JPH0449911B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 検出可能種を含有し且つ検体の濃度の関数と
して前記検体により実質的に非拡散性となるよう
に適している拡散可能な試薬の所定量を保持する
反応層；拡散してくる試薬を受容するのに適した
レジストレーシヨン層；前記拡散可能な試薬が浸
透し得る、前記反応層と前記レジストレーシヨン
層との間の絶縁層を含み、 しかも前記拡散可能な試薬は測定されるべき検
体と反応性である量より過剰な量で存在し、 前記絶縁層は反応層に保持された検出可能種の
検出を防止することを特徴とする検体を含有する
液体の分析用多層要素。 ２ 分析されるべき液体を受容するための試料ス
プレツド層を含む、特許請求の範囲第１項の要
素。 ３ 前記スプレツド層が等方性非繊維状延展層で
ある特許請求の範囲第２項の要素。 ４ 前記スプレツド層が繊維状である特許請求の
範囲第２項の要素。 ５ 前記検出可能種が螢光物質である特許請求の
範囲第１項の要素。 ６ 前記検出可能種が放射性物質である特許請求
の範囲第１項の要素。 ７ 前記絶縁層が前記検出可能種からの放射線に
対して不透過性である特許請求の範囲第１項の要
素。 ８ 前記液体が抗原（抗体）を含有しそして前記
反応層が検出可能種を結合して有する拡散可能な
抗体（抗原）を含有する特許請求の範囲第１項の
要素。 ９ 前記スプレツド層が布帛である特許請求の範
囲第２項の要素。 １０ 前記反応層がアガロースを含む特許請求の
範囲第２項の要素。 １１ 前記絶縁層が二酸化チタンを含む特許請求
の範囲第１項の要素。 １２ 前記レジストレーシヨン層がアガロースを
含む特許請求の範囲第１項の要素。 １３ 前記レジストレーシヨン層が重合体エマル
ジヨンを含む特許請求の範囲第１項の要素。 １４ 前記各層を担持する放射線透過性基材を含
む特許請求の範囲第１項の要素。 １５ 前記基材がポリスチレンである特許請求の
範囲第１４項の要素。 １６ 検出可能種を含有する拡散可能試薬の所定
量を含有する反応層およびレジストレーシヨン層
を包含する多数の層を含む要素に、検体含有液体
を加えそして前記レジストレーシヨン層に拡散し
てくる試薬の量を測定することを包含し、 しかも前記拡散可能試薬は測定されるべき検体
と反応性である量より過剰の量で存在しそして前
記検体の濃度の関数として前記検体により非拡散
性とされるものであり 前記レジストレーシヨン層はそれに拡散してく
る試薬を受容するのに適していることを特徴とす
る、液体中の検体を分析する方法。 発明の背景 液体、特に生物液体中の物質の化学分析に多数
の装置が知られている。ある型の装置には、高価
な装置、高度に訓練された操作者および大容量の
分析試料が必要である。 他の型の装置は、高価な装置なしに、単一試験
を一度に実施する比較的簡単な携帯用多層要素で
ある。 1973年３月23日に特許された米国特許第
3723064号明細書は、試験物質との反応用化学試
薬をもつて含浸され、試験流体に対する異なつた
透過性の第１領域および第２領域を有する透過可
能部材を含む層を含む層状試験装置に向けられて
いる。透過層は、透過可能部材に隣接して配置さ
れて、化学試薬と試験物質の反応から生じた反応
生成物を通して、前記反応生成物と反応して、供
試物質の存在および濃度を示す可視反応を生じる
ように適した化学薬品をもつて含浸された指示薬
層である次層に引き出すのを助ける。 1976年11月16日に特許された米国特許第
3992158号明細書には、スプレツド層および試薬
層を含む一体化分析要素が開示されている。スプ
レツド層は、それ自体の中に適用された液体試料
の少なくとも１成分を拡げて均一な濃度を得、こ
の濃度は次いで反応して検出可能種を形成し得る
隣接試薬層に移行する等方性非繊維状多孔層であ
る。 1977年８月16日に特許された米国特許第
4042335号明細書は、生化学液体および生物液体
のような液体の分析用多層要素を志向している。
この要素は、分析される物質と相互作用性で拡散
性、検出可能種を与える組成物を含む試薬層およ
び検出可能種が透過性のレジストレーシヨン層を
含み、このレジストレーシヨン層内でこのような
種を検出できる。また、この要素はスプレツド層
および放射線阻止層を含み、検出可能種の検出を
増進し得る。 1977年９月27日に特許された米国特許第
4050898号明細書はスプレツド層が、スプレツド
層の輸送を規格化する非イオン界面活性剤を含む
非繊維状等方性多孔性スプレツド層である、少な
くとも２層の重ね合わされた層のスプレツド層お
よび試薬層を含む。 1976年１月３日に特許された米国特許第
4066403号明細書は、検体と反応して分解生成物
を生成する第１試薬および前記分解生成物と反応
して、検出可能変化を生成するに適した第２試薬
を含み、妨害物質が実質的に不透過性の、前記分
解生成物に対する障壁が第１試薬と第２試薬の間
に配置された複合流体の分析用一体化分析要素ら
向けられている。 1978年１月17日に特許された米国特許第
4069016号明細書は、水性液体試料をビリルビン
をもまた結合できるキヤリヤーに結合された拡散
性のビリルビン置換可能の検出可能配位子と接触
させ、次いでこのように置換された検出可能配位
子を検出することを特徴とする、水性液体試料中
のビリルビンの定量方法に向けられている。 1979年３月13日に特許された米国特許第
4144306号明細書は、試薬層が非拡散性物質に結
合された予備成形された検出可能部分を有する非
拡散性物質を含む相互作用組成物を含有し、この
組成物は検体を含有する液体の存在下に検体によ
る置換によつて予備成形された検出可能部分を含
む、拡散性生成物を与える、少なくとも試薬層お
よびレジストレーシヨン層を含む多層分析要素を
用いる置換／放出方法を志向している。レジスト
レーシヨン層は拡散性生成物を受容する。支持
体、スプレツド層、放射線阻止層などを初め他層
をも使用できる。前記相互作用組成物の例とし
て、検体がレジストレーシヨン層に移行する標識
部材を置換する標識抗原−抗体複合体が挙げられ
る。 1979年８月28日付特許された米国特許第
4166093号明細書は、検体と相互作用可能で放射
分析的に検出可能種を与える組成物を含有する放
射線透過性試薬層、検体透過性多孔性放射線阻止
層および試薬層と放射線阻止層の間に介在された
放射線透過性検出可能種移行阻害層を含み、前記
検出可能種移行阻害層は、前記検体透過可能であ
り、しかも前記要素が分析中の液体と接触した時
に前記放射分析的に検出可能種の前記多孔性放射
線阻止層への移行を阻害する、液体分析用要素に
向けられている。 1981年３月24日に特許された米国特許第
4258001号明細書は、熱安定性、非膨潤性有機重
合体粒子および接着剤を含む、粒状構造を有する
帯域を含む拮抗免疫検定用多層要素に向けられて
いる。蛍光標識抗原のような免疫試薬は、粒子に
結合できる。例50においては、抗体がスプレツ
ド／試薬帯域分散液において固定され、しかも標
識抗原が試験要素に適用する前に予備混合される
拮抗免疫検定要素が記載されている。また、標識
抗原は要素中に混入できると記載されている。し
かしながら、標識抗原が要素に混入されている場
合、要素中にあつて標識抗原と抗体の早期結合を
避ける固定された抗体から標識抗原を離して維持
するように留意しなければならないと記載されて
いる（第30欄第２行〜第７行）。 D.M.Weirによりイムノケミストリー
（Immunochemistry）第３版、ブラツクウエル・
サイエンテイフイツク・パブリケーシヨン
（Blackwell Scientific Publication）、英国、オ
ツクスフオード所在、第１巻、第19章には、抗原
を含有する検体を抗体を含有するコロイド層の中
心に入れる半径方向定量免疫沈殿技術が記載され
ている。抗原が中心から放射する距離を測定し
て、検体中の抗原の定量を与える。 1981年10月15日付で出願されたヨーロツパ特許
出願第0051183号明細書には、抗原（または抗体）
が固定された多孔性媒質層および多孔性媒質層中
の免疫沈殿に関与しなかつた物質が拡散し得る層
を含み、その後、検出手段を用いて前記物質の量
を求めることのできる多層分析要素が開示されて
いる。運転中は分析される抗原（または抗体）は
標識され、次いで多孔性媒質層に適用される。標
識抗原（または抗体）は固定された抗原（または
抗体）と反応して複合体を形成する。過剰の未反
応抗原（または抗体）は複合体から本質的に分離
され、次いで試薬層に拡散する。未反応標識抗原
（または抗体）を、光学的に測定して定量を与え
る。本特許出願明細書は、ゲル中介沈殿反応の定
量的性質を示す。 本発明の要約 検出可能種を含有し、検体の濃度の関数として
前記検体により実質的に非拡散性となるように適
した拡散可能試薬の所定量を含有する反応層；下
記レジストレーシヨン層に拡散してくる試薬を受
容するように適したレジストレーシヨン層；前記
レジストレーシヨン層中の前記試薬を検出する手
段；および前記試薬層と前記レジストレーシヨン
層との検出可能種間の識別を与えるに適した前記
反応層と前記レジストレーシヨン層との間の絶縁
層；を含むことを特徴とする、検体を含有する液
体の分析用多層要素。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の好ましい多層要素の略断面
図であり、 第２図は、検体との接触前の要素の成分の若干
の位置を示す第１図の要素の略断面図であり、 第３図は、検体との接触後の要素の成分の若干
の位置を示す第２図の要素の略断面図である。 発明の詳細な記載 本発明は、検体と反応するように適した分析要
素の一層に所定濃度の試薬を含む分析技術を意図
している。すなわち、検体は、検体の量に関連し
て、通常は拡散可能のある量の試薬と反応し、次
いでその量を不動化する。また検出可能種をも含
有する未反応試薬はレジストレーシヨン層に拡散
し、そのレジストレーシヨン層では適当な検出手
段を用いて検出可能種によつてレジストレーシヨ
ン層の試薬の量を確認する。好ましくは、検出可
能種の検出をレジストレーシヨン層に拡散したも
のに限定するために、反応層とレジストレーシヨ
ン層との間に絶縁層が使用される。 本発明は、検出可能種を有する第２の拡散可能
物質と反応して、前記第２の物質を固定でる実質
的に任意の物質の分析用に適しているが、本発明
は、免疫沈殿技術を用いる用途に特に適してい
る。簡略化のために、本発明を免疫沈殿について
記載する。 分析技術は、不均質法または均質法として分類
できる。不均質法には、遊離および結合反応体の
物理的分離が必要であるが、一層敏感であると考
えられる。均質法は、その操作が容易かつ簡単の
ために好ましいが、結合種および遊離種の間の不
完全な識別によつて生じる高いバツクグラウンド
水準の不利をまねく。均質法においては、物理的
分離は、起こらないが、むしろキヤリヤーの複合
体形成の状態に基づく反応体標識の１つの変調が
起こる。感度の低下した水準は、少なくとも１部
分は不完全識別に起因する。 本発明は、一体化一工程形式の不均質免疫沈殿
技術を用い、従つて薄膜フオーマツトの不均質技
術の感度を有しながら均質技術の操作の簡単さを
得る。 本発明の新規な要素および操作は、単一工程で
および予め形成された薄膜形態で免疫沈殿技術を
用いて、結合および未結合種の分離を行い、しか
も検出は検出可能標識抗体の示差拡散によつて行
われ、それによつて、追加抗原種との競合反応が
避けられる。したがつて、本発明により、免疫複
合体を生成する任意の物質は、免疫複合体を生成
するもの以外の反応体を使用することなしに分析
できる。 本明細書において用いる「免疫複合体」の用語
は、免疫グロビンとハプテン性または多価抗原お
よび不均質またはモノクローン抗体を包含する可
溶性または不溶性の何れかの、抗体過剰から抗原
過剰までの任意の割合の、前記免疫グロビンを組
み合わせた配位子との凝集体を表わすように意図
されている。 操作中、検体を含有する試料液体の所定量、予
め形成された薄膜（ここでは拡散可能抗体がこの
抗体に結合された検出可能種を含有する）に配置
された拡散可能抗体の測定された量と接触され
る。抗原検体は、抗体と会合して、試料液体中の
抗原の濃度に定量的に比例して、未複合体形成抗
体よりも実質的に少なく拡散可能の複合体種を形
成する。複合体化抗体および未複合体化抗体の分
離は、抗原と複合体を形成するに必要なものより
過剰の未複合体化抗体の拡散率の差により起こ
る。未複合体化抗体の量の測定は、最初に抗体が
配置された層から拡散して出て、好ましくは、レ
ジストレーシヨン層（ここで抗体が不動化によつ
て濃縮されて、要素中の抗体のどのような逆拡散
または遊走をも防止する）に拡散する抗体の量を
測定することによつて行われる。測定は、抗体−
抗原複合体種の量、従つて試料液体中の抗原検体
の濃度を示すレジストレーシヨン層中の検出可能
種の量を測定する操作によつて行われる。 本発明は、拡散可能抗体に結合している検出可
能種を有する拡散可能抗体を用いる、抗原の分析
について主として記載されているが、免疫沈殿技
術が用いられているので、拡散可能抗原に結合さ
れている検出可能種を有する拡散可能抗原を用い
るために抗体が分析されることができると理解さ
れたい。簡略化のために、本発明は検体としての
抗原の点から記載されているが、本発明は両操作
を包含すると理解されたい。 下記の例は、薄膜免疫沈殿の原理を具体的に説
明する。 例 １ ３ミル ポリスチレン基材［ダウ・ケミカル・
カンパニー、ミシガン州ミツドランド所在によつ
て商標トライサイト（TRYCITE）の下に販売］
上に下記の材料を塗布した。10mg／ft²商標免疫
グロブリン（アトランチツク・アンテイボデイー
ズ・インコーポレーテツド、メイン州スカーバロ
ウ所在、販売のFITC−抗ヒトアルブミン）、
1000mg／ft²アガロース［エフ・エム・シー・マ
リーン・コロイズ、メイン州ロツクランド所在販
売のシーケム（SEAKEM）LE］および0.1mg／
ft²界面活性剤［オリーン・ケミカルコーポレー
シヨン、コネチカツト州スタンフオード所在によ
り商品名オリーン（OLIN）10Gの下に販売され
ているｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール］。
このように被覆された基材を乾燥し、次いで10cm
×１cmの細片に切断した。この細片は、細片の１
部を下記抗原の溶液に10分浸し、次いで蒸留水中
で10分すすぎ、次に室温において風乾することに
よつて抗原（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミ
ズーリ州セントルイス所在によつて販売の無グロ
ブリンヒトアルブミン）にさらされた。ホスフエ
ートで緩衝された生理的食塩水中０mg／ml0.5
mg／ml、１mg／mlおよび２mg／mlからなる抗原濃
度系列を調製した。試料の相対蛍光強度は、励起
450nｍ、スリツト5nｍ、発光走査470nｍ〜600n
ｍおよび集積光子計数モード（スペツクス・イン
ダストリーズ・インコーポレーテツド、ニユージ
ヤージー州、メタチタン所在）を用いるフルオロ
ログ（FLOUROLOG）を使用して個々の試料細
片の暴露および未暴露部分から測定した。試料間
の比較は、抗原溶液に暴露したことによつて生じ
た蛍光の減少％の計算によつて行われた。下記第
１表を参照して抗原の一層高い水準は、蛍光抗体
の一層高い水準を固定することが分る。 第１表試料No. ［Ag］（mg／ml） 蛍光強度（％） １ ０ 29.5 ２ 0.125 26.5 ３ 0.250 23.0 ４ 0.375 21.2 ５ 0.500 18.5 この例は、抗原が、予め形成されたコロイドの
薄膜層における予め被覆された抗体と有効かつ測
定可能に反応し、しかも抗体の層外への拡散は層
に加えられた抗原の量に対して示差的にかつ反比
例して起こり、従つて抗原定量の機構を与えるこ
とを示している。 本発明の新規な要素は、その最も簡単な形態に
おいて試料スプレツド層； 拡散可能抗体に結合した検出可能種を有する拡
散可能抗体を含む反応層； 実質的に放射線不透過性の多孔層； レジストレーシヨン層に拡散する前記抗体を受
容しかつ実質的に不動化するのに適したレジスト
レーシヨン層；および 前記各層を支持する放射線透過性基材を用い
る。 スプレツド層は試料の吸収の完了後液体の単位
面積当たりの一定容積を保持する空隙率を有しそ
して試料液体の測定された量の反応層への正確な
供給を与え、従つて計量分配または測定装置が何
ら必要なくなる。スプレツド層として使用するの
に適した材料の例として、特別の予じめ定められ
た空隙率を有する繊維状層、米国特許第3992158
号明細書に開示された等方性多孔非繊維状材料お
よび1981年９月29日に特許された米国特許第
4292272号明細書の布帛を挙げることができる。 別の態様において、スプレツド層は例えば、
紙、石綿またはチタン酸カリウムのような有機繊
維または無機繊維の繊維状被覆を含んでもよい。 反応層は親水性コロイドを含み、その親水性コ
ロイドは、液体試料透過性の、蛋白質に不活性
の、膨潤性であるがしかし湿潤強さ一体性を保つ
ように不溶性であり、しかも抗体に結合した検出
可能種を有する抗体が最初に配置され、そして前
記抗体に対して非反応性で且つ非結合性である。
反応層に適した材料としては、ゼラチン誘導体、
親水性セルロース誘導体、デキストラン、アラビ
アゴム、アガロースなどの多糖類のような天然に
存在する物質およびポリビニルアルコールおよび
ポリビニルピロリドン、アクリルアミド重合体な
どの水溶性ポリビニル化合物のような合成物質の
両者を包含する親水性ゲル化可能材料がある。熱
可逆可能ゲルは、その製作が簡単なために好まし
い。反応層として用いられる重合体は所望ならば
架橋されてもよいが、架橋剤によつて抗体の失活
を避けるように留意しなければならない。 検出可能種は、当業界に既知の従来の標識手段
を含んでもよい。適当な検出可能種の中で、放射
性標識、例えばγ検出、蛍光標識、酵素標識（比
色信号を与える）および発光標識を挙げることが
できる。好ましい態様においては、蛍光材料は、
特に検出感度の故に検出可能種として使用され
る。 好ましい態様においては、反応層の親水性コロ
イドは、また重合体マトリツクスの標識抗体の拡
散定数を増進する透過体をも含有する、すなわ
ち、透過体は親水性コロイド媒質の細孔径を有効
に増大する。好ましくは、透過体はポリビニルピ
ロリドンまたはソルビトールのような親水性非ゲ
ル化性重合体である。理論によつて束縛されるこ
とを意図しないが、透過体はゲル化重合体の水素
結合度を減少して、検出可能種による抗体の拡散
に対する一層少ない抵抗を与えると考えられる。 蛍光検出技術を用いる場合、蛍光の量子効率を
低下させ、従つて抗体の検出可能性を実質的に一
層少なくする可能性がある物質の使用を避けるよ
うに注意すべきである。 重合体マトリツクスの透過体の有効性を例示す
るために、種々の被覆重合体マトリツクスについ
て比較半径方向拡散測定を行つた。 例 ２ アガローム（シーケム LE）溶液を、下記透
過体添加剤をもつて製造し、次いで接着を促進す
るために接着性重合体［ロープレツクス
（RHOPLEX、ローム・アンド・ハース・カンパ
ニー、ペンシルバニア州、フイラデルフイア所
在］68.3ｇ、マロン酸ジオクチルの10％溶液5.6
ｇ、10％コロイドシリカ分散液［ルドツクス
（LUDOX）、イー・アイ・デユポン・デ・ネモア
ス・カンパニー、デラウエア州ウイルミントン所
在］26.7ｇ、フタル化ゼラチンの10％溶液40ｇ、
ポリノニルフエノキシグリシドール（オリーン
10G）の50％溶液３ｇおよび水862ｇを含む組成
物をもつて下塗りされたポリスチレン基材［トラ
イサイト（TRYCITE）］上に押出すことによつ
て被覆した。トレーサー染料としてフルオレシイ
ンナトリウム塩の５％溶液を用いた。試験する被
覆試料を両面粘着テープによつてガラス板に取り
つけ、次いでセレクトラソール（Selectrasol）
TLC−ソルベント・セレクター・システム
（Solvent Selector System）［シユライヘル・ア
ンド・シエル・インコーポレーテツド
（Schleicher＆Schell、Inc.）ニユーハンプシヤー
州、キーン所在］において試験が行われた。トレ
ーサー染料溶液を多孔心を通して湿環境において
各試験試料の中心に適用して、溶媒の早期蒸発を
防止した。第２表に、結果をまとめる。

【表】 使用したカルボワツクスは、分子量3000〜
37000のフイツシヤー・サイエンテイフイツク・
カンパニー、ニユージヤージー州、フエアヘイブ
ン所在のポリエチレングリコールであつた。 ポリスクロースはフアーマコス・フアイン・ケ
ミカルズ（Pharmacos Fine Chemicals）、スウ
エーデン、アツプサラ所在）販売のフイコル
（FICOLL）400であつた。 第２表は、種々の透過体のアガロース層を通す
拡散速度を増大する有効性を具体的に説明する。 多孔性不透明層は、検出可能種を有する拡散抗
体透過可能であり、しかも不透明性を与えて、記
録層における以外の検出可能種の検出のどのよう
な可能性をも除くことによつて誤つた読みを防止
する。換言すれば、多孔性不透明層は、反応層に
保持された検出可能種の検出を防止する。例え
ば、蛍光検出可能種の場合に、多孔性不透明層は
蛍光放射線の領域、例えば可視領域の反射能を維
持しながら、励起放射線、例えば紫外線領域にお
いて吸収する。従つて、励起放射線は、結合標識
に達するのを有効に抑制するが、レジストレーシ
ヨン層からの放出放射線は、吸収されるよりもむ
しろ反射される。多孔性不透明層は結合剤に適当
な反射性材料を含んでもよい。好ましくは、アガ
ロース中の二酸化チタンは種々の被覆量で被覆さ
れて望まれる多孔度を与える。所望ならば多孔性
不透明層は、また不透明性および反射率を向上さ
せる適当な添加剤をまた含有してもよい。 多くの顔料は、免疫グロブリンの非特異性吸収
の高表面結合係数を有するので、このような顔料
を、顔料の表面に強く吸着されるが免疫試薬に対
してそれ自体親和性を有しない他の重合体を用い
て前処理するのが望ましい。 下記の例は、望ましくない免疫グロブリンの粒
状材料に対する結合を阻止する表面処理の有効性
を具体的に説明する。 例 ３ 表面処理法 二酸化チタン（TiPure Ｒ−931、イー・ア
イ・デユポン・デネモアス・カンパニー・デラウ
エア州、ウイルミントン所在）100ｇを写真グレ
ードゼラチン型9168［ルセロ・コーポレーシヨン
（Rousselot Corp.）フランス、パリ所在］の１
％溶液400ｇと混合し、次いで40℃において１時
間撹拌した。この時間の終りに、二酸化チタンを
低速遠心分離によつて分離した。過剰のゼラチン
を除き、二酸化チタンを蒸留水に再懸濁し、次い
で遠心分離した。このゼラチン除去工程を３回繰
り返した。 例 ４ 表面活性の測定 例３の操作に従つて処理された顔料（0.3ｇ）
の試料を標識免疫グロブリン（FITC−抗ヒトア
ルブミン、アトランチツク・アンテイボデイー
ズ・インコーポレーテツド、メイン州スカーバロ
ウ所在）3.0ｇとともに１時間撹拌し、ホスフエ
ートで緩衝された生理的食塩水と１：９に希釈
し、次いで水をもつて全量6.89ｇに希釈した。こ
の混合物を、アミコン（AMICON）XM−3000
膜フイルター（アミコン・インコーポレーテツ
ド、マサチユーセツツ州ケンブリツジ所在）を有
する限外ろ過セルに充てんし、次いで低速で数分
間遠心分離した。限外ろ過液１mlをホスフエート
で緩衝された生理的食塩水をもつて１：９に希釈
し、次いで蛍光読取り用に組み立てられたベツク
マン（Beckman）5864スペクトロホスメータ
ー・フルオレツセンス・アクセサリー・196776型
（ベツクマン・インストルメンツ・インコーポレ
ーテツド、カリフオルニア州フラートン所在）を
もつて蛍光強度を測定した。 対象試料は、試験試料と同じ希釈度の免疫グロ
ブリン溶液であり、しかも試験試料と同じく超遠
心分離された。第３表には、対照用に100％に規
格化された試料からの蛍光強度（FI）測定値を
含む。 第３表試 料 F.I. 未処理TiO₂ 4.4 処理TiO₂（例３） 54.4 対照（免疫グロブリン溶液） 100.00 第３表は、免疫グロブリンの結合の阻止におけ
る顔料処理の有効性を具体的に説明する。 レジストレーシヨン層は、拡散してくる抗体を
検出可能種で不動化することにより濃縮するため
の位置として働く。検出手段は、この層中の検出
可能種の量の測定のために用いられる。抗体を非
特異的に結合、不動化または「媒染」するに適し
た材料は当業界において既知である。例えば、ジ
ヤーナル・オブ・ザ・レテイキロエンドシーリア
ル・ソサイエテイ（Journal of the
Reticuloendothelial Society）第３巻、第29頁〜
40頁（1966）を参照されたい。 抗体を不動化または媒染することが当業界にお
いて既知の材料の多くは、溶液中において働く
が、これらの材料は、アガロースのようなゲル化
環境において不活性化され、従つて本発明におい
て使用するにはその選択に特別の注意が必要と思
われる。 下記の非限定例は、標識免疫グロブリンの固定
用のレジストレーシヨン層における非特異吸着特
性の有効性を具体的に説明する。 例 ５ 下記の材料を不連続相として中に配合している
アガロースをゲル化環境として用いることによつ
て一連の被覆を製造した。界面活性剤、ｐ−ノニ
ルフエノキシポリグリシドール（オリン10G）を
被覆助剤として加えた。被覆は、各被覆を、標識
抗体溶液の固定された容量と正確に10分接触させ
ることによつて評価された。使用した抗体溶液
は、例３に示したものと同じであつた。接触時間
の終りに、被覆を蒸留水ですすぎ、次いで環境温
度において風乾した。蛍光（任意の相対単位）
は、例４に記載と同じ技術によつて測定した。

【表】 ポリビニルピロリドン

【表】 ミニウム

重合体Ａは、ヒドロキシエチルセルロース
（HEC）上に４−ビニルピリジン（4VP）および
塩化ベンジルトリメチルアンモニウム（TMQ）
の比率2.2HEC／2.24VP／1TMQにおけるグラフ
トであつた。デンプンは、マリンクロツト・イン
コーポレーテツド、ケンタツキー州パリス所在に
よつて販売されている可溶性デンプンであつた。
ポリエチレンオキシドは、ユニオン・カーバイ
ド・コーポレーシヨン、ニユーヨーク州ニユーヨ
ーク所在によつて商品名ポリオツクス
（POLYOX）WSR−Ｎ−80の下に販売されてい
るエマルジヨンであつた。二酸化チタンは、例３
に記載のものと同じであつた。ポリビニルピロリ
ドンは、GAF・コーポレーシヨン、ニユーヨー
ク州、ニユーヨーク所在によつて販売されている
型NP−X15であつた。酸化アルミニウム（0.3マ
イクロメートル）はフラカ・ケミカル・カンパニ
ー（Fluka Chemical Co.、ニユーヨーク州
Hauppauge所在によつて販売された。 別法として、抗体は、レジストレーシヨン層に
おいて予め被覆されて、媒染特性を与えることが
できる。例えば、前記米国特許第4258001号明細
書を参照されたい。しかしながら、これには、第
４表に記載のレジストレーシヨン層を用いること
は必要ない。なぜならば、これらのレジストレー
シヨン層は、抗体用の有効な媒染剤のみでなく、
非特異性でもあるからである。すなわち、これら
のレジストレーシヨン層はその源にかかわらず実
質的にすべての免疫グロブリンＧに結合する。 本発明において使用される放射線透過性基材
は、検出器および検出可能種によつて放出された
放射線透過性である。例えば、好ましい態様にお
いては、検出器は、励起放射線を放出し、そして
検出可能種によつて放出される蛍光を検出する。
放射線透過性基材として使用する適当なフイルム
基材の例として、酢酸セルロース、ポリエチレン
テレフタレート、ポリカーボネートおよびポリス
チレンのようなポリビニル化合物のような材料を
挙げることができる。接着を促進するためには、
フイルム基材を下塗りするのが好ましい。 また、本発明の新規な分析要素には、フイルタ
ー層、タイミング層などの任意の層を含有しても
よいと理解されたい。例えば、フイルター層は、
分析を妨害する可能性のある微小分子および粒状
物を除くためにスプレツド層または反応層上に使
用できる。また、タイミング層を設けて抗体と反
応層の接触と検出可能種を有する抗体の拡散との
間の遅れを調節して、抗原が反応層において抗体
に結合する機会を有する前に抗体の拡散の結果と
してのどのような誤つた読みをも避けるのも望ま
しいであろう。またフイルター層を用いて、外来
物質がレジストレーシヨン層に入るのを防止でき
る。 図面を参照して、第１図は本発明の好ましい要
素の断面図である。要素10は、順に下記の層から
なる。すなわち検体が適用されているスプレツド
層12；検出可能種を有する抗体を含有する反応層
14；前記のようにタイミング層および（または）
フイルター層を含有してもよい中間層16；検出可
能種を有する拡散してくる抗体のために濃縮また
は固定要素を含むレジストレーシヨン層20におけ
る検出可能種から、反応層に残存している検出可
能を単離するに適した多孔性不透明層18；および
要素10の支持体として働き、しかも下記透過層を
とおして検出器がレジストレーシヨン層20中の検
出可能種からの放出放射線を測定する放射線透過
性層22から構成される。 第２図および第３図は、第１図の要素10の動作
を示す。検体を含有する試料流体、この場合に
は、分析中の物質である抗原は、均一な予め定め
られた量を受容しそして次いで反応層14に拡散さ
せるスプレツド層12に適用される。抗原は、層14
に配置された抗体の同様の量と会合して、実質的
に非拡散の複合体を形成する。試料液体の要素を
通過して通常拡散することができる、抗原より過
剰の抗体は、中間層16および多孔性不透明層18中
を拡散しそしてレジストレーシヨン層中で不動化
され、レジストレーシヨン層では検出可能種が放
射線透過層22を通過する入射放射線によつて活性
化され、次いで検出可能種の量が確認される。 下記の非限定例は、本発明の要素の動作を具体
的に説明する。 例 ６ 0.1％ヒト血清アルブミン（抗原）（シグマ・ケ
ミカル・カンパニー、ミズーリ州セントルイス所
在）10mlおよびフルオレシインイソチオシアナー
ト（抗体）（アトランテイツク・アンテイボデイ
ーズ・インコーポレーテツド、メイン州スカーバ
ロウ所在によつて販売）によつて標識され、ホス
フエートで緩衝された生理的食塩水中で１：５に
希釈された山羊抗ヒト血清アルブミンIgG画分
100mlを試験中で混合した。白つぽい沈殿が直ち
に形成された。試験管の内容物を (a) アガロース1000mg／ft²および分子量3000〜
3700（フイツシヤー・ケミカル・カンパニー、
ニユージヤージー州、フアシラワ所在）のポリ
エチレングリコール1000mg／ft²を含む反応層、 (b) ゼラチンをもつて前処理された二酸化チタン
（イー・アイ・デユポン・デ・ネモアス・イン
コーポレーテツド、デラウエア州ウイルミント
ン所在によつて商品名TiPure Ｒ−933の下に
販売）520mg／ft²およびアガロース500mg／ft²
を含む放射線に実質的に不透過性の多孔層、 (c) アガロース1000mg／ft²およびポリエチレン
グリコール分子量4000 100mg／ft²を含むレジ
ストレーシヨン層および (d) ３ミルの下塗りされたポリスチレン基材（ダ
ウ・ケミカル・カンパニー、ミシガン州ミツド
ランド所在）を含む要素上にスポツトした。 ２時間の吸収期間後、紫外線を、前記要素の基
底およびヒト血清アルブミンが山羊抗ヒト血清ア
ルブミンを塗布されていない対照要素を通して照
らした。対照の場合、相当量の蛍光が検出され、
フルオレセイン標識抗体の実質量がレジストレー
シヨン層に達したことを示したが、一方試験試料
は著しく少ない蛍光を示し、フルオレセイン標識
抗体が抗原によつて固定され、しかもレジストレ
ーシヨン層に達しなかつたことを示した。 前記の先行技術に示される速度論技術とは反対
に、本発明は、終点技術を用いる。本明細書にお
いて用いる「終点技術」の用語は、反応体が実質
的に消耗される若干の指定時間後に全量が実質的
に固定されている検出可能生成物を生じる化学反
応に基づく描写を示すように意図されている。終
点技術は、検体の環境水準および試薬の化学量論
的量をもつて作動し、しかも速度論技術よりも温
度の変動に本質的に敏感でない。 例えば、米国特許第3992158号、同第4422335号
および同第4144306号明細書に記載された置換放
出機構は、本質的に速度論検定系である。なぜな
らば反応を測定可能の速度に促進するために試薬
の大過剰が必要だからである。速度論技術は、温
度および時間に敏感であり、かつ速度定数を求め
るために複雑な計装が必要である。 本発明の新規な方法および要素は本質的に一層
速い反応時間を与える。なぜならば会合反応速度
は、前記特許に用いられた置換放出に必要な前提
条件である解離よりも何桁も速いからである。