0.65で
あつた。
定用組成物にかかわる。 発明の背景 今日微生物を給源とするコレステロールオキシ
ダーゼを基剤とした検定用組成物の使用により血
清中のコレステロールを測定することが知られて
いる。この検定に伴なう反応は下記の如くであ
る： コレステロール＋O2コレステロール オキシダーゼ ―――――――――――――――――→ コレスタ−４−エン−３−オン＋H2O2 (1) 全コレステロール測定の場合、下記反応： コレステロールエステル＋H2Ｏコレステロール エステラーゼ ―――――――――――――――――→ コレステロール＋RCOOH (2) によつてコレステロールを生成するコレステロー
ルエステラーゼを包含させることにより、結合コ
レステロールを解放させることができる。 而して、コレステロールの量は、酸素消費量、
コレスタ−４−エン−３−オン形成量又は過酸化
水素形成量を調べることによつて検定されうる。
好ましい方法は、色原体系の使用により形成され
る過酸化水素の量を調べることである。好適な色
原体系は、セイヨウワサビからのペルオキシダー
ゼ、フエノールおよびアンチピリンを基剤とした
もので、下記反応を示す： 2H2O2＋アミノアンチピリン＋フエノールペルオキシダ
ーゼ ――――――――――→ キノンイミン染料 ＋4H2Ｏ (3) コレステロールオキシダーゼを基剤とする検定
系のほとんどは調製時機能的にされうるが、しか
しそれらは迅速劣化をきたしやすい。そのため、
斯界では早くから、組成物を、使用時の再組成に
備えるべく凍結乾燥していた。しかしながら、こ
の凍結乾燥はコスト高であり、しかも精度上問題
があつた。 而して、組成が制御されていて販売目的に適度
な保存寿命を有する液状検定系の出現が要望され
ていた。本発明者のひとりは、1980年８月１日付
けのEPC出願801045683に開示しているようにグ
リセロールの如きポリヒドロキシ化合物を例えば
50容量％まで存在させることによつて、液状の検
定用組成物が保存寿命を延長せしめられることを
発見した。この発明は、系の組成に対する精度の
高い量管理を実施可能なものとし、また手段とし
ての検定系への総信頼性を高めることができた。
系は濃厚物として処方した。この濃厚物の保存寿
命は工業用途に適する以上のものであり、それま
で斯界で知られていなかつたレベルの安定性を示
した。 ポリヒドロキシ化合物は、系を劣化せぬよう安
定化するのに機能的であるがコスト高であり、ま
た適当な管理維持のなされない場合装置を汚染
し、特にトリグリセリド分析の如き他の試験に影
響する。 それ故、機能上低下せずしかも、希釈なしで用
いられる単一処方物として市販され得、なお且つ
市場要件を満たす十分な保存寿命を示すような液
状検定系の開発が待たれていた。 本発明の概要 然るに、コレステロール検定系内に標準的に存
在する基本成分を利用し、しかし胆汁酸ないしそ
の塩、非イオン界面活性剤および緩衝剤の濃度並
びにPHに対する厳格な制御を実施するとき、ポリ
ヒドロキシ化合物を必要とせずにしかも４℃では
18ケ月ないしそれ以上の企図した保存寿命を示
し、また色原体系使用時には迅速完了時間をも示
す安定なコレステロール検定用組成物を処方しう
ることがわかつた。 使用ベース液は、約5mMまでの正の量好まし
くは約0.2〜5mM濃度で存在する胆汁酸ないしそ
の塩である少くとも１種の酸化合物約0.15〜1.5
％（ｖ／ｖ）好ましくは約0.2〜0.6％（ｖ／ｖ）
濃度で存在する非イオン界面活性剤好適にはプロ
ピレングリコールｐ−イソオクチルフエニルエー
テル、０〜65mM好ましくは0.5〜50mM、より
好ましくは0.5〜30mMの緩衝剤好適にはりん酸
二水素カリウム（KH2PO2）、少くとも
0.02KIU／好ましくは少くとも0.05KIU／濃
度のコレステロールオキシダーゼよりなる、PH約
5.5〜7.5好ましくは約６〜7.5の水溶液である。 全コレステロールに関し検定することが望まし
い場合、組成物は、少くとも0.07KIU／好まし
くは少くとも約0.1KIU／濃度の微生物コレス
テロールエステラーゼを含む。 好適な組成物は、過酸化水素測定用色原体系を
含む組成物である。色原体系は好ましくは、約８
〜35mM濃度のフエノールと、形成せる過酸化水
素に対し定量的な強度にピンクのキノンイミン染
料を生ぜしめる色原体反応の完了を可能にするの
に十分な濃度の４−アミノアンチピリンおよびペ
ルオキシダーゼとを含む。工業的実用化では、こ
れら両成分は、反応の完了を37℃で10分以内とす
るのに十分な量で供与される。好ましくは、ペル
オキシダーゼは少くとも30KIU／の濃度、４
−アミノアンチピリンは約0.3mMの濃度で供給
される。 組成物に約1mMまでの濃度好ましくは約0.4〜
0.6mM濃度で殺バクテリア剤好適には２，４−
ジクロルフエノールを含ませることが好ましい。 本発明に従つて製せられる組成物は41℃で少く
とも３日間安定である。これは、４℃における18
ケ月間或いは周囲温度（25℃）における約６ケ月
間の保存寿命に相当する。 色原体系を用いるとき、好ましくは、反応は37
℃で10min以内に完了し、少くとも更に30min以
上の色安定性がもたらされる。 製品は、先ず、水溶液を形成しこれに緩衝剤、
胆汁酸ないしその塩および界面活性剤を加えるこ
とによつて製せられる。また、フエノール、ジク
ロルフエノールおよび４−アミノアンチピリンが
必要に応じて加えられる。このベース組成物は所
要時、適当な酸又は塩基を加えることによつて受
容されるPH範囲に調節される。 これとは別個に、非イオン界面活性剤と酵素を
含んだ水溶液を形成する。次いで、この酵素液を
上記のベース液と一緒にして正味溶液（net
solution）を形成する。 好ましい実施態様 本発明に従えば、血清を含む液状コレステロー
ル測定用検定液にして４℃（冷凍状態）では約18
ケ月以上の長い保存寿命を示す検定液が供与され
る。長い保存寿命は主に、用いられる緩衝剤の濃
度が制御された結果である。 本発明の安定なコレステロール検定用組成物
は、胆汁酸および（又は）胆汁酸塩である少くと
も１種の酸化合物（その全体濃度は約5mMまで
の正の量好ましくは約0.2〜5mMである）、約0.15
〜1.5％（ｖ／ｖ）好ましくは約0.2〜0.6％（ｖ／
ｖ）濃度で存在する非イオン界面活性剤、０〜約
65mM好ましくは約0.5〜50mM濃度の緩衝剤、
少くとも約0.02KIU／好ましくは少くとも
0.05KIU／濃度のコレステロールオキシダーゼ
を含む、PH約5.5〜8.5の水溶液よりなる。 全コレステロールの検定の場合、微生物コレス
テロールエステラーゼは少くとも約0.07KIU／
好ましくは少くとも約0.1KIU／の濃度で包含
せしめられる。 好適なコレステロール検定用組成物は、過酸化
水素測定用色原体系を含む。 更に特定するに、本発明の好ましい色原体コレ
ステロール検定液は、その１容量当り約８〜
35mM好ましくは約15〜20mM濃度のフエノー
ル、総量が約5.0mMまでの正の量好ましくは約
0.2〜5mMの胆汁酸および（又は）胆汁酸塩、約
0.15〜1.5（ｖ／ｖ）好ましくは約0.2〜0.6％
（ｖ／ｖ）濃度の非イオン界面活性剤好ましくは
ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフエニ
ルエーテル〔トリトン（TRITON）Ｘ−100）、
０〜65mM好ましくは約0.5〜50mM濃度の緩衝
剤、少くとも0.02KIU／濃度のコレステロール
オキシダーゼ、好ましくは少くとも約30KIU／
濃度のペルオキシダーゼおよび、存在時少くと
も0.07KIU／好ましくは少くとも約0.1KIU／
濃度のコレステロールエステラーゼを含有す
る。ペルオキシダーゼおよび４−アミノアンチピ
リンは、コレステロールの酸化によつて形成され
る過酸化水素の定量的色度測定を可能にするのに
十分な量で存在する。この反応は37℃で10min以
内に完了する。該反応の完了時、好ましくは、４
−アミノアンチピリンが約0.3mMの濃度で存在
することが好ましい。この受容しうる範囲は約
0.2mM〜0.35mMである。而して、４−アミノア
ンチピリンの存在量が多すぎたり少なすぎたりす
るとき、反応は、少くとも所期時間内での完了を
達成しない。 系中に殺バクテリア剤を含ませることは好まし
い。好適な殺バクテリア剤はジクロルフエノール
であり、このものは0.75mMまでの濃度好ましく
は約0.4〜0.5mMの濃度で存在しうる。 緩衝剤は必要に応じ含有せしめられ、而してそ
れは無機のものでも有機のものでもよいが、りん
酸塩が好ましい。現在好適とされる緩衝剤はりん
酸二水素カリウム（KH2PO2）である。 好ましい酸化合物はコール酸又はその金属塩で
ある。現在好適とされる化合物はコール酸ナトリ
ウムである。 本発明の色原体コレステロール検定用組成物は
コレステロールの回収能力すなわち検出能力を示
し、また、ピンク色を呈するまでの検定終了時間
が37℃で10min以内である。しかも、ピンク色の
展開強度は少くとも更に30min間安定である。本
組成物は41℃で少なくとも３日間は安定である。
これは、４℃における少くとも18ケ月或いは室温
における約６ケ月の企図した安定性ないし保存寿
命に相当する。本発明の色原体検定系はそのまま
用いられ、希釈を必要としない。 本発明の色原体コレステロール検定用組成物に
おいて、フエノールの下限濃度は、系が安定性を
損うか否かの境界を画成し、また上限濃度は、フ
エノールが、色に悪影響のある濃度に達するか否
かの境界を画成する。 ジクロルフエノールは、殺バクテリア剤として機
能することに加え、発色を促進するので、その殺
バクテリア機能を別にしても非常に望ましい成分
である。 緩衝剤の上限濃度は臨界的である。もし、その
濃度が高すぎるなら、終了時間が遅すぎて信頼で
きない結果を生じ、しかも全く予想外なことに、
保存寿命にも悪影響がある。 胆汁酸又は胆汁酸塩は不可欠である。これらが
不在なとき、系はコレステロールを回収すること
ができない。また、約5mMを上回る濃度では、
終了時間が長すぎて工業的に利用できなくなる。 非イオン界面活性剤は酵素特にコレステロール
エステラーゼを賦活することが観察された。この
ものが存在せぬとき、反応時間は長すぎ、また余
りに高い濃度で存在するとき、発泡があり、粘度
に悪影響を及ぼし得る。 本発明を実施するのに現在用いられているコレ
ステロールオキシダーゼは微生物質のものであ
る。而して、それは、英国のワツトマン・バイオ
ケミカルズ社で製造販売されている。ブレビ
（Brevi）・バクテリア属のコレステロールオキシ
ダーゼは機能しないことが観察された。コレステ
ロールエステラーゼは任意の微生物源から得られ
るが、使用コレステロールエステラーゼは協和発
酵で製造販売されているものである。これは微生
物プセウドモナス・フルオレツセンスATCC1126
より産生されたものと認められる。使用ペルオキ
シダーゼは簡便にはセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼである。 本製品は、先ず、水溶液を形成しこれに緩衝
剤、胆汁酸ないしその塩および界面活性剤を加え
ることによつて製せられる。また、フエノール、
ジクロルフエノールおよび４−アミノアンチピリ
ンが必要に応じて加えられる。このベース組成物
は所要時、適当な酸又は塩基を加えることによつ
て受容されるPH範囲に調節される。 これとは別個に、非イオン界面活性剤と酵素を
含んだ水溶液を形成する。次いで、この酵素液を
上記のベース液と一緒にして正味溶液を形成す
る。 現在好ましい色原体組成物は、下記組成（全容
量１当りの量）である： 成 分 濃 度 フエノール 17mM KH2PO4 12.5mM ２，４−ジクロルフエノール 0.49mM ４−アミノアンチピリン 0.295mM コール酸 2.3mM コレステロールオキシダーゼ 0.05KIU／ コレステロールエステラーゼ 0.1KIU／ ペルオキシダーゼ 30KIU／ トリトンＸ−100 0.4±0.2V／Ｖ 下記例および対照は、本発明の組成物に関連し
た種々のパラメーターを例示するが、それによつ
て本発明を限定するつもりはない。 例 １ 下記組成の透明なベース溶液を形成することに
よつて、コレステロール検定系を処方した： 成 分 濃 度 水（３回蒸留した脱イオン水） 0.955 トリトンＸ−100（10％ｖ／ｖ溶液） 32.0ml KH2PO4 12.5mM ２，４−ジクロルフエノール 0.49mM ４−アミノアンチピリン 0.3mM フエノール 17.0mM コール酸ナトリウム 2.3mM PH 7.0 トリトンＸ−100を含有する水溶液10mlに、正
味溶液中0.1KIU／濃度となるような十分量の
コレステロールオキシダーゼと、正味溶液中
0.2KIU／濃度となるような十分量のコレステ
ロールエステラーゼと、そして正味溶液中
30KIU／濃度となるような十分量のペルオキ
シダーゼを加えることによつて、透明な酵素液を
形成した。 この酵素液を上記のベース溶液と一緒にした。
該混液は37℃で10min以内の完了時間を以て被検
コレステロールを回収検出した。生じた色は
30min以上の安定性を示し、41℃では３日を越え
る寿命を有した。これは、４℃での18ケ月間或い
は室温での約６ケ月間という保存寿命に相当す
る。 例１に従つて調製した検定用組成物の変種につ
いて詳しく調べた。而して、変更したパラメータ
ーは、緩衝剤の濃度、PH、コール酸の濃度および
非イオン洗浄の濃度であつた。例および対照で用
いた略号ないしコードは下記意味を有する： １＝変化なし A′＝37℃、500nmでの初期吸収は、一回通し
の場合0.15以下でなければならない。 ２＝ベツクマン・インスツルメンツ社で製造販売
されている、コレステロールに特異な対照
物。 ３＝制御時間１又は示される要素に帰せられる平
均ないし主要値（PAV）。 ４＝対照物のロツト番号。 ５＝ベツクマン・インスツルメンツ社で製造販売
されている、コレステロールを含んだ多数検
定用対照物。 ６＝ニユーイングランド・リーエイジエント・ラ
ボラトリーズで製造販売されている対照コレ
ステロール。コレステロールの濃度は200
mg／dlであつた。 Ｔ＝トリトンＸ−100。イーストマン・ケミカル
ズで製造販売されている平均式C34H62O11
（MW＝646）のポリエチレングリコールｐ−
イソオクチルフエニルエーテル。 完了時間は、コレステロール濃度600mg／dlにお
けるベツクマン基準に関する。 色安定性は、コレステロール濃度50mg／dl（低）
および（又は）500mg／dl（高）に関する。示し
た数値は記述時間での変化％である。 下記事項のうち１つ又は２つ以上が生じたとき
は不首尾とした： ａ コレステロールが回収ないし検出されない。 ｂ 37℃での完了時間が10minを越える。これ
は、長い完了時間が工業上受容されないことの
ため不首尾である。 ｃ 色安定性が完了時間後30minに満たない。 ｄ 安定性が41℃で３日に満たない。 また、初期吸収A′1が0.15より大きく或いはコ
レステロールの回収（検出量）が試料の±５％以
内にとどまらないときにも不首尾と認められる。 例２〜７および対照Ａ〜Ｃ 緩衝剤濃度 例１に従つて処方される溶液をKH2PO4濃度に
関し修正した。而して、他の全成分は一定に保持
した。 表から、処方時（フレツシユ）の性能と、表
中に記載の期間41℃に加熱（ストレス）したあと
の性能とを比較することができる。対照Ａ，Ｂお
よびＣは、41℃に加熱したあとの長い完了時間故
に不首尾であつた。 なお、例１〜７の組成物において、りん酸水素
カリウムを65mM濃度で用いた結果、その処方物
は検定完了時間が「フレツシユ」で5.5min、「41
℃、82時間」で8.5min、そして「A′」が「フ
レツシユ」で0.0032、「41℃、82時間」で0.65で
あつた。
【表】
例８，９および対照Ｄ〜Ｉ
PHの評価
例１に従つて調製せる検定液を用い、HCl又は
NaOHを使つてPHを変えることにより、性能に
対するその効果を調べた。例２〜７の同じ基準を
用いた結果を表に示す。 不首尾は完了時間が長すぎるためであつた。対
照Ｄ，ＨおよびＩは調製時不首尾であり、また対
照ＥおよびＦは、48時間加熱後不首尾、対照Ｇは
82時間の加熱後不首尾であつた。色安定性は
45min後であつた。
NaOHを使つてPHを変えることにより、性能に
対するその効果を調べた。例２〜７の同じ基準を
用いた結果を表に示す。 不首尾は完了時間が長すぎるためであつた。対
照Ｄ，ＨおよびＩは調製時不首尾であり、また対
照ＥおよびＦは、48時間加熱後不首尾、対照Ｇは
82時間の加熱後不首尾であつた。色安定性は
45min後であつた。
【表】
例10〜14および対照Ｊ，Ｋ
コール酸の効果
例１の検定用組成物を用いたが、コール酸の濃
度を変えた。他の全ての要素は一定に保持した。
その結果を表に示す。対照Ｊは、系が濁つてお
りまたヒト血清に応用したとき崩壊したため不首
尾だつた。対照Ｋは、41℃に72時間加熱したこと
による液のストレス時でさえ、ヒト血清における
完了時間が長すぎたために不首尾だつた。色安定
性は37℃で75min後であつた。
度を変えた。他の全ての要素は一定に保持した。
その結果を表に示す。対照Ｊは、系が濁つてお
りまたヒト血清に応用したとき崩壊したため不首
尾だつた。対照Ｋは、41℃に72時間加熱したこと
による液のストレス時でさえ、ヒト血清における
完了時間が長すぎたために不首尾だつた。色安定
性は37℃で75min後であつた。
【表】
例15〜20および対照Ｌ，Ｍ
非イオン界面活性剤
酵素は初期酵素安定性を得るのに或る種の非イ
オン界面活性剤（トリトンＸ−100）を必要とす
るので、表の対照Ｌにおける「０」は10000部
当り６部という容量基準での濃度を意味する。非
血清での完了時間はコレステロール濃度567.5
mg／dlにおいてであり、また血清での完了時間
は、使用血清のコレステロール濃度650mg／dlに
おいてであつた。対照Ｌは、血清での完了時間が
長すぎたために不首尾だつた。
オン界面活性剤（トリトンＸ−100）を必要とす
るので、表の対照Ｌにおける「０」は10000部
当り６部という容量基準での濃度を意味する。非
血清での完了時間はコレステロール濃度567.5
mg／dlにおいてであり、また血清での完了時間
は、使用血清のコレステロール濃度650mg／dlに
おいてであつた。対照Ｌは、血清での完了時間が
長すぎたために不首尾だつた。
【表】
上記対照において、不首尾が、ストレス後コレ
ステロールを回収できないからでなく完了時間が
長すぎたことに由来する場合、その組成物は、完
了時間が工業化に重要であるため実用性に欠ける
ということができる。それ故、前掲特許請求の範
囲に記載のものは、完了時間の短い商用製品に指
向する。しかしながら、完了時間がより長い系で
あつても、それが十分な保存寿命を有する限り本
発明範囲に入ると理解されるべきである。
ステロールを回収できないからでなく完了時間が
長すぎたことに由来する場合、その組成物は、完
了時間が工業化に重要であるため実用性に欠ける
ということができる。それ故、前掲特許請求の範
囲に記載のものは、完了時間の短い商用製品に指
向する。しかしながら、完了時間がより長い系で
あつても、それが十分な保存寿命を有する限り本
発明範囲に入ると理解されるべきである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ａ 約5mMまでの正の量で存在する、胆汁
酸及び胆汁酸塩よりなる群から選ばれる酸化合
物少なくとも１種、 ｂ 約0.15〜1.5％（ｖ／ｖ）濃度で存在する非
イオン界面活性剤、 ｃ ０〜約65mM濃度の緩衝剤、及び ｄ 少なくとも約0.02KIU／濃度のコレステロ
ールオキシダーゼの水溶液を含み、約5.5〜7.5
範囲のPH及び41℃で少なくとも３日間の安定性
を有し、しかも37℃で10分以内の検定完了時間
を有する安定なコレステロール検定用組成物。 ２ 少なくとも約0.07KIU／濃度で存在する微
生物コレステロールエステラーゼを含む特許請求
の範囲第１項記載の安定なコレステロール検定用
組成物。 ３ 過酸化水素を測定するための色原体系を含む
特許請求の範囲第１項又は２項記載の安定なコレ
ステロール検定用組成物。 ４ 色原体系が、約８〜35mM濃度のフエノール
と、コレステロールの酸化により形成される過酸
化水素を定量的に色度測定するのに十分な濃度の
４−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼと
を含む、特許請求の範囲第３項記載の安定なコレ
ステロール検定用組成物。 ５ 過酸化水素を測定するための色原体系を含
み、しかも約８〜35mM濃度のフエノールと、約
0.25〜0.35mM濃度の４−アミノアンチピリンと、
少なくとも約30KIU／のペルオキシダーゼと
を含む特許請求の範囲第１項又は２項記載の安定
なコレステロール検定用組成物。 ６ 殺バクテリア剤を含む特許請求の範囲第１項
〜５項いずれか記載の安定なコレステロール検定
用組成物。 ７ ２，４−ジクロルフエノールを1mMまでの
濃度で含む特許請求の範囲第６項記載の安定なコ
レステロール検定用組成物。 ８ 非イオン界面活性剤がポリエチレングリコー
ルｐ−イソオクチルフエニルエーテルである、特
許請求の範囲第１項〜７項いずれか記載の安定な
コレステロール検定用組成物。 ９ 緩衝剤がりん酸二水素カリウムである、特許
請求の範囲第１項〜８項いずれか記載の安定なコ
レステロール検定用組成物。 １０ 酸化合物がコール酸の金属塩である、特許
請求の範囲第１項〜９項いずれか記載の安定なコ
レステロール検定用組成物。 １１ ａ 約８〜35mM濃度のフエノール、 ｂ 約5mMまでの正の量で存在するコール酸の
金属塩、 ｃ 約0.2〜1.5％（ｖ／ｖ）濃度で存在する非イ
オン界面活性剤、 ｄ ０〜約65mM濃度で存在する緩衝剤、 ｅ ４−アミノアンチピリン、 ｆ 少なくとも約0.07KIU／濃度で存在する微
生物コレステロールエステラーゼ、 ｇ 少なくとも約0.02KIU／濃度で存在するコ
レステロールオキシダーゼ、及び ｈ ペルオキシダーゼを含む、PH約6.5〜7.5の水
溶液を含み、而して前記ペルオキシダーゼ及び
４−アミノアンチピリンの量が、37℃、10分以
内でコレステロールの酸化により形成される過
酸化水素の定量測定を可能にするのに十分であ
り、しかも41℃で少なくとも３日間の安定性を
有する、安定な全コレステロール検定用含色原
体系組成物。 １２ 緩衝剤がりん酸二水素カリウムであり、PH
が約６〜7.5である、特許請求の範囲第１１項記
載の安定な全コレステロール検定用含色原体系組
成物。 １３ 非イオン界面活性剤が、約0.2〜0.4％
（ｖ／ｖ）濃度で存在するポリエチレングリコー
ルｐ−イソオクチルフエニルエーテルである、特
許請求の範囲第１１項又は１２項記載の安定な全
コレステロール検定用含色原体系組成物。 １４ ペルオキシダーゼが少なくとも約
30KIU／濃度で存在し、４−アミノアンチピ
リンが約0.3mM濃度で存在する、特許請求の範
囲第１１項〜１３項いずれか記載の安定な全コレ
ステロール検定用含色原体系組成物。 １５ ａ 約17mM濃度のフエノール、 ｂ 約0.5mM濃度で存在する２，４−ジクロル
フエノール、 ｃ 約5mMまでの正の量で存在するコール酸の
金属塩、 ｄ 約0.2〜0.6％（ｖ／ｖ）濃度で存在するポリ
エチレングリコールｐ−イソオクチルフエニル
エーテル、 ｅ 約12.5mM濃度で存在するKH2，PO4、 ｆ 約30KIU／濃度で存在するペルオキシダ
ーゼ、 ｇ 少なくとも約0.05KIU／濃度で存在するコ
レステロールオキシダーゼ、 ｈ 少なくとも約0.1KIU／濃度で存在する微
生物コレステロールエステラーゼ、及び ｉ 約0.3mM濃度で存在する４−アミノアンチ
ピリンの水溶液を含み、約6.0〜7.5のPH及び41
℃で少なくとも３日間の安定性を有する、安定
な全コレステロール検定用含色原体系組成物。 １６ ベース液と酵素液を形成し、次いで該ベー
ス液と酵素液を一緒にして正味溶液を形成するこ
とを含む、安定なコレステロール検定液の製造方
法であつて、 ａ 水に、 胆汁酸及び胆汁酸塩よりなる群から選ばれ
る酸化合物少なくとも１種を、前記正味溶液
中該酸化合物の総量が5mMまでの正の量と
なるように、又 非イオン界面活性剤を、前記正味溶液中約
0.15〜1.5％（ｖ／ｖ）濃度となるように溶
かすことによつて前記ベース液を調製し、 ｂ 且つ全非イオン界面活性剤の一部分を含有す
る水に、コレステロールオキシダーゼを、前記
正味溶液中該オキシダーゼが少なくとも約
0.02KIU／濃度になるように溶かすことによ
つて前記酵素液を調製し、更に前記ベース液
を、前記正味溶液が約5.5〜7.5のPHを示すよう
に必要に応じて調節する、検定が37℃で10分以
内に完了しうる、安定なコレステロール検定液
の製造方法。 １７ 酵素液に、正味溶液中のコレステロールエ
ステラーゼ濃度が少なくとも約0.07KIU／とな
る量で微生物コレステロールエステラーゼを加え
る、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８ ベース液に、正味溶液中のフエノール濃度
が約８〜15mMとなるのに十分量のフエノールと
そして４−アミノアンチピリンを加え、又酵素液
にペルオキシダーゼを加え、而して正味溶液中の
ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンの
量は、コレステロールの酸化によつて形成される
過酸化水素の定量的色度測定を可能にするのに十
分なものである、特許請求の範囲第１６項または
１７項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36489982A | 1982-04-02 | 1982-04-02 | |
| US364899 | 1982-04-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201999A JPS58201999A (ja) | 1983-11-25 |
| JPH0443640B2 true JPH0443640B2 (ja) | 1992-07-17 |
Family
ID=23436578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58055188A Granted JPS58201999A (ja) | 1982-04-02 | 1983-04-01 | 経時安定性液状のコレステロ−ル検定用組成物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0091026B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58201999A (ja) |
| AT (1) | ATE25464T1 (ja) |
| CA (1) | CA1205364A (ja) |
| DE (1) | DE3369792D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0218083A1 (en) * | 1985-09-03 | 1987-04-15 | Abbott Laboratories | Stabilized cholesterol reagent and method for determining total cholesterol using the reagent |
| DE3533288A1 (de) * | 1985-09-18 | 1987-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von hdl-cholesterin im serum |
| DE3782084D1 (en) * | 1986-05-09 | 1992-11-12 | Fuji Photo Film Co Ltd | Trockenes analysenelement fuer cholesterol. |
| US5589347A (en) * | 1986-12-18 | 1996-12-31 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Multilayer analysis elements for the determination of total cholesterol |
| JPS63158000A (ja) * | 1986-12-18 | 1988-06-30 | Fuji Photo Film Co Ltd | 総コレステロ−ル定量用一体型多層分析要素 |
| JPH04173099A (ja) * | 1990-11-08 | 1992-06-19 | Nissho Corp | 総コレステロール測定用試薬 |
| US6821410B2 (en) * | 2001-03-07 | 2004-11-23 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Biosensor and method of substrate quantification |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1479994A (en) * | 1974-03-04 | 1977-07-13 | Abbott Lab | Single reagent for the enzymatic determination of cholesterol and method therefor |
| DE2816229C2 (de) * | 1978-04-14 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Mittel zur Beseitigung von Trübungen |
| US4226713A (en) * | 1978-04-24 | 1980-10-07 | Goldberg Jack M | Diagnostic agents |
| ATE5539T1 (de) * | 1979-08-23 | 1983-12-15 | Ivan Endre Modrovich | Verfahren zur stabilisierung einer enzymatischen loesung zur verwendung bei der bestimmung des gesamt-cholesterols, stabilisierte loesung und reagenzsatz dafuer. |
-
1983
- 1983-03-24 AT AT83102958T patent/ATE25464T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-03-24 DE DE8383102958T patent/DE3369792D1/de not_active Expired
- 1983-03-24 EP EP83102958A patent/EP0091026B1/en not_active Expired
- 1983-03-29 CA CA000424774A patent/CA1205364A/en not_active Expired
- 1983-04-01 JP JP58055188A patent/JPS58201999A/ja active Granted
Also Published As
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|---|---|
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| EP0091026A3 (en) | 1985-07-10 |
| DE3369792D1 (en) | 1987-03-19 |
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