JPH0449659B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原の特性を示す微生物の細胞蛋白質
の単離、更に特に蛋白質がすべてのトラコーマク
ラミジア血清形に共通な抗原の特性を示すトラコ
ーマクラミジアの主外側膜蛋白質の単離に関する
ものである。 本発明はザ・ナシヨナール・インスチチユー
ツ・オブ・ヘルスの許可を得る過程または許可の
下でなされた。 トラコーマクラミジアはクラミジアセアエ
（Chlamydiaceae）属、クラミジアレス目の２つ
の微生物種の１つである。他の種はオウム病クラ
ミジアである。そのある15の異なる菌株における
トラコーマクラミジアはトラコーマ、包入体性結
膜炎、性病性リンパ肉芽腫、非淋疾性尿道炎およ
び直腸肛門炎を含む多くの人間の眼病および生殖
器病に対する病因物である。トラコーマクラミジ
ア感染は一般の住民全体に亘り広がる。例えばト
ラコーマクラミジアは年当り数百万の非淋疾性尿
道炎の原因となつていると考えられてきた。 トラコーマクラミジアが介在した病気は広がる
ので、有機体の存在に対する信頼しうる簡単な費
用のかからない試験が、適当な治療が行われるよ
うに著しく望まれておりまた極めて重要である。
現在使用されている唯一の血清学的試験はミクロ
免疫蛍光法試験である。然しこの試験はトラコー
マクラミジアの菌株を血清学試験抗原として使用
することを必要とする。更に、この試験を行うた
めの設備は全世界で極く限られた数の実験室にお
いてのみ利用できる。試験は著しく労力がかか
り、時間を消費し、行うのが困難である。 最近米国特許第4118469号明細書には性病性リ
ンパ肉芽種および非淋疾性尿道炎の血清学的試験
に有用なトラコーマクラミジアの抗原の調製が記
載されている。かかる抗原は、アガロースゲルカ
ラムで共有結合した特定のリガンドとして特定の
抗血清を用い免疫吸着クロマトグラフイーにより
トラコーマクラミジア微生物から精製された。こ
の抗原は約160000ダルトンの分子量を有し、向流
免疫電気泳動法試験で性病性リンパ肉芽種の患者
の血清から抗体を検出することができた。然し非
淋疾性尿道炎の患者の血清を用いる同様の試験で
利用する場合にはこの抗原では抗体を検出できな
かつた。然し２次元の免疫電気泳動法試験におい
て抗体を検出することに成功した。 然しすべての場合に、好ましくは普通実施され
ている抗原−抗体分析法によりトラコーマクラミ
ジアの検出ができるとトラコーマクラミジアの種
特異性抗原の単離に医学的に尚極めて関心があ
る。 本発明はトラコーマクラミジアの主外側膜蛋白
質からなる種特異性抗原を表わす。かかる蛋白質
はトラコーマクラミジアの全体の関連する外側膜
蛋白質の約60％を含み、38000〜44000ダルトのサ
ブユニツト分子量で、39500ダルトの平均分子量
を有す。以下簡単にするためこの主外側膜蛋白質
群をMP39.5として表わし、これは「39500ダルト
ンの平均サブユニツト分子量を有する主外側膜蛋
白質」を意味する。 すべての血清形から誘導されるトラコーマクラ
ミジア抗体に対する試験を行う場合、MP39.5は
種特異性をもつて反応する。即ちMP39.5はトラ
コーマクラミジア種特異性抗原である。MP39.5
はトラコーマクラミジア血清形に共通の独特な蛋
白質であり、抗原としてすべてのトラコーマクラ
ミジア血清形のものの同定の基礎を与える。 MP39.5はトラコーマクラミジア基本小体、即
ち無傷微生物細胞から、先ず有機体の適当な菌株
を生長させ、生長媒質を含まない基本小体を集め
ることにより単離される。精製した基本小体を後
述する手段により処理して外側細胞膜から単離す
る。これ等の外側細胞膜を、細胞形質膜および原
形質から選択的に分離する。次いで単離した外側
細胞膜を後述する方法で更に収納してほぼ純粋の
MP39.5を得る。 次いで外側膜から回収したMP39.5を利用して
１）トラコーマクラミジアに感染した宿主の血清
中に生ずるトラコーマクラミジア抗体と直接反応
させるかまたは２）実験室の動物に注射して
MP39.5に対する抗血清を生成する。このように
して回収したMP39.5は、トラコーマクラミジア
に対する免疫反応診断学の分析法において利用す
ることができる。 従つて本発明の目的はトラコーマクラミジアの
主外側膜蛋白質（MP39.5）を提供せんとするに
ある。 本発明の他の目的はトラコーマクラミジア種特
異性抗原を提供せんとするにある。 尚本発明の他の目的はトラコーマクラミジア主
外側膜蛋白質を単離する方法を提供せんとするに
ある。 尚本発明の他の目的はクラミジアの感染を分析
するのに適する抗原を得んとするにある。 MP39.5はトラコーマクラミジアの主外側膜蛋
白質であり、すべてのトラコーマクラミジア血清
形に対する種特異性抗原である。 MP39.5はトラコーマクラミジア基本小体から
主として２工程の抽出処理により単離される。第
１工程において、精製した基本小体を温和なアニ
オンサルコシン洗浄剤、好ましくはｎ−ラウロイ
ルサルコシンナトリウム（普通サルコシルと称さ
れる）の水溶液と接触させる。サルコシルは蛋白
質、核酸および関連する他の分子構造体を含む基
本小体細胞形質を選択的に溶解し、基本小体外側
膜を不溶性残留物として残す。 電子顕微鏡の研究によるとサルコシル処理によ
り、負のクラミジア基本小体外側膜の大きさおよ
び形態学の特性を有する単一の無傷二重トラツク
単位膜の均一粒子から成る不溶性残留物が残るこ
とが分る。 第２処理工程において、残留する基本小体を、
主外側膜蛋白質、MP39.5を可溶化する強アニオ
ン洗浄剤、好ましくはドデシル硫酸ナリトリウム
で溶解する。次いでMP39.5を洗浄剤溶液から回
収し、精製してMP39.5抗原を得る。 精製したMP39.5蛋白質は、既知のトラコーマ
クラミジア血清形から誘導された抗体に対して試
験する場合には、MP39.5がクラミジア有機体の
種特異性抗原であることを示す。 トラコーマクラミジアとしてのMP39.5の特異
性および全体の詳細な単離方法は以下の処理方法
および試験により理解される。 トラコーマクラミジア有機体の生長および精
製。−次のトラコーマクラミジア菌株を用いた：
L2／434／Bu（L2），Ｅ／UW−５／Cx（Ｅ）およ
びＣ／TW−３／OT（Ｃ）。クラミジアを
HeLa229細胞中で、「アンチゲン・アナリシス・
オブ・クラミジアエ・バイ・ツーデイメンシヨナ
ル・イミユノエレクトロホレシス」を題する「ジ
ヤーナル・オブ・イミユノロジイ」1975年10月第
15巻、第963〜968頁に記載してあるように、生長
させた。またL2菌株をＬ−929細胞の懸濁培養で
生長させた。Ｌ細胞で繁殖させたL2有機体を
39500ダルトン蛋白質の単離、精製に使用した。 クラミジアを150cm²のポリスチレン培養フラス
コ（コーニング・クラス・ウワークス製、ニユー
ヨーク、コーニング）中で生長させたHeLa細胞
単層から得、90％の細胞が接種後48時間で封入体
を含有した。媒質を流し出し、４mmのガラスビー
ズおよび10mlのハンクスのバランスのとれた冷塩
溶液を用いて除去した。これ当の細胞懸濁液をプ
ールし、細胞をソニケーシヨン（sonication）
（ブラウンソニツク・モデル1510）により破裂さ
せた。この懸濁液を500×ｇで４℃で15分間遠心
機にかけた。上澄み液は、0.15MのNaClを含有
する0.01MのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−N′−２−エチンスルホン酸中の35％ゲノグ
ラフイン溶液（ｖ／ｖ）（ジアトリゾエートメグ
ルミンおよびジアトリゼートナトリウム、注射用
76％、スクイブ・アンド・ソンズ（Squibb and
Sons）ニユーヨーク）８ml上に層をなした。次
いでこれ等の上澄液をSW27ローター（ベツクマ
ン・インストリユーメンツ社、フラートンCa）
で４℃で１時間43000×ｇで遠心機にかけた。ペ
レツトを0.25Mのスクロースと5mMのＬ−グル
タミン酸（SPG）を含有する0.01Mのリン酸ナト
リウム（PH7.2）中に再懸濁し、プールし、不連
続のレノグラフイン勾配（レニグラフイン40％13
ml、44％８ml、52％５ml、ｖ／ｖ）上に層をなし
た。これ等の勾配をSW27ローターで４℃で１時
間43000×ｇで遠心機にかけた。 44／52％レノグラフイン界面に位置するクラミ
ジア基本小体帯状物を集め、３容量のSPGで稀
釈し、次いで3000×ｇで30分間遠心分離機にかけ
た。基本小体ペレツトをSPG中で洗浄して残留
するレノグラフインを除去した。精製した基本小
体をSPGに再懸濁し、−80℃で貯蔵した。基本小
体調剤の純度を電子顕微鏡およびマツキヤヴエロ
染色塗布標本により測定した。 クラミジア外側膜複合体（COMC）の無傷基
本小体のサルコシル抽出による単離−上記のよう
にして集めたトラコーマクラミジアL2基本小体
を0.01Mのリン酸ナトリウムおよび0.15MのNaCl
を含みPH8.0で、また２％のサルコシルおよび
1.5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を
含有するリン酸緩衝溶液（PSB）５ml中に懸濁
させた（約５mgの蛋白質／ml）。この懸濁液を37
℃で１時間培養し、次いで100000×ｇで１時間遠
心機にかけた。不溶性ペレツトを同じサルコシル
緩衝液中に再懸濁し、前述の如く遠心機にかけ
た。ペレツトをPBS中で２回洗浄して過剰の洗
浄剤を除去し、19mMのMgCl₂および25ｇ／mlの
デオキシリボ核酸酵素（ウワーシントン・バイオ
ケミカル社、ニユーヨーク州、フリーホルド）と
リボ核酸酵素（ミリポール社、ニユーヨーク州、
フリーホルド）を含有するPH8.0の0.02Mのリン
酸ナトリウム中に再懸濁した。次いでこの懸濁液
を37℃で２時間培養し、遠心機にかけ、不溶性ペ
レツトをPBSで２回洗浄してすべての残留する
ヌクレアーゼを除去した。このサルコシル不溶性
物質はクラミジア外側膜複合体より成るものであ
つた。 39500ダルトン外側膜蛋白質の精製−前記操作
で25〜30mgのL2EB蛋白質から調製し単離した
COMCを２％ドデシル硫酸ナトリウム緩衝液５
mlに懸濁し、37℃で１時間培養した。この懸濁液
を100000×ｇで１時間遠心機にかけ、可溶性上澄
み部分を集めた。 39500ダルトン蛋白質に富んだこのドデシル硫
酸ナトリウム抽出物を、1mMのジチオスレイト
ール（DTT）と0.1％のドデシル硫酸ナトリウム
を含有するPH6.4の0.01Mのリン酸ナトリウム
（カラム平衡緩衝液）200mlに対して透析液を数回
変えて24時間透析した。この抽出物を「ジヤーナ
ル・オブ・ジイオロジカル・ケミストリー」1972
年、第247巻、第5194〜5198ページにおいてモス
およびローゼンブルームにより披瀝された技術を
使用しドデシル硫酸ナトリウムの存在下でヒドロ
キシルアパタイトにより分別した。 簡単に言うと、透析した抽出物（８〜10ml）を
予め平衡にしたヒドロキシルアパタイトカラム
（0.9×30cm）に適用した。カラムを100mlの平衡
緩衝液で洗浄し、1mMのDTTと0.1％のドデシ
ル硫酸ナトリウムを含有するPH6.4の0.1Mリン酸
ナトリウムの150ml線形勾配を用いて溶離した。
カラム溶離液を５〜６ml／時の流速で40滴部分で
集め、280mm吸光度で分光光度計で調べた。正の
吸光度を示すこれ等の部分をドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
析した。 ポリアクリルアミドゲルを蛋白質用のコマシー
ブルおよびステインズ−オールで染色して核酸お
よび糖脂質部分を検出した。1/10カラム部分毎の
リン酸塩を、すべてのリンを測定しリン酸塩部分
に転換し既知標準リン酸ナトリウムを用いてつく
つた標準曲線を用いることにより、測定した。
MP39.5だけを含有した部分をプールし、0.15M
のNaClと0.1％のドデシル硫酸ナトリウムを含有
する0.05mMのトリス−HClに対し真空透析によ
り１〜２mlに濃縮した。これ等の濃縮した調剤を
用いて分析を行い蛋白質の純度を調べ、イミユノ
ジエンのもととし実験室動物における坑血清をつ
くつた。 上記操作における洗浄剤の抽出温度および時間
を前記のものと変えることができる。更に高い温
度、例えば45℃、60℃、80℃または100℃で抽出
することは完全に可能である。抽出温度が高くな
るほど、抽出時間を短くすることができる。特定
の洗浄剤に可溶性である殆んどすべての基本小体
成分を可溶化するには100℃で10分間の抽出で十
分である。然し一般に時間が問題でない場合に
は、比較的低い温度、例えば37℃で抽出して所望
蛋白質を変質する機会をすべて防止することが望
ましい。 精製したCOMC蛋白質の分子量をポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動により測定した。特にク
ラミジア蛋白質を「ネーチヤー」（ロンドン）第
227巻、第680〜685頁（1970）にレムリイにより
記載されている不連続のトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−グリシン（トリスグリシン）
系において12.5％アリクルアミドの粘着性ゲル上
で電気泳動した。アクリルアミド対Ｎ，N′−メ
チレンビスアクリルアミドの比は12.5％分離ゲル
および５％粘着ゲルの両者で30：0.8であつた。
電気泳動前試料を、2.5％のドデシル硫酸ナトリ
ウム（BDHケミカルス社）、５％２−メルカプト
エタノール、20％グリセロールおよび0.0001％の
ブロモフエノールブルーを含有する等容量の可溶
化溶液（0.1MのトリスHCl、PH6.8）と混合し、
10分間沸騰させた。0.1％のドデシル硫酸ナトリ
ウムを含有するトリス−グリシン緩衝液中の電気
泳動を25mAの一定電流で行つた。ゲルを７％酢
酸と30％メタノール中に0.25％のコマシーブリリ
アントブルーＲ−250を溶解した溶液で染色した。
クラミジア蛋白質の分子量を評価するため使用し
た標準蛋白質は、ホスホリラーゼｂ（94000）、牛
の血清アルブミン（67000）、オバルブミン
（43000）、炭酸脱水酵素（30000）、大豆トリプシ
ン防止剤（20100）およびα−ラクトアルブミン
（14400）（フアーマシア・インコーポレーテツド、
ニユージヤージー州ピスケータウエイ）であつ
た。 １つの実験において、前記操作を行つた後、濃
縮後精製したMP39.5蛋白質約1.4mgを回収した。
回収量は一層容易に培養できる微生物からの外側
膜蛋白質の回収に比較して小さかつたが、僅か25
〜30mgの基本小体蛋白質を出発物質として使用し
たことを考えると、収率は全く例外的であつた。 抗血清の調製−スイスウエブスターマウス菌株
ICR（チヤールス・リバー・コンパニー、メリー
ランド州バーテイモア）に30μｇの精製した
MP39.5をフロインドの不完全補助薬で乳化した
乳剤を０日に皮下に投与して免疫にした。同量の
精製した蛋白質を16日および27日に補助薬を用い
ることなく皮下に投与して免疫化を繰返した。各
免疫化後５日（夫々21日および32日）に心臓穿刺
によりマウスから採血した。各採血で集めプール
した血清の反応性および特異性を蛍光坑体間接法
により評価した。 次の第１表はマウスに生じた抗血清を用いた
種々のクラミジア血清形の基本小体（トラコーマ
クラミジアおよびオウム病クラミジア）に対する
試験の結果を示す。

【表】

【表】 マウスにおける抗血清の製造につき記載したと
同様の方法で、ラツトに夫々精製したMP39.5蛋
白質300μｇを接種した。この蛋白質を筋肉内に
注射し、次いで適当な時間MP39.5抗体を誘発さ
せた後採血した。次いでプールしたラツトの血清
を用いて種々のクラミジア基本小体血清形のすべ
てに対する反応を評価した。これ等の試験の結果
を次の第２表に示す。

【表】 ラミジ
ア Ba 8192
C 64

【表】 結膜炎
ラツトの抗−MP39.5（L2抗血清）を連続２倍
に稀釈し各クラミジア血清形の基本小体と反応さ
せることにより蛍光を測定した。抗−MP39.5は
各トラコーマクラミジア血清形と反応するが、オ
ウム病クラミジア菌株とは反応しない。これ等の
結果はMP39.5がトラコーマクラミジア種特異性
抗原であることを示す。 他のトラコーマクラミジア血清形例えばＨから
つくつたMP39.5蛋白質を用いて実験室の動物に
抗血清を生ぜしめ、生成した抗血清をすべてのト
ラコーマクラミジア血清形の基本小体と反応させ
た場合、前記第２表に示した結果と同様の正の結
果が得られた。 然しいかなる場合にも、MP39.5抗原はすべて
のトラコーマクラミジア血清形に対し種特異性を
有する。 上述の如くMP39.5抗原に対する特定の抗体は
マウスおよび／またはラツトのような実験室の動
物を用い適当な接種法により得ることができる。
動物の発生した抗体を他の動物におけるクラミジ
ア感染の分析に用いることができる。これ等の分
析は感染した対象におけるバクテリア抗原の存在
を分析するためよく知られている方法で行うこと
ができる。特定抗体の供給がMP39.5抗原を接種
した実験室動物から確保された際直接または間接
分析を、潜伏するクラミジア感染と考えられる哺
乳動物から確保された試料を用いて行うことがで
きる。 酵素結合した免疫吸収分析（ELISA）または
放射線免疫分析（RIA）の如き分析法がこれ等の
目的に適する。 直接分析法においてMP39.5蛋白質に対する特
定の抗体は固相の支持体系に共有結合または非共
有結合させることができる。これ等の技術では普
通であるように、支持体系はガラス、プラスチツ
ク等とすることができる。MP39.5に対する特定
抗体の結合した固相支持体をクラミジアの感染し
たと考えられるものから予め確保した試料を用い
て培養することができる。接種する前試料を洗浄
剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムまたは他のア
ニオン、ノニオン若しくはカチオン洗浄剤で処理
して任意のクラミジア微生物からMP39.5外側膜
抗原を抽出する。固相支持体を用いて培養される
のはこの抽出した試料である。 既知方法により予め放射性標識したがまたは酵
素と共役結合したMP39.5抗原に対する特定の抗
体と支持体系に対して平衡させる。支持体上の抗
体に結合した試料中に存在する任意のMP39.5抗
原を、次いで放射性標識した抗体または酵素と結
合した抗体に結合する。 放射性標識をした抗体を使用する場合には、試
料中の残留放射能の量を測定することができる。
この血をクラミジアMP39.5抗原を含まないこと
が決定された試料と比較する。酵素と結合した抗
体を使用する場合には、酵素に対し特定の代替物
を固体の支持体反応混合物に添加し、得られた色
の変化を分光光度計で記録する。この色の変化を
クラミジアMP39.5抗原を含まないことが知られ
ている試料と比較する。 このようにして哺乳動物の試料における
MP39.5抗原の存在を直接分析することができる。 或いはまた間接分析法を使用することができ
る。特に前記操作における如くして確保したクラ
ミジア（MP39.5）抗原を適当な固相支持体系に
共役または非共役結合することができる。クラミ
ジア感染したと考えられるものからの試料を洗浄
剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムで処理して存
在し得る任意のトラコーマクラミジアから主外側
膜蛋白質を抽出する。 次いで試料からの抽出物を実験室の動物源から
予め確保したMP39.5抗原に対し放射性標識をし
たかまたは酵素と結合した既知量の抗体と混合す
ることができる。試料抽出物−抗体混合物を固体
支持体系およびその結合したMP39.5抗原を用い
て培養する。 固体支持体系の放射能を測定するかまたは酵素
と結合した系における発色を測定し、クラミジア
抗原を含まない標準として同様に処理した試料と
比較する。 放射性標識をしたかまたは酵素と結合した抗体
の固体支持体に結合したMP39.5抗原に対する能
力を抑制する、トラコーマクラミジアを含有する
と考えられる臨床試料の能力が臨床試料における
MP39.5抗原の存在または不存在を表わす。何等
かの抑制が表われたことはトラコーマクラミジア
感染の存在を示す。 他の適当な分析方法および改良はかかる分析技
術における技術者に明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 約３，8000〜44，000ダルトンの範囲の分子
   量を有するトラコーマクラミジアの主外側膜蛋白
   質であるトラコーマクラミジアの種特異性抗原。 ２ 抗原が約39，500ダルトンの平均分子量を有
   する特許請求の範囲第１項記載の種特異性抗原。 ３ トラコーマクラミジアの種特異性抗原を製造
   するに当り、トラコーマクラミジア微生物の外側
   細胞膜物質を残余の細胞内容物から分離し、次い
   で上記分離した外側細胞物質を強力なアニオン洗
   浄剤と接触させて蛋白質抗原を可溶化し、然る後
   蛋白質抗原を洗浄剤溶液から回収し、蛋白質抗原
   を精製することを特徴とする約38，000〜44，000
   ダルトンの範囲の分子量を有するトラコーマクラ
   ミジアの種特異性抗原の製造方法。 ４ 蛋白質抗原が約39，500ダルトンの平均分子
   量を有する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 残余の細胞内容物を、トラコーマクラミジア
   の基本小体を外側細胞膜が実質的に不溶性である
   温和なアニオン洗浄剤と接触させることにより可
   溶化する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 温和なアニオン洗浄剤がサルコシン洗浄剤で
   ある特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ サルコシン洗浄剤がＮ−ラウロイルサルコシ
   ンナトリウムである特許請求の範囲第６項記載の
   方法。 ８ 分離した外側細胞膜を洗浄剤のアルキル硫酸
   の塩と接触させて蛋白質抗原を可溶化する特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ９ 洗浄剤のアルキル硫酸の塩がドデシル硫酸ナ
   トリウムである特許請求の範囲第８項記載の方
   法。 １０ 可溶化した蛋白質抗原をヒドロキシアパタ
   イトクロマトグラフイーにより精製する特許請求
   の範囲第８項記載の方法。