JPH04500066A - ポリペプチドの百日咳トキシンのワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ボ１ペプチドの　日　トキシンの　クチン、る　の この出願は、１９８８年８月２日提出の米国特許出願第２２７．３７２号の一部 継続出願、その開示をここに引用によって加える、である。

本発明は、Ｎ　Ｉ　Ｈ（ＲＯＩ　Ａｌ　２２４６２）からの許可により一部分支 持された。米国政府は権利を有することができる。

１−渣 葺土公立 本発明は、完全（ｉｎｔａｃｔ）抗原以外のペプチドワクチンの設計に関する。

豆量 ワクチンは大いに完全な生物体に実質的に依存する。弱毒化または殺した実質的 に完全な生物体を使用することによって、ビルレン）　（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）生 物体の病原性に暴露されないで、免疫系が活性化されそして記憶細胞をつくるよ うに、自然の病原体のコンフォメーションおよび免疫応答を再現することができ ることが望まれている。ある病気について、これは非常に満足すべきものである ことが証明された。しカルながら、他の場合において、この方法は種々の理由で 失敗した。

生きている、弱毒化した生物体を使用するとき、弱毒化した生物体がピルレンジ −を回復することがあるという問題が常に存在する０個々の場合において、確率 は低いが、大量のワクチン接種を行っている場合、病原性生物体を有するという ことは、わずかの患者の間で感染の可能性を大きく増加する。他の場合において 、個体に種々の程度、に病的症状をもたらすであろうトキシンが関与することが ある。これらの場合において、個体に対する悪影響に抗して全体集団のための有 益な効果に重点を置かなければならない。このことは、生物体、百日咳菌（Ｂｏ ｒｄｅｔｅｌｌａ　匹」且阻江）により引き起こされる、百日咳に適用される。

百日咳トキシンは、ＡＤＰ−リボシル化を触媒する酵素である。このトキシンは 宿主に対する悪影響の広いスペクトルを有する。こうして、ワクチンの場合にお いて、完全な（ｉｎｔａｃｔ）　）キシンは生命を危険にする結果を与え得るの で、この生物体は不活性化することでは十分ではない。

種々の研究に基づいて、今日、異なる個体は抗原の異なる部分に応答することが できると信じられる。抗原提供細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　 ｃｅｌｌ）、例えば、Ｂ細胞の場合において、１つのタンパク質は表面の免疫グ ロブリンに結合することができ、そして他のタンパク質はＭＨＣ抗原に結合し、 そしてＴ細胞に提供されそしてＴ！ｌｌ胞により認識されることができるか、あ るいはＴ細胞およびＢ細胞の結合部分は重なるか、又は同一であることがある。

こうして、ヒトにおいて、）ＩＬＰ型に依存して、抗原に対する応答は異なる個 体の間で変化することがあり、そしである個体は抗原に対する強い免疫応答を獲 得することができない。

したがって、弱毒化または完全な病原体を使用する不確かさなしに、集団を通じ て広い用途を有すると同時に、ワクチン接種すべきすべてのあるいは実質的にす べての個体に強い免疫応答を提供するワクチンを開発することができることに実 質的な関心が向けられている。

Ｍ１工ゑ文献 タムラ（Ｔａｍｕｒａ）　ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ■） （１９８２）　２２　：　５５１６は、百日咳トキシンの種々のサブユニットを 記載している。ロチト（Ｌｏｃｈｔ）およびケイス（Ｋｅｉｔｈ）、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）　（１９８６）　２３２　：　１２５８　；およびニコシア （Ｎｉｃｏｓｉａ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ（１９ ８６）　８３　：　４６３１は、百日咳トキシンのサブユニットのクローニング および配列決定を記載している。ヘフロン（）ｌｅｆｆｒｏｎ）ら、　゛　プロ シーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８６）　７５　：　６０１２　；およびブ ラック（Ｂｌａｃｋ）およびフォールコラ（Ｆａｌｋｏｗ）　、感染および免疫 性（Ｉｎｆｅｃｔ。

ニットの突然変異誘発を記載している。ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）　（１９８８）　２４０　：　６５６は、トキシンおよびワ クチンとして突然変異誘発したＳ１サブユニツトの試験はを記載している。デリ シ（ＤｅＬｉｓｉ）およびベルシフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、プロシーデ ィンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ（１９８５）　８２　：　７０４８　、ホ ップ（Ｈｏｐｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）、プロシーディンゲス・オプ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）ＵＳＡ（１９８５）７８　：　３Ｂ２４：チョウ（Ｃｈｏｕ）および ファスマン（Ｆａｓｍａｎ）、顛とハ鉦鮫包■（１９７８）　４７　：　４５　 ；およびロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）およびタイラー（Ｔａｙｌｏｒ）　、 ＥＭＢＯジャーナル（Ｊ、）（１９８Ｂ）　７：　９３は、タンパク質配列中の 免疫優性部位を決定する方法を記載している。ザンビル（Ｚａｍｖｉｌ　）らネ イチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９８６）３２４　：２５８；およびプロング（ ｂｒｏｃｋｅ）　ら、（１９８８）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステ ィゲイション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔｉ−■置皿）（印刷中）は、実験 のアレルギー性脳を髄炎および重症筋無力症へのロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ）のアルゴリズムの適用を記載している。バンネージー（Ｂａｎｎｅｒｊｅｅ） ら、ジャーナル・オプ・イクスペリメンタル・メディシン（ムｈ１」鱈−）（１ ９８８）　１６７　：　８３２は、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎に対す る感受性における■βＴ細胞受容体遺伝子の可能な役割を記載している。バーネ ッテ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）ら、バイオチク）ｏ’；−（旦ｏ　ｔｅｔ山＋ｏｌｏ ■）（１９８８）　６　：６９９およびハルトロニ（Ｂａｒｔｏｌｏｎｉ）ら、 バイオテクノロジー（…ｏｔｅｃｈｎｏｌｏ■）（１９８８）　６　ニア０９は 、百日咳トキシンを記載している。

オフセンハーグ（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ）ら（１９８８）ジャーナル−オブ・イク スペリメンタル・メディシン（ム旺り鼓虹）　１６８　：　１８５５は、百日咳 トキシンの免疫原性Ｔ細胞のＭＭＣ制限認識を記載してしする。アスケロフ（八 ５ｋｅｌｏｆ）ら（１９８８）ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジー ジス（Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、）　１５７：７３８は、百日咳トキシンのサブ ユニットの抗原性部位のマツピングを報告している。デ・マギストリス（ＤｅＭ ａｇｉｓｔｒｉｓ）ら（１９８９）ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メ ディシン（Ｊ、ＥｘムＭｅｄ、）　ニーは、百日咳トキシンの大部分の免疫原性 部分としてＳ１サブユニツトを規定しそしてそのエピトープ地図を決定するため のヒトＴ細胞のクローンの使用することを記載している。

生豆ｑ！ｈ ワクチンにおいて使用できる、タンパク質中のペプチド配列を決定するための方 法および組成物が提供される。この方法は、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）細胞お よび／または同種異系（ａｌｌｏ−ｇｅｎｅｉｃ）細胞と組み合わせて配列の選 択を使用する。百日咳トキシンのＳ１サブユニツトを使用して、この方法および 組病原体の抗原性タンパク質中に存在する配列に基づくワクチンを案出する方法 および組成物を提供する。この方法は、分子全体とオーバーラツプする断片の調 製の必要性を回避しながら、免疫優性である確率が合理的に高くそして場合Ｏこ よってはＢ−細胞エピトープを中和する配列の選択を提供する。

さらに、Ｔ細胞、とくにＴヘルパー細胞（ＣＤ４”）と組み合わせて、同系およ び／または同種異系抗原提供細胞、マクロファージまたはＢ細胞の組み合わせを 使用することによって、そしてワクチン接種した乳児からの抗血清でスクリーニ ングすることによって、配列を選択することができる。ヒトにおけるより共通の ＨＬ　Ａ型および他の動物、とくに家畜における、より共通のＭＨＣ型について 選択することによって、共通組織適合性抗原に結合する配列について選択するこ とができる。しばしば、ヒトの組織適合性抗原と他の動物の抗原との間に相関関 係が存在するので、スクリーニングは動物の細胞、例えば、マウスまたはヒト以 外の霊長類の細胞を使用して実施することができる。このようにして、わずかの オリゴペプチドで、ワクチン接種すべき集団の実質的にすべてをカバーし、そし て保護的免疫応答を生成することができる。

種々のスクリーニング技術、とくに抗原を発現する細胞とＴ細胞との間の結合に よる活性化の結果としての細胞の増殖を使用することができる。いったん活性化 が実証されると、オリゴペプチドはそれ自体で使用するか、あるいは共有結合ま たは非共有結合により結合された他のオリゴペプチドと組み合わせて使用して、 免疫応答を生成することができる。次いで、ワクチンとしての投与するために慣 用方法で組成物を配合するか、あるいは病原性抗原に対する抗体を産生ずるため に使用することができる。

本発明の方法を百日咳トキシンで例示する。百日咳トキシンはとくにすぐれた例 である。百日咳トキシンの完全なサブユニットＳ１は、ワクチン接種した宿主へ 種々の悪影響を生成することがあると信じられる。Ｓ１サブユニツトは、ＡＤＰ −リボシル化することができ、そして低緊張、低応答症候群、痙彎および脳障害 に関係づけることができる。こうして、完全な抗原は広く適用可能なワクチンつ いての重大な健康な問題である。

本発明を実施するとき、抗原配列は次の物の一方または双方についてスクリーニ ングする。

第１分析は、高い柔軟性の領域の選択であり、この領域は次のものを包含する： 予測されたＢ−ターン（Ｂ−ｔｕｒｎｓ）　（チュ（Ｃｈｕ）およびファスマン （Ｆａｓｍａｎ）　、前掲；ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）、 前掲〕　：らせんの末端に関連するアミノ酸：および抗原の二次構造の一部分と して両極性のらせんの領域１．デリシ（Ｄｅｌｉｓｉ）およびベルシフスキー（ Ｂｅｒｚｏ−ｆｓｋｙ）　、前掲。１つの方向に面するか、あるいは一般に一方 向に向けられたアミノ酸の大部分が実質的に疎水性であるが、反対方向に面する か、あるいは一般に一方向に向けられたアミノ酸の大部分が実質的に親水性であ る、らせんを描くことによって、その配列は、組織適合性抗原に結合することに おいて、合理的な免疫優性配列である確率を有する。高い柔軟性の領域を選択す ることによって、線状配列はＴ細胞およびＢ細胞の両者の応答を引き出す可能性 が最も強い。Ｔ細胞およびＢ細胞のエピトープはオーバーランプすることがあり 〔マン力（Ｍａｎｃａ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（ Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　（１９８５）　１５　：　８４５　）そして このようなオーバーランピングエビトープは、それらの高い免疫原性のために、 好ましいワクチンであることができる。

第２分析は、いずれかの方向、すなわち、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎにおいて、荷電し た（ｃｈａｒｇｅｄ）残基またはグリシンおよび引き続く２つの疎水性残基を捜 す、ロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）およびタイラー（Ｔａｙｌｏｒ）　、前掲 。上の目的を満足するオリゴペプチドの配列を組み込んだ配列を選択する。

一般に、この配列は、機能的存在として、少なくとも８アミノ酸、好ましくは９ アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸であり、そして通常２０を越えず、より 通常１８アミノ酸を越えない。もちろん、とくに隣接するか、あるいはオーバー ラッピングする存在する場合、あるいはより長い配列が合成、安定性などにおい て多少の利点を提供する場合において、より長い配列を使用することができる。

定義されたオリゴペプチド配列はオリゴペプチド配列に対してＮ末端、Ｃ末端あ るいは内部に存在することができるが、ロスバードのアルゴリズムは、通常オリ ゴペプチドのＮ末端に近接するか、Ｎ末端に位置するであろう。通常、スクリー ニングしたペプチドは少なくとも約１０アミノ酸を有し、そしてこのような配列 の少なくとも８０％はワクチンにおいて使用されるであろう。

はとんどの場合、前記配列は高い柔軟性をもち、そしてタンパク質のＮ末端また は予測されたβ−ターン（β−ｔｕｒｎｓ）の領域に存在するであろう。多くの 場合において、選択の２つの方法はオーバーランピングする配列を提供せず、そ して２つの方法により選択された配列は容易に試験されるであろう。通常、選択 した配列の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約２５％は、１または２以 上の共通の組織適合性抗原と供に免疫優性配列として有用であることが証明され るであろう。

百日咳トキシンのサブユニット１　（ＳＬ）の場合において、選択されたオリゴ ペプチドを表１に記載し、ここで最初の５つは二次構造により選択されるが、残 りはロスバードのアルゴリズムにより選択された。ロスバードの配列の各々にお いて、最初のアミノ酸はグリシンまたは荷電したアミノ酸であり、現在の場合に おいて、とくにアルギニンであることに注意すべきである。

次いで、抗原提供細胞（ＡＰＣ）を合致したＴヘルパー細胞、すなわち、ＡＰＣ により制限されたＴ細胞と組み合わせるとき、配列はＡＰＣを刺激するそれらの 能力についてスクリーニングされ得る。Ｔヘルパー細胞は同系、半一同系または 同種異系であることができる。Ｔ細胞は少なくとも１つの共通の組織適合性抗原 をＡＰＣと共有すべきである。Ｓｌでは、ＨＬＡ　−ＤＰは関係すると思われず 、ＨＬＡ　−ＤＲおよび／またはＤＱの抗原決定基は関係することが発見された 。

同系ＡＰＣおよびＴ細胞を使用するスクリーニングは、特定のオリゴペプチドと 結合する１または２以上の組織適合性抗原の検出を可能とするが、宿主源の特定 のＴ細胞遺伝子型に限定される。少なくとも１つの共通の組織適合性型を有する 同種異系Ｔ細胞を抗原提供細胞とともに使用することによって、特定のペプチド を検出しかつそれに対して応答するＴ細胞の遺伝子型の一般性に関して、さらに 、スクリーニングすることができる。

表１ Ｔ　の番゛に　した　日　トキシン サブユニット１　のペプチド ＊　親の出願における前の番号は、シグナル配列のアミノ酸を包含した。本発明 の番号は成熟タンパク質に基づく。

陽性の応答を提供する方法による評価の外に、組織適合性抗原に対する抗体と組 み合わせた応答の逆転を探索することができる。こうして、存在する組織適合性 抗原の１つに対して特異的な抗体に関する、増殖活性の逆転が存在する場合、こ れは少なくともその組織適合性抗原がオリゴペプチドの提供に関係することを示 す。このようにして、どの特定の組織適合性抗原がどのオリゴペプチドを提供（ ｐｒｅｓｅｎｔ）するかをマツピングすることができる。共通の組織適合性抗原 は、とくにヒトについて、知られており、そしてこれらはマウスＭＨＣ抗原と関 係づけられているので、これらの組織適合性抗原を有する抗原提供細胞を使用し 、そして増殖性応答に関係する特定の組織適合性は抗体を使用する逆転を実証す ることによって決定することができる。結果は、さらに、増殖試験において存在 する他の組織適合性抗原に結合する抗体についての逆転の不存在により、確証さ れる。

百日咳トキシンについて、特別に重要な配列は、９−１９゜３０−４１．７０− ８２．　１１７−１２７．１３４−１４５および１８９−１９９を包含する。

配列またはユニットは種々の方法で使用することができる。

多くの場合、オリゴペプチドは抗原性ではないので、オリゴペプチド配列は通常 は抗原および／またはアジュバントと組み合わせて使用することができる。本発 明の目的のために、所望のオリゴペプチドを一緒に結合して少なくとも約３０ア ミノ酸、好ましくは少なくとも約６０アミノ酸のポリペプチドを形成することが でき、ここでオリゴペプチドは直接または結合鎖を通して接合することができる か、あるいは抗原の応答を増強ごとが知られているタンパク質またはタンパク質 断片に接合することができる。オリゴペプチドを一緒に結合するとき、それらは 通常天然に存在する介在配列を含まないであろう。

Ｓ１タンパク嘗の個々のユニットは、それら自体であるいは免疫学的活性を有す る他のタンパク質からのユニットと組み合わせて、種々の方法で、例えば、頭対 頭、頭対尾、尾対尾、またはそれらの組み合わせで接合することができ、ここで パターンは少なくとも２回で反復することができ、そして３０回またはそれ以上 反復することができる。ある数の異なるユニットが存在する幾つかの場合におい て、ユニットのランダムな組織化を使用することができ、ここで各ユニットはあ る免疫学的活性を付与することができる。

Ｔ細胞およびＢ細胞の両者のエピトープを包含する配列について、その配列を強 い免疫応答を誘発ことか知られているＴ細胞のエピトープの第２配列ユニットに 接合することによって、免疫応答をさらに増強することができる。Ｔ細胞のエピ トープは、Ｓ１タンパク質からホモロガスであるか、あるイハ異ナル百日咳菌（ 月工脛β非咀込）タンパク質、または百日咳菌（β−朋Ｂｙｌ艮）に対して外来 のタンパク質、例えば、ＨＢｓＡｇのｐｒｅ−Ｓタンパク質からヘテロロガスで あることができる。生ずるオリゴペプチドは１２通常、少なくとも約２０アミノ 酸であり、そしてそれより大きくあることができる。オリゴペプチドは次にオリ ゴマー化されることができ、ここで、Ｓ１サブユニット断片のみをオリゴマー化 するか、あるいは両者の配列を交互するオリゴマーまたはブロックオリゴマーと してオリゴマー化することができる。通常、生ずるポリペプチドは約１５０ｋＤ ａｌより小さいであろう。強いＴ細胞のエピトープの例は、ＨＢｓＡｇのＳタン パク質のｐｒｅ−Ｔ細胞エピトープである。参照、米国特許第４．６８３．１３ ６号。

主題のＴ細胞エピトープはまた、ヘテロロガスタンバク質のＢ細胞エピトープと ともに使用して免疫応答を刺激することができる。Ｔ細胞およびＢ細胞のエピト ープがオーバーランピングするとき、主題のペプチドは百日咳トキシンに対する 免疫応答を提供するであろう。さらに、主題のＴ細胞エピトープは他のタンパク 質、とくに病原体、例えば、ウィルスおよびバクテリアからの他のタンパク質の Ｂ細胞エピトープに対する免疫応答を増強するであろう。組み合わせは、物理学 的混合物により、あるいは共有カップリング（ここでオリゴペプチドはタンパク 質またはポリペプチドに結合している）により、あるいは遺伝子融合（ここでヘ テロロガス配列が、本発明のＴ細胞のエピトープの配列にタンデムに結合してい る）によることができる。

さらに、小さいオリゴペプチドは、通常、ワクチンとして投与されるとき、非常 に短い半減期を有するであろう。したがって、抗原提供細胞への結合を与えるた めにオリゴペプチドのライフタイムを安定化する手段をを提供することが望まし い。

オリゴペプチドの安定化は種々の方法で達成することができる。１つの方法は、 既に示したように、選択したオリゴペプチドの配列以外の配列を使用して大きい ポリペプチドを調製して安定化を与えることである。あるいは、問題のオリゴ物 質に結合し、リポソームまたは他の小胞中に導入し、プロテアーゼによる消化の 確率を実質的に減少することができる。

Ｄ−異性体のアミノ酸をオリゴペプチドに、とくに結合ヘリックスの外側に、含 めることができる。末端を官能化しあるいはアミノ酸の側基を修飾してタンパク 質分解的に感受性の部位を修飾することができる。こうして、主題のオリゴペプ チドは一緒に接合して単一のタンパク質またはタンパク質の混合物を形成するこ とができ、あるいは、免疫応答のそれらの活性化を妨害しないであるいは、好ま しくは、免疫応答を増強しながらオリゴペプチドの保護を可能とする種々の手順 を用いることによって、個別にまたは組み合わせで使用することができる。

本発明のオリゴペプチドは種々の方法で調製することができる。同一または異な るオリゴペプチドが単一のポリペプチド中で、それら自体でまたは他のポリペプ チドとの組み合わせにおいて組み合わされており、そして分子が約６０より少な いアミノ酸を有するようなオリゴペプチドの組成物については、これらの組成物 を合成することができる。商業的合成装置は使用のために入手可能であり、そし て有利に使用することができる。しかしながら、多くの場合、約３０アミノ酸よ り大きいポリペプチドについて、遺伝子工学を使用することができ、ここで遺伝 子は合成配列および自然配列の組み合わせにより合成または調製することができ る。多くの場合、使用するペプチドは約６００．０００より小さい分子量、好ま しくは約３００、０００より小さい分子量、より好ましくは約２００．０００よ り小さい分子量である。通常、ペプチドは完全ポリペプチドまたはサブユニット のアミノ酸の数に対して約５０％より少ないアミノ酸からなるので、通常天然に 存在するタンパク質の小さい部分、通常約２５％以下のみが使用される。こうし て、約２ｋｎｔ以下、好ましくは約１ｋｔ以下、より好ましくは０．５ｋｎｔ以 下からなる配列を設計することができる。

次いで、生ずる遺伝子を使用して、適当な宿主中で、所望のポリペプチドを発現 することができる。多数の発現ベクターは今日入手可能であり、これらは種々の 単細胞の宿主、原核生物および真核生物の両者、において使用することができる 。このようにして、タンパク質を調製することができ、ここでタンパク質は生物 体、例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、バタテリウム・スブチリス（Ｂａｃ ｔｒｉｕｍ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）または他のバチルス生物体、酵母菌、例えば、 サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）など中で細胞内で産生されるであろう。望ましくは、このようにして、 生きているまたは殺したワクチンは使用することができ、これらはＳ１サブユニ ツトを欠くが、中和性免疫応答を開始するための所望のオリゴペプチド配列を含 む。さらに、宿主は標的病原体のタンパク質に対して免疫化されるばかりでなく 、かつまた宿主は百日咳トキシンに対して免疫化されるであろう。

本発明のポリペプチドを有しかつ機能的Ｓ１サブユニツトを欠如する宿主生物体 を提供する方法は、文献において類似性を見いだす。機能的Ｓ１タンパク質を欠 如する百日咳菌（Ｌ匹ｊ！咀込）について選択することができ、そして主題のポ リペプチドおよび宿主の染色体の非必須配列と相同性の少なくとも約５０ｂｐの ＤＮＡ配列からなる発現ベクターでこのような宿主を形質転換することができる 。このようにして、組み換えは起こることができ、ここで主題のポリペプチドは 染色体中に組み込まれるであろう。次いで、主題のポリペプチドの発現は、ウェ スタン・プロットにより決定することができるが、組み込みは染色体の断片化お よび適当なプローブとのハイブリダイゼーションを検出することによって決定す ることができる。便利には、宿主中で不安定でありそして失われるであろうが抗 生物質耐性を有し、あるいは栄養要求宿主に原栄養性を提供するベクターを使用 することができる。

この方法において、選択マーカーを保持する宿主について選択することによって 、このような宿主は、染色体中に組み込まれた免疫原性ポリペプチドをコードす る主題の遺伝子をも保持する高い確率を有する。

あるいは、主題の遺伝子のための境界としてＳｌサブユニットの遺伝子の非翻訳 ５′および３′配列を使用することによって、百日咳トキシンのＳｔサブユニッ ト遺伝子と主題のオリゴペプチドをコードする遺伝子との間の組み換えを提供す ることができる。次いで、野生型トキシン遺伝子をもはや有しないが、その代わ り主題遺伝子を置換した宿主についてスクリーニングする。

主題のポリペプチドの発現のために発現カセットを使用し、ここで発現宿主にお いて機能的であるプロモーターまたは転写開始領域を使用する。本発明について 、通常強いプロモーター（ここでプロモーターは宿主中で少なくとも比較的高い レベルで産生されるタンパク質と関連する）、あるいは宿主中で機能的であるウ ィルスまたはファージのプロモーターであるであろう。プロモーターは、通常、 宿主がワクチンであるかどうか；宿主をワクチンとして使用する場合、宿主が生 きているか、あるいは死んでいるかどうか；タンパク質を収穫しそして細胞外で ワクチンとして使用すべきであるかどうかに依存して、誘導的であるか、あるい は構成的であることができる。

広範な種類のプロモーターはバクテリア中で使用するために利用可能であり、そ してＩａｃ、　ｔｒｐ、λの左または右のプロモーター、０１１１１１１．　丁 ７　、前期または後期のプロモーターなどを包含する。もちろん、また、Ｓ１野 生型プロモーターを使用することができるであろう。

転写の方向においてプロモーターから下流に主題の遺伝子は存在し、次いで停止 を可能とするターミネータ−配列が存在し、このターミネータ−配列は選択した 宿主中で機能的である。広範な種類のターミネータ−配列が知られており、そし て使用されてきており、そしてここで説明を必要としない。

多くの場合において、発現力セントは容易に入手可能であり、ここでプロモータ ーおよびターミネータ−はポリリンカーにより分離されており、そしてベクター 中に既に存在し、このベクターは特定の宿主中の安定なまたは不安定な複製を行 うことができ、そして宿主の選択のための１または２以上のマーカーを包含する ことができる。このようなベクターが入手可能である場合、主題の遺伝子を合成 または調製した後、遺伝子は平滑末端またはリンカ−を有することができ、そし てプロモーターの転写制御下にあるべきポリリンカー中に直接挿入することがで きる。

調製される遺伝子は主題のオリゴペプチドの少なくとも１つそして、望ましくは 、２またはそれ以上、通常１０以下、通常６以下をコードするであろう。オリゴ ペプチドの各々は１または２以上、通常約１０以下、通常約６以下のコピー中に 存在することができる。合成するとき、特定の宿主により好まれるコドンを使用 して、発現の速度を増大し、特定のｔＲＮＡの低いレベルに関連する制限を回避 することができる。

特定のワクチンの性質に依存して、そのワクチンは種々の方法で配合することが できる。既に示したように１．ポリペプチドはリポソームとして、結合した粒子 として、あるいは生きている宿主または死亡した宿主中に存在すものとして製剤 化することができる。種々のアジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、油、 複合体のサツカリド、リポサツカリドなどを使用することができる。ワクチンの 量はその性質に依存して変化し、一般に約ＩＪ！ｇ〜１■／ｋｇ宿主、より通常 的２０−５００ｍｇ／ｋｇ宿主であり、そして約０．２５〜２１ｎ１、より通常 ０．１〜１戚の量で投与される。種々の生理学的許容されうる担体、例えば、水 、アルコール、リン酸塩緩衝液などを使用することができる。１または２回以上 の投与を使用することができ、ここで投与は経口的、注射による非経口的（例え ば、皮下、筋肉内、静脈内など）などであることができる。

主題のオリゴペプチドはそれら自体でまたは他の病原体からの配列と組み合わせ て使用することができる。こうして、単一のポリペプチドはＳｌトキシンからの 免疫優性配列ばかりでなく、かつまた他の病原体からの免疫優性配列を包含して 、組み合わされたワクチンを提供することができる。使用するポリペプチドはポ リペプチドの混合物または単一のポリペプチドであり、種々のポリペプチドの配 列を使用することができる。オリゴペプチド配列を提供することができる問題の 種々の病原体は、風疹、天然痘、ジフテリア、水痘、ＨＩＶ−１および−２など を包含する。

主題のオリゴペプチドを他のペプチド配列とともに使用するほかに、主題のオリ ゴペプチドは非ペプチド性のハプテンまたは抗原、例えば、炭水化物および脂質 と混合することができる。炭水化物は、次の異なる型のバクテリアからの莢膜を 包含する：例えば、ヘモフィイラ（！ｌｅｍｏｆｉ！ｉａ）　、例えば、インフ ルエンザ菌（勘ｙ関立」眩ゴ１ｕｅｎｚａｅ）　、連鎖法菌属（旦工担仝餌に■ ）種、〔次のものを包含するが、これらに限定されない：ニューモニアエ（里ｕ ｍｏｎｒａｅ）（とくに海溝型］、、４．５．６Ａ、６Ｂ　、９Ｖ　、］、４， １８Ｃ，１９Ｆおよび２３Ｆ）、ビロゲネス（りおよびアグラクチアエ（丑山脛 肛肥）〕、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ往）、例えば、ネイセリア・メニンギ チデス（ＮＬ鱈ｊ１工国競）、クレブシェラ（に１ｅｂｓｉｅｌｌａ）、例えば 、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　匹弘赳紅肥）、シュードモナス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ）　、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ旦ユれ赳と）、連鎖法菌 属（釘Ｂ躬恣二匹ｕ）、例えば、黄色ブドウ球菌（３工ａｕｒｅｕｓ）および他 のグラム陰性バクテリア。脂質はグラム陰性バクテリアからのリボ多糖を包含す る。

次の実施例によって、本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明を限 定しない。

材料豊よ互方抜 金底王プ天上 ペプチドは、商業的に入手可能なｔ−Ｂｏｃアミノ酸ポリスチレン樹脂および次 の側鎖保護基でｔ−Ｂｏｃ保護したアミノ酸を使用して出発する、固相技術によ り合成した：　ＡｓｐおよびＧｌｕについて０−ベンジルエステル、Ｓｅｒおよ びＴｈｒについてＯ−ベンジルエステル、ＡｒｇおよびＨｉｓについてトシル、 ＣｙｓについてＰ−メトキシベンジル、Ｌｙｓについてオル）−クロロベンジル オキシカルボニル、およびＴｙｒについて２゜６−ジクロロヘンジル。すべての カップリングは、樹脂上のアミノ酸のミリ当量数より２．５モル過剰のｊ　Ｂｏ ｃアミノ酸およびジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して実施し た。ＡｓｎおよびＧｉｎの場合において、２．５モル過剰のＮ−ヒドロキシベン ゾトリアヅール（ＨＯＢＩ）を添加した。ペプチドがそれらの配列中にＨｉｓを 有する場合、ＡｓｎおよびＧｌｎについて、活性エステル（ｐ−ニトロフェニル ）カップリングを実施した。すべてのカップリングはニンヒドリン試験により監 視した。０．１％のヨウ素を含有する４０％のトリフルオロ酢酸／ジクロロメタ ンをＢｏｃの脱保護に使用した。合成後、ペプチドをＨＦ反反応装置梨型Ｐｅｎ ｉｓｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ）中で無水ＨＦを使用して樹脂から切断した。ペプチ ドは、種々の有機副生物からエーテルで抽出することによって分離し、そして５ ０％の酢酸で抽出して単離し、希釈し、そして凍結乾燥した。

粗製のペプチドをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　ＬＨ−２０を使用する ゲル濾過により精製した。ペプチドの純度は逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析に より検査した。

被検体 全細胞百日咳菌（Ｂ、　匣杜用■Ｓ）ワクチンで前取て免疫した健康な大人のボ ランティアの末梢血液のリンパ球（ＰＢＬ）を、ヒストパーク（Ｈｉｓｔｏｐａ ｑｕｅ）勾配（Ｓｉｇｍａ　、ミゾリー州セントルイス）遠心により単離した。

ＨＬＡ　−ＤＲ、ＤＱの型別は、ナイロンウールＴ細胞消耗Ｂ細胞濃縮リンパ球 について、ＮＩＨ標準補体依存性延長ミクロ細胞障害性技術により実施した。

贋１乙ヱ±／−１ ＨＬＡ−ＯＲ、ＤＱ型別した提供者からのＰＢＬを、異なる濃度の合成ペプチド とともに、丸底のマイクロタイタープレート中で、０．２−の培地中の２Ｘ１０ ５細胞の濃度において培養した。培地は、２０％不加熱活性化し、プールしたヒ ト血清（Ｉｒｖ−ｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州すンタアナ ）、２１のＬ−グルタミンおよび抗生物質を補充したＲＰＭＴ１６４０（Ｍｅｄ ｉａｔｅｃｈ、ワシントンＤＣ）から構成した。７２時間後、培養物を〔３Ｈ〕 チミジン（１μＣｉ／ウエル、比活性５Ｃｉ／ミリモル）でパルス標識した。１ ８時間後、細胞を収穫し、そしてチミジンの取込みを液体シンチレーションカウ ンター中で測定した。

筑原蓑　およびＴリンパ　のＵ 抗原提供細胞（ＡＰＣ）は、フレンドリッヒ（Ｆｒｅｎｄｌｉｃｈ）およびアブ ダロビク（Ａｖｄａｌｏｖｉｃ）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ ズ（Ｊ、　Ｉ＋ｎｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　（１９８３）６ ２　：　３１に記載されているようにしてＰＢＬから調製した。簡単に述べると 、この方法は１２０分間のインキュベーションおよびゼラチンおよびオートロガ スの血漿で被覆したプラスチックのペトリ皿へのフィブロネクチンの受容体を有 する細胞の付着を包含する。濃縮した１９７８球の集団は、ナイロンウールのカ ラムにフィブロネクチン非付着性細胞の通過により得た。

モノクローナル抗体のパネルを使用して、フィブロネクチン付着性細胞はＨＬ　 Ａクラス■および■の抗原について陽性であり、そしてＴ細胞マーカーを発現し ないことが示された〔オフセンバーブ（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ａｏ＋、Ｊ、 Ｒｅｐｒｏｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　（１９８６）旦：８２〕。

ブロッキング フィブロネクチン付着性ＡＰＣまたは非付着性Ｔ細胞を、種々の濃度の異なるモ ノクローナル抗体（ｍＡｂ）とともに６０分間インキュベーションした。細胞を 同時培養前によく洗浄した。ブロッキングは、抗原＋ｍＡｂの存在下に得られた ｒｐｓの百分率を抗原単独での応答で割って決定した。次のｍＡｂを使用した： 　Ｌ２４３、および抗ＨＬＡ−ＤＲ（マウスＩｇＧ２ａ）、単形前件ＨＬＡ　− ＤＲエピトープと反応性、　５ＫＩＯ１およびＨＬＡ　−ＤＱ　（Ｌｅｕ−１０ ）（マウスＩｇＧ　１　）　、これはＤＱＷ　１およびＤＱＷ　３分子上の共通 の多形態性のエピトープを認識する；　Ｂ７／２１、抗）ＩＬＡ　−ＤＰ（マウ スＩｇＧ　１　）　、これはＤＰ　１　、　ＤＰ２　、　ＤＰ３　、　ＤＰ４ま たはＤＰ５を発現する細胞のＤＰ分子上に存在する単形層性エピトープを認識す る；および抗ＣＤ　４　（Ｌｅｕ３ａ）　（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 。

カリフォルニア州マウンテンビュー）。ポリクローナルウサギ抗百日咳トキシン は、完全ソロインドアジュバント中のＦＴ（小島活性化タンパク質、Ｌｉ５ｔ　 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州キャンプ ベル）の順次の注入により得た。

ウサギに３７の乳化抗原（２００ｎｇ／　ｍｌ　）を筋肉内注射した。免疫化を １月後に反復し、そしてウサギを２週後に採血した。

促進および採血のサイクルを３週の休養期間後反復した。

フ゛ロモデオキシウリジンおよび　几 応答（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）リンパ球（１０Ｘ　１０’／フラスコ）およびＸｋ ＩＡ照射した刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）　リンパ球（１０Ｘ　１０’／フラ スコ）を２０紙の培地中で３７°Ｃにおいて５％のＣＯ２で同時培養した。２ｎ ／−の５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ、Ｓｉｇ＋＋＋ａ　、 ミゾリー州セントルイス）を培養物に４８時間において添加した。１７時間後、 培養物を蛍光光源により１８０分間照明してアロ反応性クローンを排除した〔ジ エンウェイ（Ｊａｎｅｗａｙ）およびポール（Ｐａｕｌ）　、ジャーナル・オブ ・イクスペリメンタル・メディシン（ムハム厘ム）　（１９７６）　１４４　： １６４１　）。

この手順は特異的同種性（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）応答を約７５〜８５％だけ減 少した。次いで、生き残ったクローンをペプチドでブライミングしたＡＰＣとイ ンキュベーションして遺伝子制限を試験した。これらの細胞がＲＨＡおよび関連 しない同種性刺激に対して応答する能力はこの処置により危うくされないことに 注意すべきである。

マウス マウス（４，５週齢）はＨ６０，マクデビット（ＭｃＤｅｖｉｔｔ　（スタッフ ォード大学）の養殖コロニーから入手したが、ＢＡＬＢ／ｃはスタンフォードの 放射線学部から入手した。

免及止 ５匹の雌のマウスの群を、完全ソロインドアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した ０、　２　ｄのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中の５犀の合成ペプチドで腹腔内（ｉ ｐ）で免疫した。マウスを同一接種で１０日後に再免疫化した。脳障害（発作に 関連するショック様状態）の誘発のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに０．２　ｄの ＰＢＳ中に懸濁した１０ｎｇのＰＴ（小島活性化タンパク質、ＬｉｓｔＢｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、カリフォルニア州キャンプベル） を第０日および２日に尾の静脈中の注射により与えた。第一１、＋１および＋６ 日に、各マウスに０．２−のＰＢＳ中５０ｏｎのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） を１ｐ与えた。マウスを次ぎの２時間の間発作、ショックおよび死亡について観 察した。ウサギに３７の乳化した抗原（２００ｎｇ　／　ｒｄ）を筋肉内注射し た。免疫化を１月後反復し、そしてウサギを２週後採血した。追加免疫および採 血のサイクルを３週の休養後反復した。

且上皿盪跋料 レデルレ・トリ・イムツル（Ｌｅｄｅｒｌｅ　Ｔｒｉ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌ）によ るまたはｐ　７　（Ｌｅｄｅｒｌｅ）を含有する非細胞の百日咳ワクチンによる 第３回の免疫化前に、６力月の年令の乳児から血清が集められた。試料はＣ，ブ ロウバ−（Ｐｒｏｂｅｒ）博士（スタッフォード大学病院）から提供された。

ＬＩＳＡ マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ、Ｄｙｎａｔａｃｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏ−ｒｉｅｓ＋Ｉｎｃ、　、バージニア州チャンチリイ）を、７５　ｐｇ　／ −のフェツイン（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州グラ ンドアイランド）で−夜処理し、そして５ｎのＰＴまたは合成ペプチドを含有す る１００ＪｔｌのＰＢＳで２時間被覆した。結合しない抗原を除去した後、５０ 〜１００ｍの希釈した血清を各ウェルに添加し、そして室温において１時間イン キュベーションした。結合した血清抗体をβ−ガラクトシダーゼ接合ヤギ抗マウ スＩｇまたはマウス抗ＩｇＧ、　Ａ＋　Ｍ（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ、Ｉｎｃ、、カリフォルニア州すウスサンフランシスコ）で同定した。接合 体の添加後、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを添加し、そして ４０５ｎｗにおける吸収を２時間後分光光度計で読んだ。すべての希釈物を３回 反復試験した。正常マウスの血清をバックグラウンド対照として使用した。Ｂ　 ｌ　ａ　ｄ　／　ｃ動物を使用してアッセイにおいて、標準抗血清を系統的に希 釈し、そして標準抗血清の体積対吸収のプロットをつくった。

すべての試験の抗血清は常に希釈して、それらが標準曲線の直線部分に存在する ようにした。Ｂｌａｂ／ｃマウスからのプールした血清ＣＣＦＡ中のＬｏｎｇの ＰＴで２回ｉｐ免疫化後７日に採血した）を標準抗血清として使用した。１００ Ｉの試験血清のそれに等しい吸収を与えるために要求される標準の参照血清の体 積により、結果を表す〔アルド−（Ｗａｌｄｏｒ）ら（１９８３）プロシーデイ ンジス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｐｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８０　：　２７１３）。

ＣＨＯのア・・セイ 中和の試験はトロルフォース（Ｔｒｏｌｌｆｏｒｓ）ら（１９８８）ジャーナル ・オブ・インフェクシャス・ディジージス（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、）１５ ８　：　９９１に記載されているようにして実施した。

ユヱバ球１及 ＰＴで第２の免疫化後数日にマウスを殺し、そして膝窩のリンパ節を取り出した 。リンパ節をＰＢＳ中で解体し、そして単一の細胞の懸濁液を３回洗浄し、そし てペニシリンＧ（１００単位／−）、ストレプトマイシン（１００，ｗ／Ｉｄ） および１０％の加熱不活性化マウス血清を補充した、ＲＰＭ１１６４０中に再懸 濁した。細胞（５Ｘ１０’）を、異なる濃度の合成ペプチドの存在下に加湿した ５％のＣＯ２の環境中で３７°Ｃにおいて平底マイクロタイタープレート中の５ 日間３回の反復実験で培養した。

３〔Ｈ〕チミジン（１μＣｉ／ウエル）を添加し、１６時間後に収穫した。

結果 二次構造を使用するデリシ（ＤｅＬｉｓｉ）およびベルシフスキー　（Ｂｅｒｚ ｏｆｓｋｙ）のアルゴリズムおよびアミノ酸配列に基づくソウバードのアルゴリ ズムに基づいて、次の残基を選択した。

二次構造について、９−１９　、３０−４１　、５３−６４　、７０−８２およ び１７２−１８４゜アルゴリズムの配列について、９９−１１２．１１７−１２ ７、１３５−１４５．１４６−１５６および１８９−１９９を選択した。百日咳 ワクチンで前原て免疫化した健康大人のボランティアを子供と同様に試験した。

代表的な一投与量応答は、供与体Ｊ　Ｏ（ＨＬＡ−ＤＲ３、８；　ＤＱ賀２）の ＰＢＬが最初のアルゴリズムにより選択された５ペプチドのうちで３およびロス バードのアルゴリズムにより選択された５のうちで２に対して応答したものであ る。種々のペプチドに対する個々の応答は顕著に異なった。各個体は１より多い ペプチドにより刺激することができるが、ペプチドのいずれも応答体の全体のパ ネルにおいて応答を引き出さなかった。しかしながら、２つのペプチド、ｐ３０ −４１およびｐＨ？−１２７の組み合わせにより、全体の応答体のパネルをカバ ーすることができることを示すことができた。次のページの表は結果を示す。ペ プチドで刺激した異なる応答のリンパ球は、百日咳トキシンによる第２対抗に対 して激しく応答し、応答体の細胞が非応答性において示されなかったことを示唆 する。ＨＬＡ遺伝子型共有する個体はＴ細胞の受容体の遺伝子型を共有すること が期待できないので、同一のＨＬＡ遺伝子型共有する個体がオリゴペプチドのパ ネルに対して同一の方法で応答しないであろうことは完全には予期せざることで はなかった〔パネルジー（Ｂａｎｎｅｒｊｅｅ）ら、５ｕｐｒａ　）。ＨＬＡ− ＤＲ２，５遺伝子型共有する個体はＰ９−１９およびｐ９９−１１２に対して応 答したが、ｐ３０−４１．　ｐ５３−６４、　ｐＨ７−１２７，ｐ１３５−１４ ５およびｐ１８９−１９９に対して応答しなかった。

百日咳トキシン（ＰＴ）に対する応答におけるＨＬＡ分子の役割を分析するため に、２つの異なるアプローチを使用した：ＨＬＡ−Ｄ分子に対して向けられたモ ノクローナル抗体（ｍＡｂ）による所定のペプチドに対する応答の遮断および異 種の精製したＴ細胞へのペプチドの発現についてのＨＬＡ　−Ｄ合致ＡＰＣの使 用。３つの個体では、フィブロネクチン付着性ＡＰＣによるペプチドｐ９−１９ ．　ｐ７７−８２．　１７２−１８４．　ｐ９９−１１２、ｐＨ７−１２７およ びｐ１８９−１９９の発現（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）は抗肛Ａ　−ＤＲｍＡ ｂにより大きく阻害されるが、抗ＨＬＡ　−ＤＱは約１０〜２０％だけある応答 を抑制することができるのみであった。

ＬｅｕｌＯｍＡｂ　（抗−ＨＬＡ　−ＤＱｗｌ、１ｙ３）はペプチド３０−４１ 　、５３−６４および１３５−６４に対する応答をブロッキングしたが、抗肛Ａ −ＤＲｍＡｂはこれらのペプチドに対する応答において非常に小さい減少に関連 した。抗）ＩＬＡ　−ＤＰによるＡＰＣまたは抗ＰＴ抗体による対照の処理は、 応答の限界の減少のみを引き起こした。これらの結果は、ＰＴ分子の異なるエピ トープは１（ＬＡ−ＤＲまたはＤＱに関連するという結論を支持する。抗体−ブ ロッキングの研究において、ペプチドの刺激は抗ＣＤ４で非付着性リンパ球を処 理することによってブロッキングすることができるが、抗＋ＩＬＡクラス■のｍ Ａｂでは不可能であることが示された。

紅゛ ペプチド　１．−　１．４　２，４　２．５　２，５　３．賀８５．吐　５．７ 　ｗ６．７９−１９　）Ｉ　Ｎ　Ｎ　ＨＨＨＬ　ＨＨ３Ｏ−４１ＨＮ　Ｎ　Ｎ　 ＨＨＨＨＮ ３３−６４　ＨＮ　ＨＮ　Ｉ　ＨＨＬ　Ｎ７Ｏ−８２ＨＩ　Ｉ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｈ ＨＮ１７２−１８４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　ＨＮ　Ｎ９９−１１２　Ｎ　） ｌ　ＨＬ　Ｌ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ１１７−１２７　ＨＩ　ＨＩ　Ｎ　ＨＮ　ＨＮ１ ３５−１４５　ＨＮ　ｌ（Ｎ　Ｉ　ＨＨＮ　Ｎ１４６−１５６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ１８９−１９９　Ｎ　ＨＨＮ　Ｉ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｈ３Ｏ− ４１／１１７４２７　ＨＩ　ＨＺ　ＨＨＴ　Ｈ８９匹の）ｉＬＡ　−ＤＲ型別し た個体からの、百日咳トキシン（ＰＴ）ペプチドに対する２、５，１０．２０お よび１００）　ｇ　／　１におけるリンパ球の増殖指数。結果は、通常１０また は２０）ｇ／ｌである最大の増殖を引き出したペプチドの濃度について与えられ ている。バックグラウンドのｃｐｍ　（ペプチドなし）は１５０〜２５００ｃｐ ｍの範囲であった。高い応答体（Ｈ）　（Ｓｌ　＞　１５）　；中間の応答体（ １）　（ＳＬ　＞　６および＜１５）　；低い応答体（Ｓｌ＞３および〈６）； 非応答体（Ｎ）　（ＳＬ＜　３　）。

第２の実験のアプローチは、異なるかあるいはＨＬＡ−ＤＲ。

ＤＱ抗原決定基共有するＴ細胞およびヘテロロガスＡＰＣＯ使用を包含する。同 種反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）　Ｔ細胞のクローンはＢｒｄ　Ｕｒｄお よび光の処理により活性化され、無関係の増殖反応が排除された。

紅 Ｂｒｄ　Ｕｒｄおよび光の処理後のＭ）Ｉｃ制限およびＴ細胞の反応性１　Ｔ− 」匹ユ」堕」毀」Ｌ町畦己Ｕ匹’ｓ　ＨＬＡ−Ｄ歴Ｊ１町婬、Ｌ９−１９　１２ ６０’！Ｉ　Ｏ，９５ＪＪ１６７０　１．０５　１２８３０　４．４８　２９１ ０　１．７１３０−４１　１２３０　１．０４２５６００．６７　７２５　０． ６９３８６０１．５４５３−６４　１９２０　０．８３　１８８０　１．８９　 ８５４　０．６４　１９１０　１．５９７０−８２　１６７３０　５．４６　２ ９６０　１２７　７１０　１．０１　６６０　０．６７１７２−１８４　１８７ ０　１．８０　２４９０　１．２４　５３０　０．４７　９６０　１．７７９９ −１１２　３１１２５　１２．２０　８６０　０．７７　２４Ｂ６０　８．６３ 　３８２０　２．７４１１７−１２７　９９２０　１１．４０　１７８０　０． ８９　２５３３０　８．４０　４１９０　１．６３１３５−１４５　４０１０　 ５．０７°２２８０　１．７８　８３０　０．７７　７５０　０．９６１４６− １５６　１２１０　１．０７　１９７５　２．２９　１９３０　１．９４　９２ ０　０．８７＊　Ｂｒｄ　Ｕｒｄおよび光の処理、引き続いてペプチドでプライ ミングしたヘテロロガスＡＰＣで刺激した後の精製したＴリンパ球。

丁　計数７分。各個は２つの異なる三重反復実験の平均値を表す。標準偏差値は 平均のｃｐｍの］２％を決して越えなかった。

表３に示すように、ＡＰＣがＨＬＡクラス■の抗原を応答Ｔ細胞と共有する組み 合わせのみが有意なペプチドの応答を生じた。結果はペプチドの応答においてＴ 細胞の範囲の重要な役割を支持する。「非応答Ｊ　ＡＰＣおよび「応答」Ｔ細胞 の組み合わせは陽性の応答を与えるが、「応答、ＡＰＣおよび「非応答」Ｔ細胞 は陰性の応答を生じた。例えば、ＨＬＡ　−ＤＴ２　、４　；ＤＱｗｌ、ｗ３　 ＡＰＣはｐ７２−８２．ｐ９９−１１２．ｐＨ７−１２７゜ｐ１３５−１４５お よびｐ１８９−１９９をＨＬＡ　ＤＲＩ　、　４　；ＤＱｗｌ、３ｗ　Ｔ細胞に 提供（ｐｒｅｓｅｎｔ）　Ｌ／た。ＨＬＡ−ＤＰ２　、４　；ＤＱｗｌ、ｗ３で あった個体は、ｐ５３−６４およびｐ１３５−１４５　、ならびにｐ７０−８２ ゜ｐ９９−１１２．　ｐＨ７−１２７およびｐ１８９−１９９に対して効果的に 応答した。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＰ２　、４　；　ＤＱｗｌ、ｗ３　ＡＰＣ はｐｓ３−６４またはｐ１３５−１４５をこれらのペプチドに対する非応答体で あったＨＬＡ−ＤＲ１、４，；　ＤＱｗｌ、ｗ３の個体のＴ細胞に対して効果的 に提供することができなかった。同様なパターンはＨＬＡ　ＤＰ５　、７　ＡＰ ＣおよびＨＬＡ−ＤＲｗ６　、７−ｆ’細胞で見られ、ここで応答はｐ９−１９ ．　ｐ９９−１１２．ｐＨ１７−１２７およびｐ１８９−１９９に効果的にマウ ントされたが、ＡＰＣの供与体を効果的に刺激するがＴ細胞の供与体を刺激し２ ないｐ３０−４０およびｐ７０−８２にマウントされなかった。

表１に記載するペプチドに加えて、ペプチドｐ＋−１７を合成した。このペプチ ドは配列：　Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ａ−Ｔ−シーＹ−Ｒ−Ｙ−Ｄ−５−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｅ− Ｄを有した。種々の同系交配のマウス系統におけるＰＴの３１サブユニツトの潜 在的抗原決定基の免疫応答を研究した。

５匹のマウス／群からの血清を異なるペプチドによる免疫化前後に集め、プール し、そして全ＰＴを標的抗原として使用してＥＬＩＳＡにおいて試験した。デー タを表４に要約する。

紅 ＰＴ合成ペプチドを使用した免疫化後における百日咳トキシンに対する抗体の応 答 ７０−８２　＋＋＋　＋＋＋　十＋＋　＋＋＋１７２−１８４　＋ ９９−１１２　＋＋＋　＋＋＋ １８９−１９９　＋＋＋　＋　＋ ＰＴ　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋＋十＋　ｏｏｐｒ−ｏ［１バッ クグラウンド　〉　０．４　復姓エピトープ＋　０．４　＜　０ＤＰＴ　−ＯＯ バックグラウンド　＞　０・２　サブＦミナシトエピトープ−ＱＤＰＴ−ＯＤ　 ）ｉツクグラウンド　＜　０・２試験した１１のペプチドのうちの１０はＢ細胞 （抗体）のエピトープを有することが発見されたが、それらのいずれもすべての 系統において抗体の応答を引き出さなかった。例えば、ペプチド７０−８２はＢ ａ１ｂ／ｃ（Ｈ２ｄ）　、　Ｃ３Ｈ（）１２−ｋ）　、Ｃ５７Ｂｌ／６（）１２ −ｂ）およびＰＬ　／　Ｊ　（２Ｈ−ｕ）において強い応答を刺激したが、Ｂａ １ｂ／ｂ（Ｈ２−ｂ）　７ウスにおいて刺激しなかった。Ｂａ１ｂ／ｂおよびＣ ５７Ｂ１／６（両者は１１２−ｂ系統である）の間の反応の異なるパターンはと くに注意すべきである。フェツインで被覆しないプレートを使用して、ある種の エピトープがフェツインの結合により不明瞭になる可能性を除外するとき、同様 な結果が得られた。ｐ８０−８２を注射した応答体のマウスの抗ペプチド血清は 、ＰＴへ結合するウサギ抗ＰＴ血清を有意にブロッキングし、同一コンフォメー ションについての競合性を実証した。Ｂａ１ｂ／ｂ、７０　８２に対して非応答 体、からのの抗血清は、期待するように、ウサギ抗ＦＴ血清をブロッキングしな かった。

Ｂａ１ｂ／ｃ　７ウスをＣＦＡ中の１１００ｎのＰＴで一次および二次の免疫化 を実施した後、抗ペプチドの力価をＥＬＩＳＡにおいて決定した（表５）。

紅 ＦＴで免疫化したＢＡＬＢ／Ｃマウスの抗体力価および細胞の応答 ３０−４１　０．０７　１１４８０ ５３−６４　０．０８　９１６０ ７０−８２　４．５　１４１９７ １７２−１８４　０．０８　２４１０２９９−１１２　０．０７５　９５８６ １１７−１２７　０．０７　２２４００１３５−１４５　０．０７　３１６６３ １４６−１５６　０．０８　９５９０ ＰＴ　５８５４６ ＰＢＳ　Ｏ，０００１５１２０ ＊　１００ｉ１１の試験血清のそれに等しい吸収を与えるために要求される参照 血清の体積。

：生体外刺激において使用したペプチドの濃度は０．６〜６００μモルの範囲で あった。５日の培養後に最大増殖を引き出したペプチドの濃度、通常６μモル、 についての結果を記載する。各ｃｐｍは２つの異なる三重反復実験の決定の平均 を表す。ＳＤ値は平均のｃｍｐの１５％を決して越えなかった。

標的ペプチドをフェツイン被覆したマイクロプレート中に接合または固定しなか った。結合は、配列１−１７．９−１９゜７７−８２および１８９−１９９（ペ プチド１−１７　、７０−８２および１８９−１９９は高い抗ＰＴ力価を誘発し た、表４および６）に相当するペプチドに対して観測された。細胞の応答を試験 するために、ＰＴで足において免疫化したＢａ１ｂ／ｃマウスから排出するリン パ節の細胞を、種々の合成ペプチドで生体外でチャレンジした。強い増殖の応答 は、配列１−１７　、９−１９　、１１７−１２７．１７２−１８４．１３５− １４５および１８９−Ｌ９９（表５）に相当するペプチドで観測された。ペプチ ド７０−８２で刺激した細胞は低いが、一定した増殖を表した（刺激指数＝２． ７７）。これらの増殖の応答はすべて投与量依存性であった。

表呈 日　トキシンの　′・ゞ　の １−１７　１５　７／１５　（５４）：　１：２９−１９　０．５５　１１／１ ５　（２７）５３−６４　０．５　９／１８　（５０）７０−８２　５５　６／ １７　（６５）　１：２１７２−１８４　０．４５　１２／１Ｂ　（３４）１１ ７−１２７　５　１０／１Ｂ　（４５）１３５−１４５　０．０８　１２／１５ 　（２０）１４６−１５６　０．０７　１２／１９　（３７）１８９−１９９　 ８０　９／１Ｂ　（５０）　１：２ＰＴ　Ｏ／１２　（１００）　１：６４ＰＢ Ｓ　Ｏ，０００１１２／１２　（０）＊　１００！の試験血清のそれに等しい吸 収を与えるために要求される参照血清の体積。

：保護の相対的百分率 ミオクロヌスの発作が先行する致死的ショック様症候群は、Ｐ、ＴおよびＢＳＡ で免疫化後、適当なＨ−２型でマウスにおいて誘発される。研究のこの部分にお いて、ＰＴペプチドが生体内でリアクトジェニック（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ） または免疫原性であるかどうかを決定した。したがって、ペプチドが遺伝的に感 受性のマウスにおいて発作を伴う致死的ショックを誘発するかどうかを試験し、 そしてＰＴペプチドにより予備免疫化が致死的百日咳−ＢＳＡの対抗から動物を 効果的に保護するかどうかを試験した。

精製したトキシン（１００ｎｇ）をＢａ１ｂ／ｃマウスの尾の静脈に第０日およ び第２日に注射した。第一１．１、および６日に、５００ＲのＢＳＡを腹腔内に 与えた。ＢＳＡの最後の注射後３０分以内に、健康なマウスは不活性化しかつ呼 吸頻繁となった。

それらは体幹および端のミオクロヌスの痙動を発現し、触覚および聴覚の刺激に より増悪した。それらは２時間以内に湖死となり、そしてほとんどが死亡した。

シッヨク、発作および死亡は、ＰＴおよびＢＳＡを与えた２０匹のＢａ１ｂ／ｃ マウスのうちで１９匹において、そしてＢＳＡを与えないでトキシンを与えた１ ０匹のうちで０匹において起こった。合成ペプチドのいずれもこの症候群の誘発 において全ＰＴと置換することができなかった。ＰＴを異なるペプチドと置換し たとき、１００匹のうちで１匹のみが死亡した。同様な結果はペプチドの量をｌ Ｏｎｇから１■の増加したとき得られた。

発作を伴う致死的ショックの中和作用は表６に示されている。ペプチド１−１７ ．５３−６４．７０−８２．　１８９−１９９およびとくに９９−１１２による 免疫化は、この致死的症候群の発生を減少する（　ｐ　＜０．００１　、非免疫 化動物と比較したとき）。表６は、また、ＣＨＯ細胞をＰＴに暴露したとき観測 される、特徴ある集合した増殖のパターンを、ペプチド誘発抗血清が阻害する能 力を示す。〔ヘラレット（Ｈｅｗｌｅｔｔ）　ら、インフエクション・アンド・ イミユニティ（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋＋ｕｅｕｎ、）　４０　：　１９８８）。

中和活性は、ペプチドｌ　−１７、７０−８２および１８９−１９９で免疫化し たマウスから得られた１：２希釈の抗血清でのみ検出された。ペプチドそれら自 体のいずれも、広い範囲の濃度（０，１〜１０’ｎｇ／　ａｄ！　）にわたって ＣＨＯの増殖の明らかな変化を引き起こさない。

百日咳ワクチンを接種した二人の乳児からの合成ペプチドに対する抗体の反応性 を決定した。試験した５人の子供から、わずかに２人は全ＰＴに対する有意な応 答を示した。これらの２つの試料を異なるペプチドに対して試験した。それらは ペプチド１−１７　、７０−８２　、９９−１１２．１３５−１４５および１８ ９−１９９を包含するＳ１サブユニツトにおける種々のエピトープに対して応答 した。２人の赤ん坊の両者は１−１７および１３５−１４５に対して応答したが 、多分一部分それらの異なる免疫原性バックグラウンドのために、ｐ７０−８２ ．ｐ９９−１１２およびｐ１８９−１９９に対して発散する応答を有した。

上のデータが実証するように、ヒトの宿主に悪い生理学的作用を有することがあ る完全な抗原を必要としないで、百日咳トキシンに対する免疫を産生ずるとき有 効なオリゴペプチドを産生ずることができる。主題のペプチドは、免疫系の活性 化のために、広範な種類のＨＬＡ　−ＡＰＣにおいて組み合わせることができ、 こうしてほとんどの共通の組織適合性抗原に対して有効であるポリペプチドを使 用することによって、集団を通じて有効な応答を保証することができる。便利に は、主題のオリゴペプチドをエンコードする遺伝子を調製することができ、ここ で遺伝子は新規なポリペプチドの産生のための発現ベクターにおいて使用するこ とができるか、あるいは遺伝子は百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）中に形質 転換することができ、この百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は活性トキシン に対して陰性であるか、あるいは形質転換により陰性とされる。あるいは、中和 性抗体を誘発する合成ペプチドを調製することができる。このようにして、ワク チンで処理される大きい集団の小さいが、有意の部分において悪い作用を発生さ せないで、有効なワクチンを調製することができる。

この明細書中に引用したすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物およ び特許出願が引用によって加えることによって特別にかつ個々に示されるように 、ここに引用によって加える。

以上の発明は理解の明瞭さを目的として例示および実施例により多少詳細に記載 したが、本発明の教示に照らして当業者とって容易に明らかなように、ある種の 変化および変更は添付する請求の範囲の精神または範囲を逸脱しないでなすこと ができる。

手続補正書（方式） 平成３年２月１８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の配列のＳ１サブユニットおよびその反復ユニットの少なくとも１つの 少なくとも約８０％を含んでなり、そしてＳ１サブユニットの介在アミノ酸配列 を実質的に含まない少なくとも１つのオリゴペプチドを含んでなる、百日咳菌（ Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチンとして有用なポリペプチド：９−１９，３０ −４１，５３−６４，７０−８２，１７２−１８４，９９−１１２，１１７−１ ２７，１３５−１４５，１４６−１５６および１８９−１９９２．配列：９−１ ９，３０−４１．５３−６４，７０−８２，９９−１１２，１１７−１２７，１ ３５−１４５および１８９−１９９の少なくとも１つの少なくとも８０％を含ん でなる、上記第１項記載のポリペプチド。 ３．前記配列の少なくとも２つの前記配列が存在する、上記第２項記載のポリペ プチド。 ４．前記少なくとも２つの配列は９−１９，５３−６４，７０−８２，９９−１ １２または１８９−１９９を含んでなる、上記第３項記載のポリペプチド。 ５．前記少なくとも２つの配列は９−１９，７７−８２，９９−１１２，１３５ −１４５または１８９−１９９を含んでなる、上記第３項記載のポリペプチド。 ６．前記ポリペプチドはさらにヒトの宿主の免疫原を含んでなる、上記第２項記 載のポリペプチド。 ７．前記ポリペプチドは約６００キロダルトンより小さい、上記第６項記載のポ リペプチド。 ８．前記Ｓ１サブユニットから隣接する配列以外のＢ細胞エピトープに接合した 、アミノ酸配列３０−４１または１１７−１２７の少なくとも１つを含んでなる 、上記第１項記載のポリペプチド。 ９．ヒトの宿主において免疫応答を生成するために十分な量の上記第１項記載の ポリペプチドを含んでなり、前記ポリペプチドは生理学的許容されうる担体中に 分散している、ワクチン組成物。 １０．前記化合物はさらに免疫応答を増強するためのアジュバントを含んでなる 、上記第９項記載のワクチン組成物。 １１．前記ポリペプチドは配列：９−１９，３０−４１，５３−６４，７０−８ ２，１７２−１８４，９９−１１２，１１７−１２７，１３５−１４５，１４６ −１５６および１８９−１９９の少なくとも１つの少なくとも約８０％を含んで なる、上記第９項記載のワクチン組成物。 １２．工程： ベーターターン（ｂｅｔａ−ｔｕｒｎｓ）の少なくとも１つの領域を含んでなる か、あるいはグリシンまたは荷電したアミノ酸の配列および引き続くＮ末端に隣 接した２つの疎水性アミノ酸を有するペプチドを、抗原を発現する細胞および前 記抗原を発現する細胞の少なくとも１つのクラスＩＩの組織適合性の抗原により 制限されたＴヘルパー細胞と組み合わせ、前記ペプチドによる活性化を示すもの として、前記Ｔヘルパー細胞の活性化を検出し、 前記クラスＩＩの組織適合性の抗原の１つに対する抗体の存在下に前記組み合わ せを反復し、そして前記ペプチドによる活性化を示すものとして、前記Ｔヘルパ ー細胞の活性化を検出する、 ことを含んでなり、ここで前記抗体の不存在下の活性化および前記抗体の存在下 の活性化の阻害は、前記ペプチドが前記組織適合性抗原により発現され、そして 前記異型Ｔヘルパー細胞により結合されることを示す、ポリペプチド配列の免疫 原作用を決定する方法。 １３．前記検出はインターリューキン−２の分泌の検出である、上記第１２項記 載の方法。 １４．免疫原性応答生成量の上記第９項記載のワクチン組成物をヒトの宿主に投 与することを含んでなる、ヒトの宿主を百日咳に対して保護する方法。 １５．免疫原性応答生成量の上記第１０項記載のワクチン組成物をヒトの宿主に 投与することからなる、ヒトの宿主を百日咳に対して保護する方法。