JPH0448434B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フイブリン溶解剤、それらの製造法
およびそれらを含有する医薬組成物に関する。更
に詳細には、本発明は、改変された増殖因子ドメ
インを有する組成プラスミノーゲン活性化因子類
似体に関する。 〔従来の技術〕 止血は、各種の酵素の複雑な相互作用によつて
保持されている。凝固因子は、活性化段階の「カ
スケード」で相互作用を行ない、最終的にはフイ
ブリン血餅を形成する。フイブリン血餅は、次に
フイブリンを分解するタンパク分解酵素であるセ
リンプロテアーゼプラスミンを包含するフイブリ
ン溶解系によつて分解される。プラスミンは、あ
る種の凝固因子をも開裂することによつて、それ
らを不活性化する広域スペクトルを有するプロテ
アーゼである。プラスミンの不活性前駆体である
プラスミノーゲンからのプラスミンの生成は、組
織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）であ
るフイブリン特異的セリンプロテアーゼによつて
媒介され、このセリンプロテアーゼはプラスミノ
ーゲンの生理的血管活性化因子であると考えられ
ている。ウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性
化因子（ｕ−PA）は、セリンプロテアーゼとし
て特徴付けられるプラスミノーゲン活性化因子の
種類のもう一つの一員である。ｔ−PAとｕ−PA
とは、機能上からおよび免疫学的に識別可能であ
る。正常な止血系に狂いを生じると、不適当な時
期および場所に凝血が形成され、心筋梗塞、深部
静脈血栓症、肺塞栓症および狭窄症を引き起こ
す。これらの状態から生じる組織の損傷によつ
て、死亡または重篤な廃失が起こる。 ｔ−PAは、通常はMr＝72000ダルトンの単一
ポリペプチド鎖として循環し、これはアミノ酸
275（Arg）と276（Ile）との間のペプチド結合の
開裂によつて二本鎖形に返還される。ｔ−PAの
重鎖（Mr40000および37000の２種の変種）はア
ミノ末端に由来し、軽鎖（Mr33000）はｔ−PA
分子のカルボキシ末端に由来している。この開裂
はトリプシンまたはプラスミンによつて触媒さ
れ、合成基質を用いて計測すると、活性が増加し
且つフイブリン溶解活性が増加する。一本鎖ｔ−
PAは、フイブリンへの結合と同時に、恐らくフ
イブリンへの結合によつて誘導される活性化因子
のコンホーメーシヨン変化のために、活性にな
る。二本鎖形への開裂は血流からのｔ−PAの迅
速なクリアランスと関連していることがあるが、
これと矛盾する報告も行われており〔ウオーレン
（Wallen）ら、Eur.J.Biochem.、132、681−686、
1983を参照されたい〕、クリアランス機構はほと
んど解明されていない。 潜在的前駆体ｔ−PAタンパク質の二次元モデ
ルは確立されている〔ナイ（My）ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、81、5355−5359、1984〕。
このモデルから重鎖は「クリングル（Kringles）」
として知られる２個のトリプル・ジスルフイド構
造を有することが決定された。同様なクリングル
構造は、プロトロンビン、プラスミノーゲンおよ
びウロキナーゼにも生じ、フイブリンへの結合に
重要であると考えられている〔ナイ（My）ら、
同上文献〕。ｔ−PAの第二のクリングル（K2）
は、フイブリンに対する親和性が第一のクリング
ル（K1）よりも高いと考えられている（イチノ
セ（Ichinose）、タキオ（Takio）およびフジカ
ワ（Fujikawa）、J.Clin.Invest.78：163−169、
1986；ベルハイエン（Verheijen）ら、EMBO J.
５：3525−3530、1986〕。 更に、ｔ−PAの重鎖は、表皮増殖因子との相
同性、並びにプロテインＣ、第因子、第因子
および第因子中の同種ドメインとの相同性を有
する、トリプル・ジスルフイド結合構造の“増殖
因子”ドメインを含む。生来のｔ−PAの増殖因
子ドメインは、おおよそアミノ酸48〜90を包含す
る。増殖因子ドメインがｔ−PAの迅速な生体内
クリアランスに関与しており、そして増殖因子ド
メインを欠失しても生成する分子のフイブリンへ
の結合を損うことはなく、またプラスミノーゲン
を活性化する能力を阻止しないことが見出だされ
ている。 ｔ−PAの重鎖は、フイブロネクチンのフイン
ガードメインと相同である「フインガー」ドメイ
ンもまた含む。フイブロネクチンは、フイブリン
結合活性のような各種の生物学的活性を示し、こ
のフイブリン結合活性はその９個のフインガード
メインのうちの４個または５個と互いに関係づけ
られている。 ｔ−PAの軽鎖はセリンプロテアーゼ活性の活
性部位（セリンプロテアーゼドメイン）を有し、
この活性部位は他のセリンプロテアーゼの活性部
位と高度に相同である。 ｔ−PAの前駆体形は、下流にプロ領域が続い
ているプレ領域であつて「プレ−プロ」領域と総
称されるものもさらに含んで成る。プレ−プロ領
域は、血管の内皮細胞によるｔ−PAの分泌に重
要なシグナルペプチドを有する〔ナイ（My）
ら、同上文献〕。プレ配列は、細胞外分泌に必要
な段階である小胞体の内腔中へのｔ−PAの分泌
に重要であると考えられている。プロ配列は、小
胞体からゴルジ装置への輸送の後、ｔ−PA分子
から開裂するものと考えられる。 動物およびヒト被験者においてフイブリン溶解
にｔ−PAを用いると、生来の分子の幾つかの欠
陥が強調された。生体内のｔ−PAの半減期は、
ヒトでは短く、３分間程度であることが示されて
いる〔ニルソン（Nilsson）ら、Scand.J.
Haematol.33：49−53、1984〕。注入されたｔ−
PAは肝臓によつて速やかに浄化され、注射され
た物質のほとんどは30分間以内に代謝されて低分
子量形になる。この様に半減期が短いため、治療
投与量を高くする必要がある。典型的には、生来
のｔ−PAは患者当たり30〜150mgの投与量で投与
され、該タンパク質の溶解度が低いため長時間の
点滴静注を必要とする。フツクス（Fuchs）ら
（Blood 65：539−544、1985）は、点滴静注さ
れたｔ−PAはタンパク質開裂部位から独立した
過程で肝臓によつて浄化され、注入されたｔ−
PAは体内に蓄積されない、すなわち、クリアラ
ンス機構を飽和することが出来ないと結論した。
更に、冠状動脈血栓を溶解するのに充分なｔ−
PAの投与量は通常の生理的レベルよりもかなり
高く、体中のプラスミノーゲンを活性化して、フ
イブリノーゲンの全身的分解をまねき〔シエリー
（Sherry）、同上文献〕、危険な出血を起こすこと
がある。 様々な研究者らがｔ−PAを改変して、その臨
床的適合性を高める試みを行なつてきた。ローザ
（Rosa）とローザ（Rosa）（国際特許出願
W086／01538号明細書）は、ｔ−PAの277位の
Lysを改変して、ｔ−PAの一本鎖形を安定化さ
せた。E.coli中で産生されるIle（277）ｔ−PAは、
生来のｔ−PAに比較して一本鎖分子としては活
性が低いことが判つた。ウオーレン（Wallen）
ら（同上文献）は、このリジン残基が一本鎖ｔ−
PAのタンパク質分解活性を招くだろうと仮定し
た。ハイネツカー（Heyneker）とベツハー
（Vehar）（英国特許出願公告第2173804号明細書）
は、ｔ−PAの開裂部位の周りのアミノ酸置換を
開示している。275位にCluを有するｔ−PA変異
体は、生来のｔ−PAに比較して特異的活性が大
きいことが示された。このｔ−PA変異体はまた、
ｔ−PA阻害剤と複合体を余り形成しなかつた。
一本鎖形は、フイブリンに対する親和性が二本鎖
形よりも大きいことも示された。ロビンソン
（Robinson）（W084／01786号明細書）は、酵素
的手段を用いて、ｔ−PAから炭水化物側鎖を取
り除いて、血漿中半減期を増加させた。ラウ
（Lau）ら（Bio／Technology、５、953、1987）
は、451位に炭水化物を欠いているｔ−PA変異体
を開示している。バン・ゾンネヴエルト（Van
Zonneveld）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、
83：4670−4674、1986）は、重鎖の部分が欠失し
てしまつている改変形のｔ−PAを開示している。
ロビンソン（Robinson）ら（欧州特許第
207589Al号明細書）は、増殖因子ドメインが欠
失してしまつているかまたは改変されている変異
形ｔ−PAを開示している。ラーセン（Larsen）
ら（W087／04722号明細書）は、アミノ酸置換お
よび／または欠失を有するｔ−PA様タンパクを
開示している。エールリツチ（Ehrlich）ら
（Fibrinolysis、１：75、1987）は、クリングル
ドメインを欠いている組換えｔ−PA分子を開示
している。しかしながら、これらの変異体形のｔ
−PAは、生来のタンパク質に関連した問題点を
完全には解決しない。 〔発明が解決しようとする課題〕 当業界では、半減期が長く且つフイブリンに対
する特異性が高いプラスミノーゲン活性化タンパ
ク質を必要としている。本発明は、増殖因子ドメ
インが構造的に変更された組織プラスミノーゲン
活性化因子の新規誘導体を提供することによつて
この必要性を満たす。本明細書に記載のｔ−PA
類似体は、生来のｔ−PAに比較して極めて低い
投与量を用いることができ、したがつて生来のｔ
−PAの溶解度が低いという問題点を解決し、点
滴静注おりも注射によつて投与することもできる
ので、治療用フイブリン溶解剤として生来のｔ−
PAを上回る著しい利点を提供する。組換えDNA
技術を用いることによつて、一貫した且つ均質な
これらのタンパク質源が提供される。これらのタ
ンパク質は、心臓発作および脳卒中の患者に存在
する血栓を溶解するのに用いたり、あるいはフイ
ブリンマトリツクスを溶解したりまたはその形成
を抑制する必要が治療上望ましい場合に用いるこ
とができる。 〔課題を解決するための手段〕 簡単に説明すれば、本発明は、生来のｔ−PA
の増殖因子ドメインを有する組織プラスミノーゲ
ン活性化因子類似体であつて、上記ドメインが少
なくとも１個のシステイン残基が他のアミノ酸で
置換されているものを開示する。本発明の選択さ
れた態様では、該システイン残基は生来のｔ−
PAの84番目であり、該アミノ酸はセリンまたは
アラニンである。特に好ましい態様では、該シス
テイン残基は生来のｔ−PAの84番目であり、該
アミノ酸はセリンである。 本発明のもう一つの態様では、増殖因子ドメイ
ン、クリングルドメイン及びセリンプロテアーゼ
ドメインを含んで成るプラスミノーゲン活性化因
子であつて、該増殖因子ドメインが生来のｔ−
PAの増殖因子ドメインと比較して実質的に連続
的なアミノ酸の複数の置換を有し、この置換によ
つて血漿中半減期が増加するものが開示される。
本発明の目的上、「複数の置換」という用語は、
４個以上の置換として定義される。これらの実質
的に連続的なアミノ酸置換は、増殖因子ドメイン
の１より多くの領域において行なうことができ
る。増殖因子ドメインは、第因子、第因子、
プロラインＣまたは表皮増殖因子のようなタンパ
ク質のアミノ酸配列を含んで成ることができる。
好ましい態様では、増殖因子ドメインは、第８図
に示されるようなフラグメントＡ〜Ｎのいずれか
の増殖因子ドメインのアミノ酸配列を有する。 本明細書記載のｔ−PA類似体およびプラスミ
ノーゲン活性化因子は、更に開裂部位の13個のア
ミノ酸残基内の少なくとも１個のアミノ酸が置換
されていてもよく、この置換によつてプラスミン
による開裂に対する耐性が増大する。更に、本明
細書記載のｔ−PA類似体は、第１０Ａ−Ｉ図に
示される配列からなる群から選択されたアミノ酸
配列を有するフインガードメインを有することが
できる。 本発明の他の観点では、ｔ−PA類似体または
プラスミノーゲン活性化因子は２個のクリングル
構造を含み、それらの少なくとも一方が炭水化物
を欠いている。更に、本明細書の該類似体および
プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲ
ンに由来するクリングル構造を有することもでき
る。好ましい態様では、プラスミノーゲンクリン
グル構造は、プラスミノーゲンのK1、K4および
K5クリングルドメインからなる群から選択され
る。プラスミノーゲンクリングル構造に加えて、
ｔ−PA類似体およびプラスミノーゲン活性化因
子は、プラスミノーゲンクリングル構造の下流に
位置した生来のｔ−PAのK2クリングル構造を更
に含むこともできる。 本発明の関連した観点においては、上記のよう
に、プロテインＣ、第因子、第因子及び第
因子からなる群から選択されたタンパク質の増殖
因子ドメインを有するｔ−PA類似体が開示され
る。これらの類似体は、更に上記の置換およびそ
の他の変異を有することもできる。 上記のｔ−PA類似体およびプラスミノーゲン
活性化因子をコードするDNA配列並びにこれら
のDNA配列を含む発現ベクターも開示される。
これに関して好ましい発現ベクターは、Zem99−
9100またはZem99−9200である。 このような発現ベクターでトランスフエクシヨ
ンまたは形質転換された宿主細胞も開示される。
この宿主細胞は、E.coliまたは哺乳類宿主細胞、
例えばBHK宿主細胞でもよい。 更にもう一つの本発明の観点では、本明細書記
載のｔ−PA類似体またはプラスミノーゲン活性
化因子及び生理学上許容されるキヤリヤーまたは
希釈剤を含んで成る医薬組成物が開示される。 これらおよびその他の本発明の観点は、下記の
詳細な説明および添付の図面を参照することによ
つて明らかになるであろう。 本発明を実施する前に、本明細書において用い
られる幾つかの用語の定義を記載することは、本
発明を理解する助けとなるであろう。 相補的DNAまたはcDNA mRNA鋳型中に存在する配列から酵素的に合
成したDNA分子または配列、またはこのような
分子のクローン。 DNA構造体 ヒトの介在によつて改変され、そうでなければ
天然には存在しないやり方で結合または並置され
たDNAのセグメントを有する、一本鎖もしくは
二本鎖のDNA分子またはそのような分子のクロ
ーン。 プラスミドまたはベクター 遺伝情報を有するDNA構造体であつて、宿主
細胞中に挿入されたときにその複製の準備をする
もの。複製は自律性であるかまたは宿主ゲノム中
への組込みによつて行なうこともできる。プラス
ミドは、一般的には宿主細胞において発現される
少なくとも１個の遺伝子配列と、上記遺伝子発現
を促進する機能をコードする配列であつてプロモ
ーター、転写開始部位および転写ターミネーター
とを含むものを有する。これは、線状分子であつ
てもまたは閉じた環状分子であつてもよい。 プレープロ領域 一般的には、ある種のタンパク質の前駆体のア
ミノ末端に存在し且つ一般的には少なくとも部分
的に分泌中にタンパク質から開裂されるアミノ酸
配列。プレープロ領域は、部分的には、細胞の分
泌経路中にタンパク質を配向させる配列を含んで
成り、そして一般的には疎水性アミノ酸に富む領
域を有する。 ドメイン タンパク質分子のアミノ酸の三次元の自己集合
配列であつて、このタンパク質の特異的生物活性
に必要な構造的要素を有するもの。 生物活性 生物学的状況において（すなわち、生物体、細
胞またはその生体外複写物において）分子によつ
て行われる機能または一連の機能。タンパク質の
生物活性は、触媒活性とエフエクター活性とに分
類することができる。フイブリン溶解剤の触媒活
性は、前駆体の特異的開裂によつて他のタンパク
質を活性化することができる。対照的に、エフエ
クター活性は、生理学的に活性な分子とフイブリ
ンのような他の分子または細胞との特異的結合を
含む。エフエクター活性は、生理的条件下で触媒
活性を増加したりまたはこれに本質的であること
がある。幾つかの場合には、触媒活性およびエフ
エクター活性が、タンパク質の同一ドメインに存
在する。プラスミノーゲン活性化因子について
は、生物活性は、プロ酵素またはチモーゲンであ
るプラスミノーゲンのプラスミンへの転換によつ
て特徴付けられ、このプラスミンが次にフイブリ
ンマトリツクスを分解するのである。フイブリン
はｔ−PAによるプラスミノーゲンの活性化にお
いて補因子として作用するのでフイブリンの不存
在では一体鎖ｔ−PAの活性は比較的小さい。 プラスミノーゲン活性化因子 フイブリンの存在下においてプロ酵素プラスミ
ノーゲンをプラスミンへ転換できるタンパク質。 生来のｔ−PA ヒト黒色腫細胞から単離されたような組織プラ
スミノーゲン活性化因子の構造および生物活性を
有するタンパク質（欧州特許第0041766A2号明細
書参照）。生来のｔ−PAは黒色腫細胞のｔ−PA
のアミノ酸配列を有するか、または配列が若干変
化したものを含むことができる。例えば遺伝多型
から生じるこれらの変異体は、タンパク質の構造
または活性を実質的に変更しない。生来のｔ−
PAの生物活性は、プロ酵素またはチモーゲンプ
ラスミノーゲンのプラスミンへの転換によつて特
徴付けられ、これが次にフイブリンマトリツクス
を分解する。生来のｔ−PAは、これを天然に産
生する細胞から単離したり、または生来のｔ−
PAをコードするDNA配列でトランスフエクシヨ
ンまたは形質転換された組換え細胞から調製する
ことができる。代表的な生来のｔ−PAのアミノ
酸配列を、第１図に示す。 ｔ−PA類似体 上記のようなプラスミノーゲン活性化因子の特
徴的な生物活性を有し、アミノ酸配列において人
工的に誘発される特異的な変異の存在によつて更
に特徴付けられるタンパク質。ｔ−PA類似体を
コードするDNA配列は「変異体DNA配列」と呼
ばれ、一般的にはcDNAの形状をしている。「人
工的に誘発された特異的な変異」という用語は、
アミノ酸配列中の欠失、挿入および置換を包含
し、これはクローン化されたDNA配列の操作に
よつて導入することができる。一般的には、ｔ−
PA類似体の生物活性は、生来のｔ−PAの生物活
性から測定可能なほどに変更されるだろう。 血漿半減期 動物の血流からの物質の50％を除去または不活
性化するのに要する時間。ｔ−PAについては、
血漿半減期は、例えば酵素免疫測定法（ELISA）
を用いてラツトのような試験動物の血流からのｔ
−PAの消失を監視することによつて測定される。 上記のように、ヒトｔ−PAは72000ダルトンの
タンパク質であり、二本鎖形で存在することがで
きる。このタンパク質は、該タンパク質の生物活
性を個別的および集合的に寄与する多数の構造的
ドメインを有する。これらのドメインの一つは、
表皮増殖因子（EGF）との相同性のため、「増殖
因子ドメイン」（これ以後「GFドメイン」と表わ
す）と呼ばれる。完全な成熟タンパク質は35個の
システイン残基を有し、それらの34個が鎖間また
は鎖内ジスルフイド結合に関与している〔ナイ
（My）ら、同上文献〕。これらのシステインの７
個はGFドメイン内にあり、そして３個のジスル
フイド結合に配置されており、７番目のシステイ
ンは対を為さないままである。 上記のように、GFドメインは薬剤としての生
来のｔ−PAの使用におけるある種の制限の原因
であることが判つた。本発明者が検討を行なつた
ところ、GFドメインは血流からｔ−PAを速やか
に浄化するのに部分的に関与していることを示す
データーが得られた。更に、GFドメインに遊離
のスルフヒドリル基が存在すると、タンパク質が
不安定化することがある。一般的には、溶液中の
タンパク質の遊離のスルフヒドリル基は、自動酸
化され易く、そして分子間のジスルフイド結合を
形成して、タンパク質の凝集を導き得る。遊離の
スルフヒドリル基を有するタンパク質を薬剤とし
て用いるときには、遊離のスルフヒドリル基に起
因する物理化学的特性の変化がタンパク質の免疫
学的または抗原的特性を変更し、従つてその治療
上の有用性を制限することがある。この作用はイ
ンターロイキン−２について観察された〔ワング
（Wang）ら、Science 224：1431−1433、1984
およびリアング（Liang）ら、J.Biol.Chem.、
261：334−337、1986〕。 フイブリン結合活性およびセリンプロテアーゼ
活性を両方とも有するため、本発明のプラスミノ
ーゲン活性化因子は少なくとも１個のGFドメイ
ン、クリングルドメイン及びセリンプロテアーゼ
ドメインを有するだろう。好ましくは、クリング
ルドメインは、生来のｔ−PAのK2ドメインであ
ろう。下記に更に詳細に論じるように、付加のク
リングルドメインもまた含むことができる。フイ
ブリンに対し更に大きな親和性を提供するために
フインガードメインを含むことも有利である。好
ましいフインガードメインは、生来のｔ−PAの
フインガードメインである。 本発明者らは、ｔ−PAのGFドメインの構造を
変更することによつて、このタンパク質の血漿中
半減期を延長できることを発見した。そういつた
変更の一つには、ｔ−PAのGFドメインからの１
つのシステイン残基の除去が含まれる。84位のシ
ステイン残基の除去が好ましいが、その他、51、
56、62、73、75および83位のシステイン残基を、
単一でまたは組み合わせで除去することもでき
る。如何なる場合でも、得られた分子は、上記の
理由から、不対のシステインを持たないことが好
ましい。システイン残基は、欠失またはアミノ酸
置変によつて除去することができる。なお、置換
の方が望ましい。理論上は、システインの代わり
に如何なるアミノ酸も置換し得るが、セリンまた
はアラニンとの置換が望ましい。特に好ましい置
換アミノ酸はセリンである。GFドメイン配列の
その他の変更には、生来のｔ−PAのGFドメイン
における実質的に連続した複数のアミノ酸の置換
が含まれる。アミノ酸置換は、増殖因子ドメイン
内に位置する潜在的レセプター領域を徹底的に変
更することなく、血漿中からのｔ−PAの急速な
クリアランスに関与する領域を崩壊させる目的
で、この領域で行われる。62位と73位のアミノ酸
によつて結ばれたループ構造は、その他の増殖因
子ドメイン含有タンパク質における対応領域との
相同性の低さ、およびそのループがタンパク質表
面に位置することを示唆する特徴のために、レセ
プター結合領域にとつての第一候補である。置換
アミノ酸は、他のタンパク質の増殖因子ドメイン
における対応位置中に見い出されるアミノ酸から
選ばれることが望ましい。目的の変更は、51−62
位間、56−73位間および75−84位間のシステイン
対のジスルフイド結合を含む。そのドメインに全
EGF様コンホーメーシヨンをとらせるような特
徴を失わせずに、特異的なレセプター相互作用を
排除することができる。一般に、増殖因子ドメイ
ンとして作用する、この領域の能力を保持するこ
とが望ましい。このために、コンホーメーシヨン
の大きな変化は伴わないが、特異的な位置におけ
る１つ以上のアミノ酸残基の化学的性質の変化を
目的とするようなアミノ酸置換が選ばれる。例え
ば、高度に保存された、増殖因子ドメインの特徴
を保持することが好ましい。第２２図に示すよう
に、これらの特徴には、(a)ｔ−PA増殖因子ドメ
インの第２番目のシステイン残基に隣接したAsn
−Gly−Gly（NGG）配列の存在；並びに(b)生来
のｔ−PA増殖因子ドメインにおける、４番目お
よび５番目のシステイン残基に相当するCys−Ｘ
−Cys配列（Ｘは如何なるアミノ酸でも可）の存
在が含まれる。 好ましい置換には、第および第凝固因子と
いつた、比較的長い血漿中半減期を有する１つま
たは複数のタパク質の増殖因子ドメインにおけ
る、実質的に連続した複数のアミノ酸の置換が含
まれる。さらに、生来のｔ−PAの増殖因子ドメ
インの一つより多い領域が、上記アミノ酸の各ブ
ロツクによつて置換されることがある。なお、別
のタンパク質からの完全な増殖因子ドメインを置
換することもできる。その他の置換は、第因
子、第因子、プロテインＣ、表皮増殖因子、お
よび増殖因子ドメインを含む他のタンパク質中の
配列を基に、増殖因子のコンセンサス配列を設計
することによつて行われる。増殖因子ドメイン
は、ウロキナーゼ、第因子、プロテインＳ、プ
ロテインＺ、低密度リポタンパク質レセプター、
形質転換増殖因子、表皮増殖因子レセプター、ト
ロンボモジユリン、およびトロンボスポンジン中
にも見い出される。特に好ましいコンセンサス配
列には、生来のｔ−PAの63−70位アミノ酸に代
わり置換された、メチオニン−グルタミン酸−グ
リシン−アスパラギン−ヒスチジン−ロイシン−
アラニン−アスパラギン（MEGNHLAN）配列
が挙げられる。ある種の好ましい態様において
は、生来のｔ−PAのGFドメインにおける83位の
アミノ酸残基に相当するシステインもまた、結果
として得られる分子の安定性を増すために、別の
アミノ酸で置き換えられる。原則として如何なる
アミノ酸もシステインと置換させることができる
が、セリンおよびアラニンが好ましい。特に好ま
しい置換アミノ酸はセリンである。 GFドメインにおける変更の外に、本発明のｔ
−PA類似体は、追加の突然変異を含むことがで
きる。これらの突然変異には、アミノ酸置換、欠
失、または付加が挙げられる。上述の如く、そう
いつた多くの突然変異が記載されている。特に好
ましい突然変異には、フインガードメインおよ
び／またはK1ドメインの置換、開裂（活性化）
部位付近のアミノ酸置換、K1ドメイン中の炭水
化物付加部位の除去、またはK2ドメイン中の炭
水化物付加部位の修飾が含まれる。そういつた突
然変異によつて、ｔ−PA類似体の臨床適合性が
高められるであろう。例えば、生来のｔ−PAの
K1ドメインは、結果として得られる類似体のフ
イブリン特異性を高めるために、別のタンパク質
に由来するクリングルドメインで置換され得る。
この点で適したクリングルドメインには、プラス
ミノーゲンのK1、K2、K3、K4およびK5ドメイ
ン、生来のｔ−PAのK2ドメイン、プロトロンビ
ンのK1およびK2ドメイン、並びに第因子の
クリングルドメインが含まれる。プラスミノーゲ
ンのK1ドメインが特に好ましい。活性化部位の
修飾を行えば、プラスミンによるタンパク質分解
的開裂に対する感受性を低下せしめそして／また
はトロンビンによる開裂を可能にすることによつ
て、ｔ−PA類似体の凝固特異性を高めることが
できる。炭水化物付加部位の修飾は、タンパク質
生成物の均一性を高め、そして血漿中半減期を増
加させる。Ｎ−結合グリコシル化部位（Asn−Ｘ
−Ser／Thr配列、Ｘは如何なるアミノ酸も可）
における、Asn残基の他のアミノ酸残基への変更
によつて、グリコシル化が阻害される可能性があ
る。Asn残基をGln残基に変更することが特に好
ましい。Asnは、SerまたはThrに変更すること
もできる。さらに、該配列中における他の変更
が、コードされるタンパク質のグリコシル化のブ
ロツクを目的として導入されてもよい。例えば、
Asn−Ｘ−Ser／Thr配列の２番目の位置におけ
るプロリン残基が、グリコシル化を阻害できる
（Marshall、Biochem.Soc.Symp.40：17−26、
1974）。この位置で他の置換を行うこともできる。
Ｎ−結合グリコシル化部位の３番目のアミノ酸
を、Ala、Cys、Gly、AsnもしくはGlnに換える
ことが好ましい場合もある。グリコシル化部位
を、単一でまたは組み合わせて変更してもよい。
一つの好ましい態様では、Asn−117の所での炭
水化物付加が、ダルタミン残基の置換によつて阻
害される。 本発明に基づくと、出発材料としてcDNAクロ
ーンまたはゲノムクローンを用いた、組換え
DNA技術の使用によつて、これらの新規なタン
パク質を産生することが好ましい。適切なDNA
配列は、自動合成を含む標準法に従つて合成する
ことができ、または、市販品の材料から得ること
も可能である。cDNAクローンを使用することが
好ましい。改変されたｔ−PAの産生のために出
発物質として生来のｔ−PAをコードする全長
cDNAを使用することにより、イントロンが除去
され、その結果、生来のｔ−PA中のすべてのエ
キソンが存在しそして、互いに正しい方向をとる
ためである。cDNAは、オリゴヌクレオチド指令
の突然変異誘発による配列の欠失、変更もしくは
挿入のための鋳型として用いることも可能であ
る。 組換えDNA技術により、従来のｔ−PAのフイ
ブリン結合ドメインの便利な増強が得られる。そ
ういつた増強は、付加的なクリングル構造の挿
入、フインガードメインの付加、またフインガー
ドメインの置換によつて達せられることがある。
この方法論から、生来のｔ−PAまたは関連タン
パク質中に見られる機能的なドメインの最適な組
み合わせを選択する手段が得られる。従つて、フ
イブリン結合、およびセリンプロテアーゼ活性の
点で、増強された生物活性を有するフイブリン溶
解剤が得られる。 アミノ酸置換または欠失は、鋳型としてクロー
ン化ｔ−PA配列またはその一部を用いた部位特
異的突然変異誘発によつて導入される。オリゴヌ
クレオチド指令生体外突然変異誘発のための技術
は、一般的にこの技術分野で知られている。その
ような方法として好ましいものに、Zollerおよび
Smithの方法（DNA ３：479−488、1984）が
ある。 アミノ酸置換は、適切な長さのオリゴヌクレオ
チド（好ましくは、長さ約30〜50ヌクレオチド）
を合成し、そしてそれらを組み立てて所望のコー
ド配列を作製することにより行われるのが好まし
い。この長さのオリゴヌクレオチドによれば、モ
ジユラー配列の設計が可能である。そして、この
モジユラー配列は、多くの全配列を得るために、
多様な組み合わせで並置できる。そのような組み
合わせは、対合された時に、生じる断片の両端が
平滑末端になるか、または隣接配列をコードする
オリゴヌクレオチドペアのものに相補的な末端と
なるように、オリゴヌクレオチドを設計すること
により容易になる。しかし、完全なGF置換は、
全長のオリゴヌクレオチドを用いることによつて
作製できることが理解されよう。オリゴヌクレオ
チドは、選択された宿主細胞タイプに適したコド
ン使用の最適化を可能にするという付加的利点を
提供する。 また、GF置換をコードするDNA配列は、GF
ドメインを有するタンパク質をコードするcDNA
またはゲノムクローンから得られることもある。
以下の各クローン、第因子（Kurachiおよび
Davie、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6461−
6464、1982；Ansonら、ENBO J.３：1053−
1060、1984）、第因子（Hagenら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 83：2412−2416、1986）、プロ
テインＣ（Fosterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82：4673−4677、1985）、および表皮増殖因子
（Grayら、Nature 303：722−725、1983）が記
載されている。これら及び他のタンパク質をコー
ドする適当なクローンは、遺伝子操作技術に通常
の知識を有する者にとつて周知の方法によつて得
られる。 続いて、GFドメインの置換をコードする配列
は、便利な制限部位の所でｔ−PA配列へ挿入さ
れる。場合によつては、その配列を正しく結合さ
せるために、in vitroでの突然変異誘発を利用す
ることが必要であろう。 変異した配列を、必要に応じて、ｔ−PAをコ
ードする配列の残りに結合させ、続いて、完全な
コード配列を発現ベクター中に挿入する。この変
異配列は、哺乳類細胞、酵母および他の真菌、並
びに細菌を含む様々な宿主細胞中での発現が可能
である。 細菌、酵母および哺乳類細胞中での組換えｔ−
PAの産生は、例えば、Goeddelら（EP 93619
Al）、MeyhackとHinnen（EP 143、081 A2）、お
よびGill（EP 174、835 A1）によつて開示されて
いる。外来DNAを用いた、哺乳類細胞をトラン
スフエクトする方法並びに細菌おび真菌を形質転
換する方法は、当該分野で周知の方法である。適
当な発現ベクターは、宿主細胞中でのクローン化
されたDNA配列の転写を指令し得るプロモータ
ー、および機能的転写終止部位を含むであろう。 場合によつては、発現ベクターが、複製の開始
点、並びに選択された宿主細胞に依存して、発現
レベルを調節および／または増強させる配列を更
に含むことが望ましい。適切な発現ベクターは、
プラスミド、RNAおよひDNAウイルス、もしく
は細胞性DNA配列から由来することがあり、ま
たは、それぞれの要素を含むこともある。 本発明を実施する時に使用するのに好ましい原
核細胞宿主としては、各種大腸菌株が挙げられる
が、枯草菌またはその他の属も有用である。これ
らの宿主の形質転換法、およびそれら宿主中での
クローン化された外来DNA配列の発現法は、当
該分野でよく知られている（例えば、Maniatis
ら、Molecular Cloning：Ａ Laboratory
Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、
1982参照）。細菌宿主中での外来DNAの発現に用
いられるベクターは、通常、抗生物質耐性遺伝子
のような選択可能マーカー、および宿主細胞中で
機能するプロモーターを含む。適切なプロモータ
ーは、trp（NicholsとYanofsky、Meth.in
Enzymology 101：155、1983）、lac
（Casadabanら、J.Bact.143：971−980、1980）、
TAC（Russelら、Gene 20：232−243、1982）、
およびλフアージのプロモーター系を含む。細菌
を形質転換させるのに有用なプラスミドには、
pBR322（Bolivarら、Gene ２：95−113、
1977）、pUCプラスミド（Messing、Meth.in
Enzymology 101：20−78、1983；Viejraと
Messing、Gene 19：259−268、1982）、pCQV2
（Queen、J.Mol.Appl.Genet.、２：１−10、
1983）、およびそれらの誘導体が含まれる。 ビール酵母のSaccharomyces cerevisiae等の
真核微生物、またはアスペルギルス属を含む糸状
真菌も宿主細胞として使用できる。アスペルギル
ス属の中で特に好ましい種には、A.nidulans、
A.niger、A.oryzae、およびA.terreusが含まれ
る。酵母を形質転換させる方法は、例えば、
Beggs、（Nature、275：104−108、1978）によ
つて記載されている。アルペルギルス属の各種
は、既知の方法、例えばYeltonらの方法（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 81：1740−1747、1984）
に従つて形質転換させることができる。酵母に使
用される発現ベクターには、YRp7（Struhlら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1035−1039、
1979）、YEp13（Broachら、Gene ８：121−
133、1979）、pJDB248およびJpDB219（Beggs、
同上）、並びにそれらの誘導体が含まれる。そう
いつたベクターには、通常、trpl変異を有する宿
主株での選択を可能にする、栄養要求性マーカー
のTPR1等の選択マーカーが含まれる。酵母の発
現ベクターに使用される、好ましいプロモーター
には、酵母解糖遺伝子からのプロモーター
（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255：12073−12080、
1980；AlberとKawasaki、J.Mol.Appl.Genet.
１：419−434、1982；Kawasaki、米国特許第
4599311号）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子からのプロモーター（Youngら、「化学薬
品に関する微生物の遺伝子工学（Genetic
Engineering of Microorganisms for
Chemicals）」、Hollaenderら編、355頁、
Plenum、New York、1982；Ammerer、Meth.
in Enzymology 101：192−201、1983）が含ま
れる。酵母の形質転換体中で生産される、改変さ
れたｔ−PAタパク質の精製を容易にするため、
また、正確なジスルフイド結合の形成を得るため
に、分泌タンパク質をコードする酵母遺伝子から
のシグナル配列が、ｔ−PAプレープロ配列の代
わりに置換され得る。特に好ましいシグナル配列
は、MFα1遺伝子のプレープロ領域である
（KurjhanとHerskowitz、Gell 30：933−943、
1982；およびSingh、EP 123、544）。 高等真核細胞も、本発明を実施する上で、宿主
細胞として役立つ。BHK、CHO、NS−１、
SP2／０、およびJ558L細胞系のような培養哺乳
類細胞が好ましい。こういつた細胞系は、例え
ば、ATCCから広範囲に得られる。特に好ましい
粘着性細胞系は、BHK細胞系tk^-ts13（Waechter
とBaserga、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：
1106−1110、1982）であつて、以降、これを
tk^-BHK細胞と称する。哺乳類細胞中で用いられ
る発現ベクターには、哺乳類細胞中に導入された
クローン化遺伝子の転写を指令し得るプロモータ
ーが含まれるだろう。特に好ましいプロモーター
には、SV40プロモーター（Subramaniら、Mol.
Cell Biol.１：854−64、1981）、MT−１プロモ
ーター（Palmiterら、Science 222：809−814、
1983）、およびマウスのκ遺伝子プロモーター
（Berganら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：
7041−7045）が挙げられる。また、発現ベクター
の中には転写ターミネーターが含まれ、これは、
発現和予定のDNA配列のための挿入部位の下流
に置かれる。好ましいターミネーターは、ヒト成
長ホルモン（hGH）遺伝子のターミネーター
（DeNotoらNuc.Acid Res.９：3719−3730、
1981）である。さらに、ベクターは、好ましくは
特定の宿主細胞系に適したエンハンサー配列を含
むだろう。 培養された哺乳類細胞系中でのｔ−PA変異体
の発現のために、クローン化ｔ−PA配列を含む
発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介によるト
ランスフエクシヨン（GrahamとVan der Eb、
Virology 52：456−467、1973；Wiglorらの変
法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567−3570、
1980；またはLoyterらが記載した方法、Proc.
Natl.Acad.Sci USA 79：422、1982）、または
エレクトロポレーシヨン（Neumannら、EMBO
J.１：841−845、1982）等の適当なトランスフエ
クシヨン法によつて、細胞内に導入される。細胞
の一部が、DNAを取り込み、それを細胞内に数
日保持する。この細胞の小分画が、宿主細胞のゲ
ノム中にこのDNAを組み込むか、または非クロ
モソーム性核構造中にDNAを保持する。これら
のトランスフエクタントは、選択可能な表現型を
付与する遺伝子（選択可能マーカー）を用いた同
時トランスフエクシヨンによつて同定することが
できる。好ましい選択可能マーカーには、ヌクレ
オチド合成の阻害剤であるメトトレキセート
（MTX）に対し細胞の耐性を与えるDHFR遺伝
子；または、タンパク質合成の阻害剤であるＧ−
418への耐性を与てる、細菌のネオマンシン耐性
遺伝子が挙げられる。宿主細胞がDNAを取り込
んだ後、耐性を十分に付与するレベルで選択可能
マーカーを発現している細胞集団を選択するため
に、薬剤による選択が行われる。選択可能マーカ
ーは、ｔ−PA類似体をコードする配列と同一の
ベクター上に担持されていてもよく、また別のベ
クター上に担持されていてもよい。 メトトレキセートを用いた選択の場合、初回の
選択時における培地中へ高濃度のMTXの添加、
または培地中のMTX濃度の連続増加に続き、薬
剤耐性細胞系の希釈による反復クローニングによ
つて、発現レベルを上昇させるために同時増幅が
行われる。同時トランスフエクトされたDNA配
列の初期ゲノム配置（すなわち、染色体外クロモ
ソーム対クロモソーム）と増幅自体の機構との両
方に関連する増幅および関連能力の変動が起き、
種々の量のDNA再配列が起こり得る。この為に、
各増幅過程の後、希釈によるクローニングが必要
である。続いて、DHFRマーカーを発現する細
胞を選択し、ｔ−PA生産についてスクリーニン
グを行う。スクリーニングは、酵素免疫測定法
（ELISA）、または生物活性測定法によつて、実
施することもできる。 本発明のプロスミノーゲン活性化因子は、生来
のｔ−PAに等しいフイブリン溶解効果を発揮す
る。しかし、これらのタンパク質は、血漿中半減
期が生来のｔ−PAの５倍長い点で、生来のｔ−
PAを上回る利点がある。このことは、それらが
治療薬としても優れていることを示唆している。 本発明のプラスミノーゲン活性化因子は、血栓
の治療に医薬組成物として用いることもできる。
この医薬組成物には、プラスミノーゲン活性化因
子が、担体、または滅菌水もしくは滅菌生理食塩
水等の希釈剤と組み合わせて含まれたり、適当な
賦形剤および／または溶媒を含有させることもで
きる。得られる水溶液は、使用のために包装され
るか、または、無菌状態で濾過および凍結乾燥が
なされる。この凍結乾燥された調製物は、投与前
に滅菌水溶液と混合される。 典型的には、３ｇのマンニトールおよび10⁶単
位のｔ−PA類似体を含む水溶液が、滅菌状態で
調製される。この溶液のアリコート１mlを、ピペ
ツトで小バイアルに分け、続いて、これらを凍結
乾燥して封をする。注射には、凍結乾燥された物
質を密封したアンプルの滅菌水２mlと混合する。
注射による投与が好ましい。通常、本発明のタン
パク質は、患者の体重および溶解すべき血栓の性
質に応じて、１人の患者につき約６mg〜約100mg
の用量で投与される。しかし、本発明は、上記の
範囲に限定されるものではないので、用量は、状
態に応じて変えることができる。適正用量の決定
は、熟練した臨床家には明らかであろう。 以下の実施例は、例示のためであつて、限定を
意味するものではない。 実施例 例 １ 全長ｔ−PAクローンの作成 生来のヒトｔ−PA cDNAクローンの配列は報
告されている（Pennica等、Nature、301：214−
221、1983）。その配列は、32〜35個のアミノ酸の
プレープロ（pre−pro）ペプチドに続き527−
530個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードして
いる。 成熟ｔ−PAのコード配列を含んで成るcDNA
クローンは、Bowes黒色腫細胞系（Rijkenおよ
びCollen、J.Bio.Chem.256：7035−7041、1981）
からのmRNAを出発材料として使用して作成さ
れた。次にこのcDNAを用いてプラスミド
pDR1296を作成した。pDR1296で形質転換され
たエシエリシア・コリ（Escherichia coli）
JM83株をアメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨン（ATCC）に受託番号（Accession
No.）53347として寄託した。 cDNAクローンpDR1296中にはプレープロ配
列は存在しなかつたので、その配列を合成オリゴ
ヌクレオチドから作成し、続いてcDNAと連結さ
せた。合成ｔ−PAプレープロ配列中に、BamHI
およびNcoIの開裂部位を、プレープロ配列の第
１コドン（ATG）のすぐ5′側の位置に導入し、
そしてBgl（Sau3A、Xho）部位をプレープ
ロ配列の3′末端に保持した。天然に存在するプレ
ープロ配列には、中間付近に便利な制限部位が欠
けている。しかし、配列GGAGCA（アミノ酸−
20および−19；Gly−Alaをコードする）を
GGCGCCに変えて、アミノ酸配列を変化させな
いでNarI部位を提供することができる。 プレープロ配列を作成するために、Applied
Biosystems Model 380−Ａ DNAシンセサイ
ザーを用いて、以下のオリゴヌクレオチドを合成
した。 【表】 精製した後、オリゴマーZC131とZC132をアニ
ーリングして12塩基対のオーバーラツプを作成し
た（セクシヨン１）。オリゴマーZC133とZC134
とを同様にアニーリングした（セクシヨン２）。
これらのオリゴマーをPol緩衝液（Bethesda
Research Labs）中で混合し、65℃で５分間加熱
し、そして４時間で徐々に室温を冷却してアニー
リングした。DNAポリメラーゼ 10単位を加
え、反応を室温に２時間進行させた。反応生成物
を大きさに基づいて分画するために、８％ポリア
クリルアミド−尿素シークエンシングゲル上で
1000Vにおいて2.5時間、前記混合物の電気泳動
を行つた。正しいサイズの断片（ポリメラーゼ反
応が完全に進行した断片）をゲルから切り出して
抽出した。 アニーリングした後で、セクシヨン１を
BamHおよびNarで切り、BamHI＋NarI切
断pUC8（VieiraおよびMessing、Gene、19：259
−268、1982；およびMessing、Meth.in
Enzymology 101；20−72、1983）中へクロー
ン化した。セクシヨン２を再アニーリングし、
NarおよびBglで切断し、BamH＋Nar
切断pUC8中にクローン化した。コロニーを、適
当なラベル化されたオリゴヌクレオチドによつて
スクリーニングした。コロニーハイブリダイゼー
シヨンにより陽性として同定されたプラスミドを
配列決定し、正しい配列がクローン化されている
ことを確かめた。 次に、セクシヨン１を適当なpUCクローンの
BamH＋Nar２重消化物から精製した。セク
シヨン２をNar＋Xho消化物から精製した。
この２個のフラグメントをNar部位で連結せし
め、BamH切断pUC8中にクローン化した。 次に、pDR1296のｔ−PA配列を、以下の方法
で合成プレープロ配列に連結せしめた（第２図）。
プラスミドpIC19R（Marsh等、Gene 32；481−
486、1984）をSmaおよびHindで消化した。
続いて、地図位置270（Pvu）から位置5171
（Hind）までのSV40のori領域を線状化された
pIC19Rと連結させてプラスミドZem67を作成し
た。次にこのプラスミドをBglで開裂し、ヒト
成長ホルモン遺伝子からのターミネーター領域
（De Nots等、Nuc.Acids Res ９：3719−
3730、1981）をBgl−BamH断片として挿入
してプラスミドZem86を作成した。合成ｔ−PA
プレープロ配列を、BamHおよびXhoによ
る消化によつてpUC8ベクターから除去した。こ
の断片をBglで消化されたZem86中に挿入し、
プラスミドZem88を作成した。プラスミド
pDR1296をBglおよびBamHで消化し、ｔ−
PAcDNA断片を単離し、そしてBgl切断
Zem88中に挿入した。得られたプラスミドを
Zem94と称する。 MT−１プロモーター、完全なｔ−PAコード
配列およびhGHターミネータを含んで成るベク
ターZem99を以下の方法で作成した（第２図）。
MT−１プロモーターを含むKpn−BamH断
片をMThGH111（Palmiter等、Science 222：
809〜814、1983）から単離し、そしてpUC18に
挿入してZem93を作成した。プラスミド
MThGH112（Palmiter等、同文献）をBglで消
化し、そして再結合させてhGHコード配列を除
いた。次に、MT−１プロモーターおよびhGH
ターミネーターをEcoR断片として単離し、
pUC13に挿入してZem4を作成した。次に、
Zem93を、BamHおよびSalでの消化によつ
て線状化した。Zem4をBglおよびSalで消化
し、hGHターミネーターを精製した。ｔ−PAプ
レ−プロ配列をpUC8ベクターからBamH−
Xho断片として除去した。３つのDNA断片を
一緒にし、Zem97構造をもつプラスミド（第２
図）を選んだ。Zem97をBglで切断し、Zem94
からのXho断片を挿入した。得られたベクター
はZem99である。 例 ２ Zem219cの作成 ベクターZem219cを第３図に示すようにして作
成した。プラスミドpSV2−DHFR（Subramani
等、同文献）をCfoで消化し、DHFR cDNA
および3′付着SV40配列を含有する断片を単離し、
修復し、BamHリンカーに結合させた。
BamHで消化した後、全cDNAおよびSV40タ
ーミネーター領域を含有する約800bpの断片を精
製し、BamH消化pUC8に連結させた。Zem67
（例１）をBglで消化し、BamHDHFR−
SV40断片と連結させてプラスミドZem176を作成
した。プラスミドZem93をSstで消化し、再連
結してプラスミドZem106（ここで、MT−１プロ
モーターの5′側の約600bpの配列が除去された）
を作成した。プラスミドZem106をEcoRで消化
し、プラスミドZem176からのDHFR遺伝子含有
EcoR断片と連結した。得られたプラスミドを
Zts13と称した。プラスミドZts13をBamHで消
化し、全ｔ−PAコード領域とhGHターミネータ
ー配列とを含有するプラスミドZem99からの
BamH断片と連結した。得られたプラスミド
をZts15と命名した。Zts15をBamHで部分消化
し、修復し、再連結してプラスミドZem219（ここ
で3′BamH部位が破壊された）を作成した。プ
ラスミドZem219をXbaで部分消化し、修復し、
そして再連結してプラスミドZem219a（ここでは
3′Xba部位が破壊された）を作成した。プラス
ミドZem219aをBamHおよびXbaで消化し、
ベクター配列をｔ−PA cDNA配列から精製し、
オリゴマーBamH−Xbaアダプターと連結
してベクターZem219bを生成した。Zem219bの
SV40−DHFR配列のポリリンカー領域内のVho
部位の破壊を、Vhoによる消化、修復、およ
び新しい平滑末端の再連結によつて行つた。得ら
れたプラスミドをZem219cと称した。 例 ３ Cys83の置換 Zem99中のｔ−PAコード配列を、83位がセリ
ンをコードするように突然変異誘発させた（アミ
ノ酸の番号は第１図に示す配列による）。Zem99
をBamHで消化し、ｔ−PAコード配列および
hGHターミネーターを含む2.4kb断片を単離し
た。この断片をBamH消化M13mp18
（Pharmaciaから得られる）と結合し、得られた
組換えフアージを用いてE.coli JM103をトラン
スフエクトさせた。目的の挿入部をもつフアージ
クローンをM13mp18／Bam−Zem99と命名し
た。 部位特異的突然変異誘発のために、オリゴヌク
レオチド（配列5′CT GGT ATC GAT TTC
ACA GCT CTT CCC AGC Ａ 3′）を合成し、
突異原性プライマーとして使用した。このオリゴ
ヌクレオチドを一重鎖M13mp18／Bam−Zem99
とアニーリングした。突然変異誘発は標準的な方
法で実施し、一重鎖DNAをシークエンシング用
に単離した。変異誘発されたフアージ（M13−
9100RFと称す）の複製型をBglとHindで消
化した。ｔ−PA配列を含む2.3kbの断片を回収
し、Zem99（これはBglおよびHindで消化さ
れている：第４図）と連結させ、そのDNAを用
いてE.coli TB１を形質転換した。目的とする配
列変形をもつプラスミドを回収し、Zem99−9100
と命名した。Zem99−9100の変異ｔ−PA配列お
よびコードされるアミノ酸配列を第５図に示す。 プラスミドZem99−9100およびpSV2−dhfr
（Subramani等、同文献）を用い、Loyterの方法
（Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 79：422、1982）に
よつてtk^-BHK細胞を形質転換した。形質転換体
を、限定希釈法によつてクローニングした。変異
タンパク質（9100と称する）をアフイニイテイー
クロマトグラフイーによつて細胞倍地から精製し
た。 プラスミドZem99−9100を含有するE.coli
TB1形質転換体は、通産省工業技術院微生物工
業技術研究所（FRI）に寄託された（受託番号
FERMP−9269）。 例 ４ Cys84の置換 オリゴヌレオチド5′CCT GGT ATC GAT
TTC ACT GCA CTT CCC 3′を用いる部位特
異的突然変異誘発法により、84番目のアミノ酸が
セリンをコードするようにｔ−PA DNA配列を
変異誘発させた。オリゴヌクレオチドを
M13mp18／Bam−Zem99とアニーリングし、標
準的操作によつて突然変異誘発を実施した。一重
鎖の変異誘発されたフアージを配列決定し、目的
の配列変化を有するクローンを選んだ。複製型
DNAを調製し、（M13−9200RFと称す）、Bgl
およびHindで消化した。2.3kbのｔ−PA断片
を単離し、Bal＋Hind切断Zem99と連結させ
た。得られたベクターをZem99−9200と命名した
（第４図）。Zem99−9200の変更されたｔ−PAコ
ード配列およびコードされるアミノ酸配列を第６
図に示す。 Zem99−9200およびpSV2−dhfrを用い、
Loyterの方法（同文献）によつてtk^-BHK細胞
を同時トランスフエクトした限定希釈法により、
形質転換体をクローニングした。変異タンパク質
（9200）をアフイニテイー精製によつて精製した。 プラスミドZem99−9200を含有するE.coli
RRI形質転換体は微工研に寄託番号FERM Ｐ−
9274として寄託された。 例 ５ ｔ−PA増殖因子ドメインの突然変異誘発 真正ｔ−PA GFドメインを代わりの増殖因子
配列で置換するため、まず生来のｔ−PA配列を
改変しフインガードメインと増殖因子ドメインコ
ード配列との間にKpn部を設けた。プラスミド
Zem99を、BamHおよびEcoRで消化し次い
で5′t−PA断片を回収し次いでBamH＋EcoR
切断M13mp13に挿入した。フアージDNAを調
製し、次いで該DNA溶液100μを用い、0.1μ
ｇ／mlウリジンを加えたYN媒地100μ中でE.コ
リRZ1032を感染させた。この培養物を激しく振
とうしながら一夜37℃ねインキユベートした。
RZ1032内でM13を増殖させるとウリジンを含有
するフアージを生産するが、これはRZ1032内で
は生存するが、JM101内では生存しない。 細胞を回転除去し、フアージ上澄みを、E.コリ
RZ1032を再感染するのに用いた。この第二継代
は、ウラシルを含まないJM101−由来フアージを
希釈するために行つた。再び細胞を回転除去し、
次いでフアージをJM101およびRZ1032上にプレ
ートした。正常な生存がRZ1032プレートについ
て観察された（10⁹pfu／mlでフアージを示す）
が、プラークはJM101細胞については観察されな
かつた。変異原性のオリゴヌクレオチドでプライ
ムした相補的鎖を、インビトロで産生した。突然
変異を含む新規鎖は、チミジンを含有し、従つて
JM101内で生存可能性であつた；野生型鋳型は生
存しなかつた。 鋳型DNAを、フアージ上澄みのPEG沈殿およ
びその後のフエノール−クロロホルム抽出、更に
エタノール沈殿により調製した。1μｇのこの鋳
型DNAを10μｇのオリゴヌクレオチドZC986と共
に、短時間煮沸し、65℃で５分間インキユベート
し次いで温度を４℃にゆつくり下げることによつ
てハイブリダイズせしめ、次いで10μの0.2M
HEPES（PH7.8）、2μの100mM DTT、1μの
1M MgCl₂、20μの2.5mM各dNTP、10μの
10mM ATP、1μの2.5U／μクレノーおよび
2μの1U／μ T4 DNA リガーゼを添加し
水で最終容量を100μに調整した。37℃で２時
間の伸長後、該DNAをコンピテントE.コリ
JM101細胞にトランスフエクトした。対照の伸長
（オリゴヌクレオチドなし）を行い、混入する
RNA又はDNA種上にプライムすることによる伸
長による生ずるバツクグラウンドの量を比較し
た。 このトランスフエクシヨンにより、変異誘発さ
れなかつた鋳型ではプラーク数０、対照の伸長
（オリゴヌクレオチドなし）の鋳型ではプラーク
数150、そして変異誘発された鋳型ではプラーク
数300が生成した。 プラークリフトを³²P−ラベル化変異原性オリ
ゴヌクレオチドとハイブリダイズせしめ次いで５
℃で30分間3M TMAC1（ウツド等、Proc.Nat1.
Acad.Sci.USA、82；1585−1588、1985）中で洗
浄することにより、更にまたランダムに選択した
プラークを配列決定することによつてもスクリー
ニングした。１個の陽性クローンを得た。 Kpn部位を有する変異誘発されたBamH
−EcoR断片を更に変異誘発せしめ、GFドメイ
ンの3′末端にXho部位を挿入した。鋳型DNA
を、Kpn部位含有M13フアージクローンから、
フアージ上澄みのPEG沈殿に続くフエノール−
クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により調製
した。1μｇのこのDNAを10μｇのオリゴヌクレ
オチドZC987（5′CAC GTG GCT CGA GTA
TCT ATT TC 3′）とハイブリダイズさせ
た。混合物を短時間煮沸し、65℃で５分間インキ
ユベートし、次いで温度を徐々に４℃に下げ、そ
の後10μの0.2M HEPES（PH7.8）、2μの
100mM DTT、1μの1M MgCl₂、20μの
2.5mM各dNTP、10μの10mM ATP、2.5単位
のDNAポリメラーゼ（クレノー断片）および
２単位のT4DNAリガーゼを添加し、水で最終容
量を100μに調整した。37℃で２時間伸長後、
DNAをコンピテントE.コリ JM101細胞にトラ
ンスフエクトした。プレートをハイブリダイゼー
シヨンによりスクリーニングし、突然変異誘発の
配列確認後、新しいフアージクローン（ZpL1）
を用い第二の変異誘発用の鋳型を調製した。オリ
ゴヌクレオチドZC988（5′CTC AGA GCA TGC
AGG GG 3′）を用い第一のクリングルドメイン
の3′末端にSph部位を導入した。突然変異誘発
を確認し次いでフアージクローンをZpL2と命名
した。複製型DNAをZpL2から調製し次いでｔ−
PAコード配列の５′部分を含むBamH−EcoR
断片を単離した。この断片を、Zem99からの部
分的EcoR−Xba消化3′t−PA断片および
BamH＋Xbaで消化されたZem219cと連結
させた（第７図）。得られた構成物をZpL7と命名
した。 増殖因子ドメイン置換体を第１図に示すオリゴ
ヌクレオチドを用いて作成した。18のオリゴヌク
レオチドを４又は６つの配列の種々の組合せで一
緒にし第８図に示す組合せを得た。500nｇの各
オリゴヌクレオチドを、50mMトリス−HCl（PH
8.0）、10mM MgCl₂、10μCi（0.3μM）の³²P−
ATPを有する150mMジチオトレイトールおよび
0.5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含有す
る別々の試験管で37℃で30分間（全反応容量＝
30μ）インキユーベートした。特定のオリゴヌ
クレオチドを含む反応混合物の5μのアリコー
トを第８図で示した組合せにおいて混合した（４
種のオリゴヌクレオチドを混合する場合全量20μ
；６種の混合では30μ）。 T4 DNAリガーゼ１単位を添加し、混合物を
室温で２時間インキユベートした。連結されたオ
リゴヌクレオチド組立て体を、8M尿素を有する
５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。全
長の組立てられた断片に相当するバンドを切り取
り、0.3Mの酢酸ナトリウム中で一夜溶出し、
DNAをエタノール沈殿させた。オリゴヌクレオ
チド組立て体を１倍、10倍、50倍に希釈し、精製
Kpn、Xho−切断ZpL7と共に連結混合物に
添加した。正確に置換したプラスミドを初めに
Southernプロツト分析により、次いで全置換域
を配列決定により同定した。第８図は参照しつつ
説明すると、断片Ａはｔ−PAアミノ酸63−70を
配列MEGNHLANで置換しており、断片Ｂはｔ
−PAアミノ酸51−84をヒト第因子の全増殖因
子ドメインで置換しており、断片Ｃはｔ−PAア
ミノ酸51−60をヒト第因子の対応領域で置換し
ており、断片Ｄはｔ−PAアミノ酸51−60を第
因子の対応領域で更にアミノ酸63−70を
MEGNHLANで置換しており、断片Ｅはｔ−
PAアミノ酸63−70をヒト第因子の対応領域で
置換しており、断片Ｆはｔ−PAアミノ酸51−84
をヒト第因子の全増殖因子領域で置換してお
り、更に断片Ｇはｔ−PAアミノ酸63−84をヒト
第因子の対応領域で置換している。断片Ａ，
Ｃ，ＤおよびＥにおいて、83位の遊離システイン
をセリンに変換しタンパク質の安定性を高める。 代表的オリゴヌクレオチド組合せの配列及びコ
ードされるアミノ酸配列を第６図に示す。対にな
つたオリゴヌクレオチド（1351＋1352、1353＋
1354、1355＋1356、1357＋1358、1359＋1360、
1361＋1362、1363＋1364、1457＋1458、および
1459＋1460）はまた第８図に示すように他の組合
せで組み立てることが可能である。 【表】 【表】 改変されたｔ−PA配列のための発現ベクター
作成するため、ベクターZpL7をKpnおよび
Xhoで消化し、ベクター断片をゲル精製した。
ベクターDNAを増殖因子置換断片Ａ，Ｂ，Ｃ，
Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，ＪおよびＫの各々と連
結した。連結混合物を用いコンピテントE.コリ
HB101細胞を形質転換した。クローンをひろい
あげ、DNAを調製し、EcoRで消化し次いで１
％アガロースゲルで分画した。該DNAをニトロ
セルロースに移し、次いで適当なγ³²ラベル化オ
リゴヌクレオチドで探索し置換の存在を確認し
た。 ZpL7A，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，
ＪおよびＫと命名した生成プラスミドをEcoR
およびBamHで消化し、そして5′t−PA断片を
M13フアージベクター中にクローン化し、次いで
更に確認のため配列決定した。次いでプラスミド
をtk^-BHK細胞にトランスフエクトし、次いで高
生産性クローンを蛋白質生産および特徴付けのた
めスケールアツプした。 例 ６ 変更した活性化部位によるｔ−PA類似体にお
けるCysの置換 部位特異的突然変異誘発のために、bp802〜
bp1274のｔ−PA配列を含んで成る472bpのEcoR
断片をZem99から単離し、M13mp18（複製型）
のEcoR部位にクローニングした。この組換え
フアージでE.コリ（E.coli）（JM101）をトラン
スフエクトし、そして、アンチセンス類DNAを
単離した。次に、部位特性的突然変異誘発を、第
２表に示した変異原性プライマーの１つおよび第
２のプライマーとしてのZC87を使用して、一本
鎖のアンチセンス鋳型DNA上で行つた。オリゴ
ヌクレオチドZC487，488，489および620は、274
位におけるPheをそれぞれGlu、Gly、Argまた
Proに変化させる。オリゴヌクレオチドZC797，
874，1013および1027は、275位におけるArgをそ
れぞれGly、Leu、ProまたはAspに変化させる。
オリゴヌクレオチド621は、277位のLysの代わり
にLeuを導入する。オリゴヌクレオチド928は、
276位のIleをProに変化させる。オリゴヌクレオ
チド875はArg（275）をLeuに変化させ、そして
オリゴヌクレオチド927は、予めLys（277）をLeu
に変換した変異体中のPhe（274）をPhoに変化さ
せる。従つて、オリゴヌクレオチド875および927
は、二重突然変異を発生させるために使用するこ
とができる。リン酸化された変異原性プライマー
20pmoleおよび第二のプライマー20pmoleと一本
鎖鋳型とを、10μの20mMトリス（Tris）（PH
7.5）、10mM MgCl₂、50mM NaCl、1mM
DTT中で合わせ、そして65℃で10分間次いで室
温で５分間インキユベートし、氷上に置いた。
1mMのdNTPs、2.5単位のクレノーポリメラー
ゼおよび3.5単位のDNAリガーゼを含む、20mM
トリス（PH7.5）、10mM MgCl₂、10mM DTTの
溶液10μを、アニール化されたDNAに添加し、
そしてこの混合物を15℃で３時間インキユベート
した。次に、このDNAでコンピテントE.コリ
JM101をトランスフエクトし、この細胞をYT寒
天上に接種しそして37℃でインキユベートした。
次に、このDNAをニトロセルロース上に移し、
６×SSC、10×デンハーツ（Denhardt´s）中、１
時間Tm−４℃にて変異原性プライマーとプレハ
イブリダイズせしめ、そして同一溶液中、Tm−
４℃で³²P−ラベル化変異原性プライマーとハイ
ブリダイズせしめた。Tm−４℃で３度洗浄した
後、フイルターを一夜Ｘ線フイルムにさらした。
必要な時、５℃高い温度で追加の洗浄工程を行い
突然変異体のプラークを同定した。この突然変異
した挿入部を、ジデオキシ法により配列決定し
た。 【表】 部分的に改変した配列のための発現ベクター
を、次に作成した（第９図）。複製型（RF）
DNAを前記変異誘発されたフアージから調製し、
そして改変されたｔ−PA配列をEcoR断片とし
て精製した。プラスミドZem182bをEcoRで消
化し、ｔ−PAコード配列の5′および3′部分を含
有するベクター配列をウシアルカリホスフアター
ゼで処理し、そして改変されたｔ−PA配列を挿
入した。得られたプラスミドをBamHおよび
Xbaで消化し、ｔ−PA断片を、BamH＋
Xbaで切断したpDR3002に挿入した。得らて
たベクターをpMH17〜pMH20（第３表）と命名
した。 【表】 【表】 次に、改変されたGFドメインおよび活性化部
位突然変異体を次の方法で一緒にした。Zem99−
9200由来のCys（84）変異体DNAを、BamH−
Sca断片として単離し、３部分連結でBamH
、Xba消化Zem219b、および改変された活性
化部位をコードしている、pMH10、pMH13また
はpMH17由来のSca−Xba断片と連結せし
めた。得られた発現ベクター（9200−10、9200−
13および9200−17と命名した）を、エレクトロポ
レーシヨンによりtk^-BHK細胞のトランスフエク
シヨンに使用した。高生産性クローンをスケール
アツプし、該タンパク質を精製した。 例 ７ コンセンサスフインガードメインを含有するｔ
−PA類似体におけるCys置換 コンセンサスフインガードメインによるｔ−
PAのフインガードメインの置換は、Arg−27、
Lys−49およびArg−89における潜在的タンパク
質分解性開裂部位の除去をもたらす。８つのフイ
ンガー置換配列を、フイブロネクチンおよびｔ−
PAのフインガードメインの分析に基づいて作成
した。 コンセンサスフインガー配列を、後述するよう
なオリゴヌクレオチドから作成し、次にｔ−PA
コード配列中に挿入した。この挿入を容易にする
ために、野生型フインガードメインをコードする
領域の下流（3′）にKpn部位を導入した。 BglおよびKpnによる得られた配列の消化
は、野生型フインガードメインの欠失をもたらし
た。 Ａ フインガードメインと増殖因子ドメイン間へ
のkpn部位の挿入 ｔ−PAのフインガードメインの後にkpn
部位を配置するために、オリゴヌクレチオド
ZC986（5′TTT GAC AGG TAC CGA GTG
GCA ３′）で突然変異誘発を行つた。生来の
ｔ−PA cDNAの5′BamH−EcoR断片を
含有するフアージM13クローンのDNAを調製
した。このDNA溶液100μを用いて、ウリジ
ン0.1μｇ／mlを補足したYM倍地100μ中でE.
コリRZ1032を感染せしめた。この倍地を、一
夜、激しく撹拌しながら37℃でインキユベート
した。RZ1032におけるM13の増殖は、RZ1032
中で生産できるがJM101中で生存できないウリ
ジンを含有するフアージを産生する。 細胞を遠心除去し、該フアージの上澄を用い
て、E.コリRZ1032を再感染した。この第２継
代は、全くウラシルを含有しないすべての
JM101−由来フアージを希釈除去するために行
つた。再度、この細胞を遠心除去し、そしてフ
アージをJM101およびRZ1032に接種した。
RZ1032プレート上で正常な生存性が観察され
る（10⁹pfu／mlのフアージを示す）が、JM101
細胞上では、全くプラークは観察されなかつ
た。次に、変異原性オリゴヌクレオチドでプラ
イムされた相補鎖を試験管内で調製した。新規
なストランドは、変異を受けていてチミジンを
含有し、そのためにJM101で生存できるが、野
生型の鋳型は生存できない。 鋳型DNAを、前記フアージの上澄のPEG沈
殿、次いでフエノールクロロホルム抽出そして
エタノール沈殿により調製した。この鋳型
DNA1μｇをオリゴヌクレオチドZC986 10μｇ
と共に、短時間煮沸し、65℃で５分間インキユ
ベートし、次いでゆつくり温度を４℃まで下げ
ることによりハイブリダイズせしめた後、
0.2MのHEPES（PH7.8）10μ、100mMのDTT
2μ、1MのMgCl₂ 1μ、2.5mMの各dNTP
20μ、10mMのATP 10μ、2.5U／μのク
レノウ1μおよび1U／μ T4DNAリガー
ゼ2μを加え、そしてH₂Oで最終体積100μ
に調整した。37℃で２時間伸長した後、この
DNAをコンピテントJM101細胞にトランスフ
エクトした。対照の伸長（オリゴヌクレオチド
を含まない）を行い、混入するDNAまたは
RNA種上にプライムすることによる伸長によ
り生じたバツクグランドの量と比較した。変異
誘発されていない鋳型によるトランスフエクシ
ヨンは、プラーク数０であり、対照（オリゴヌ
クレオチドを含まない）では、150個のプラー
クを生じ、変異誘発された鋳型によるトランス
フエクシヨンは、300個のプラークを生じた。 プレートを、³²P−ラベル化変異原性オリゴヌ
クレオチドとプラークリフトとをハイブリダイ
ズせしめそして3MのTMAC1（Wood等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 82：1585−1588、1985）
中で、30分間Tm−５℃にて洗浄することによ
り、そしてさらにランダムに採取したプラーク
の配列決定により、スクリーニングした。 Ｂ フインガー置換ドメインの調製 第４表及び第１０図に示されるコンセスンサ
フインガー領域置換体を作成した。 【表】 【表】 ８種類のコンセンサス配列を指示されたオリ
ゴヌクレオチドから作成した。該オリゴヌクレ
オチド（第５表）をApplied Biosystems
Model 380ADNA合成器を使用して調製した。
最初に、12種類のオリゴヌクレオチドを、それ
ぞれをポリヌクレオチドキナーゼと共に37℃で
１／２時間インキユベートすることによつて、キ
ナーゼ処理しかつ同時にγ−³²P ATPで低い
比活性にラベル化した。次いで、指示された８
種類の組合せ（ABC，DEF，ABF，AEC，
AEF，DBF，DEC及びDBC）を、適当なオリ
ゴヌクレオチドを混合し、DNAリガーゼを添
加し、そして37℃で１時間インキユベートする
ことによつて調製した。この反応の生成物を６
％ポリアクリルアミド−8M尿素シークエンス
用ゲル上で分画した。全長のフインガードメイ
ンをコードするDNAに相当するバンドを切り
出し、そして2.5M酢酸アンモニウム中で該
DNAを溶出させた。該DNAをエタノールで沈
殿させ、1pモル／μの濃度に水中に再懸濁
させた。RF DNAを例7Aに記載の陽性クロー
ンから調製し、そしてBamH〜EcoR ｔ
−PA断片を精製した。プラスミドZem219a
（例２に記載）をXbaで消化し、そして次に
EcoRで部分的に消化した。3′t−PAコード
領域を含有する1010bp断片を精製した。プラ
スミドZem219b（例２に記載）をBamHおよ
びXbaで消化し、そして5′t−PA断片
（BamH−EcoR）及び1010bp EcoR−
Xba断片に連結した。得られたベクター
（Zem238と命名）はフインガードメインの後に
kpn部位を含有する。Zem238をBgl及び
kpnで消化し、野生型のフインガードメイン
を除去するためにゲル−精製し、そして８種類
のコンセンサス配列のそれぞれと連結して発現
ベクター238−Fcon1〜238−Fcon8を生ぜしめ
た。 Ｃ Cys（84）置換とコンセンサスフインガーの
組合せ M13−9200（例４）からの鋳型DNAを例7A
に記載のようにしてオリゴヌクレオチドプライ
マーZC986にアニールした。フインガードメイ
ンの3′端のところに挿入されたkpn部位を有
する正しく突然変異されたクローンを同定し、
そして配列決定した。このクローンからのRF
DNAをkpn及びXbaで消化し、そしてCys
（84）変異体DNAをkpn，Xba−消化プラ
スミド238−Fcon1〜238−Fcon8に連結した。
得られたベクター（9200−Fcon1〜9200−
Fcon8と命名）をtk^-BHK細胞にトランスフエ
クトし、そして変異タンパク質を精製しかつ特
徴づけた。 例 ８ ｔ−PA類似体における炭水化物付加部位の、
GFドメイン中の変異による修飾 組織プラスミノーゲン活性化因子は４個の潜在
的グリコシル化部位（アミノ酸配列Asn−Ｘ−
Ser／Thr）を含有する。Poh1ら
（Biochemistry，23：3701〜3707，1984）の報告
によれば、これらの部位のうちの３箇所は（Asn
−117，−184及び−448）はBowes黒色腫細胞か
ら得たｔ−PAにおいてグリコシル化されている。
グリコシル化部位のAsn残基を別のアミノ酸残基
に変更することによつてグリコシル化をブロツク
することができる。 Asn残基をG1n残基に変更することが特に有利
である。ｔ−PAをコードするDNA配列における
変更を、部位−特異的突然変異誘発によつて行つ
た。ヌクレオチドの変更は、単独で行つてもよ
く、あるいは、１つもしくはそれ以上のグリコシ
ル化部位を変更するために、組み合わせて行つて
もよい。その上、いくつかの突然変異を組み合わ
せて含む新しいタンパク質を生じさせるために、
ｔ−PAコード配列の他の欠失、挿入または置換
を含むDNA断片と突然変異された配列を組み合
わせてもよい。 部位−特異的突然変異誘発を一本鎖のM13フア
ージ鎖型について、変異原性プライマーZC294，
ZC295及びZC297（第６表参照）を使用して実施
し、それぞれAsn−117，−184及び−448のところ
に変異を生ぜしめた。次いで、変異体ｔ−PAsを
コードしていてシングル、ダブル又はトリプルの
突然変異を含むDNA配列を、pDR1296中のｔ−
PAコード配列を置換することによつて、作成し
た。次のようなプラスミドが作成された：(1)突然
変異をAsn−117に含むpDR1601；(2)突然変異を
Asn−１８４に含むpDR１６０２；(3)突然変異を
Asn−448に含むpDR1603；(4)突然変異をAsn−
117及び−448に含むpDR1604；(5)突然変異をAsn
−184及び−448に含むpDR1605；及び(6)前記３
種の突然変異を含むpDR1606。 【表】 追加の突然変異誘発において、Gly（183）及び
Ser（186）をそれぞれSer及びThrで置換するため
にオリゴヌクレオチドプライマー（5′ACG GTA
GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA
3′）を調製した。これらの突然変異の結果、K2
ドメインのより均一なグリコシル化が得られた。
部位−特異的突然変異誘発を、ワン−プライマー
法に従つて、鋳型M13mp18／Bam−Zem99（例
３）を使用して行つた。一本鎖の突然変異フアー
ジDNAを調製し、そして配列決定した。所望の
配列変更を有するクローンをM13−6000と命名し
た。 M13−6000からのRF DNAを単離し、Bgl
及びApaで消化し、そして約1.4kbの断片を単
離した。この断片をBgl，Apa−消化Zem99
に連結してベクターZem99−6000を調製した。
Zem99−6000で形質転換されたE.coli PRIを受託
便号FERM Ｐ−9126としてFermentation
Research Instituteに寄託した。 プラスミドzem99−9200からのCys（84）変異
体DNAをBgl及びNarで消化した。変異体
DNA配列をpDR1601及びZem99−6000からNar
−Xba断片として単離した。Zem99−9200か
らのBgl−Nar断片、pDR1601からのNar
−Xba断片およびZem219aのBgl−Xba
（ベクター）断片を連結することによつてプラス
ミド9200−1601を作成した。Zem99−9200からの
Bgl−Nar断片、Zem99−6000からのNar
−Xba断片およびZem219aベクター断片を連結
することによつてプラスミド9200−6000を作成し
た。これらのプラスミドを、tk^-BHK細胞をエレ
クトロポレーシヨンによつてトランスフエクシヨ
ンするために使用した。変異タンパク質を精製
し、そして特徴づけた。 pDR1601及びpDR1606の変異体ｔ−PA配列を
BamH−Xba断片として単離し、そして
Zem99中に挿入した。得られた発現ベクターを
tk^-BHK細胞にトランスフエクトした。トランス
フエクトした。トランスフエクトされた細胞から
変異タンパク質1601及び1606を単離し、そして特
徴づけた。 例５に記載のGF置換変異体のK1グリコシル化
部位中のAsnを置換するために、鋳型DNAをフ
アージZpL2から調製し、そしてオリゴヌクレオ
チドZC1452（5′CAA CGC GCT AGA TTG
CCA GTT GGT 3′）で突然変異誘発した。得
られたフアージクローンをZpL3（第７図）と命名
した。 複製型DNAをZpL3から調製し、そしてｔ−
PAコード配列の5′部分を含むBamH−EcoR
断片を単離した。この断片を、Zem99からの部分
EcoR−Xba3′t−PA断片及びBamH＋
Xba消化Zem219cに連結した（第７図）。得ら
れたベクター（ZpL5と命名）をkpn及びXho
で消化し、そしてベクター断片をゲル精製し
た。ベクターDNAを例５に記載の増殖因子置換
断片Ａ，Ｂ，Ｄ及びＧと連結した。連結混合物を
使用して、コンピテントE.coli HB101細胞の形
質転換を行つた。クローンを拾い、そしてGFド
メイン置換をプラスミドZpL5A，Ｂ及びＤに関
するハイブリダイゼーシヨン及び配列分析によつ
て確認した。ZpL5Aをtk^-BHK細胞にトランス
フエクトし、そして高生産性クローンをタンパク
質製造及び特徴づけのためにスケールアツプし
た。 例 ９ GF改変とクリグルドメイン置換との組合せ Ａ Asp（96）プラスミノーゲンクリングル プラスミドpK1はプラスミノーゲンのK1ド
メインのコード配列を含み、その配列は第１１
図に示されている。これは、PK1−１，PK1−
２，PK1−３，……PK1−12と称する一連の11
のオリゴヌクレオチドから作成された。それら
の配列を表７に示す。 【表】 プラスミノーゲンK1ドメインのヌクレオチ
ド１〜182のコード配列は、下記のように、オ
リゴヌクレオチドPK1−１〜PK1−７から作成
された。オリゴヌクレオチドPK1−１，PK1−
２、PK1−３およびPK1−４のそれぞれ
100pmoleをそれらの5′端で燐酸化した。燐酸
化したオリゴヌクレオチドをそれぞれ
100pmoleのPK1−５，PK1−６およびPK1−
７と混合した。混合物をエタノールで沈澱さ
せ、沈澱物をH₂O中に再懸濁させ、90℃で３
分間加熱した。次に、溶液を室温で10分間放置
し、次いで氷上に置いた。冷却混合物に、10μ
の6.6mM MgCl₂含有660mM Tris−HCl、
PH7.6、10μの0.1Mジチオスレイトール、10μ
の5mM ATPおよび1000単位のＴ４ DNA
リガーゼを添加した。混合物を14℃で15時間イ
ンキユベートした。エタノールを添加し、沈澱
物を20μのTE緩衝液（10mM Tris−HCl、
1mM EDTA、PH8.0）中に懸濁させ、次いで
同量のアルカリ緩衝液（20mM NaCl、2mM
EDTA、80％ホルムアミド、0.1％キシレンシ
アノールおよび0.1％ブロモフエノールブルー）
を添加した。混合物を90℃で３分間加熱し、
8.4M尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル
上で300ボルトで１時間電気泳動した。ゲルを
臭化エチジウムで染色し、250bpのバンドを
DEAEセルロース紙への電気泳動転写により回
収した（Dretzen他、Anal.Biochem.，112：
295−298，1981）。回収したDNAを100μの
TH緩衝液中で可溶化し、該断片をPK1−ｎと
した。10μのPK1−ｎを2μの100mMナトリ
ウムカコジレート−25mM HEPES、PH7.6、
6.2μの1mMdCTP、10単位のターミナルデオ
キシヌクレオジルトランスフエラーゼおよび
5μのH₂Oと一緒にすることによりPK1−ｎ
の3′端にＣをつなげた。反応混合物を37℃で10
分間インキユベートし、次いでフエノール：ク
ロロホルム（１：１）で抽出した。 1μの3′−オリゴ（dG）テールを有する
pUC9（Pharmaciaから入手）をSmaにより
切断した。Ｇ−tailを有する線状化された該プ
ラスミドを、Ｃ−tailを有するPK1−ｎに添加
した。次に、混合物をエタノール沈澱させ、
DNAを0.5μの2MKClおよび9.5μのTE緩衝
液中に再懸濁させ、65℃で10分間インキユベー
トし、次いで室温で冷却した。冷却混合物に、
0.1M MgCl₂および0.1Mジチオスレイトールを
含有する、5μの0.2M Tris HCl、PH7.5、
20μの2.5mM dNTPs、10μの5mM ATP、
53μのH₂O、５単位のDNAポリメラーゼ
（クレノー断片）および300単位のT4 DNAリ
ガーゼを添加した（最終容量100μ）。混合物
を14℃で12時間インキユベートし、次いでE.
coli JM83をトランスフエクトするのに用い
た。 トランスフエクトされたJM83細胞を、
Wallace他の方法（Nuc.Acids Res.，９：879
−894，1981）を用いて、PK1−６でプローブ
した。20の陽性クローンを配列決定し、２つを
選択した。塩基対１−170を含む＃１−３、お
よび塩基対68−186を含む＃８−５（第１２図参
照）。 第１３図を参照するに、クローン＃１−３を
EcoRおよびFokにより消化し、kpn部
位を含む130bpの断片を回収した。同様に、ク
ローン＃８−５をFokおよびHindにより
消化し、90bpの断片を回収した。２つの断片
をEcoR、Hind消化pUC12に連結し、得ら
れたプラスミドをpPKAとした。 K1配列の残りを、オリゴヌクレオチドPK1
−９、PK1−10、PK1−11およびPK1−12を用
いて作成した。それぞれ1pmoleのオリゴヌク
レオチドを5′端で燐酸化し、いつしよにしたオ
リゴ体を40μｇのBamH、Sph消化
M13tg130RF（Amershamより入手）と混合し
た。この混合物に、66mM MgCl₂を含有する
4μの660mM Tris−HCl、PH7.6および22μ
のH₂Oを添加した。溶液を90℃で３分間加熱
し、１時間に渡つて室温まで冷却した。4μ
の0.1Mジチオスレイトール、4μの5mM
ATPおよび300単位のT4 DNAリガーゼを添
加し、混合物を14℃で12時間インキユベートし
た。得られたウアージクローン〔M13PKB
RFとする（第１４図）〕はプラスミノーゲン
K1配列のヌクレオチド183〜250を含んでいた。 完全なプラスミノーゲンK1コード配列の組
み立てを第１４図に示す。プラスミドpPKAを
MluおよびSau３Ａで消化し、176bpの断
片を回収した。M13PKB RFをSau3Aおよ
びEcoRで消化し、88bpの断片を回収した。
これらの断片をMlu、EcoR消化
M13um20RF（IBIから入手）に連結し、得られ
たプラスミドをM13um20−PK1とした。 次に、PK1コード配列をｔ−PAクリングル
１配列の代りとしてｔ−PA cDNA中に挿入し
た（第１５図および第１６図）。ｔ−PA配列を
先ず変異誘発させて、MluおよびEcoR部
位を挿入した。プラスミドpDR1496をSphお
よびXbaで消化し、アルフア因子およびｔ−
PA配列を含む2.1kbの断片を単離した。
（pDR1496で形質転換されたS.cerevisiae株E8
−11CをAmerican Type Culture Colletionに
受託番号20728のもとに寄託した。）この断片を
Sph，Xba消化M13tg130（RF）に連結し、
得られたフアージをM13tg130−Ｗとした。次
に、一本鎖フアージDNAをオリゴヌクレオチ
ド（5′GCA CGT GGC ACG CGT ATC
TAT TTC3′）とアニールし、突然変異誘発
を標準操作に従つて実施した。変異誘発された
フアージをM13tg130−PKA1とした。
M13tg130−PKAの一本鎖DNAを単離し、配
列5′CTC AGA GCA TTC CAG GAT ATC
GCA GAA CTC 3′を有するオリゴヌクレオ
チドによりワンプライマー法を用いて変異誘発
させた。一本鎖DNAを変異誘発されたフアー
ジから調製し、配列決定した。クリングル１コ
ード配列の5′端にMlu部位をおよび3′端に
EcoRV部位を含むクローンを選択し、
M13tg130−PKA2とした。 複数型DNAをM13tg130−PKA2から調製
し、BelおよびApaで消化した。Mluお
よびEcoRV部位を含む断片を回収し、第１５
図に示すようにBgl、Apa消化Zem99に連
結した。得られたプラスミドをZem99−2020と
した。 次にPK1配列をｔ−PA cDNAに挿入した。
M13um２０−PK1 RFをMluおよびEcoRV
で消化し、336bp断片を回収した。この断片を
Mlu，EcoRV−消化Zem99−2020に連結し
て、Zem99−8000（第１６図）を作成した。
Zem99−8000のｔ−PAコード配列およびコー
ドされるアミノ酸配列を第１７図に示す。 Ｂ Asn96プラスミノーゲンクリングル 96位でAsnをコードする第二のプラスミノー
ゲンK1配列を作成した（第１６図）。Zem99−
8000をBamHで消化し、Bgl部位を含む断
片を回収した。この断片をBamH切断
M13mp18に連結して、M13−8000Rを作成し
た。オリゴヌクレオチドプライマー（配列
5′TTT TTA CCA TTA CCG GTC TT
3′）を一本鎖M13−8000Rにアニールし、ワン
プライマー法のための通常の方法に従つて突然
変異誘発を行つた。クローンをスクリーニング
し、配列決定し、陽性クローンから二本鎖
DNAを調製し、M13−8000RFとした。このフ
アージをBglおよびApaで消化し、ｔ−
PA断片を単離し、Bgl、Apa切断Zem99
に連結した。得られたプラスミドをZem99−
8100とした。Zem99−8100中に存在するｔ−
PAコード配列およびコードされるアミノ酸配
列を第１８図に示す。 プラスミドZem99−8000およびZem99−8100
を、それぞれ、受託番号FERM Ｐ−9272およ
びFERM Ｐ−9315のもとにFRIに寄託した
（E.coli RRI形質転換細胞として）。 Ｃ GF改変とK1置換の組合せ 一本鎖DNAをM13−9200から単離し、オリ
ゴヌクレオチド5′GCA CGT GGC ACG
CGT ATC TAT TTC 3′を用いて変異誘発
させて、Mlu部位を導入した。変異誘発され
たフアージをM13−92.05PKA1とした。RF
DNAを変異体フアージから調製し、Bglお
よびMluで消化し、264bp断片を回収した。
Zem99−8000をMluおよびApaで消化し、
1126bp断片を回収した。これらの２つの断片
をBgl、Apa消化Zem99に連結し、得られ
たプラスミドをZem99−9280とした。このよう
に、このプラスミドは、アミノ酸84位にSerを
有する変異体ｔ−PAおよび96位にAspに有す
るプラスミノーゲンK1ドメインをコードして
いる。 アミノ酸84位にSerを有するｔ−PA類似体
および96位にAsnを有するプラスミノーゲン
K1ドメインをコードする変異体ｔ−PA配列を
含有する、第二のベクターを作成した。M13−
92.05KA1からのRF DNAをBglおよびMlu
で消化し、264bp断片を回収した。Zem99−
8100をMluおよびApaで消化し、1126bp断
片を回収した。これらの２つの断片をBgl、
Apa消化Zem99に連結し、得られたプラスミ
ドをZem99−9281とした。 プラスミドZem99−8000をSpeおよびHind
で消化し、3′変異体ｔ−PAコード配列およ
び全hGHターミネーターを含む断片をゲル精
製した。プラスミドZpL7をHindにより部分
的に消化し、Xhoにより完全に消化し、ベク
ター配列を3′t−PAコード配列およびhGHター
ミネーターから精製した。オリゴヌクレオチド
ZC1639およびZC1640（第８表）をアニールし、
得られたXho〜Spe断片（プラスミノーゲ
ンK1クリングルの5′部分をコードする）を、
連結反応において、上記２つの精製断片といつ
しよにした。得られたプラスミドを8900とし
た。GFおよびK1置換を含むｔ−PA誘導体を
コードするキメラ配列を作成するために、プラ
スミド8900をBamHおよびXhoで消化し、
GF領域をプラスミドZpL7A−Ｎの１つから単
離されたBamH〜Xho領域で置き換えた。 【表】 例 10 タンパク質の特徴付け 前述のようにしてタンパク質9100および9200を
調製し、そして対照としてトランスフエクトされ
たtk^-BHK細胞から調製した生来のｔ−PAを用
いて、活性および血漿半減期についてテストし
た。 対照として生来の組換えｔ−PAを用いて、ｔ
−PA類似体＃9100および＃9200の血餅溶解活性
をテストした。長さ３cmの絹糸をアトム（atom）
静脈カテーテル（4Fr 3.5cm）に入れ、このカテ
ーテルを注射器につないだ。血液とクエン酸ナト
リウムの3.8％溶液とを９：１の比で混合するこ
とによりヒトのクエン酸血液を調製した。このク
エン酸血液（0.5ml）を¹²⁵−フイブリノーゲン
（50μの生理食塩水中25μCi）、50μの0.25M
CaCl₂およびトロンビン（5U／10μの溶液）と
混合した。この得られる溶液16μをカテーテル
に注入し、このカテーテルを室温で60分間放置し
た。次いで絹糸をカテーテルから取り出し、生理
食塩水で洗つた。この糸に結合した放射能（最初
のフイブリン血栓値）を測定した。次いでこの糸
を体重200〜300ｇの雄SD系ラツトの頚動脈の動
脈と静脈をつなぐ分岐に入れた。１mlあたり50ユ
ニツトのヘパリンを含む生理食塩水中のこのタン
パク質のサンプル１mlを、この動物の大腿部の静
脈に注入した。２時間後、絹糸をこの分岐より取
り出し、放射能（残留フイブリン血栓値）を測定
した。残留血栓比を下式に従い決定した。 残留血栓値＝残留フイブリン血栓値／最初のフイブリ
ン血栓値×100 第１９図は、生来のｔ−PA、＃9100および
＃9200の種々の投与量を用いて得られた結果のグ
ラフである。このデータは、生体内における血餅
を溶解する能力において、変異タンパク質がｔ−
PAに匹敵することを示している。 血漿半減期をアツセイするため、タンパク質を
生理食塩水に溶解した。この溶液を、0.4mg／Kg
の投与量で雄SDラツト（体重230〜270g）の大腿
部の静脈に投与した。頚部の静脈から血液サンプ
ル（0.5ml）を採取し、3.8％クエン酸に調整し、
遠心した。サンドイツチ型酵素免疫測定法を用い
て血漿中のｔ−PAのレベルを測定した。第２０
図は投与後の時間に対する血漿レベルのプロツト
を示す。 タンパク質の血漿レベルの変化を、２区画モデ
ルにより分析した（Shargel.LおよびYu.A.B.C
編、Applied Biopharmaceutics and
Pharmacokinetics，Appleton−Century−
Crofts，New York，1980年、38〜48頁）。半減
期はクリアランスのαおよびβ相について決定さ
れた。戻つて外挿されたβ相の縦軸の切片(B)およ
びこのカーブの下の面積（AUC）も決定した。
得られた値を表９に示す。 【表】 生来のｔ−PA並びに変異タンパク質ZpL7−
Ａ，ZpL7−ＢおよびZpL7−Ｆ（第８Ａ，Ｂおよ
びＦ図に相当）をマウス中の血漿半減期について
テストした。各タンパク質のテストについて、体
重20〜21ｇの２匹の雌Ba1b／ｃマウスをエーテ
ルで麻酔し、総体積100μのPBS中のアフイニ
テイー精製されたタンパク質10μｇを尾静脈から
投与した。投与前後で注射器の重量を測定した。 適当な時間間隔で、ヘパリン処理したミクロピ
ペツトを用いて眼下より血漿サンプル（25μ）
を集めた。このサンプルを遠心し赤血球を除去
し、アツセイ用に希釈した。生来のヒトｔ−PA
に対するアフイニテイー精製されたウサギポリク
ローナル抗体を用いてELISAにより血漿のｔ−
PAレベルを測定した。 この実験の結果を第２１図に示す。３種の変異
タンパク質すべてが、生来ｔ−PAよりも明らか
に遅い速度で浄化されることがわかつた。これら
の結果は、類似体Ａの増殖因子ドメインのアミノ
酸変化、並びに類似体ＢおよびＦの第因子およ
び第因子増殖因子置換が通常の経路のよるこれ
らの分子のクリアランスを妨害する。 同様の実験において、変異タンパク質ZpL5A
（例８参照）は、7.7分の半減期を有していた。こ
れらの実験において、生来のｔ−PAの半減期は
1.5分であつた。 変異タンパク質1601および1606を、ウサギ中の
血漿半減期についてテストした。結果を第10表に
示す。 第10表 タンパク質 Ｔ−1/2(分) 生来のｔ−PA(一本鎖) 2.3±0.1 泳来のｔ−PA(二本鎖) 2.0±0.1 1601 3.2〜3.5 1606 3.2〜3.0 説明のため本発明の特定の実施態様を記載した
が、本発明の精神および範囲から離れないで種々
の改良を行つてもよい。従つて、請求の範囲によ
る以外は限定されない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、cDNAと合成オリゴヌクレオチドと
から作成されるプレープロｔ−PAコード配列、
及びコードされるタンパク質のアミノ線配列を示
す。行の上の番号はヌクレオチド位置を示し、行
の下の番号はアミノ酸位置を指す。第２図は、ベ
クタ−Zem99の作成を示す。第３図は、ベクター
Zem219bおよびZem219cの作成を示す。第４図
は、ベクターZem99−9100およびZem99−9200の
作成を示す。第５図は、Zem99−9100における変
異体DNA配列のヌクレオチド配列と、コードさ
れるｔ−PA類似体のアミノ酸配列とを示す。番
号は、アミノ酸位置を示す。第６図は、Zem99−
9200における変異体DNA配列のヌクレオチド配
列と、コードされるｔ−PA類似体のアミノ酸配
列とを示す。番号は、アミノ酸位置を示す。第７
図は、ベクターZpL5およびZpL7の作成を示す。
第８図は、ある種の増殖因子ドメイン配列置換
と、キメラドメインをコードするオリゴヌクレオ
チドの組合わせとを示す。第９図は、変更した活
性化部位を有するプラスミノーゲン活性化因子を
コード化するDNA配列を含んでなる発現ベクタ
ーのpMHシリーズの作成を示す。第１０Ａ−
図は、生来のｔ−PAのフインガードメインのア
ミノ酸配列と、コンセンサスフインガードメイン
のアミノ酸配列を示す。第１１図は、プラスミノ
ーゲンのK1ドメインのアミノ酸配列およびDNA
配列を示す。第１２図は、プラスミノーゲンK1
ドメインの部分をコードするクローン＃１−３お
よび＃８−５の部分制限地図を示す。第１３図
は、プラスミドpRKAの作成を示す。第１４図
は、プラスミノーゲンK1コード配列を含むベク
ターの作成を示す。第１５図はプラスミドZem99
−2020の作成を示す。第１６図は、プラスミド
Zem99−8000および、Zem99−8100の作成を示
す。第１７図および第１８図は、代表的なｔ−
PA類似体のcDNA配列とアミノ酸配列とを示す。
第１９図は、生来のｔ−PAと本発明の代表的な
ｔ−PA類似体についての血栓溶解分析の結果を
示す。（〓）は生来のｔ−PAを表わし、（…）は
類似体＃9100を表わし、（‐・‐）は類似体＃9200を
示す。第２０図は、ラツトに投与した生来のｔ−
PAおよび代表的なｔ−PA類似体についての時間
に対する血漿レベルのプロツトを示す。用いた記
号は、○は類似体9100であり、△は類似体9200で
あり、●は生来のｔ−PAである。第２１図は、
生来のｔ−PAと３種類の代表的な変異体ｔ−PA
の血漿半減期の検討結果を示す。第２２Ａ，Ｂお
よびＣ図は、各種の選択されたタンパク質の増殖
因子ドメインのアミノ酸配列の比較を示してい
る。配列は、次のように同定される。TPA、生
来の組織プラスミノーゲン活性化因子；Urok、
ウロキナーゼ；F7、第因子；F9、第因子；
F10、第因子；PS、プロテインＳ；PZ、プロ
テインＺ；ECF、表皮増殖因子；TGFa、形質転
換増殖因子アルフア；TGFTr、形質転換増殖因
子型Ｔ（ラツト）；C9、補体因子９；LDLr、低密
度リポタンパク質レセプター；EGEr、EGFレセ
プター；PC、プロテインＣ。その他の表示記号
は、ｈ、ヒト；ｐ、ブタ；ｍ、マウス；ｂ、ウ
シ；およびrb、ウサギである。第，，因子
およびプロテインＣ，ＳおよびＺについては、番
号と大文字は遺伝子エキソンを示す。EGFレセ
プターおよびLDLレセプターについては、それ
ぞれ番号および大文字は特定の増殖因子ドメイン
を示す。例えば、PC−4hはヒトプロテインＣ第
４エキソン増殖因子ドメインであり、LDLrBrb
は、ウサギ低密度リポタンパク質レセプターの増
殖因子ドメインＢである。ギヤツプ（−）は、タ
ンパクの間の相同性を最大にするために挿入され
ている。アミノ酸は、標準的な一文字記号で表わ
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生来の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ
   −PA）のアミノ酸配列の83番目および84番目の
   システイン残基のうち少なくても１つが、他のア
   ミノ酸残基で置換されているｔ−PA類似体。 ２ 前記83番目のシステイン残基が他のアミノ酸
   残基で置換されている請求項１記載のｔ−PA類
   似体。 ３ 前記84番目のシステイン残基が、他のアミノ
   酸残基で置換されている請求項１記載のｔ−PA
   類似体。 ４ 前記他のアミノ酸残基がセリン残基またはア
   ラニン残基である請求項１記載のｔ−PA類似体。 ５ 前記83番目のシステイン残基が、セリン残基
   で置換されている請求項１記載のｔ−PA類似体。 ６ 前記84番目のシステイン残基が、セリン残基
   で置換されている請求項１記載のｔ−PA類似体。 ７ 請求項１〜４のいずれか１つに定義されてい
   るｔ−PA類似体をコードするDNA。 ８ 請求項５に定義されているｔ−PA類似体を
   コードするDNA。 ９ 請求項６に定義されているｔ−PA類似体を
   コードするDNA。 １０ 請求項７に定義されているDNA配列を含
   有する発現ベクター。 １１ 請求項８に定義されているDNA配列を含
   有する発現ベクター。 １２ 請求項９に定義されているDNA配列を含
   有する発現ベクター。 １３ Zem99−9100またはZem99−9200である請
   求項１１または１２記載の発現ベクター。 １４ 請求項１０または１１により定義された発
   現ベクターによりトランスフエクトまた形質転換
   された宿主細胞。 １５ 請求項１２で定義した発現ベクターにより
   トランスフエクトまたは形質転換された宿主細
   胞。 １６ 細菌、酵母、真菌または動物細胞である請
   求項１５記載の宿主細胞。 １７ 請求項１〜４のいずれか１項で定義されて
   いるｔ−PA類似体をコードするDNAを含有する
   発現ベクターによつて形質転換された宿主細胞を
   培地に培養し、生じたｔ−PA類似体を培養物か
   ら採取することを特徴とする請求項１〜４のいず
   れか１項で定義されたｔ−PA類似体の製造方法。 １８ 請求項５で定義されているｔ−PA類似体
   をコードするDNAを含有する発現ベクターによ
   つて形質転換された宿主細胞を培地に培養し、生
   じたｔ−PA類似体を培養物から採取することを
   特徴とする請求項５で定義されたｔ−PA類似体
   の製造方法。 １９ 請求項６で定義されているｔ−PA類似体
   をコードするDNAを含有する発現ベクターによ
   つて形質転換された宿主細胞を培地に培養し、生
   じたｔ−PA類似体を培養物から採取することを
   特徴とする請求項６で定義されたｔ−PA類似体
   の製造方法。 ２０ 請求項１〜４のいずれか１項で定義されて
   いるｔ−PA類似体を有効成分とする、血栓溶解
   剤。 ２１ 請求項５で定義されているｔ−PA類似体
   を有効成分とする血栓溶解剤。 ２２ 請求項６で定義されているｔ−PA類似体
   を有効成分とする血栓溶解剤。